佐劑組合製劑的製作方法

2023-07-12 07:01:01

專利名稱：佐劑組合製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及3-O-脫醯單磷脂A或單磷脂A及其衍生物和類似物的用途，它和細胞因子或淋巴因子(尤其是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子或白介素-12)聯用，作為抗原性組合物中的佐劑製劑，以增強脊椎動物宿主對所選抗原的免疫應答。
背景技術：
免疫系統對攻擊性病原體採用了各種機制。然而，這些機制並不一定在免疫後都被激活。免疫接種誘導的保護性免疫力取決於疫苗引發合適免疫反應來抵禦或根除病原體的能力。根據病原體的不同，可能需要細胞介導的和/或體液免疫應答反應。
輔助T細胞在免疫反應中的作用的當前範例是T細胞能根據它們產生的細胞因子分成亞組，這些細胞中所見的不同的細胞因子分泌模式決定了這些細胞的功能。該T細胞模式主要包括兩小類產生使細胞和體液(抗體)免疫反應增強的γ幹擾素和白介素(IL-2)的TH-1細胞；和產生使體液免疫反應增強的白介素-4、白介素-5和白介素-10(分別為IL-4、IL-5和IL-10)的TH-2細胞(參考書目1)。
為了在免疫接種的生物中獲得較強的免疫應答和增強宿主對攜帶抗原的因子的抵抗力，通常希望增強抗原的免疫原性。在某些情況下，希望將免疫應答從以體液(TH-2)應答反應為主變為更為平衡的細胞(TH-1)和體液(TH-2)應答反應。
細胞應答反應涉及CD8+CTL(細胞毒性T-淋巴細胞)應答反應的產生。這種應答是開發針對胞內病原體的疫苗所需要的。對各種病原體的保護作用需要有強的黏膜應答反應、高的血清滴度、誘導產生CTL以及有強烈的細胞應答。大多數抗原製備物(製劑)，包括常規的亞單位疫苗都不能提供這些應答。在這些病原體中包括人免疫缺陷病毒。
因此，需要開發出一種能在脊椎動物宿主中產生體液免疫應答反應和細胞免疫應答反應的抗原性組合物製劑。
發明概述因此，本發明的目的是在抗原性組合物中利用了佐劑組合製劑，該製劑含有3-O-脫醯單磷脂A(MPLTM)或單磷脂A和其衍生物和類似物與細胞因子或淋巴因子(具體是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或白細胞介素-12(IL-12))、或與所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑聯用。佐劑是一種當與免疫原或抗原一起給予時能增強免疫應答反應的物質。將本發明的佐劑製劑與所選抗原以抗原性組合物形式一起給予。本發明的抗原性組合物增強了脊椎動物宿主對於該所選抗原的免疫應答反應。所選抗原可以是衍生自下列物質的多肽、肽或片段(1)病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲，或(2)癌細胞或腫瘤細胞，或(3)變應原，以幹擾IgE的產生，從而緩和對於變應原的變態性應答反應；或(4)澱粉樣肽蛋白，從而預防或治療脊椎動物宿主中以澱粉樣沉積為特徵的疾病。在本發明的一個實施方案中，所選抗原來自HIV。所選HIV抗原可以是HIV蛋白、或衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。在本發明的其它實施方案中，HIV抗原是一種特異性肽。在本發明的其它實施方案中，所選抗原來自淋病奈瑟氏球菌或呼吸道合胞病毒。
MPLTM可以水溶液形式或穩定的水包油乳液(穩定的乳液或SE)形式存在。在本發明的一個較佳實施方案中，該水包油乳液含有鯊烯、甘油和磷脂醯膽鹼。在該SE製劑中，在給藥前，將MPLTM與細胞因子或淋巴因子混合形成抗原性組合物。細胞因子或淋巴因子無需進入乳液。在本發明的一個較佳實施方案中，MPLTM是SE形式。抗原性組合物還可進一步包含稀釋劑或載體。
本發明還涉及提高含所選抗原的抗原性組合物的能力的方法，所述抗原來自(1)病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲，以引發脊椎動物宿主免疫應答反應，或(2)癌細胞或腫瘤細胞的癌抗原或腫瘤相關抗原，以引發脊椎動物宿主的治療性或預防性抗癌作用，或(3)變應原，以幹擾IgE的產生，從而緩和對於變應原的變態性應答反應，或(4)澱粉樣肽蛋白，從而預防或治療脊椎動物宿主中以澱粉樣沉積為特徵的疾病，上述方法是加入有效量佐劑與細胞因子或淋巴因子(尤其是MPLTM與GM-CSF或IL-12)或所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑聯合。
本發明還涉及提高含所選抗原的抗原性組合物的能力的方法，所述抗原來自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲，以引發脊椎動物宿主中的細胞毒性T淋巴細胞，所述方法是加入有效量佐劑與細胞因子或淋巴因子(尤其是MPLTM與GM-CSF或IL-12)或所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑聯合。
附圖簡述

圖1顯示了從5隻Balb/c雌小鼠的組測得的終點滴度的倒數(reciprocal)，這些小鼠用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫，該肽是多表位的39個胺基酸的肽，用CFA或IFA(三角)配製，或用50微克MPLTM2％穩定乳液(SE)配製(正方形)。小鼠於第0天免疫，於第28天加強免疫。在第42天，用ELISA測定所收集血清中的肽特異性IgG，IgG1和IgG2a滴度。
圖2顯示了單用SE、單用MPLTM或MPLTM和SE聯用對於GM-CSF針對抗-T1SP10MN(A)(-Cys)IgG滴度的佐劑性能的影響。在第0天對每組5隻Balb/c雌小鼠用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫，在第28天用所述佐劑製劑加強免疫。使CFA和IFA與水性肽以1∶1的比例乳化。GM-CSF以10微克/劑的量使用。作為水性製劑，MPLTM以50微克的最終濃度輸送給小鼠，或作為含1％SE的穩定乳液的一部分，以25微克的最終濃度輸送。第二次接種後二周測定滴度，數據表示從5隻小鼠測得的各小鼠滴度。
圖3顯示了病毒中和試驗的結果。在第42天，從第0天免疫接種和第28天以所示製劑加強的小鼠取得血清，合併，稀釋(1/1600)，在加入體外的AA5細胞中之前，加入T細胞適應的HIVMN稀釋液中。培養7天後，測定細胞培養物上清的病毒逆轉錄酶作為病毒複製的指標。
圖4顯示了經T1SP10MN(A)(-Cys)以及各種佐劑製劑免疫接種的小鼠的脾細胞增殖。用3.3微克/毫升的T1SP10MN(A)(-Cys)體外刺激脾細胞4天。結果顯示成因T1SP10MN(A)(-Cys)體外刺激所致的標記的胸苷摻入量相對於未受刺激的摻入量的變化(Δcpm)。
圖5顯示了二次免疫後第7天分離自小鼠的脾細胞的CTL活性。從每組3隻Balb/c小鼠收穫脾細胞，小鼠在第0天和第21天用50微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫，所述T1SP10MN(A)(-Cys)用含或不含10微克GM-CSF的MPLTM的1％SE配製。使細胞與HIVMNCTL表位肽一起培育7天。在最後5天，將IL-2加入培養物中。將效應脾細胞加入鉻標記的P815細胞中，該細胞以所示比例用HIVMN、另一株命名為HIVIIIB脈衝處理或不加入肽。CTL活性百分數計算如下 「E∶T」指效應細胞與靶細胞之比。
發明詳述佐劑，細胞因子和淋巴因子是調節免疫的化合物，它們能增強和操縱針對本身免疫原性很差的各種抗原的免疫應答反應的產生和分布類型(profile)。合適地選擇佐劑、細胞因子和淋巴因子能誘導產生好的體液和細胞免疫應答反應，而該反應在沒有佐劑、細胞因子或淋巴因子時不會產生。具體地說，佐劑、細胞因子和淋巴因子具有顯著增強對疫苗中亞單位和肽抗原免疫應答反應的作用。它們的刺激活性也有利於產生針對蛋白質抗原的抗原特異性免疫應答反應。對於需要強黏膜應答、高血清滴度、誘導產生CTL和強細胞應答反應的各種抗原，佐劑和細胞因子/淋巴因子組合可提供大多數抗原製劑不能提供的刺激。
眾多研究已經在動物模型中評價了不同的佐劑製劑，但是目前鋁(alum)(氫氧化鋁或磷酸鋁)是被許可廣泛用於人體的唯一佐劑。有一類佐劑，由各種油包水或水包油組合組成的穩定的乳液，已經因其增強免疫的能力而受到相當多的注意。這些製劑一般包括各種可代謝的或惰性油的各種組合，它們起著穩定和貯存抗原於注射部位的作用。一種這樣的佐劑是不完全的Freund佐劑(IFA)，它包括礦物油、水和乳化劑。完全的Freund佐劑(CFA)是IFA加上熱滅活的分支桿菌。使用這些類型的佐劑的一個特別注意的問題是與注射部位有關的刺激，它通常是單核細胞滲透引起肉芽腫病灶的結果。因此，正在研究作為潛在佐劑的其它化合物和製劑。
一種這樣的化合物是3-O-脫醯單磷脂A(monophosphoryl lipid A)(MPLTM)，它可從Ribi ImmunoChem Research Inc.(Hamilton，MT)購得。MPLTM在納入本文作為參考的美國專利4,912,904(2)中有所描述。
最近，Ribi ImmunoChem Research Inc.已經配製出一種可代謝的水包油型製劑，當其與MPLTM混合時，會形成稱為MPLTMSE的穩定化的乳液。該穩定化的乳液是通過MPLTM與鯊烯油、甘油和磷脂醯膽鹼微流化而產生的。目前的製劑是達到GMP質量的微流化乳液。在下述實驗中描述了含有1或2％油的乳液。
當皮下或肌內給予Balb/c小鼠時，MPLTMSE不產生可辨認的與注射部位有關的組織病理學變化。另外，製備了含有相同組分、但沒有MPLTM的穩定化的乳液用作比較。具體地說，用40個胺基酸的HIV肽T1SP10MN(A)(+Cys)或半胱氨酸缺失的39個胺基酸肽T1SP10MN(A)(-Cys)(40個胺基酸的肽(+Cys)的第17胺基酸處的半胱氨酸殘基缺失)作皮下或肌內免疫接種，用佐劑MPLTMSE和GM-CSF的組合物配製，免疫後兩周沒有產生可辨認的細胞滲入或組織異常。
單磷脂A的用途也在本發明範圍內，該單磷脂A是MPLTM的前體形式，其在美國專利4,912,094(2)中也有所描述。另外，MPLTM和單磷脂A的衍生物和類似物也在本發明範圍內。
在疫苗製劑中摻入細胞因子和淋巴因子已經顯示出有希望擴大和增強疫苗潛力(3)。已經證實，細胞因子白介素-12(IL-12)能通過將T輔助細胞亞組的擴張轉移到Th1細胞因子分泌模式(即，在小鼠模型中向IgG2亞類移動)，而引發和增強細胞介導免疫力(4-6)。已顯示重組鼠IL-12增強了小鼠的Th1優勢免疫應答類型(3)。
IL-12由各種抗原呈遞細胞(理論上是巨噬細胞和單核細胞)產生。它是誘導從原初T-細胞產生TH1細胞的關鍵因素。IL-12的產生或對其應答反應的能力已經表明是產生保護性TH1-樣應答(例如其寄生蟲感染(最突出的是立什曼病))的關鍵(7)。IL-12的作用大部分由NK細胞和T輔助細胞產生的γ-幹擾素來介導。γ-幹擾素在誘導產生針對T細胞依賴性蛋白質抗原的IgG2a抗體(8)以及針對T細胞非依賴性抗原的IgG3應答(9)中很關鍵。IL-12，最初被稱為天然殺傷細胞刺激因子，它是一種異二聚體細胞因子(10)。IL-12蛋白質在重組宿主中的表達和分離在出版的國際專利申請WO90/05147(11)中有所描述。
有希望作為佐劑的另一細胞因子是GM-CSF。GM-CSF是集落刺激因子(CSF)的一種具體類型。CSF是誘導骨髓中所見祖細胞分化成具體類型成熟血細胞的淋巴因子家族。如納入本文作為參考的美國專利5,078,996(12)所述，GM-CSF能激活巨噬細胞或前體單核細胞來介導非特異性殺腫瘤活性。編碼人GM-CSF基因的核苷酸序列已有描述(12)。含有GM-CSF cDNA的質粒已經轉化到大腸桿菌中，並已保藏於美國典型培養物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)，保藏號為39900。如納入本文作為參考的美國專利5,229,496(13)所述，GM-CSF基因還被插入酵母表達質粒中，ATCC保藏號為53157。另外，如納入本文作為參考的美國專利5,073,627(14)所述，編碼糖基化位點已被除去的GM-CSF的DNA序列以保藏號67231保藏於ATCC。
GM-CSF顯示出能上調抗原呈遞細胞上已知能增強免疫應答反應的蛋白分子(15)，而且能影響純種的鼠B細胞的Ig分泌(16)。
其它細胞因子或淋巴因子也顯示具有免疫調節活性，它們包括但不局限於白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、幹擾素-α、β和γ、粒細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子α和β。
細胞因子或淋巴因子的全身給藥相關問題是與細胞因子或淋巴因子活性有關的生物學結果。另外，如果細胞因子或淋巴因子的局部濃度得到維持，那麼應能增強與產生抗原特異性免疫應答的產生有關的細胞因子或淋巴因子的作用。
在以前的研究中，分別評價了GM-CSF和IL-12，並觀察到各種免疫應答參數的增強。
本文中描述的發明證實，通過將抗原、所選的細胞因子或淋巴因子佐劑以及第二種佐劑MPLTM(較佳的以穩定的可代謝乳液形式)組合，能增強針對該抗原的特異性免疫應答。
選擇加入本發明抗原性組合物的抗原包含衍生自蛋白質的肽或多肽，和下列物質的片段糖類、蛋白質、多核苷酸或寡核苷酸、或其它大分子成分。本文所用的術語「肽」包含一連串至少6個胺基酸，且含有至少一個抗原決定簇，而「多肽」是比肽更長、但不構成全長蛋白質的分子。本文所用的「片段」包含糖、蛋白質、多或寡核苷酸、或其它大分子成分的一部分而不是全部。在HIV情況下，本發明的抗原性組合物還包含全長HIV蛋白質。
本發明以採用衍生自HIV的肽抗原的模型系統為例。這些肽描述在或衍生自納入本文作為參考的美國專利5,013,548(17)和5,019,387(18)中，現在作歸納如下。這些肽包含對應於HIV包膜蛋白區域(針對該區域產生中和性抗體和T細胞應答)的胺基酸序列。
HIV是一種人逆轉錄病毒，它是獲得性免疫缺陷症候群(ADIS)的致病因子。HIV通過其外膜糖蛋白與T淋巴細胞表面的CD4(T4)分子結合而感染免疫系統的T淋巴細胞，因此，它用CD4(T4)分子作為進入和感染T細胞的受體。嘗試通過免疫接種誘導針對HIV感染的特異性保護性免疫應答很少成功。目前許多方法尋求確定一種有效的保護性的疫苗策略。這些方法包括採用能表達HIV抗原性表位的減毒和重組細菌載體(19)、重組腺病毒(20)或牛痘病毒載體(21)、DNA疫苗(22)和含有HIV的各種T和B細胞表位的合成的肽(23)。
現已表明，HIV外膜糖蛋白gp120能誘導人體中和性抗體。編碼整個gp120分子大約1/3的重組蛋白PB1顯示具有能誘導中和性抗體形成的包膜蛋白部分。然而，黑猩猩研究表明，完整的gp120或PB1均不能誘導產生高滴度的中和性抗體。
用常規方法合成了對應於gp120抗原決定簇的短肽，結果產生了針對gp120的抗體應答反應，中和了病毒並誘導了針對該病毒的T輔助細胞和CTL應答。
一種這樣的肽是含有多個C4/V3表位的HIV-1MN肽，命名為T1SP10MN(A)(+Cys)，以及其半胱氨酸缺失的變異體T1SP10MN(A)(-Cys)。這些肽包括Th，TCTL和B表位，但是不誘導幹擾CD4結合的抗體。在以前已經證實，當將這些C4/V3 HIV肽和CFA或CFA樣佐劑一起給予時，這些肽是有前途的免疫應答反應誘導候選物(24-29)。這些肽含有以前表明在小鼠和人中誘發CD4+Th細胞應答的表位，而且它含有一個主要的中和決定簇以及被Balb/c小鼠和人CD8+CTL識別的位點(HLA B7+)。這39個胺基酸的肽最近證實在HIV感染的患者中具有免疫原性和安全性(28)。
T1SP10MN(A)(+Cys)具有以下的40個胺基酸序列
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ IDNO1)(26).
T1SP10MN(A)(-Cys)是合成的，17位沒有半胱氨酸，它具有下示的39個胺基酸序列Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Lyr Lys (SEQ IDNO2).
該半胱氨酸殘基位於Th細胞、CTL或B細胞識別的功能性表位之外。來自病毒基因組各區域的其它HIV肽在美國專利5,861,243(30)、美國專利5,932,218(31)、美國專利5,939,074(32)、美國專利5,993,819(33)、美國專利6,037,135(34)和出版的歐洲專利申請671,947(35)中有所描述，這些文獻均納入本文作為參考。
HIV抗原可以是蛋白質、或衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。該蛋白質可以是糖蛋白，如gp41、gp120或gp160。或者，蛋白質可以是諸如gag，pol，vif，rev，vpr，tat，nef或env等基因編碼的蛋白質。衍生自這些蛋白質的肽將含有至少一個長度至少為6個胺基酸的抗原決定簇(表位)。
針對HIV肽的免疫應答可通過將該肽與藥學上可接受的載體分子共價連接(偶聯)來增強。載體分子的合適例子包括破傷風類毒素、白喉類毒素、匙孔血藍蛋白和對應於HIV gp120糖蛋白的T細胞表位的其它肽。
目前認為，成功的抵抗HIV的疫苗策略需要引發抗HIV的黏膜免疫力以及好的CTL應答。在最近採用T1SP10MN(A)多表位肽、黏膜佐劑霍亂毒素的鼠研究中，已表明鼻內免疫誘導了中和性血清IgG1抗體(36)。隨後仍採用HIV-V3環狀肽的研究證實誘導產生了黏膜合成的IgA抗體和強的細胞介導的應答，包括肽特異性CTL(37)。高滴度的全身中和性抗體在預防和穩定HIV感染個體中的功能作用未知，但是認為高滴度的病毒特異性抗體對於預防病毒傳播很重要。
在本發明的較佳實施方案中，配製了含有MPLTM的穩定的水包油乳液，然後將其與細胞因子IL-12或GM-CSF混合。下示數據證實，這些組合產生了高滴度的HIV-中和性血清抗體。MPLTMSE和GM-CSF的組合誘導免疫接種雌小鼠陰道穹隆(vault)內產生高滴度的抗原特異性IgG和IgA抗體。用配以MPLTMSE和GM-CSF的T1SP10MN(A)肽的任一種疫苗免疫小鼠誘導產生了強烈的細胞免疫應答反應(通過增強的抗原特異性細胞增殖和細胞因子分泌入培養物中而確定)並誘導產生肽特異性CTL應答。
一般來說，MPLTM或MPLTMSE聯合GM-CSF或IL-12以及所選蛋白質或肽的抗原/佐劑製劑能誘導高滴度的抗原特異性病毒中和抗體，IgG亞類的比例明顯向較高比例的補體固定的IgG抗體移動(小鼠中為IgG2a佔優)，提高了單核細胞在體外對抗原刺激反應中細胞因子的產生和細胞增殖。在MPLTM不存在時，無論有無GM-CSF或IL-12，抗原和SE的製劑均未觀察到有這些性能。本發明的製劑還誘導了良好的細胞應答(通過CTL的誘導而確定)。
MPLTMSE的一個優點是該製劑不在注射部位誘導肉芽腫性累積和炎症；而油包水或水包油佐劑製劑通常會引起這些注射部位反應。
目前還沒有報導過用其它治療HIV的佐劑製劑能在沒有局部肉芽腫炎症的情況下通過MPLTM結合GM-CSF或IL-12的刺激作用而誘導增強的免疫應答反應。
進行了一系列的研究來比較MPLTM(有或沒有SE)加上GM-CSF或IL-12與單獨的MPLTM、SE、GM-CSF、IL-12或CFA/IFA，或與HIV肽在一起的效果。現在將在更詳細的討論中展示這些結果的總結。
在第一個實驗中，用和MPLTMSE以及GM-CSF一起配製的C4/V3 HIV肽T1 SP10MN(A)(-Cys)皮下免疫Balb/c小鼠，結果注射僅2次後就產生了超過107的血清IgG滴度。該抗體反應是HIV中和性的，且證實IgG1、IgG2a和IgG2b肽特異性抗體滴度有顯著增高。用肽刺激的培育脾細胞釋放IL-4、IL-5和γ-幹擾素的水平升高。總之，那些發現表明誘導產生了平衡的Th1/Th2型應答。在經MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠的陰道灌洗液中產生了對T1SP10MN(A)(-Cys)有特異性的IgG和IgA抗體。這些發現表明，MPLTMSE和GM-CSF與HIV肽抗原的組合誘導產生了有利的免疫應答類型。
在此第一個實驗中，Balb/c小鼠用HIV肽T1 SP10MN(A)(-Cys)以及含有SE的佐劑製劑或GM-CSF來免疫，結果產生了對該肽有特異性的IgG抗體滴度(表1)。水包油型穩定乳液(SE)由鯊烯、甘油和乳化劑(磷脂醯膽鹼)組成，它表明在與T1SP10MN(A)(-Cys)混合時能增強肽特異性IgG滴度。通過免疫接種以SE配製的25∶gT1SP10MN(A)(-Cys)誘導的IgG滴度誘導了二次應答滴度，其約為用肽和CFA免疫、然後用IFA和肽加強免疫的小鼠所誘導滴度的1/5。用CFA/IFA常規配製的疫苗的接種者在初次免疫應答反應中產生T1SP10MN(A)(-Cys)特異性IgG滴度。為了進行比較，單用25∶g(微克)的T1SP10MN(A)(-Cys)肽免疫小鼠。
將MPLTM的水性和SE製劑與用Freund佐劑或細胞因子IL-12和GM-CSF免疫小鼠所誘導的反應作比較。在幾個重複的研究中，混合了IL-12的T1SP10MN(A)(-Cys)的接種者通常不產生肽特異性抗體滴度。相反，GM-CSF或MPLTMSE加上T1SP10MN(A)(-Cys)的接受者產生低的但很容易檢測的IgG抗體滴度。在含有MPLTMSE和T1SP10MN(A)(-Cys)肽的製劑中加入IL-12或GM-CSF在免疫應答中誘導產生了明顯較高的IgG滴度。實際上，用MPLTMSE和GM-CSF的聯合來免疫小鼠導致二次應答滴度始終高於經其它任何測試製劑免疫的小鼠。該肽的特異性IgG滴度高於經Freund佐劑配製的125微克T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠的滴度。
所需的HIV特異性免疫應答反應的特徵是細胞和體液免疫力之間的平衡。特定的免疫球蛋白同種型亞類與T輔助細胞亞組朝Th1或Th2佔優勢的方向偏離有關。這些T輔助細胞亞組各自分泌的細胞因子已證實具有指導IgG亞類轉換的活性。測定第二次免疫後兩周收集的合併血清IgG亞類的終點滴度(endpoint titer)(表2)。在幾個重複的研究中，單用T1SP10MN(A)(-Cys)、或配以GM-CSF或IL-12免疫小鼠沒有產生或產生低的IgG亞類滴度。IgG3抗體不能用ELISA檢測到。用CFA乳化的T1SP10MN(A)(-Cys)免疫、IFA加強免疫的小鼠組主要產生了T1SP10MN(A)(-Cys)特異性的IgG1抗體應答。肽與SE、MPLTMSE、MPLTMSE加IL-12或MPLTMSE加GM-CSF的製劑也產生了高滴度的IgG1抗體。SE配製疫苗的接受者反覆證實有明顯的IgG1滴度，但是沒有明顯的IgG2a或IgG2b滴度。在SE製劑中加入MPLTM導致IgG2a和IgG2b T1SP10MN(A)(-Cys)特異性抗體滴度增高。在MPLTMSE和T1SP10MN(A)(-Cys)中加入IL-12或GM-CSF導致IgG1∶IgG2a抗體滴度比移動。若沒有細胞因子，MPLTMSE配製的疫苗誘導了相似的IgG1和IgG2a滴度。IL-12和GM-CSF都提高了肽特異性IgG2a的相對血清濃度。另外，MPLTMSE和GM-CSF的組合還使T1SP10MN(A)(-Cys)特異性IgG2b抗體滴度顯著增加(是MPLTMSE的47倍，是SE的74倍)。經MPLTMSE和GM-CSF以及T1SP10MN(A)(-Cys)肽免疫的小鼠所產生的滴度始終是各疫苗接種組中最高的。
為了確定經T1SP10MN(A)(-Cys)、MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠合併血清所測得的高滴度是否代表了該組中的各只小鼠，將該組中各只小鼠的滴度與經Freund佐劑配製的肽免疫的小鼠的滴度相比較(圖1)。確定各個血清的IgG、IgG1和IgG2a滴度平均值與合併血清測得的滴度相似(數據未顯示)。用MPLTMSE和GM-CSF共同配製T1SP10MN(A)(-Cys)使得IgG、IgG1和IgG2a的滴度明顯高於接種CFA/IFA的小鼠中所誘導的滴度。經配以MPLTMSE和GM-CSF的肽所免疫的所有小鼠均產生了高於經CFA/IFA製劑免疫的小鼠中所測得的IgG抗體滴度。這些結果表明，MPLTMSE和GM-CSF的組合產生了有利的抗體應答特徵(從高滴度的肽特異性抗體可以確定)和有利的IgG亞類分布。該製劑通常在所有所用疫苗製劑中誘導出最高的T1SP10MN(A)(-Cys)特異性滴度。
用與水性MPLTM、SE或MPLTMSE一起配製的GM-CSF免疫小鼠，比較小鼠的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG滴度，以確定GM-CSF作為補充佐劑的影響(圖2)。結果提示，MPLTMSE和GM-CSF以及肽的組合是該特定實施方案中唯一誘導出高滴度抗體的一個組合。MPLTM加GM-CSF所引發的滴度與CFA/IFA相當。因此，當一起配製時，MPLTM和GM-CSF的佐劑性質看來有協同性，其中MPLTM可以是水性形式，或是穩定的乳液形式。
然後，測定第二次免疫後4周時合併的小鼠陰道灌洗液中T1SP10MN(A)(-Cys)特異性抗體滴度(圖3)。經MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠產生了高滴度的IgA和IgG抗體。接種其它製劑的小鼠陰道灌洗液通常未能檢測到有抗體滴度。由於陰道灌洗液中的IgG與IgA之IgG佔優，且沒有測定sIgA，因此不能得出陰道灌洗液中檢測到的IgA抗體是由黏膜組織局部合成的結論。實際上，所檢測到的IgA和IgG滴度可能是遠離陰道黏膜的漿細胞所分泌的免疫球蛋白滲出的結果。
這些結果證實，用MPLTMSE結合IL-12或GM-CSF配製的HIV-肽T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠具有高滴度的肽特異性血清抗體。
為了評價那些抗體滴度在功能上是否有效，分析血清抑制細胞受實驗室適應的HIV病毒株體外感染的能力。該試驗測定了受合適HIV病毒株感染的細胞進入培養上清的病毒的逆轉錄酶活性。經MPLTMSE和GM-CSF或MPLTMSE和IL-12免疫的小鼠血清均有顯著減少的病毒傳染性(圖3)。最高大的病毒逆轉錄酶(活性)單位為9481至10411範圍內。用該製劑免疫的小鼠血清抑制了病毒複製。甚至在僅僅1/20的病毒稀釋度下，經MPLTMSE和GM-CSF以及T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠血清仍能抑制大約50％的病毒複製。與經MPLTMSE、IL-12和HIV肽製劑免疫的小鼠所得的血清滴度為71相比，測得該製劑的血清中和滴度大於1600。
與用CFA和IFA免疫小鼠所引發的滴度相比，那些小鼠組的血清抗T1SP10MN(A)(-Cys)滴度是相似的(但是稍高一些)。在本試驗中，接種CFA/IFA乳化的T1SP10MN(A)(-Cys)的小鼠血清沒有顯示出中和HIV作用。接種肽以及作為佐劑聯用MPLTMSE加GM-CSF的小鼠血清表現出中和活性比任何其它血清都高。在相同的稀釋度下，經MPLTMSE加GM-CSF以及HIV肽免疫的小鼠血清中和比其它疫苗製劑接受者血清更高的病毒濃度。
然後測定了培養物中HIV肽特異性脾細胞增殖。細胞對T1SP10MN(A)(-Cys)的應答的測定方法是，使脾細胞與肽或對照蛋白一起體外培養。該試驗測定了摻入正在分裂的細胞的DNA中的3H-胸苷(表4)。與未經佐劑免疫的小鼠脾細胞不同，免疫接種和SE一起配製的T1SP10MN(A)(-Cys)的小鼠脾細胞在對該肽反應中迅速增殖。疫苗接種者的脾細胞對培養中不相關的抗原(溶菌酶)不起反應，或沒有抗原刺激反應。所有組均對促分裂素ConA的刺激有相似的反應。在大多數組中，顯示了抗原特異性劑量依賴型增殖反應。在所有三種肽劑量下，接種MPLTMSE共同配製的GM-CSF的小鼠組測得最高程度的增殖。接種以CFA/IFA、或IL-12加HIV-肽配製疫苗的小鼠組脾細胞測得有最低的增殖反應。經肽以及SE或GM-CSF免疫的小鼠脾細胞在培養物中有相似的胸苷摻入水平。這些結果表明，用MPLTMSE和GM-CSF共同配製HIV肽使得鼠脾細胞在體外抗原呈遞反應中有最高的增殖潛力。
檢查培養的脾細胞將細胞因子IL-4(表5)和γ-幹擾素(表6)分泌到培養上清中的可能性。測定用抗原或促分裂素體外刺激後三天和六天後收穫的培養上清中的這些細胞因子。IL-4(T輔助細胞2型相關的細胞因子)的測定結果表明，儘管所有組均在3天後在對促分裂素ConA刺激的反應中產生了可檢測水平的IL-4，但只有用MPLTMSE或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠在對肽刺激的反應中產生IL-4。只有用MPLTMSE加GM-CSF和T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠在用於刺激脾細胞的所有肽劑量下將可檢測水平的IL-4分泌入培養物中。在培養6天後，用肽以及MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠脾細胞的IL-4分泌水平高於用肽以及MPLTMSE、MPLTMSE加IL-12或SE免疫的小鼠所檢測到的水平。IL-4水平甚至還高於培養中受ConA刺激的那些細胞所誘導產生的水平。從用MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠的培養脾細胞也對T1SP10MN(A)(-Cys)的6天刺激起反應，將可檢測水平的IL-5(另一T輔助細胞2型細胞因子(未顯示))分泌入培養物中。而其它組小鼠的脾細胞在這些培養物中均未產生可檢測的IL-5。
所有組小鼠的脾細胞均對培養物中ConA的3天刺激起反應，將可檢測水平γ-幹擾素分泌到培養中(表6)。只有用MPLTMSE或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠細胞在對HIV肽的三天刺激的反應中產生可檢測水平的γ-幹擾素。在刺激培養6天後，觀察到在對ConA和肽的反應中均有較高濃度的γ-幹擾素。感興趣的是從用MPLTMSE或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠脾細胞培養上清測得的γ-幹擾素水平。這兩個接種組的脾細胞分泌到培養上清中的γ-幹擾素濃度顯著高於用肽以及MPLTMSE加IL-12或SE免疫的小鼠脾細胞。
第一個實驗的結果證實，在穩定的水包油乳液中加入MPLTM、然後將該乳液與HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)以及GM-CSF混合，結果誘導產生了中和性抗體。而且，GM-CSF與MPLTMSE以及疫苗抗原一同配製使得分泌到培養上清中的IL-4、IL-5以及γ-幹擾素水平提高，並增強了培養物中經免疫性抗原刺激的脾細胞的增殖反應。該製劑也誘導出所試驗的疫苗製劑中最高的IgG、IgG2a和IgG2b滴度。只有接種了MPLTMSE和GM-CSF以及肽組合的小鼠組的陰道灌洗液在多次反覆研究中始終有可檢測的IgG和IgA滴度。MPLTMSE、IL-12和肽的組合還提高了IgG1和IgG2a的滴度，提高了病毒中和效果，提高了脾細胞增殖以及IL-4和γ-幹擾素的分泌。
用任何單一佐劑配以HIV肽接種小鼠都不會產生具有引發中和抗體性質的免疫應答反應。
常發現，用T1SP10MN(A)(-Cys)和MPLTMSE或MPLTM以水性製劑形式免疫小鼠誘導產生了良好的抗體滴度。然而，這些製劑並不始終誘導具有陰道抗體滴度、中和性抗體滴度(或強的CTL應答，如下文實驗8所述)的免疫應答反應。與肽結合的MPLTM或MPLTMSE偶爾能誘導陰道灌洗液可測定的IgA和IgG滴度。在一些研究中，在疫苗製劑中的MPLTM中加入IL-12或GM-CSF產生的滴度與用CFA/IFA、或具有或沒有細胞因子的MPLTMSE製劑免疫的小鼠中產生的滴度相似。該發現提示產生HIV肽特異性的高滴度抗血清不需要SE形式的MPLTM。在SE載體中加入GM-CSF可使肽特異性滴度比單用SE或用SE和IL-12免疫的小鼠有所提高。然而，誘導好的IgG2a和IgG2b抗體滴度一般依賴於肽加MPLTM和GM-CSF的配方。感興趣的是，注意到該配方誘導的IgG滴度與用其它製劑(如CFA/IFA和肽)免疫所誘導的那些滴度相似。MPLTMSE與GM-CSF和肽的組合是唯一表現出誘導高滴度中和性抗體和CTL的製劑(見實驗8)。IL-12加MPLTMSE和肽也誘導了有利的免疫應答反應。結果表明，MPLTMSE和細胞因子GM-CSF或IL-12的共同配製在抗體應答反應中與用CFA和IFA免疫相比有質的差別。認為該差別可歸因於IgG2a和IgG2b水平的提高。
在第二個實驗中，按照第一個Balb/c-HIV肽實驗的程序稍作改動。MPLTM也以含有或不含細胞因子的水性形式給予。
用不含佐劑的HIV肽T1SP10MN(A)(-Cys)免疫Balb/c小鼠，結果不誘導產生顯著的抗體滴度。相反，含有各種佐劑/細胞因子組合的肽抗原製劑在兩次免疫後誘導產生了高的抗體滴度。
用肽和IL-12或單用SE進行免疫，結果使滴度與沒有佐劑使誘導的滴度沒有區別(表7)。以GM-CSF共同配製的肽的接受者具有適當增加的滴度。與含有CFA/IFA的疫苗接受者相比，微流化的MPLTMSE顯示產生相似的肽特異性抗體滴度。與CFA/IFA疫苗接受者相比，MPLTMSE誘導了更高水平的肽特異性IgG2a。所用的免疫方案可能影響所觀察的抗體滴度。然而，用MPLTM(水性)配製的肽免疫小鼠卻誘導出高滴度的肽特異性抗體。在該製劑中加入GM-CSF或IL-12使得滴度增加超過106。因此，HIV肽與MPLTM和細胞因子IL-12或GM-CSF的組合誘導產生了對該肽有特異性的高滴度抗體。
對陰道灌洗獲得的液體進行檢測，只有用肽和MPLTM以及IL-12或MPLTMSE和GM-CSF免疫的小鼠組產生了較高的抗體滴度(表8)。實際上，只有用MPLTM和IL-12以及肽免疫的該組小鼠產生肽特異性IgA。
在體外肽刺激的反應中通過摻入胸苷測定培養脾細胞的增殖能力。表9中的數據以這樣的方式來表示，對增殖進行歸一化，標準化成通過ConA刺激確定的增殖最大值。用MPLTMSE以及GM-CSF或IL-12免疫的小鼠脾細胞，或單用GM-CSF免疫的小鼠脾細胞顯示出低水平的肽相關的增殖。相反，用肽結合MPLTM以及GM-CSF免疫的小鼠的脾細胞顯示出明顯的增殖。
另外測定了體外培養的脾細胞的細胞因子產生。對於IL-4，只有用MPLTMSE結合GM-CSF和T1SP10MN(A)(-Cys)免疫的小鼠在對肽刺激的反應中分泌高水平的IL-4(表10)。對於γ-幹擾素，用MPLTMSE和GM-CSF或IL-12、或水性MPLTM和GM-CSF或IL-12免疫的小鼠在培養上清中產生了易於檢測水平的該細胞因子(表11)。
因此，細胞因子GM-CSF或IL-12與MPLTM或MPLTMSE的組合誘導出對該肽抗原特異性的高滴度抗體。該滴度與用肽和CFA/IFA免疫小鼠所誘導產生的滴度相似。數據表明，這些組合也誘導培養脾細胞最高的增殖反應，並建立了在對肽刺激反應中分泌最高水平γ-幹擾素的脾細胞群。
該第二個實驗的結果表明，MPLTM和細胞因子GM-CSF或IL-12和T1SP10MN(A)(-Cys)的共同配方可誘導出類似於或更好於用肽和CFA免疫並用肽和IFA加強免疫的小鼠中所誘導的免疫應答類型。
第二次免疫後兩周對注射部位進行組織學評價(未顯示)，表明用微流化MPLTMSE免疫小鼠不會產生或維持單核細胞滲入真皮。蘇木精/伊紅染色的組織看上去象未接受佐劑者製得的組織。相反，用CFA和IFA作為佐劑(油包水乳液)免疫的Balb/c小鼠在該區域有大量的單核細胞積聚。MPLTMSE和GM-CSF以及肽的接種者與沒用GM-CSF的MPLTMSE接種者相比顯示出單核細胞明顯但邊緣性增加。僅用GM-CSF和肽免疫的小鼠組織未作檢查。
第三個實驗按照第二個實驗的方案，用Swiss-Webster小鼠代替Balb/c小鼠。採用Swiss-Webster小鼠來確定HIV肽抗原的佐劑效果，其中受MHC限制的輔助性T細胞表位不會影響免疫應答反應。Swiss-Webster小鼠是雜交繁殖的小鼠株系；因此，不進行細胞研究。在本實驗中僅測定抗-HIV肽IgG終點滴度和陰道灌洗液IgG和IgA終點滴度的倒數。從表12和13看出，應答類型與第一和第二實驗中測得的Balb/c小鼠所得的數據相當。
在第四個實驗中，按照第二個實驗的程序進行，並稍作變化，採用Balb/c小鼠。如表14所示，MPLTM和GM-CSF或IL-12的佐劑製劑引發了明顯高於單用MPLTM的IgG GMT反應。如表15所示，MPLTMSE和GM-CSF的佐劑製劑引發了明顯的IgG2b亞類反應。MPLTM和GM-CSF或IL-12的佐劑製劑引發了顯著高於單用MPLTM的IgG2a亞類反應，同時，MPLTMSE和GM-CSF或IL-12的製劑引發了高於單用MPLTM的IgG2a亞類反應。如表16所示，MPLTM和GM-CSF或IL-12的製劑在陰道灌洗液中引發了明顯高於單用MPLTM的IgG滴度。最後，如圖4所示，MPLTM和GM-CSF或IL-12的佐劑製劑，以及MPLTMSE和GM-CSF或IL-12的製劑分別顯示出高於單用MPLTM或MPLTMSE的脾細胞增殖。
在第五個實驗中，按照第二個實驗的程序進行，並稍作變化，採用Balb/c小鼠，佐劑製劑中不加入IL-12。如表17所示，含有MPLTM和GM-CSF的佐劑製劑引發了明顯高於單用MPLTM的IgG2a和IgG2b應答反應。而且，含有MPLTM和GM-CSF的佐劑製劑還引發了明顯高於單用MPLTM時的所有IgG亞類的應答反應。
在第六個實驗中，按照第二個實驗的程序進行，並稍作變化，採用Balb/c小鼠，佐劑製劑中不加入IL-12。HIV肽的胺基酸長度為40，因為胺基酸17位有半胱氨酸。如表18所示，含有MPLTMSE和GM-CSF的佐劑製劑引發了明顯高於單用MPLTM時的所有IgG亞類的反應，和顯著高於單用MPLTMSE時的所有亞類的反應。
在第七個實驗中，按照第六個實驗的程序進行，並稍作變化，採用Balb/c小鼠，佐劑製劑中不加入IL-12。如表19所示，含有MPLTMSE和GM-CSF的佐劑製劑引發了明顯高於MPLTMSE的所有IgG亞類的反應，含有MPLTM和GM-CSF的佐劑製劑引發了明顯高於單用MPLTM時的所有IgG亞類的反應。
在第八個實驗中，將MPLTMSE、或MPLTMSE加GM-CSF與多表位肽T1SP10MN(A)(+Cys)配製在一起，對小鼠進行免疫，評價該小鼠脾細胞產生HIVMN特異性CTL反應的能力作為功能性細胞介導的免疫力的指標。
如圖5所示，用MPLTMSE、或MPLTMSE加GM-CSF免疫的小鼠脾細胞顯示出對未標記或用IIIB CTL表位經脈衝標記的靶細胞活性很低。用與MPLTMSE和GM-CSF一起配製的T1SP10MN(A)(+Cys)免疫的小鼠脾細胞在一次免疫後誘導出好的HIVMN特異性CTL活性。在第二次免疫後7天測定時，HIVMN特異性CTL介導的靶細胞裂解顯著增強(圖5)。在另一個實驗中，未用佐劑免疫的小鼠未誘導CTL反應。用水性MPLTM和肽免疫的小鼠產生較低的(＜30％)肽特異性CTL反應。
評價該免疫原性組合物抵禦HIV的潛在效力的困難是HIV感染的非人靈長類動物不產生類似於AIDS的症狀。因此，潛在的動物模型不能模擬HIV引起的人體症狀。幸運的是，被猿猴免疫缺陷病毒(SIV，該病毒與HIV密切相關)感染的非人靈長類動物能產生類似於AIDS的症狀。
這樣就能在非人靈長類動物中評價SIV抗原。SIV抗原可以是蛋白質或衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。該蛋白質可以是諸如gp41、gp120或gp160等糖蛋白。或者，該蛋白質可以是諸如gag，pol，vif，rev，vpr，tat，nef或env等基因編碼的蛋白質。衍生自這些蛋白質的肽將含有至少一個長度至少為6個胺基酸的抗原決定簇(表位)。
與HIV相似，在非人靈長類動物中採用多表位SIV肽。進行研究以評價各種肽與MPLTMSE和GM-CSF的組合是否能引發CTL反應。在0、4、8和18周，用MPLTMSE和GM-CSF以及下列三個肽中任一肽對獼猴進行皮下免疫(接種)(見表20)(1)每個肽含有如下所示的Mamu A*01限制性CTL表位Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ IDNO3)(gag)(38，39)Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ IDNO4)(pol)(40)Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ IDNO5)(env)(40)(2)或者，這三個肽各與具有以下序列的混雜(promiscuous)T輔助細胞表位相連Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID NO6)(根據文獻41改進)因此，這三個肽具有下列序列Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn GlnMet(SEQ ID NO7)Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg LeuVal(SEQ ID NO8)Glu Leu Tyr Tys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly GlnIle(SEQ ID NO9).
每兩周收集肝素化血液，用51Cr釋放試驗、新鮮外周血單核細胞(PBMC)的四聚體染色以及培養的PBMC的四聚體染色來分析外周血單核細胞的CTL。新鮮PBMC的四聚體染色和51Cr釋放測定的溶細胞殺傷作用未顯示有活性。然而，用MPLTMSE和GM-CSF配製的Mamu A*01限制的Th/CTL肽混合物對獼猴進行免疫卻導致檢測出四聚體陽性的CD8陽性T細胞。表21-24中顯示的結果表明與各肽培養11天的PBMC中檢測到四聚體陽性CD8+(表21-23)或CD4+(表24)T細胞的百分數。
總之，用具有Th表位(Rh 55，Rh 142)或不具有Th表位(Rh 73，Rh 80)的CTL表位免疫的所有四隻MamuA*01陽性獼猴顯示檢測到對gag、pol或env有特異性的CD8陽性四聚體陽性細胞。如所預計的，在MamuA*01陰性動物(Rh 41，Rh 47)中沒有檢測到四聚體陽性CD8細胞。在初次免疫後見到了SIV gag和env特異性免疫應答反應，而在加強免疫後觀察到pol特異性四聚體陽性。由於第18周的最後一次加強免疫沒有使應答反應進一步提高，因此在表21-24中沒有顯示14周後的數據。
總之，用佐以MPLTMSE和人GM-CSF的Mamu A*01限制性的Th/SIV gag，pol和env CTL表位肽混合物對獼猴進行免疫，結果如靈敏的特異性四聚體試驗所證明的那樣，引發了細胞應答反應。
淋病奈瑟氏球菌的膜孔蛋白B蛋白也稱為PIB蛋白，該蛋白已被重組表達(42，納入本文作為參考)，它是預防或治療淋病奈瑟氏球菌所引起的感染的候選抗原。
進行了一系列的研究，比較了和淋病奈瑟氏球菌的膜孔蛋白B蛋白改進版本(其中氨基端的16個胺基酸來自噬菌體，其後是成熟形式的膜孔蛋白B蛋白)在一起時，採用MPLTM(有或沒有SE)加GM-CSF或IL-12與單用MPLTM(有或沒有SE)的效果。下面將提供研究結果的小結。
在第一個實驗中，用重組膜孔蛋白B蛋白在Swiss-Webster小鼠臀部作皮下免疫接種，產生抗原特異性抗體滴度，表明該膜孔蛋白B蛋白是有活性的候選抗原。在MPLTM和膜孔蛋白B蛋白中加入GM-CSF，結果使血清抗體IgG和IgG2a滴度比接受MPLTM和膜孔蛋白B蛋白有所提高(見表25和26)。
在第二個實驗中，用重組膜孔蛋白B蛋白加IL-12和MPLTM或MPLTMSE在Swiss-Webster小鼠臀部作皮下免疫，結果誘導產生了高於接受膜孔蛋白B蛋白加MPLTM或MPLTMSE時的抗原特異性抗體滴度(尤其是IgG)。在初次和第二次免疫後均觀察到有較高的滴度。在製劑中加入IL-12導致陰道灌洗液中測得的IgG滴度增加約10倍(見表27)。
天然二聚體形式的人呼吸道合胞病毒(RSV)的純化的天然融合(F)蛋白是預防RSV感染的候選抗原(43，納入本文作為參考)。
進行一系列研究，比較了在與RSV純化的天然F蛋白一起時，用MPLTM(有或沒有SE)加GM-CSF或IL-12與單用MPLTM(有或沒有SE)、磷酸鋁或StimulonTMQS-21的效果。下面提供研究結果的小結。
在第一個實驗中，經天然RSV F蛋白肌內免疫的Balb/e小鼠產生了抗原特異性抗體滴度，表明該F蛋白是有活性的候選抗原。將GM-CSF加入MPLTM中，結果在初次和第二次免疫後誘導出高於單用MPLTM的抗F蛋白終點滴度(見表28)，而且還使脾細胞對體外刺激的細胞應答反應比單用MPLTM時有所增強(見表29)。將GM-CSF加入MPLTMSE中使得對F蛋白的初次IgG應答比單用MPLTMSE時更高(見表28)。
第二個實驗重複第一個實驗的程序。將GM-CSF加入MPLTM中，結果在初次和第二次免疫後均誘導出高於單用MPLTM時的抗F蛋白終點滴度(見表30)。將GM-CSF加入MPLTMSE中也在初次免疫後誘導了比單用MPLTMSE更高的抗F蛋白終點滴度(見表30)。在F蛋白和MPLTM或MPLTMSE的製劑中加入GM-CSF誘導了比用缺少GM-CSF的製劑更高百分比的RSV特異性脾細胞CTL活性，如免疫小鼠脾細胞所測定的那樣(見表31)。
第三個實驗用IL-12代替GM-CSF。IL-12和MPLTM的共同製劑在初次免疫後誘導了比F蛋白單加MPLTM輸送時更高的IgG滴度(見表32)。然而，在MPLTM或MPLTMSE中加入IL-12對於效應細胞體外刺激後測得的RSV特異性CTL活性沒有影響(見表33)。
進行一個研究，比較了當與流感病毒NP(核殼)蛋白一起時，MPLTM(有或沒有SE)加上GM-CSF與單用MPLTM(有或沒有SE)的效果。進行實驗測定抗體滴度的NP量不夠。用有或沒有佐劑的NP肽免疫小鼠，在最後一次免疫後14天，分析脾細胞對於抗原刺激的應答反應。在含有MPLTM或MPLTMSE的製劑中加入GM-CSF，結果使CTL活性明顯降低(數據未顯示)。
還不清楚為何會獲得該反常的結果。可能在進行試驗時有技術問題。
在給予本發明的抗原性組合物後，該抗原性組合物可通過提高脊椎動物宿主抗體反應和細胞介導的免疫力來調節免疫應答反應，該組合物包含選自病原性病毒、細菌真菌或寄生蟲的抗原，以及與細胞因子或淋巴因子(尤其是GM-CSF或IL-12)結合的有效輔佐量的MPLTM(以水性或穩定的乳液形式)。已顯示具有免疫調節活性的其它細胞因子或淋巴因子包括，但不局限於，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、幹擾素-α、β和γ、粒細胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子α和β。
所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑也在本發明範圍內。本文所用的術語「激動劑」指增強所述細胞因子或淋巴因子活性或以和其相同的方式起作用的分子。該激動劑的例子是所述細胞因子或淋巴因子的模擬物。本文所用的術語「拮抗劑」指抑制或阻止所述細胞因子或淋巴因子活性的分子。該拮抗劑的例子是可溶的IL-4受體和可溶的TNF受體。
本文所用的術語「有效輔佐量」指本文所述佐劑的結合量，該結合量適合在脊椎動物宿主中引發增強的免疫應答。具體劑量將部分取決於宿主的年齡、體重和醫療狀況，以及給藥方法和抗原。在較佳的實施方案中，佐劑組合將採用1-100微克/劑範圍內的MPLTM。本領域技術人員不難確定合適的劑量。本發明的抗原性組合物還可以常規方式與免疫學上可接受的稀釋劑或載體混合，製得可注射的液體溶液或懸浮液。
本發明的抗原性組合物可通過各種途徑給予人或非人脊椎動物，這些途徑包括但不局限於，鼻內、經口、陰道、直腸、腸胃外、皮內、透皮(例如見國際申請WO98/20734(44)，納入本文作為參考)、肌內、腹膜內、皮下、靜脈內和動脈內。抗原性組合物中的抗原成分的量部分取決於抗原的身份、宿主的年齡、重量和醫療狀況、以及給藥方法。同樣，本領域技術人員很容易確定合適的劑量。儘管不需要，但較佳的是抗原與佐劑組合同時給予。抗原性組合物的劑數和劑量方案也是本領域技術人員容易確定。在一些情況下，佐劑組合的佐劑性質可減少所需的劑數或劑量方案的時間。
本發明的佐劑組合適用於含有各種抗原的抗原性組合物，該抗原可來自各種病原性微生物，它們包括但不局限於感染人和非人脊椎動物的病毒、細菌、真菌、寄生蟲微生物，或來自癌細胞或腫瘤細胞。抗原可包含衍生自蛋白質的肽或多肽，以及下列物質的片段糖類、蛋白質、多或寡核苷酸、癌或腫瘤細胞、變應原、澱粉樣肽蛋白或其它大分子組分。在一些情況下，抗原性組合物中加入多種抗原。
含有本發明佐劑組合的所需病毒疫苗包括目的為預防和/或治療由下列病毒引起的疾病的那些疫苗，這些病毒包括但不局限於人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、流感病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、脊髓灰質炎病毒、輪狀病毒、萼狀病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟熱病毒、牛傷寒病毒、冠狀病毒、細小病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、貓白血病病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、禽類傳染性粘液囊病病毒、新城堡疾病病毒、馬立克氏病病毒、豬呼吸生殖道症候群病毒、馬動脈炎病毒和各種腦炎病毒。
含有本發明佐劑組合的所需細菌疫苗包括目的是預防和/或治療由下列細菌引起的疾病的那些疫苗，這些細菌包括但不局限於流感嗜血桿菌(可分類的(typable)和不可分類的(nontypable))、睡眠嗜血桿菌、黏膜炎莫拉氏菌、肺炎鏈球菌、釀膿鏈球菌、無乳鏈球菌、糞鏈球菌、幽門螺桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、砂眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、百日咳博德特氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、白喉棒桿菌、結核分枝桿菌、貪食分支桿菌、胞內分支桿菌複合體、奇異變形菌、普通變形菌、金黃色葡萄球菌、破傷風梭菌、問號鉤端螺旋體、布氏疏螺旋體、溶血巴斯德氏菌、多殺巴斯德氏菌、大葉性肺炎放線桿菌和雞敗血枝原體。
含有本發明佐劑組合的所需抗真菌病原體疫苗包括目的是預防和/或治療下列真菌引起的疾病的那些疫苗，這些真菌包括但不局限於，麴黴、芽酵母、假絲酵母、球孢子菌(Coccidiodes)、隱球菌和組織漿菌。
含有本發明佐劑組合的所需抗寄生蟲疫苗包括目的是預防和/或治療下列寄生蟲引起的疾病的那些疫苗，這些寄生蟲包括但不局限於，Leishmania major、蛔蟲、Trichuris、Giardia、Schistosoma、Cryptosporidium、Trichomonas、Toxoplasma gondii和、Pneumocystis carinii。
含有本發明佐劑組合的引發脊椎動物宿主治療性或預防性抗癌作用的所需疫苗包括採用癌抗原或腫瘤相關抗原的那些疫苗，這些抗原包括但不局限於，前列腺特異性抗原、癌胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125和MAGE-3。
含有本發明佐劑組合的緩和脊椎動物宿主對變應原應答反應的所需疫苗包括含有變應原或其片段的那些。這些變應原的例子在美國專利5,830,877(45)和出版的國際專利申請WO99/51259(46)中有所描述，這些出版物均納入本文作為參考，包括花粉、昆蟲毒液、動物鱗屑、真菌孢子和藥物(如青黴素)。該疫苗幹擾IgE抗體(變態性應答反應的已知病因)的產生。
含有本發明佐劑組合的預防或治療脊椎動物宿主以澱粉樣沉積為特徵的疾病的所需疫苗包括含有澱粉樣肽蛋白(APP)部分的那些疫苗。該疾病另外被稱為阿爾茨海默疾病、澱粉樣變性或致澱粉樣(amyloidogenic)疾病。β-澱粉樣肽(也稱為Aβ肽)是APP的42個胺基酸的片段，它通過β和γ分泌酶加工APP而產生，並具有下列序列Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn LysGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NOl0).
在一些患者中，澱粉樣沉積採用聚集Aβ肽的形式。令人驚奇的是，已經發現分離的Aβ肽的給予誘導了脊椎動物宿主中抵抗澱粉樣沉積的Aβ肽成分的免疫應答反應。因此，本發明的疫苗包括本發明的佐劑組合再加上Aβ肽，以及Aβ肽的片段和針對Aβ肽或其片段的抗體。一個Aβ肽的片段是具有下列序列的28個胺基酸的肽(48)Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His HisGln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ ID NO11).
在HIV和SIV的情況下，抗原性組合物包含至少一種蛋白質或衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。在一些情況下，抗原性組合物中可包括多個HIV或SIV蛋白質、多肽、肽和/或片段。
本發明的佐劑組合製劑(配方)還適合作為多核苷酸疫苗(也稱為DNA疫苗)的佐劑。這些疫苗可進一步包括促進劑如布匹卡因(bupivicaine)(見美國專利5,593,972(49)，納入本文作為參考)。
為了更好地了解本發明，列舉了下列實施例。這些實施例僅僅是為了描述，而不應理解成限制了本發明的範圍。
實施例實驗1用HIV肽和各種佐劑免疫接種Balb/c小鼠實施例1材料和方法動物7-9周齡的雌性Balb/c小鼠購自Taconic Farms，Inc.(Germantown，NY)。所有小鼠均飼養在美國實驗室動物飼養鑑定協會批准的設施中。在開始研究之前，使小鼠適應飼養設施1周。
肽多表位HIV-1-MN肽T1SP10MN(A)(-Cys)的序列如下Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO2).該肽在以前已有描述(28，29)，它含有在小鼠和人中均引起CD4+Th細胞應答反應的HIV-1 gp120MN的序列(主要的中和決定簇)以及被Balb/c小鼠CD8+CTL識別的位點。該肽由R.Scearce博士(Duke University，Durham，NC)提供。對於CTL分析，對應於HIV-1-IlID的V3環中的CTL表位的肽(Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile(SEQ IDNO12)，H-2Dd限制性)或HIV-1-MN(Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr(SEQ IDNO13)，H-2Dd限制性)購自Denosys Biotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)。將肽溶解在無菌水中，在使用前用合適的緩衝液或細胞培養液稀釋。
佐劑所有含MPLTM的佐劑製劑從Ribi ImmunoChem Research，Inc.(Hamilton，MT)獲得。MPLTM用三乙醇胺(Sigma，St.Louis，MO)製成水性製劑。溶解後，按照生產商說明書對MPLTM進行超聲處理，產生一乳光/澄清溶液，作無菌過濾。MPLTMSE以預先配製的鯊烯基水包油(1-2％的油)乳液形式提供，其中MPLTM的濃度在0-2500微克/毫升之間。磷酸鋁由自己製得。Freund完全佐劑(CFA)和不完全佐劑(IFA)購自DifcoLaboratories，Detroit，MI。T1SPl0MN(A)肽和Freund佐劑用兩個連接的注射器以1∶1的比例乳化。重組表達的鼠IL-12由Genetics Institute(Cambridge，MA)提供。重組鼠GM-CSF由Immunex(Seattle，WA)、RD Systems(Minneapolis，MN)提供，或以無載體凍乾粉末形式購自Biosource International(Camarillo，CA)。
免疫接種在小鼠臀部進行皮下免疫，總體積為0.2毫升，等量分在尾部的每一側。在下述不同時間間隔處進行免疫。將抗原和細胞因子稀釋在磷酸緩衝鹽溶液中至合適的濃度，在免疫前16小時以內在無菌條件下配以佐劑。輕輕攪動混合疫苗，4℃下保藏。在臨免疫時，渦流混合該製劑。
樣品收集在初次免疫前以及所示時間點取動物血液。分析各小鼠的血清或同組小鼠的合併物。對安樂死的小鼠上進行陰道灌洗，評價抗體水平。這用下述方式來進行用200∶1移液管將75∶1 RPMI-10滴注入雌小鼠的陰道穹隆中。反覆輸送和取出液體來洗滌該穹隆，然後加入10∶1的FBS。分析陰道灌洗合併液。
細胞製備對於增殖試驗和體外細胞因子分析，在所示時間點獲得小鼠的脾細胞。從3-5隻小鼠的合併物製得單細胞懸浮液(如結果所示)。對於增殖和細胞因子分析，將細胞懸浮在96孔圓底培養板中，孔內預先用HIV肽抗原、對照蛋白或僅僅RPMI-10包被過夜。利用具有2x補充物的培養液以5×105細胞/孔的密度加入脾細胞。在培養開始後3天或6天，收穫一式三孔細胞培養上清進行細胞因子分析。緊接收穫上清後，培養中加入3H-胸苷脈衝18-24小時，收穫以定量測定細胞增殖。
酶聯免疫吸附試驗為了分析HIV肽特異性抗體和亞類的分布，將該肽以1微克/毫升的濃度懸浮在碳酸鹽緩衝液(15mM碳酸鈉、35mM碳酸氫鈉、pH 9.6)或PBS中，以100∶1(微升)的體積接種到96孔微量滴定板(Nunc)中。37℃培育過夜後，洗滌該板，室溫下封閉(0.1％明膠/PBS)2-4小時。用洗滌緩衝液(PBS，0.1％TweenTM20)洗滌ELISA板，然後加入連續稀釋的血清(PBS，0.1％明膠，0.05％TweenTM20，0.02％疊氮鈉)。培育4小時後，洗滌各孔，加入生物素化抗同種型/亞類抗體的合適稀釋液，4℃培育過夜。洗滌各孔，與鏈親和素偶聯的辣根過氧化物酶一起培育。培育後，洗滌各孔，用ABTS顯色。在405nm下讀各孔。用對照血清將滴度標準化。
對於細胞因子分析，將細胞培養上清加入經BVD6-11B11(用於抗IL-4)或R4-6A2(用於γ-幹擾素)包被的孔中。培育和洗滌後，用生物素標記的BVD6-24G2(用於IL-4)或XMG1.2(用於γ-幹擾素)使各孔顯色。用從重組鼠γ-幹擾素或自介素-4得到的標準曲線測定細胞因子濃度。所有細胞因子試劑購自Pharmingen(San Diego，CA)。
HIV-1MN中和試驗中和試驗在Duke大學Thomas Matthews博士的實驗室中進行。試驗基本上如前(25)所述那樣進行。簡言之，將測試血清的稀釋液等分在96孔微量滴定板的孔中(25∶1/孔)。在各孔內加入等體積的連續稀釋的病毒原液。培育後，將病毒/抗體混合物加入AA5靶細胞中。將細胞培養在96孔微量滴定板中，每隔一天加入新鮮的培養液。感染7天後，測定上清中病毒逆轉錄酶的存在作為病毒複製、成功感染或抑制的指標。
實施例2抗T1SP10MN(A)IgG終點滴度的倒數在初次免疫後的所示時間點測定合併血清(n＝5Balb/c)的抗HIV肽特異性IgG終點滴度的倒數。在第0天和第27天用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)對小鼠臀部作皮下免疫，除非另有描述。對於Freund佐劑接受者，用CFA乳化的肽使小鼠接觸抗原，用IFA加強。MPLTMSE以含2％鯊烯油的乳液形式提供，每劑50微克MPLTM。SE是由鯊烯、甘油和乳化劑組成的水包油乳液載體。重組鼠IL-12以50毫微克/小鼠的劑量給予。重組鼠GM-CSF以10微克/小鼠的劑量給予。結果顯示在表1中。
表1抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數終點滴度佐劑 微克HIV肽 第4周 第6周第8周無 25 ＜100 ＜100＜100CFA/IFA25 23,998 137,683 313,200rIL-12 25 ＜100 ＜100＜100GM-CSF 25 ＜100 17,579 12,537SE 25 ＜100 171,923 76,479MPLTMSE 25 ＜100 104,331 79,021MPLTMSE+ 25 ＜100 1,313,330631,688rIL-12MPLTMSE+ 25 14,824 ＞10,000,000 3,752,870GM-CSF實施例3抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點亞類滴度的倒數測定初次免疫後6周、第二次免疫後2周的合併血清(n＝5 Balb/c)的IgG亞類終點滴度的倒數。用25微克肽對小鼠臀部作皮下免疫，除非另有描述。對於Freund佐劑的接受者，使小鼠接觸完全Freund佐劑乳化的肽，第4周和第6周用不完全Freund佐劑加強。MPLTMSE以含2％鯊烯油的乳液形式提供，每劑50微克MPLTM。SE是由鯊烯、甘油和乳化劑組成的水包油乳液載體。重組鼠IL-12以50毫微克/小鼠的劑量給予。重組鼠GM-CSF以10微克/小鼠的劑量給予。結果顯示在表2中。
表2抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG亞類終點滴度的倒數終點滴度佐劑 微克HIV肽 IgG1 IgG2a IgG2b無25 ＜100 ＜100 ＜100
CFA/IFA 25 29,907 143 798rIL-12(.05) 25 ＜100 ＜100 ＜100GM-CSF(10)25 1,78 3＜100＜100SE(2％) 25 74,293 ＜100 3,331MPLTM(50)SE(2％) 25 11,441 10,1765,280MPLTM(50)SE(2％) 25 169,27827,1612,303+rIL-12(.05)MPLTM(50)SE(2％) 25 3,494,862 954,707 245,828+GM-CSF(10)實施例4陰道灌洗液的IgG和IgA抗T1SP10MN(A)(-Cys)抗體滴度測定首次免疫後兩周獲得的陰道灌洗液的IgG和IgA抗肽抗體滴度。在第0、28和42天，用25微克T1 SP10MN(A)(-Cys)和所示佐劑製劑對每組5隻Balb/c雌小鼠進行免疫。測定合併的灌洗液陰道抗體滴度。結果顯示在表3中。
表3陰道灌洗液IgG和IgA抗T1SP10MN(A)(-Cys)抗體滴度佐劑 IgG IgA＜20 ＜20無CFA/IFA 20＜20rIL-12(.05) ＜20 ＜20GM-CSF(10) ＜20 ＜20MPLTM(50)SE(2％)＜20 ＜20MPLTM(50)SE(2％)+ 24＜20rIL-12(.05)MPLTM(50)SE(2％)+ 1,125 113GM-CSF(10)SE(2％) ＜20 ＜20實施例5脾細胞增殖測定用T1SP10MN(A)(-Cys)和不同佐劑製劑免疫的小鼠脾細胞的增殖。在第0和28天，用25微克T1SP10MN(A)(-Cys)和所示佐劑對每組5隻Balb/c雌小鼠進行免疫。第56天建立脾細胞培養物，收穫以測定96小時後3H-胸苷摻入。用以水性製劑或含2％SE的穩定乳液中的50毫微克IL-12、10微克GM-CSF和50微克MPLTM免疫小鼠。數據表示成與無刺激時培養生長的細胞所測得的增殖值相比的Δcpm值。本底刺激計數小於800cpm。結果列在表4中。
表4脾細胞增殖
實施例6脾細胞的IL-4分泌測定經25微克T1SP10MN(A)(-Cys)刺激的脾細胞分泌到培養液中的白介素-4。從5隻Balb/c雌小鼠合併收穫脾細胞，並和所示的抗原性刺激物(所示的50毫微克IL-12、10微克GM-CSF、50微克MPLTM)一起培育3天或6天。用ELISA測定白介素-4的水平，並與具有已知濃度的標準品比較。空白孔表明試驗不能在那些培養條件下檢測到白介素-4。檢測靈敏度的下限為22單位/毫升。結果列在表5中。
表5脾細胞的IL-4分泌三天培養物
表5(續)脾細胞的IL-4分泌六天培養物
實施例7脾細胞的γ-幹擾素分泌測定經25微克T1SPl0MN(A)(-Cys)刺激的脾細胞分泌到培養物中的γ-幹擾素。從5隻Balb/c雌小鼠合併收穫脾細胞，並和所示的抗原性刺激物(與實施例6相同)一起培育3天或6天。用ELISA測定γ-幹擾素的水平，並與具有已知濃度的標準品比較。空白孔表明試驗不能在那些培養條件下檢測到γ-幹擾素。檢測靈敏度的下限為4皮克/毫升。結果列在表6中。
表6脾細胞的γ-幹擾素分泌三天培養物
表6(續)脾細胞的γ-幹擾素分泌六天培養物
試驗2用HIV肽和不同佐劑免疫Balb/c小鼠實施例8材料和方法動物採用上述實施例1中的7-9周齡的Balb/c雌小鼠。
肽採用實施例1中描述的HIV-1-MN肽T1SP10MN(A)。使該肽在鹽水中重新水化至濃度為1毫克/毫升。
佐劑所用佐劑如實施例1所述，只是在一些情況下保持MPLTM為水性製劑的形式，而不是採用穩定乳液形式。
免疫接種在小鼠臀部進行皮下免疫，總體積為0.2毫升，等量分在尾部的每一側。在第0天和第21天用25微克HIV肽以及所示量的佐劑進行免疫。接受CFA/IFA的小鼠在第0天接受CFA，在第21天接受IFA。稀釋和混合如實施例1所述。
樣品收集根據實施例1的程序，在每次免疫前1天和第二次免疫後14天收集動物樣品。
細胞製備細胞製備物的產生和操作按照實施例1的程序。
酶聯免疫吸附試驗根據實施例1的程序進行ELISA。
HIV-1MN中和試驗同樣，根據實施例1的程序，在Duke大學進行中和試驗。
實施例9抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數從第二次免疫後14天獲得的個別小鼠的幾何平均值(GMT)或合併的血清(n＝5Balb/c)測定抗肽IgG終點滴度的的倒數。另外還測定了合併血清的IgG1和IgG2a亞類終點滴度。對於Freund佐劑的接受者，使小鼠接觸以CFA乳化的25微克肽，然後用IFA加強。MPLTMSE以含1％鯊烯油的乳液形式提供，每劑50微克MPLTM。水性MPLTM以每劑50微克的量輸送。重組鼠IL-12以40毫微克/小鼠的劑量給予。重組鼠GM-CSF以10微克/小鼠的劑量給予。結果顯示在表7中。
表7抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數終點滴度佐劑 IgG IgG IgG1IgG2a(微克/劑) (合併物)(GMT) (合併物)(合併物)無＜1000 720 ＜1000 ＜1000CCFA/IFA 72,387 135,740 126,433 9,023MPLTMSE 183,802 197,808 162,480 98,342SE2,426 6,029 1,859 ＜1000MPLTMSE+148,139 133,171 103,298 50,415GM-CSFMPLTMSE+182,852 611,076 6,610 111,662rIL-12GM-CSF27,333 1,756 14,538 4,864rIL-12＜1000 500 ＜11000 ＜1000MPLTM219,705 241,918 134,428 7,127MPLTM+ 946,695 1,101,449 545,444 12,291GM-CSFMPLTM+ 377,972 2,378,702 204,334 12,795rIL-12實施例10抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG亞類終點滴度的倒數從第二次免疫後15天獲得合併血清(n＝5Balb/c)測定HIV肽特異性陰道灌洗液IgG和IgA抗體終點滴度的倒數。小鼠如實施例9那樣進行免疫。MPLTMSE以含1％鯊烯油的乳液形式提供，每劑50微克MPLTM。水性MPLTM以每劑50微克的量輸送。重組鼠IL-12以40毫微克/小鼠的劑量給予。重組鼠GM-CSF以10微克/小鼠的劑量給予。結果顯示在表8中。
表8抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG和IgA終點滴度的倒數終點滴度佐劑IgG IgA無 ＜10＜10CFA/IFA ＜10＜10MPLTMSE(1％) 32 ＜10SE ＜10＜10MPLTMSE(1％)+ 129 ＜10GM-CSFMPLTMSE(1％)+40 ＜10IL-12GM-CSF 26 ＜10rIL-12 ＜10＜10MPLTM＜10＜10MPLTM+GM-CSF ＜10＜10MPLTM+IL-12260 197實施例11脾細胞增殖測定對T1SP10MN(A)(-Cys)和不同佐劑製劑(與實施例10相同)體外刺激的反應中脾細胞的增殖。培養細胞總共96小時。在最後18小時在培養物中加入3H-胸苷。數據表示成根據在培養中用ConA刺激的細胞標準化的增殖指數([抗原平均cpm/ConA平均cpm]-[培養液平均cpm/ConA平均cpm])×100。結果，培養液中培養細胞的本底增殖為0。結果顯示在表9中。低於未受刺激培養生長細胞的增殖數值寫在括號內。
表9脾細胞增殖
實施例12脾細胞的IL-4分泌測定用T1SP10MN(A)(-Cys)刺激的脾細胞分泌到培養物中的白介素-4。培養細胞總共96小時。用ELISA分析細胞培養上清的IL-4。所有數值是減去經10微克無關蛋白(溶菌酶)刺激的細胞上清所測得的數值後的數值。結果以pg/ml為單位列在表10中。在減去用溶菌酶誘導的刺激後，結果低於檢測下限的用「bd」表示。佐劑是40毫微克IL-12、10微克GM-CSF和50微克MPLTM。
表10
實施例13脾細胞的γ-幹擾素分泌測定經T1SP10MN(A)(-Cys)刺激的脾細胞分泌到培養物中的γ-幹擾素。培養細胞總共96小時。用ELISA分析細胞培養上清的γ-幹擾素。所有數值是減去經10微克溶菌酶刺激的細胞上清所測得的數值後的數值。結果以pg/ml為單位列在表11中。在減去用溶菌酶誘導的刺激後，結果低於檢測下限的用「bd」表示。佐劑與實施例12中的相同。
表11
實驗3用HIV肽和各種佐劑免疫Swiss-Webster小鼠採用實驗2的程序，用Swiss-Webster小鼠代替Balb/c小鼠。在本實驗中，只測定了抗肽IgG終點滴度和陰道灌洗液IgG和IgA抗體終點滴度的倒數。
實施例14抗HIV肽IgG終點滴度的倒數從第二次免疫後14天獲得的個別小鼠的幾何平均值(GMT)測得抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數。另外還測定了合併血清的IgG1和IgG2a亞類的終點滴度。對於Freund佐劑的接受者，使小鼠接觸以CFA乳化的肽，然後用IFA加強。MPLTMSE以含1％鯊烯油的乳液形式提供，每劑50微克MPLTM。水性MPLTM以每劑50微克的量輸送。重組鼠IL-12以40毫微克/小鼠的劑量給予。重組鼠GM-CSF以10微克/小鼠的劑量給予。結果顯示在表12中。
表12抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數終點滴度佐劑 IgGIgG1 IgG2a(GMT) (合併物) (合併物)無500＜1000＜1000CFA/IFA 9,038 62,35854,053MPLTMSE 15,831 3,835 8,872SE625＜1000＜1000MPLTMSE+GM- 1,374 ＜10001,328CSFMPLTMSE+ 6,142 ＜10002,170rIL-12GM-CSF500＜1000＜1000rIL-12500＜1000＜1000MPLTM1,960 ＜1000＜1000MPLTM+GM-CSF 58,211 35,72437,959MPLTM+rIL-12 5,489 8,53517,769實施例15抗HIV肽IgG亞類終點滴度的倒數從第二次免疫後15天的合併血清(n＝5 Swiss-Webster)測定陰道灌洗液HIV肽特異性IgG和IgA抗體終點滴度的倒數。小鼠如實施例14所述那樣進行免疫。MPLTMSE以每劑含1％鯊烯油和50微克MPLTM的乳液形式提供。水性MPLTM以每劑50微克的量輸送。重組鼠IL-12以40毫微克/小鼠的劑量給予。重組鼠GM-CSF以10微克/小鼠的劑量給予。結果顯示在表13中。
表13抗HIV肽IgG和IgA終點滴度的倒數終點滴度佐劑 IgG IgA無＜10 ＜10CFA/IFA 118 ＜10MPLTMSE(1％)＜10 ＜10SE＜10 ＜10MPLTMSE(1％)+ ＜10 ＜10GM-CSFMPLTMSE(1％)+ ＜10 ＜10IL-12GM-CSF＜10 ＜10rIL-12＜10 ＜10MPLTM＜10 ＜10MPLTM+GM-CSF 25 ＜10MPLTM+IL-12 ＜10 ＜10實驗4用HIV肽和各種佐劑免疫Balb/c小鼠採用實驗2的程序，只是在第0天和第28天對小鼠進行免疫，在第0天、第27天和第41天取血進行血清學評價。CFA/IFA是第0天配以CFA、第28天配以IFA。MPLTMSE用50微克MPLTM和2％SE配製，並採用50毫微克IL-12和10微克GM-CSF。
實施例16抗HIV肽IgG終點滴度的倒數在初次免疫41天後、即第二次免疫13天後測定各小鼠的抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數及其幾何平均值(n＝5 Balb/c)。結果列在表14中。第0天的各鼠滴度均低於50。「[無數據]」意味著動物在該程序結束前死亡。「SD」表示標準偏差。
實施例17抗BIH肽IgG亞類終點滴度的倒數在初次免疫41天後、即第二次免疫13天後測定合併血清(n＝5Balb/c)的抗肽IgG亞類終點滴度的倒數。結果列在表15中。
表15抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG亞類終點滴度的倒數終點滴度佐劑 IgG1 IgG2aIgG2bCFA/IFA 359,238122,107 155,877IL-12 ＜100 ＜100＜100GM-CSF5,514 ＜100＜100SE5,011 ＜100＜100SE+IL-12 7,331 ＜100＜100SE+GM-CSF 67,111 ＜100＜100MPLTM33,544 212 ＜100MPLTM+IL-12 608,1636,019＜100MPLTM+GM-CSF 114,9598,000＜100MPLTMSE 142,40429,141 1,564MPLTMSE+IL-12 164,86634,439 558MPLTMSE+GM-CSF 274,24133,843 29,965實施例18陰道灌洗液IgG和IgA抗HIV肽抗體滴度在初次免疫41天後、即第二次免疫13天後測定陰道灌洗液的IgG和IgA抗肽抗體滴度。結果列在表16中。
表16陰道灌洗液IgG和IgA抗T1SP10MN(A)(-Cys)抗體滴度佐劑 IgG IgACFA/IFA 464 13IL-12 ＜10 ＜10GM-CSF＜10 ＜10SE＜10 ＜10SE+IL-12 ＜10 ＜10SE+GM-CSF 32 14MPLTM12 ＜10MPLTM+IL-12 643 44MPLTM+GM-CSF 211 65MPLTMSE 153 16MPLTMSE+IL-12 88 30MPLTMSE+GM-CSF 190 53實施例19脾細胞增殖測定用T1SP10MN(A)(-Cys)和不同佐劑製劑免疫的小鼠的脾細胞增殖。脾細胞用3.3微克/毫升T1SP10MN(A)(-Cys)體外刺激四天。結果顯示在圖4中，表示成3.3微克/毫升T1SP10MN(A)(-Cys)體外刺激所引起的標記胸苷的摻入相對於無刺激時摻入的變化(Δcpm)。
實驗5用HIV肽和各種佐劑免疫Balb/c小鼠按照實驗2的程序，只是在第0天和第22天對小鼠作皮下免疫，在第42天取血作血清學評價。MPLTMSE用50微克MPLTM和1％SE配製，同時採用10微克GM-CSF。
實施例20抗HIV肽IgG終點滴度的倒數在初次免疫後42天、即第二次免疫後13天測定合併血清(n＝5Balb/c)的抗肽IgG亞類終點滴度的倒數。另外測定了IgG的幾何平均值和標準偏差。結果列在表17中。
表17抗T1SP10MN(A)(-Cys)IgG終點滴度的倒數
實驗6用HIV肽和各種佐劑免疫Balb/c小鼠按照實驗2的程序，只是HIV肽的胺基酸17位含有半胱氨酸，在第0天和第21天對小鼠(n＝3Balb/c)進行皮下免疫，在第-1天(初次免疫前一天)、第13天、第20天和第28天取血作血清學評價。用50微克MPLTM和1％SE配製MPLTMSE，同時採用10微克GM-CSF。HIV肽T1SP10MN(A)(+Cys)(26)的胺基酸17位有半胱氨酸，長度為40個殘基。T1SP10MN(A)(+Cys)購自Genosys Biotechnologies(The Woodlands，TX)。
實施例21T1SP10MN(A)IgG終點滴度的倒數在初次免疫後28天，測定各小鼠的抗T1SP10MN(A)IgG終點滴度及其幾何平均值(n＝3 Balb/c)的倒數。結果列在表18中。
表18MPLTMSE+GM-CSF對針對HIV肽(+Cys)的IgG應答的影響
實驗7用HIV肽和各種佐劑免疫Balb/c小鼠按照實驗6的程序，只是在第0天和第32天對小鼠(n＝3Balb/c)作皮下免疫，在第38天取血作血清學評價。MPLTMSE用50微克MPLTM和1％SE配製，同時採用10微克GM-CSF。
實施例22抗HIV肽IgG終點滴度的倒數在初次免疫後38天，測定個別小鼠的抗T1SP10MN(A)(+Cys)IgG終點滴度及其幾何平均值(n＝3Balb/c)的倒數。結果列在表19中。
表19MPTMSE+GM-CSF對針對HIV肽(+Cys)的IgG應答的影響
實驗8Balb/c小鼠的CTL分析有關小鼠的免疫接種，根據實驗6的程序。測定第二次免疫7天後分離出的脾細胞的CTL活性。MPLTMSE用50微克MPLTM和1％SE配製，含有或不含10微克GM-CSF，再加上50微克T1SP10MN(A)(+Cys)。
實施例23Balb/c小鼠的CTL分析對於CTL分析，從初次免疫後14天和第二次免疫後7天的小鼠中取出脾細胞。基本上按照以前已有描述的程序(34)。簡言之，將每組3隻小鼠的去除紅細胞的脾細胞合併。在24孔培養板中以1.5-2毫升體積，用1微克/毫升「MN」或「IIIB」10聚CTL表位肽重新刺激脾效應細胞(4×106/毫升)7天。兩種CTL表位均局限於H-2Dd。在培養的最後5天，在培養物中添加10單位/毫升的重組鼠IL-2(Biosource)。為了分析細胞毒性活性，用51Cr標記P815細胞，用5微克/毫升肽(IIIB或MN)脈衝培養4小時，然後加入所培養的脾效應細胞中。效靶細胞之比採用三倍稀釋，從100∶1到3.7∶1。用((特異性鉻釋放-自發鉻釋放)/(最大鉻釋放-自發鉻釋放))×100計算出鉻釋放百分數作為CTL活性百分數。培育6小時後，測定鉻釋放。自發鉻釋放的平均值始終低於最大釋放的15％。第28天的數據結果顯示在圖5中。
實驗9用各種SIV肽和佐劑免疫獼猴測試MPLTMSE和GM-CSF佐劑製劑在獼猴(Macaca mulatta)中誘導抗原特異性CTL的能力。在本試驗中，在Duke大學Barton Haynes博士實驗室裡，將佐劑配方和三價肽免疫原一起測試，該免疫原由含有或不含SIV env的混雜的T輔助細胞表位的三個分開的Mamu A*01限制性CTL表位(各分別來自gag，pol和env，各用化學方法合成)組成。
含有Mamu A*01限制性CTL表位的肽如下Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID NO3)(gag)Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SR ID NO4)(pol)Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID NO5)(env)每個含有這些CTL的表位另與具有下列序列的T輔助細胞表位相連Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala (SEQ ID NO6)
因此，三個多表位肽具有以下序列Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Aap Ile Asn GlnMet (SEQ IDNO7)Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg LeuVal (SEQ ID NO8)Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu GlyVal Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly GlnIle (SEQ ID NO9)在Harvard醫學院Norman Letvin博士的實驗室裡，用Mamu A*01限制性四聚體染色分析來進行CTL分析。
動物、劑量和免疫原用PCR鑑定表達HLA-A同源分子Mamu A*01和亞型DRβ0201的獼猴，在NewIberia，LA群體飼養。
研究包括如表20所述的三組、每組兩隻新生獼猴(Macaca mulatta)。第1組由兩隻Mamu A*01陽性、DRβ0201陰性動物Rh 73和Rh 80組成。將三價Mamu A*01限制性SIV gag、env和pol CTL表位肽(短肽混合物)和MPLTMSE以及GM-CSF一起給予這些動物。第2組由兩隻Mamu A*01陽性、DRβ0201陽性獼猴組成，它們接受TMSIV CTL gag、pol和env表位肽(長肽混合物)，以及MPLTMSE和GM-CSF。第3組由兩隻Mamu A*01陰性、DRβ0201陽性動物組成，接種用Th/SIVCTL gag，pol和env肽(長肽混合物)。表20根據所用的HLA類型和肽免疫原列出了各組。
表20動物、劑量和免疫原
所有組在第0、4和8周用1毫升各肽混合物佐以含50微克MPLTMSE的1％油和250微克人GM-CSF皮下免疫接種。對於18周的免疫，將MPLTMSE劑量增加至含125微克的1％油。對於所有組，將2.4毫克各長肽和0.75毫克各短肽溶解在900微升蒸餾的去離子水中。然後，用該肽溶液來重溶解人GM-CSF，加入100微升MPLTMSE製劑。
實施例24獼猴的CTL分析每隔兩周取動物血，在新鮮的和培養的外周血單核細胞(PBMC)上通過四聚體染色分析肝素化血液的Mamu A*01限制性CTL(50)。在第0天用p11c，p68A，p41A或p46刺激PBMC，然後在IL-2存在下培養，在第11天分析。另外在培養的PBMC上進行標準的51Cr釋放試驗(50)。
如下進行四聚體試驗在β2微球蛋白存在下，使gag的表位肽p11c、pol的表位肽p68A或enV的表位肽p41A與純化的生物素化的Mamu A*01一起培育，然後與親和素相連，與PE(藻紅蛋白)偶聯。然後用該四聚體來染色具有能識別p11c、p68A或p41A表位的T細胞受體的獼猴CD8+細胞。在優勢env p46表位周圍摺疊的不同的DRβ0201四聚體使得特異性識別p46 Th表位的CD4+細胞被染色。結果顯示在表21-24中。
表21P11c/SIVgag四聚體陽性CD8+細胞百分數
表22p68A/SIV CTL pol四聚體陽性CD8+細胞百分數
表23P41A/SIV env四聚體陽性CD8+細胞百分數
表24p46/SIV T輔助細胞等人β0201四聚體陽性CD4+細胞百分數
實驗10用淋病奈瑟氏球菌膜孔蛋白B蛋白和各種佐劑免疫Swiss-Webster小鼠將遠交的Swiss-Webster小鼠分成5組，每組10隻小鼠。每組接種1微克重組膜孔蛋白B蛋白(來自菌株FA1090，氨基端的16個胺基酸來自噬菌體，隨後是成熟形式的膜孔蛋白B蛋白)。第一組不接種佐劑；第二組接種50微克MPLTM；第三組接種25微克MPLTM加5微克GM-CSF；第四組接種25微克MPLTMSE；第五組接種MPLTMSE加5微克GM-CSF。小鼠臀部皮下接種0.2毫升總體積，於尾部/臀基部兩個部位平分。第0和第4周進行免疫。
實施例25抗膜孔蛋白B蛋白IgG亞類終點滴度的倒數每次免疫前以及末次免疫後13天取小鼠血液。分析同組小鼠合併血清。第3周和第6周測定陰道灌洗合併血清(n＝10 Swiss-Webster)的抗膜孔蛋白B蛋白IgG亞類的終點滴度的倒數。結果列在表25中。所有組免疫前0天的滴度均小於50。
表25抗膜孔蛋白B蛋白IgG亞類終點滴度的倒數
還測定了第6周各只小鼠抗重組膜孔蛋白B蛋白的IgG滴度幾何平均值。結果列在表26中。
表26
實驗11用淋病奈瑟氏球菌膜孔蛋白B蛋白和各種佐劑免疫Swiss-Webster小鼠將遠交的Swiss-Webster小鼠分成6組，每組5隻。每組接種1微克重組膜孔蛋白B蛋白(來自菌株FA1090，氨基端的16個胺基酸來自噬菌體，隨後是成熟形式的膜孔蛋白B蛋白)。第一組不接種佐劑(蛋白用PBS配製)；第二組接種40毫微克IL-12；第三組接種50微克MPLTM；第四組接種MPLTM加40毫微克IL-12；第五組接種25微克MPLTMSE；第六組接種MPLTMSE加40毫微克IL-12。小鼠臀部皮下接種0.2毫升總體積。在第0和第4周進行免疫。
實施例26抗膜孔蛋白B蛋白IgG亞類終點滴度和陰道灌洗IgG和IgA滴度的倒數在每次免疫前以及末次免疫後13天取小鼠血液。分析同組小鼠合併血清。第3周和第6周測定陰道灌洗合併血清(n＝5 Swiss-Webster)的抗膜孔蛋白B蛋白IgG亞類的終點滴度的倒數，以及陰道灌洗液IgG和IgA滴度的倒數。結果列在表27中。所有組免疫前0天的滴度均小於50。陰道灌洗分析的起始稀釋度為1/5。
表27抗膜孔蛋白B蛋白IgG亞類終點滴度和陰道灌洗液IgG和IgA滴度的倒數
實驗12用呼吸道合胞病毒F蛋白和各種佐劑免疫Balb/c小鼠將Balb/c小鼠分成7組，每組5隻小鼠。每組接種3微克純化的天然的人呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白(二聚體形式)。第一組不接種佐劑(蛋白用PBS配製)；第二組接種100微克磷酸鋁(alum)；第三組接種20微克StimulonTMQS-21(AquilaBiopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)；第四組接種50微克MPLTM；第五組接種MPLTM加5微克GM-CSF；第六組接種25微克MPLTMSE；第七組接種MPLTMSE加5微克GM-CSF。用0.2毫升的總體積對小鼠大腿作肌內免疫。在第0周和第4周進行免疫。
實施例27抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數每次免疫前以及末次免疫後13天取小鼠血液。分析同組小鼠合併血清。測定合併血清(n＝5 Balb/c)的抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數。結果列在表28中。所有組免疫前0天的滴度均小於50。
表28抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數
實施例28脾細胞增殖測定對2.5微克/毫升RSV F蛋白和各種佐劑(與實施例27相同)的體外刺激起反應中脾細胞的增殖。在第二次免疫後14天收穫脾細胞，以5×105細胞的密度進行培養。培養該細胞總共96小時。在最後18小時，在培養物中加入3H-胸苷。數據表示為增殖指數，按照用ConA刺激的培養細胞進行標準化([抗原平均cpm/ConA平均cpm]-[培養液平均cpm/ConA平均cpm])×100。結果，在培養液中培養的細胞的本底增殖為0。結果顯示在表29中。
表29脾細胞增殖佐劑 標準化的增殖指數無18.1Alum 13.1StimulonTMQS-21 0.8MPLTM0.4MPLTM+GM-CSF 20.0MPLTMSE 17.8MPLTMSE GM-CSF 16.3實驗13用呼吸道合胞病毒F蛋白和各種佐劑免疫Balb/c小鼠重複實驗12的程序，第0周和第4周用含有或不含各種佐劑的RSVF蛋白免疫。
實施例29抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數每次免疫前以及最終末次後13天取小鼠血液。分析同組小鼠合併血清。測定合併血清(n＝5Balb/c)的抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數。結果列在表30中。所有組免疫前0天的滴度均小於50。
表30抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數
實施例30脾細胞CTL活性在末次免疫後兩周，評價作為用RSV F蛋白和所示佐劑免疫接種結果的脾細胞CTL(細胞毒性T-淋巴細胞)活性。數據表示與RSV感染的靶細胞一起培養(效應細胞與靶細胞之比為33∶1)的脾細胞的特異性CTL活性百分數。特異性CTL活性百分數如實施例24所述那樣測定，從對RSV感染靶細胞的特異性活性中減去對未感染靶細胞CTL活性。用RSV以1.5的感染複數(MOI)感染原初脾細胞2小時，作為體外刺激細胞的來源。將免疫接種小鼠脾臟的反應細胞以5∶1的比例加入刺激細胞中，培養6天。在第5天，用RSV以10的感染複數感染靶細胞(Balb/c MHC-H-2d細胞系)2小時，培育過夜。在第6天，收穫感染的和未感染的靶細胞，加入51Cr。然後在體外在靶細胞中加入效應細胞(效靶比範圍為100∶1至3∶1)。培養4小時後測定鉻釋放。結果列在表31中。
表31脾細胞CTL活性佐劑 CTL活性百分數無1Alum 4StimulonTMQS-2 153MPLTM6MPLTM+GM-CSF 15MPLTMSE 30MPLTMSE GM-CSF 36實驗14用呼吸道合胞病毒F蛋白和各種佐劑免疫Balb/c小鼠將Balb/c小鼠分成6組，每組5隻小鼠。每組接種3微克純化的天然的RSVF蛋白(二聚體形式)。第一組不接種佐劑(蛋白用PBS配製)；第二組接種40毫微克IL-12；第三組接種50微克MPLTM；第四組接種MPLTM加40毫微克IL-12；第五組接種25微克MPLTMSE；第六組接種MPLTMSE加40毫微克IL-12。用0.2毫升的總體積對小鼠臀部作皮下免疫，平均分成兩劑在尾部每側給予。在第0周和第4周進行免疫。
實施例31抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數每次免疫前以及末次免疫後13天取小鼠血液。分析同組小鼠合併血清。測定合併血清(n＝5Balb/c)的抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數。結果列在表32中。所有免疫前0天的滴度均小於50。
表32抗RSV F蛋白IgG亞類終點滴度的倒數
實施例32脾細胞CTL活性在末次免疫後兩周，評價了作為用RSV F蛋白和所示佐劑免疫接種結果的脾細胞CTL活性。數據表示與RSV感染的靶細胞一起培養(效應細胞與靶細胞之比為33∶1)的脾細胞特異性CTL活性百分數。特異性CTL活性百分數如實施例24所述那樣測定，從對RSV感染的靶細胞有特異性的活性中減去對非感染靶細胞的CTL活性。用RSV以1.5的感染複數感染原初脾細胞2小時，作為體外刺激細胞的來源。將受免疫小鼠脾臟的響應細胞以5∶1的比例加入刺激細胞中，培養6天。在第5天，用RSV以10的感染複數感染靶細胞(Balb/c MHC-H-2d細胞系)2小時，培育過夜。在第6天，收穫感染的和非感染的靶細胞，加入51Cr。然後體外在靶細胞中加入效應細胞(效靶比範圍為100∶1至3∶1)。培養4小時後測定鉻釋放。結果列在表33中。
表33脾細胞CTL活性佐劑CTL活性百分數無 6IL-12 22MPLTM15MPLTM+IL-1213MPLTMSE33MPLTMSE IL-12 28實驗15用流感病毒核衣殼蛋白和各種佐劑免疫Balb/c小鼠將Balb/c小鼠分成6組，每組5隻小鼠。每組接種1微克流感病毒NP(核衣殼)蛋白(來自A/dorn/307/72病毒株)。[檢查組]第一組不接種佐劑(肽用PBS配製)；第二組接種100微克磷酸鋁(alum)；第三組接種50微克MPLTM；第四組接種接種MPLTM加5微克GM-CSF；第五組接種25微克MPLTMSE；第六組接種MPLTMSE加5微克GM-CSF。用0.2毫升的總體積對小鼠臀部作皮下免疫。在第0周和第4周進行免疫。
實施例33脾細胞CTL活性在末次免疫後兩周，評價作為用流感病毒NP肽和所示佐劑免疫接種結果的脾細胞CTL活性。評價方法按照實施例32的程序進行，採用肽脈衝的p815靶細胞(肽對應於NP的胺基酸147-155，其序列如下Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val(SEQ IDNO14))。在含有MPLTM或MPLTMSE的製劑中加入GM-CSF使得CTL活性顯著降低(數據未顯示)。
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序列表110美國氰胺公司120佐劑組合製劑13033482-00/PCT14014116014170PatentIn Ver.2.1210121140212PRT213人免疫缺陷病毒4001Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro20 25 30Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys35 40210221139212PRT213人免疫缺陷病毒4002Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala1 5 10 15Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly20 25 30Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys3521032119212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4003Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met1 521042119212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4004Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Vall 521052119212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4005Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile1 5210621120212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4006Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala15 10 15Pro Thr Lys Ala20210721129212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4007Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala15 10 15Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met20 25210821129212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4008Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala1 510 15Pro Thr Lys Ala Ser TAr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val20 25210921129212PRT213猿猴免疫缺陷病毒4009Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala1 5 10 15Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile20 252101021142212PRT213未知生物220223未知生物的描述人澱粉樣肽蛋白40010Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 402101121128212PRT213未知生物220223未知生物的描述人澱粉樣肽蛋白40011Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 252101221110212PRT213人免疫缺陷蛋白40012Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile1 5 102101321110212PRT213人免疫缺陷蛋白40013Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr1 5 10210142119212PRT213流感病毒40014Thr Tyr G1n Arg Thr Arg Ala Leu Val1 權利要求
1.一種抗原性組合物，它包含選自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲、或癌細胞或腫瘤細胞、或變應原、或澱粉樣肽蛋白的抗原，以及有效佐劑量的下列物質的組合(1)3-O-脫醯單磷脂A或單磷脂A及其衍生物和類似物，和(2)細胞因子或淋巴因子，或所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑，其中這些佐劑組合增強了脊椎動物宿主對所述抗原的免疫應答。
2.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中所選的抗原是衍生自蛋白質的多肽、肽或片段。
3.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
4.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子選自粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素-12。
5.根據權利要求4所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
6.根據權利要求5所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
7.根據權利要求6所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是白細胞介素-12。
8.根據權利要求7所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
9.根據權利要求1所述的抗原性組合物，它包含稀釋劑或載體。
10.根據權利要求9所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
11.一種提高抗原性組合物引發脊椎動物宿主中免疫應答能力的方法，該抗原性組合物含有選自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲的抗原，該方法包括將權利要求1所述的抗原性組合物給予所述宿主。
12.一種提高抗原性組合物引發脊椎動物宿主中免疫應答的能力的方法，該抗原性組合物含有選自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲的抗原，該方法包括將 9所述的抗原性組合物給予所述宿主。
13.一種提高抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞能力的方法，該抗原性組合物含有選自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲的抗原，該方法包括將權利要求1所述的抗原性組合物給予所述宿主。
14.一種提高抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞能力的方法，該抗原性組合物含有選自病原性病毒、細菌、真菌或寄生蟲的抗原，該方法包括將權利要求9所述的抗原性組合物給予所述宿主。
15.一種提高抗原性組合物引發脊椎動物宿主中治療性或預防性抗癌效果的能力的方法，該抗原性組合物含有選自癌細胞或腫瘤細胞的癌抗原或腫瘤相關抗原，該方法包括將抗原性組合物給予所述宿主，該抗原性組合物包含選自癌細胞或腫瘤細胞的所選癌抗原或腫瘤相關抗原，以及有效佐劑量的下列物質的組合(1)3-O-脫醯單磷脂A或單磷脂A及其衍生物和類似物，和(2)細胞因子或淋巴因子，或所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑。
16.一種提高含有所選變應原的抗原性組合物緩和脊椎動物宿主中變態反應的能力的方法，該方法包括將抗原性組合物給予所述宿主，該抗原性組合物包含所述變應原，以及有效佐劑量的下列物質的組合(1)3-O-脫醯單磷脂A或單磷脂A及其衍生物和類似物，和(2)細胞因子或淋巴因子，或所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑。
17.一種提高抗原性組合物預防或治療脊椎動物宿主中以澱粉樣沉積為特徵的疾病的能力的方法，該方法包括給予所述宿主衍生自澱粉樣肽蛋白的多肽、肽或片段或其抗體，以及有效佐劑量的下列物質的組合(1)3-O-脫醯單磷脂A或單磷脂A及其衍生物和類似物，和(2)細胞因子或淋巴因子，或所述細胞因子或淋巴因子的激動劑或拮抗劑。
18.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中所選抗原來自人免疫缺陷病毒HIV。
19.根據權利要求18所述的抗原性組合物，其中所選抗原是HIV蛋白、衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。
20.根據權利要求19所述的抗原性組合物，其中所選抗原是具有以下胺基酸序列的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ IDNO1)，或Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ IDNO2)。
21.根據權利要求18所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
22.根據權利要求18所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子選自粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素-12。
23.根據權利要求22所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
24.根據權利要求23所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
25.根據權利要求22所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是白細胞介素-12。
26.根據權利要求25所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
27.根據權利要求18所述的抗原性組合物，它還包含稀釋劑或載體。
28.根據權利要求27所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
29.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中所選的抗原來自猿猴免疫缺陷病毒SIV。
30.根據權利要求29所述的抗原性組合物，其中所選的SIV抗原是SIV蛋白、衍生自所述蛋白的多肽、肽或片段。
31.根據權利要求30所述的抗原性組合物，其中所選抗原是選自由下列胺基酸序列組成的肽的SIV肽Cys Thr Pro Ayr Aap Ile Asn Gln Met (SEQ IDNO3)，Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val (SEQ IDNO4)，Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ IDNO5)，Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu ProLeu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Cys Thr Pro Tyr Aap IleAsn Gln Met (SEQ ID NO7)，Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys ValVal Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala SerThr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val(SEQ ID NO8)和GluLeu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly ValAla Pro Thr Lys Ala Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile(SEQ ID NO9)。
32.根據權利要求29所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
33.根據權利要求29所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子選自粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素-12。
34.根據權利要求33所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
35.根據權利要求34所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
36.根據權利要求33所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是白細胞介素-12。
37.根據權利要求36所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
38.根據權利要求29所述的抗原性組合物，它還包含稀釋劑或載體。
39.根據權利要求38所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
40.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中所選抗原來自淋病奈瑟氏球菌。
41.根據權利要求40所述的抗原性組合物，其中所選淋病奈瑟氏球菌抗原是淋病奈瑟氏球菌蛋白質、衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。
42.根據權利要求41所述的抗原性組合物，其中所選抗原是淋病奈瑟氏球菌膜孔蛋白B蛋白。
43.根據權利要求40所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
44.根據權利要求40所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子選自粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素-12。
45.根據權利要求44所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
46.根據權利要求45所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
47.根據權利要求44所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是白細胞介素-12。
48.根據權利要求47所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
49.根據權利要求40所述的抗原性組合物，它還進一步包含稀釋劑或載體。
50.根據權利要求49所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
51.根據權利要求1所述的抗原性組合物，其中所選抗原來自呼吸道合胞病毒RSV。
52.根據權利要求51所述的抗原性組合物，其中所選的RSV抗原是RSV蛋白、衍生自所述蛋白質的多肽、肽或片段。
53.根據權利要求52所述的抗原性組合物，其中所選抗原是RSV融合蛋白。
54.根據權利要求51所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
55.根據權利要求51所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子選自粒細胞巨噬細胞集落刺激因子和白細胞介素-12。
56.根據權利要求55所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是粒細胞巨噬細胞集落刺激因子。
57.根據權利要求56所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
58.根據權利要求55所述的抗原性組合物，其中細胞因子或淋巴因子是白細胞介素-12。
59.根據權利要求58所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
60.根據權利要求51所述的抗原性組合物，它還進一步包含稀釋劑或載體。
61.根據權利要求60所述的抗原性組合物，其中3-O-脫醯單磷脂A以穩定的水包油乳液形式使用。
62.一種提高含有HIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求18所述的抗原性組合物給予所述宿主。
63.一種提高含有HIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求27所述的抗原性組合物給予所述宿主。
64.根據權利要求63所述的方法，其中HIV抗原是具有以下胺基酸序列的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Arg Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ IDNO1)。
65.根據權利要求63所述的方法，其中HIV抗原是具有以下胺基酸序列的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ ID NO2)。
66.一種提高含有HIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求18所述的抗原性組合物給予所述宿主。
67.一種提高含有HIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求27所述的抗原性組合物給予所述宿主。
68.根據權利要求67所述的方法，其中HIV抗原是具有以下胺基酸序列的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Cys Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg IleHis Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Thr Lys (SEQ IDNO1)。
69.根據權利要求67所述的方法，其中HIV抗原是具有以下胺基酸序列的HIV肽Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala MetTyr Ala Thr Arg Pro Asn Tyr Asn Lys Arg Lys Arg Ile HisIle Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Thr Lyr Lys (SEQ IDNO2)。
70.一種提高含有SIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求29所述的抗原性組合物給予所述宿主。
71.一種提高含有SIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求38所述的抗原性組合物給予所述宿主。
72.根據權利要求71所述的方法，其中SIV抗原是選自由下列胺基酸序列組成的肽的SIV肽Cys Thr ProTyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID NO3)，Ser Thr Pro ProLeu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO4)，Tyr Ala Pro Pro IleSer Gly Gln Ile (SEQ ID NO5)，Glu Leu Tyr Lys Tyr LysVal Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys AlaCys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID NO7)，GluLeu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly ValAla Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val(SEQ ID NO8)和Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val LysIle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala ProPro Ile Ser Gly Gln Ile (SEQ ID NO9)。
73.一種提高含有SIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求29所述的抗原性組合物給予所述宿主。
74.一種提高含有SIV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求38所述的抗原性組合物給予所述宿主。
75.根據權利要求74所述的方法，其中SIV抗原是選自由下列胺基酸序列組成的肽的SIV肽Cys Thr ProTyr Asp Ile Asn Gln Met (SEQ ID NO3)，Ser Thr Pro ProLeu Val Arg Leu Val (SEQ ID NO4)，Tyr Ala Pro Pro IleSer Gly Gln Ile (SEQ ID NO5)，Glu Leu Lyr Lys Tyr LysVal Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys AlaCys Thr Pro Tyr Asp Ile Asn Gln Met(SEQ ID NO7)，GluLeu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly ValAla Pro Thr Lys Ala Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val(SEQ ID NO8)和Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val LysIle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Tyr Ala ProPro Ile Ser Gly Gln lle (SEQ ID NO9)。
76.一種提高含有淋病奈瑟氏球菌抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求40所述的抗原性組合物給予所述宿主。
77.一種提高含有淋病奈瑟氏球菌抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求49所述的抗原性組合物給予所述宿主。
78.根據權利要求77所述的方法，其中淋病奈瑟氏球菌抗原是淋病奈瑟氏球菌膜孔蛋白B蛋白。
79.一種提高含有淋病奈瑟氏球菌抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求40所述的抗原性組合物給予所述宿主。
80.一種提高含有淋病奈瑟氏球菌抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求49所述的抗原性組合物給予所述宿主。
81.根據權利要求80所述的方法，其中淋病奈瑟氏球菌抗原是淋病奈瑟氏球菌膜孔蛋白B蛋白。
82.一種提高含有人呼吸道合胞病毒RSV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求51所述的抗原性組合物給予所述宿主。
83.一種提高含有RSV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主免疫應答的能力的方法，該方法包括將權利要求60所述的抗原性組合物給予所述宿主。
84.根據權利要求83所述的方法，其中RSV抗原是RSV融合蛋白。
85.一種提高含有RSV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求51所述的抗原性組合物給予所述宿主。
86.一種提高含有RSV抗原的抗原性組合物引發脊椎動物宿主中細胞毒性T淋巴細胞的能力的方法，該方法包括將權利要求60所述的抗原性組合物給予所述宿主。
87.根據權利要求86所述的方法，其中RSV抗原是RSV融合蛋白。
全文摘要
用3－O－脫醯單磷脂A或單磷脂A及其衍生物和類似物與諸如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子或白細胞介素－12等細胞因子或淋巴因子組合,作為抗原性組合物中的佐劑組合,以增強脊椎動物宿主對所選抗原的免疫應答反應。
文檔編號A61K39/21GK1354675SQ00807489
公開日2002年6月19日 申請日期2000年5月12日 優先權日1999年5月13日
發明者M·哈根 申請人:美國氰胺公司