一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系及其試劑盒的製作方法

2023-07-12 14:46:41 4

專利名稱：一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系及其試劑盒。
背景技術：
生物機體依賴其體內的各種細胞、各種生長因子以及體液之間的相互協調作用來維持機體的正常功能。血管再生就是其中一種涉及多種細胞協同作用的生物過程，其特徵表現為某個器官或組織內現有的血管再生出新的血管。經過多年的深入研究，我們發現新生血管對組織、血管疾病以及癌症的發生發展有極為重要的作用。正常情況下，人類和動物只有在某個特定階段才有血管再生發生。例如，在胎兒發育以及在哺乳動物出生後，血管再生在卵巢、子宮內膜、胎盤的發育過程、黃體形成過程和傷口癒合階段起著至關重要的作用。血管再生是一個由許多血管再生調節因子來調節的過程(Folkman，J. Nature Med.，1 :27-31,1995)。這些因子包括促進血管再生和抑制血管再生的因子，這兩種因子之間的平衡決定血管再生是否發生。不正常的血管再生常常伴隨著一些疾病的發生。這些疾病包括癌症、糖尿病、關節炎、類風溼性關節炎、角膜血管化、動脈粥樣化形成、牛皮癬、以及糖尿病視網膜病變的發生發展。骨關節炎屬於非細菌性炎症，主要發病的病理特點是由於關節組織的血液循環障礙，導致組織細胞的營養供給不良，致使組織細胞發生病變。如果能夠改善血液循環，促進白細胞、巨噬細胞等的免疫作用，實現消炎和消腫的作用。胰島內皮細胞是胰島細胞群的重要組成部分，具有異質性強、通透性高、呈血糖濃度依賴性地分泌血管活性物質等特徵.胰島內皮細胞與胰島功能關係密切，除了向胰島內分泌細胞供應氧氣及營養物質外，還與內分泌細胞相互作用，參與胰島血管發生、胰腺內分泌部發育、胰島素基因表達誘導、胰島炎性反應損傷及移植胰島再血管化等病理生理過程， 是研究胰島功能的重要靶點(李新，袁莉，200929(1)，國際內分泌代謝雜誌)。糖尿病血管內皮細胞具有調節血管緊張度、血管通透性及促進血管發生的作用。因此，血管內皮細胞功能障礙被認為是糖尿病所引起的慢性血管併發症發病的關鍵因素，但血管內皮細胞功能障礙也可受胰島素抵抗的各種表現所影響，如高血壓、血脂紊亂和高糖血症等(胰島素抵抗與內皮細胞病變的聯繫，中華糖尿病雜誌，2008 (3))。腫瘤通過分泌各種不同的生長因子，例如，血管內皮生長因子(VEGF)和鹼性成纖維生長因子(bFGF)誘導腫瘤組織血管再生從而提供腫瘤更多的營養物質並清除腫瘤中的代謝廢物來促進腫瘤的快速生長。研究表明，血管再生同時對腫瘤轉移起著至關重要的作用，並且，統計數據顯示腫瘤轉移是癌症病人死亡率居高不下的關鍵因素。有證據表明，腫瘤中再生的血管是雜亂無章的，而且，血管壁不僅僅象長血管一樣包括血管內皮細胞和周細胞，有些血管還可能整合有腫瘤細胞，因此呈嵌合體結構。這種嵌合體結構使腫瘤細胞很容易地侵入血液，從而發生腫瘤轉移。1971年，Folkman提出了著名的抗血管再生治療癌症的理論。從那時起，科研界便掀起了研究和尋找抗血管再生機理和藥物的熱潮。最近，美國食品和藥品管理局批准了治療人直腸癌的抗血管內皮生長因子的單克隆抗體藥物Avastin 就是一個實例。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系及其試劑盒。通過應用本發明觀察體外血管內皮細胞的血管再生水平，可以高通量地篩選抑制血管再生的新藥、特藥和促進血管再生的新藥和特藥，可以應用於癌症患者的個性化治療及其耐藥性的監測，可以為病人量身定做最適合該病人的高效藥物， 從而提高治療效率和縮短治療期。本發明提供的技術方案是一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系，其包含兩層，其中，第一層是基質凝膠細胞，或是基質凝膠細胞組織混合物，或是基質凝膠組織混合物，緊貼在所用培養器皿的底部，哺乳動物的血管內皮細胞均勻分散在凝膠層中，以及哺乳動物的或是腫瘤細胞類細胞團、或是腫瘤組織的活檢樣品、或是胰島組織的活檢樣品、子宮內膜組織活檢樣品、或者其他組織器官的活檢樣品懸浮在凝膠層中；第二層是細胞培養液，在第一層上面。上述體外多種細胞三維共培養體系在細胞培養箱中進行培養觀察，觀測至少如下一種指標在第一層膠層中，血管內皮細胞的生長狀況、血管內皮細胞管狀結構的生成狀況、或是胰島內分泌細胞分泌胰島素的水平、或是其他組織相應的功能的狀況。所述的血管內皮細胞是永久性轉染表達一種螢光蛋白的血管內皮細胞，例如，血管內皮細胞被轉染了紅色螢光蛋白表達質粒pDsRed，經過使用G418篩選出穩定表達紅色螢光蛋白的血管內皮細胞。然後，使用流式細胞儀分選出高表達紅色螢光蛋白的血管內皮細胞。所述腫瘤細胞或腫瘤組織活檢樣品是永久性轉染表達一種螢光蛋白的腫瘤細胞； 而且，腫瘤細胞所表達的螢光蛋白的發射譜與血管內皮細胞永久性轉染表達的螢光蛋白發射譜不同。例如，腫瘤細胞被轉染了藍色螢光蛋白表達質粒pCFP，經過使用G418篩選出穩定表達藍色螢光蛋白的腫瘤細胞。然後，使用流式細胞儀分選出高表達藍色螢光蛋白的腫瘤細胞。所述第二層中還包含至少另外一種哺乳動物細胞系。所述的共培養體系，還至少包含另外一種哺乳動物細胞系，該細胞系可以永久性轉染表達一種螢光蛋白；該螢光蛋白的發射光譜與血管內皮細胞和腫瘤細胞所表達的螢光蛋白的發射光譜都不同。例如，選用周細胞作為另外一種細胞添加在此共培養體系。周細胞被轉染了黃色螢光蛋白表達質粒PYFP，經過使用G418篩選出穩定表達黃色螢光蛋白的周細胞。然後，使用流式細胞儀分選出高表達黃色螢光蛋白的周細胞。上述的另外一種哺乳動物細胞系是如下細胞中的一種免疫細胞例如巨噬細胞和肥大細胞；間質細胞例如成纖維細胞和脂肪細胞；或血管發生所需的周細胞。所述胰島組織活檢樣品或其他組織器官的活檢樣品是永久性轉染表達一種螢光蛋白；該種螢光蛋白的發射譜與血管內皮細胞以及可能包含有的另外一種哺乳動物的細胞系所表達的螢光蛋白的發射譜不同。所述的共培養體系，第一層或第二層中，至少有一層含有被測試的試劑。所述的共培養體系，其中所述被測試的試劑是已知的或是未知的但具有抗血管再生作用的試劑或促進血管再生的試劑。所述哺乳動物的腫瘤細胞來源於某一個主體，同時，第一或第二層至少有一層含有一種被測試的試劑，這種試劑曾被該主體用來治療其腫瘤。所述哺乳動物的活檢樣品來源於某一個主體，該主體是人或是動物。所述動物是野生型動物或是轉基因動物。所述轉基因動物是表達一種螢光蛋白的轉基因動物；所表達的螢光蛋白的發射譜與血管內皮細胞和可能包含的另外一種哺乳動物細胞系所表達的螢光蛋白的發射譜不同。 例如，使用綠色螢光蛋白轉基因大白鼠。分離出胰島組織後，將胰島組織切割成1立方毫米左右的小塊，添加到含有表達紅色螢光蛋白的內皮細胞的基質凝膠溶液細胞混合物中。本發明還提供一種標準化試劑盒，包含所述的共培養體系。所述的標準化試劑盒，是標準化高通量篩藥試劑盒或標準化個性化診斷治療試劑
品.ο其中，標準化高通量篩藥試劑盒是篩選具有促進血管再生和抑制血管再生的藥物的試劑盒；標準化個性化診斷治療試劑盒是為癌症患者選定具有高效治療作用的抗癌藥物，免除化療的盲目性的試劑盒。一種應用所述標準化試劑盒進行高通量抗腫瘤血管再生藥物篩選的方法，其過程如下將一種腫瘤細胞系的單克隆細胞球體或某個癌症患者的癌症組織活檢樣品應用在所述的標準化高通量藥物篩選試劑盒中，與血管內皮細胞一起共培養，將被測試的候選試劑添加到細胞培養盤的各個孔中，同時設立添加2%胎牛血清的陰性對照組和添加3% 二甲亞碸作為陽性對照組，觀察測試組試劑血管內皮細胞形成血管樣結構，與陰性對照組和陽性對照組的結果進行比較，如果血管再生的結果與陰性對照組相似或相近，表明該候選試劑抗血管再生的效用很弱或幾乎沒有抗血管再生的效用，如果血管再生的結果與陽性對照組結果類似，表明該候選試劑抗血管再生的效用比較強或者具有抗血管再生的效用。—種所述的共培養體系的製備方法，其包括如下步驟(1)基質凝膠溶液細胞混合物的製備a.用細胞培養瓶培養血管內皮細胞和周細胞，當血管內皮細胞和周細胞系生長密度達到70%左右時，使用蛋白消化酶將貼壁生長的細胞從容器壁上分離下來，懸浮在中性磷酸緩衝液低速離心洗滌若干次，最後將細胞重新懸浮在EBM2生長培養液中，並使用血細胞計數儀對細胞的密度進行計數，然後保存待用；b.將解凍後保存的基質凝膠溶液與血管內皮細胞或者血管內皮細胞連同周細胞或者其他種類的細胞均勻地混合在基質凝膠溶液中； (2)細胞培養盤的處理及共培養體系第一層的製備 a.細胞培養盤的處理細胞培養盤為多孔，經過4N的NaOH溶液浸泡1小時，然後用無菌蒸餾水清洗若干次，接著用4N的HCL溶液處理後，再用無菌蒸餾水清洗若干次，最後，使用無菌中性磷酸緩衝液清洗若干次，將處理後的培養盤風乾後，放入細胞培養箱內平衡，細胞培養箱內優選溫度37 °C，然後將培養盤封口，保存，備用，保存溫度優選4°C ；b.共培養體系第一層的製備往上述準備好的培養盤的每個孔中加入30-50 μ 1 的基質凝膠溶液細胞混合物作為共培養體系的第一層，添加完畢後，保存待用；(3)腫瘤細胞單克隆細胞球體或組織活檢樣品的製備a.腫瘤細胞單克隆細胞球體的製備用細胞培養瓶培養腫瘤細胞，當腫瘤細胞生長密度達到60-80%左右時，使用蛋白消化酶將貼壁生長的細胞從容器壁上分離下來，懸浮在中性磷酸緩衝液低速離心洗滌若干次，最後將細胞重新懸浮在生長培養液中，並對細胞的密度進行計數，然後保存待用；在腫瘤細胞的培養液中添加胎牛血清、抗生素、1. 5%的瓊脂溶液以及上述的腫瘤細胞，將此細胞混合液添加在凝固冷卻的1. 5%的瓊脂凝膠層上，然後，將其轉移到100%溼度的細胞培養箱中培養14天 21天以獲取腫瘤細胞單克隆球體； 將長到直徑為0. 5毫米 1毫米的腫瘤單克隆細胞球體從低密度的瓊脂凝膠中離心沉澱， 經過若干次中性磷酸緩衝液洗滌；然後使用添加抗生素的中性磷酸緩衝液將沉澱的腫瘤單克隆細胞球體重新懸浮並轉移到細菌培養皿中，挑取直徑為0. 5 0. 7毫米的腫瘤球體放到預加了冷基質凝膠溶液細胞混合物的孔中央，將此多孔盤轉移到含有100%溼度的細胞培養箱中使冷基質凝膠溶液凝固，之後，取出此多孔盤，將培養液加入各個孔中，最後，將培養盤放置在含100%溼度的培養箱中進行培養並觀察結果，細胞培養箱內優選溫度37°C ；b.組織活檢樣品的製備將採集的組織活檢樣品保存在保存液中備用；把活檢樣品從保存液中取出後，經過70%的酒精溶液浸洗若干次，中性磷酸緩衝液浸洗若干次後，轉移到細胞培養皿中，並分割成小塊，置於預加了冷基質凝膠溶液細胞混合物的多孔盤的孔中央；然後，將此多孔盤轉移到含有100%溼度的細胞培養箱中使冷基質凝膠溶液凝固；取出此多孔盤，將培養液加入各個孔中；最後，將培養盤放置在含100%溼度的培養箱中進行培養，觀察，細胞培養箱內優選溫度37 °C。所述的製備方法，所述基質凝膠溶液細胞混合物或培養液中添加有被測試的試劑。所述的製備方法，血管內皮細胞的使用密度為140，000-1, 000, 000細胞/ml，周細胞或者其他種類細胞按照與血管內皮細胞1 50 1 5比例添加到基質凝膠溶液中；所述基質凝膠溶液為適合細胞培養的動物體內提取的基質凝膠或者人工合成的類基質凝膠產品或者是兩者按照13 11的比例的混合物。本發明所述的冷基質凝膠溶液為4°C的基質凝膠溶液。本發明使用的細胞系、基質凝膠溶液、多孔細胞培養盤、細胞培養液為外購品。人原代血管內皮細胞購(HMVEC)自上海普飛生物技術有限公司，人腦血管周細胞(HBVP)購自北京裕恆豐科技有限公司。經過培養和轉染人端粒酶基因，通過新黴素G418篩選獲得永生性的人血管內皮細胞系和周細胞系。血管內皮細胞系和周細胞系使用EBM2基礎培養液及其生長因子添加試劑盒，購自上海嘉適科學儀器有限公司。各種腫瘤細胞系購自美國組織細胞工程公司(ATCC)，使用ATCC細胞系培養所建議的相應培養液。這些培養液和胎牛血清購自上海普飛生物技術有限公司和Biolab中國分公司。紅色(pDsRed)、黃色(pYFP)、藍色(pCFP)、和綠色(pIRES-EGFP)螢光蛋白表達載體/質粒購自金維克(中國)生物技術中心。永久性表達不同螢光蛋白的各種細胞系是通過傳統的電轉染方法轉染了相應的螢光蛋白表達質粒，經過新黴素G418篩選和流式細胞儀的進一步篩選獲得永久性表達相應螢光蛋白的細胞系。本發明具有以下有益效果本發明新型體外多種細胞三維立體培養體系主要包括基質凝膠細胞混合物和細胞培養液。基質凝膠可以是膠原蛋白，Matrigel，Hydrogel, Geltrex等適合細胞培養的動物體內提取的基質凝膠或者人工合成的類基質凝膠產品或者是兩者按照13 11的比例的混合物。細胞是永久性轉染表達螢光蛋白的哺乳動物血管內皮細胞系或者野生型哺乳動物血管內皮細胞系以及腫瘤細胞、腫瘤活檢樣品、胰腺組織活檢樣品等。將此新型體外多種細胞三維立體培養體系作為一個應用單元應用在各種多孔細胞培養盤中，可以製備成相應的標準化試劑盒。試劑盒是標準化高通量篩藥試劑盒或標準化個性化試劑盒。應用本發明，通過觀察血管內皮細胞的血管再生水平，可以高通量地篩選抑制血管再生的新藥、特藥和促進血管再生的新藥和特藥。而且，加上使用癌症患者的癌症組織的活檢樣品，本發明可以應用於癌症患者的個性化治療及其耐藥性的監測。如果在此標準化試劑盒中應用不同病人的組織活檢樣品，還可以為病人量身定做最適合該病人的高效藥物，從而提高治療效率和縮短治療期；與此同時，配合治療過程，此標準化試劑盒可以提前預測病人是否對現使用的藥物已經產生耐藥性，為醫務人員及時合理地調整治療方案提供科學依據。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發明，但並不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。實施例1 多種細胞三維立體培養體系的製備1、基質凝膠溶液細胞混合物的製備使用150釐米2的細胞培養瓶培養血管內皮細胞；75釐米2的細胞培養瓶培養周細胞。當血管內皮細胞和周細胞系生長密度達到70%左右時，使用蛋白消化酶將貼壁生長的細胞從容器壁上分離下來，懸浮在中性磷酸緩衝液低速離心洗滌2-3次，最後將細胞重新懸浮在500 μ 1的ΕΒΜ2生長培養液中，並使用血細胞計數儀對細胞的密度進行計數，然後放置在溼冰上保存待用。將解凍後保存在4°C的基質凝膠溶液(包括膠原蛋白，Matrigel，Hydrogel, Geltrex等適合細胞培養的動物體內提取的基質凝膠或者人工合成的類基質凝膠產品或者是兩者按照12的比例的混合物)與血管內皮細胞或者血管內皮細胞連同周細胞或者其他種類的擬加入此立體共培養體系中的細胞均勻地混合在基質凝膠溶液中。血管內皮細胞的使用密度為 140, 000-1, 000, 000 細胞/ml(比如 140, 000 細胞/ml、1000，000 細胞/ml、 600，000細胞/ml等，在本實施例中，血管內皮細胞的使用密度為g00，000細胞/ml)，周細胞或者其他種類細胞依據試劑盒的使用目的按照與血管內皮細胞1 50 1 5比例(比如1 50，1 40,1 30,1 10,1 5等，在本實施例中，為1 30比例)添加到基質凝膠溶液中。此時，被測試的試劑可以添加到此基質凝膠溶液細胞混合物中。將此基質凝膠溶液細胞混合物放置在溼冰上保存待用。2、細胞培養盤的處理及其新型體外多細胞三維立體培養體系第一層的製備作為承載平臺的多孔細胞培養盤可以是384-孔、96-孔、48-孔、M孔、12-孔、4-孔等類似的、適用細胞培養的器皿。在此多孔細胞培養盤以96-孔盤為例。96-孔細胞培養盤經過4N的NaOH溶液浸泡一小時，然後用無菌蒸餾水清洗三次。接著用4N的HCL溶液處理一小時後，再用無菌蒸餾水清洗三次。最後，使用無菌中性磷酸緩衝液清洗三次。將處理後的培養盤放在無菌操作臺內風乾後，放入細胞培養箱內平衡12小時，細胞培養箱內溫度37°C。然後將培養盤用Parafilm封口，放在室溫下或者4°C下進行保存。使用時，將 Parafilm去掉，把培養盤放置在溼冰上，往培養盤的每個孔中加入30-50 μ 1的基質凝膠溶液細胞混合物作為此新型體外多細胞三維立體培養體系的第一層。添加完畢後，96-孔細胞培養盤仍然放置在溼冰上保存待用。3、腫瘤細胞單克隆細胞球體或組織活檢樣品的製備(1)腫瘤細胞單克隆細胞球體的製備使用75釐米2的細胞培養瓶培養腫瘤細胞。當腫瘤細胞生長密度達到70%左右時，使用蛋白消化酶將貼壁生長的細胞從容器壁上分離下來，懸浮在中性磷酸緩衝液低速離心洗滌2-3次，最後將細胞重新懸浮在1毫升的相應生長培養液中，並使用血細胞計數儀對細胞的密度進行計數，然後放置在溼冰上保存待用。配製1.5%的低熔點瓊脂溶液，使用高壓滅菌鍋消毒滅菌30分鐘。可以採用任何適當的細胞培養器皿來製備腫瘤細胞單克隆細胞球體，例如採用6-孔盤。當瓊脂溶液冷卻到45°C左右時，在無菌的6-孔盤的每孔中加入1.5ml瓊脂溶液。等待20分鐘使瓊脂凝固。與此同時，往腫瘤細胞所使用的培養液中添加胎牛血清、抗生素(青黴素和鏈黴素)、1. 5%的瓊脂溶液以及腫瘤細胞。胎牛血清的濃度為6%，抗生素為6倍於正常細胞培養所使用的濃度，瓊脂濃度為0. 22-0. 3 %，腫瘤細胞的濃度為1-5萬個細胞/3ml (在本實施例中為3萬個細胞/:3ml)。將此細胞混合液添加在凝固冷卻的1. 5%的瓊脂凝膠層上，每孔添加量為:3ml。然後，將6-孔盤小心轉移到100%溼度的細胞培養箱中培養14天 21天以獲取腫瘤細胞單克隆球體，細胞培養箱內溫度37°C。將長到直徑為0. 5毫米 1毫米的腫瘤單克隆細胞球體從低密度的瓊脂凝膠中離心沉澱，經過三次中性磷酸緩衝液洗滌。然後使用添加抗生素的中性磷酸緩衝液將沉澱的腫瘤單克隆細胞球體重新懸浮並轉移到直徑為100釐米的細菌培養皿中。將盛有腫瘤單克隆細胞球體的細菌培養皿轉移到解剖鏡下，使用Drummond微量取樣器在解剖鏡下挑取直徑為0. 5 0. 7毫米的腫瘤球體放到預加了冷基質凝膠溶液細胞混合物的孔中央，每孔一個球體。操作完畢後，將此多孔盤轉移到含有100%溼度的細胞培養箱中使冷基質凝膠溶液凝固。45分鐘之後，取出此多孔盤，小心將50-100 μ 1(本實施例中為80 μ 1)培養液加入各個孔中。如果被測試的試劑沒有預先添加到第一層的基質凝膠溶液細胞混合物中的話，這時可以將其添加到第二層的培養液(ΕΒΜ2)中。最後，將培養盤放置在含100%溼度的培養箱中進行培養。一般來說，7-9天(本實施例中為8天)可以觀察結果並拍攝照片然後進行比較分析。時間長短依據細胞種類的不同而不同。(2)組織活檢樣品的製備本發明多種細胞三維立體培養體系中也可使用組織活檢樣品來替代腫瘤單克隆細胞球體，組織活檢樣品的製備如下將採集到的組織活檢樣品保存在冷的、含有2-3倍(本實施例中為2倍)抗生素、 高糖RPMI1640培養液中，放置在溼冰上運輸到準備室待用。把活檢樣品從保存液中取出後，經過70%的酒精溶液浸洗兩次，中性磷酸溶液浸洗三次後，活檢樣品被轉移到一個直徑為100釐米的細胞培養皿中。使用一次性鑷子和10號手術刀將活檢樣品分割成1立方毫米左右的小塊。使用25G的一次性針頭將切割後的活檢樣品放置在預加了冷基質凝膠溶液細胞混合物的多孔盤的孔中央。每孔加一個活檢樣品。然後，將此多孔盤轉移到含有 100%溼度的細胞培養箱中使冷基質凝膠溶液凝固。45分鐘之後，取出此多孔盤，小心將 50-100 μ 1(80 μ 1)培養液加入各個孔中。如果被測試的試劑沒有預先添加到第一層的基質凝膠溶液細胞混合物中的話，這時可以將其添加到第二層的培養中。最後，將培養盤放置在含100%溼度的培養箱中進行培養，細胞培養箱內溫度37°C。一般來說，3-9天(本實施例中為7天)可以觀察結果並拍攝照片然後進行比較分析。實施例2 標準化試劑盒的製備把本發明這種新型體外多種細胞三維立體培養體系作為一個單元應用在細胞培養用的384-孔、96-孔盤、48-孔盤、24-孔盤、12-孔盤、6-孔盤、4-孔盤以及類似的、適用細胞培養用的器皿中，從而可以製備成一種標準化高通量藥物篩選試劑盒或一種標準化個性化診斷治療試劑盒。一個單元是一個三維立體(3D)共培養體系。一個單元中的第一層是一層凝固的基質凝膠，緊貼在所用培養器皿的底部，其中，哺乳動物的血管內皮細胞均勻分散在凝膠層中，以及哺乳動物的或是腫瘤細胞類細胞團、或是腫瘤組織的活檢樣品、或者胰島組織的活檢樣品、子宮內膜組織活檢樣品、或者其他組織器官的活檢樣品懸浮在膠層中。該標準化試劑盒不僅可以用來進行高通量地篩選抗血管再生和促進血管再生的新藥和特藥，更為重要的是，如果在此標準化試劑盒中應用不同病人的組織活檢樣品，還可以為病人量身定做最適合該病人的高效藥物，從而提高治療效率和縮短治療期；與此同時， 配合治療過程，此標準化試劑盒可以提前預測病人是否對現使用的藥物已經產生耐藥性， 為醫務人員及時合理地調整治療方案提供科學依據。實施例3 標準試劑盒進行高通量抗腫瘤血管再生藥物篩選將一種腫瘤細胞系的單克隆細胞球體應用在該發明的新型體外多種細胞三維立體培養體系的標準化高通量藥物篩選試劑盒中，與血管內皮細胞一起共培養。將被測試的候選試劑添加到各個孔中，同時設立添加2%胎牛血清的陰性對照組和添加3%二甲亞碸 (DMSO)作為陽性對照組(Koizumi，et. al.)。觀察測試組試劑血管內皮細胞形成血管樣結構，與陰性和陽性對照組的結果來比較。如果血管再生的結果與陰性對照組相似或相近的話，就表明此試劑抗血管再生的作用很弱或幾乎沒有抗血管再生的效用；如果血管再生的結果與陽性對照組結果類似的話，就表明該試劑抗血管再生的效用比較強或者具有抗血管再生的效用。因此，就可以對具有抗血管再生的試劑進行進一步的研究和測試，或許可以發現抗腫瘤血管再生的新藥特藥。首先，由於此發明中所述的多種細胞三維立體共培養體系很接近體內腫瘤血管再生的環境，因此，使用此培養體系篩選的藥物最終具有獲得藥物批號的機率就非常高。其次，以使用96-孔盤作為承載平臺製備的篩藥試劑盒為例，將最左邊一列的8個孔作為陰性對照組，最右邊的一列作為陽性對照組，其他80個孔添加不同的被測試的試劑。這樣一來，一個96-孔盤試劑盒就可以一次篩選觀察80種試劑。因此，該試劑盒可以高通量地篩選藥物。第三，也是最重要的是，該試劑盒是一種標準化的產品，因此具有高重複性和可靠性。第四，由於此試劑盒所採用的體外多種細胞三維立體共培養體系， 能夠模仿體內腫瘤組織血管再生的微環境，所以，此試劑盒篩選的藥物具有很高的可信度。實施例4 標準化試劑盒進行腫瘤病人個性化治療
將某個癌症患者的癌症組織活檢樣品應用在該發明的體外多種細胞三維立體培養體系的標準化個性化診斷治療試劑盒中，與血管內皮細胞一起共培養。將現有候選藥物添加到各個孔中，同時設立添加2%胎牛血清的陰性對照組和添加3%二甲亞碸(DMSO)作為陽性對照組(Koizumi，et.al.)。觀察藥物測試組血管內皮細胞形成血管樣結構，與陰性和陽性對照組的結果來比較。如果血管再生的結果與陰性對照組相似或相近的話，就表明此藥物抗血管再生的作用很弱或幾乎沒有抗血管再生的效用；如果血管再生的結果與陽性對照組結果類似的話，就表明該藥物抗血管再生的效用比較強或者具有抗血管再生的效用。首先，由於此發明中所述的多種細胞三維立體共培養體系很接近體內腫瘤血管再生的環境，再加上添加了攜帶癌症病人癌症特徵「籤名」的癌症組織活檢樣品，因此，使用此標準化個性診斷治療試劑盒檢測出來具有高效抗腫瘤血管再生的藥物將對該癌症患者具有非常獨到的高效治療作用，而且對患者來說，去除了化療的盲目性。其次，以使用96-孔盤作為承載平臺製備的個性化診斷治療試劑盒為例，如果現有候選藥物有3種，對一個患者癌症組織活檢樣品的每一種藥物進行兩個重複測試。這樣一來，一個96-孔盤試劑盒一次就可以至少對五個癌症患者進行三種藥物測試。因此，該試劑盒適合用於批量診斷檢測。第三，也是最重要的是，該試劑盒是一種標準化的產品，因此具有高重複性和可靠性。第四，為了更好地配合化療過程，使用該試劑盒定期對癌症患者癌症活檢樣品進行，此標準化試劑盒還可以提前預測病人是否對現使用的化療藥物已經產生耐藥性，為醫務人員及時合理地調整治療方案提供科學依據。
權利要求
1.一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系，其特徵在於其包含兩層，其中，第一層是基質凝膠細胞，或是基質凝膠細胞組織混合物，或是基質凝膠組織混合物，緊貼在所用培養器皿的底部，哺乳動物的血管內皮細胞均勻分散在凝膠層中，以及哺乳動物的或是腫瘤細胞類細胞團、或是腫瘤組織的活檢樣品、或是胰島組織的活檢樣品、子宮內膜組織活檢樣品、或者其他組織器官的活檢樣品懸浮在凝膠層中；第二層是細胞培養液，在第一層上面。
2.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於所述的血管內皮細胞是永久性轉染表達一種螢光蛋白的血管內皮細胞；所述腫瘤細胞或腫瘤組織活檢樣品是永久性轉染表達一種螢光蛋白的腫瘤細胞；而且，腫瘤細胞所表達的螢光蛋白的發射譜與血管內皮細胞永久性轉染表達的螢光蛋白發射譜不同。
3.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於所述第二層中還包含至少另外一種哺乳動物細胞系。
4.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於還至少包含另外一種哺乳動物細胞系，該細胞系永久性轉染表達一種螢光蛋白；該螢光蛋白的發射光譜與血管內皮細胞和腫瘤細胞所表達的螢光蛋白的發射光譜都不同。
5.按照權利要求4所述的供培養體系，其特徵在於所述另外一種哺乳動物細胞系是如下細胞中的一種免疫細胞例如巨噬細胞和肥大細胞；間質細胞例如成纖維細胞和脂肪細胞；或血管發生所需的周細胞。
6.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於所述胰島組織活檢樣品或其他組織器官的活檢樣品是永久性轉染表達一種螢光蛋白；該種螢光蛋白的發射譜與血管內皮細胞以及可能包含有的另外一種哺乳動物的細胞系所表達的螢光蛋白的發射譜不同。
7.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於第一層或第二層中，至少有一層含有被測試的試劑。
8.按照權利要求7所述的共培養體系，其特徵在於所述被測試的試劑是已知的或是未知的但具有抗血管再生作用的試劑或促進血管再生的試劑。
9.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於所述哺乳動物的腫瘤細胞來源於某一個主體，同時，第一或第二層至少有一層含有一種被測試的試劑，這種試劑曾被該主體用來治療其腫瘤。
10.按照權利要求1所述的共培養體系，其特徵在於所述哺乳動物的活檢樣品來源於某一個主體，該主體是人或是動物。
11.按照權利要求10所述的共培養體系，其特徵在於所述動物是野生型動物或是轉基因動物。
12.按照權利要求11所述的共培養體系，其特徵在於所述轉基因動物是表達一種螢光蛋白的轉基因動物；所表達的螢光蛋白的發射譜與血管內皮細胞和可能包含的另外一種哺乳動物細胞系所表達的螢光蛋白的發射譜不同。
13.—種標準化試劑盒，其特徵在於包含權利要求1至12任一項所述的共培養體系。
14.按照權利要求13所述的標準化試劑盒，是標準化高通量篩藥試劑盒或標準化個性化診斷治療試劑盒。
15.按照權利要求14所述的標準化試劑盒，其中，標準化高通量篩藥試劑盒是篩選具有促進血管再生和抑制血管再生的藥物的試劑盒；標準化個性化診斷治療試劑盒是為癌症患者選定具有高效治療作用的抗癌藥物，免除化療的盲目性的試劑盒。
16.一種應用權利要求15所述標準化試劑盒進行高通量抗腫瘤血管再生藥物篩選的方法，其特徵在於將一種腫瘤細胞系的單克隆細胞球體或某個癌症患者的癌症組織活檢樣品應用在所述的標準化高通量藥物篩選試劑盒中，與血管內皮細胞一起共培養，將被測試的候選試劑添加到細胞培養盤的各個孔中，同時設立添加2%胎牛血清的陰性對照組和添加3%二甲亞碸作為陽性對照組，觀察測試組試劑血管內皮細胞形成血管樣結構，與陰性對照組和陽性對照組的結果進行比較，如果血管再生的結果與陰性對照組相似或相近，表明該候選試劑抗血管再生的效用很弱或幾乎沒有抗血管再生的效用，如果血管再生的結果與陽性對照組結果類似，表明該候選試劑抗血管再生的效用比較強或者具有抗血管再生的效用。
17.—種權利要求1所述的共培養體系的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)基質凝膠溶液細胞混合物的製備a.用細胞培養瓶培養血管內皮細胞和周細胞，當血管內皮細胞和周細胞系生長密度達到70%左右時，使用蛋白消化酶將貼壁生長的細胞從容器壁上分離下來，懸浮在中性磷酸緩衝液低速離心洗滌若干次，最後將細胞重新懸浮在EBM2生長培養液中，並使用血細胞計數儀對細胞的密度進行計數，然後保存待用；b.將解凍後保存的基質凝膠溶液與血管內皮細胞或者血管內皮細胞連同周細胞或者其他種類的細胞均勻地混合在基質凝膠溶液中；(2)細胞培養盤的處理及共培養體系第一層的製備a.細胞培養盤的處理細胞培養盤為多孔，經過4N的NaOH溶液浸泡1小時，然後用無菌蒸餾水清洗若干次，接著用4N的HCL溶液處理後，再用無菌蒸餾水清洗若干次，最後，使用無菌中性磷酸緩衝液清洗若干次，將處理後的培養盤風乾後，放入細胞培養箱內平衡，然後將培養盤封口，保存備用；b.共培養體系第一層的製備往上述準備好的培養盤的每個孔中加入30-50μ 1的基質凝膠溶液細胞混合物作為共培養體系的第一層，添加完畢後，保存待用；(3)腫瘤細胞單克隆細胞球體或組織活檢樣品的製備a.腫瘤細胞單克隆細胞球體的製備用細胞培養瓶培養腫瘤細胞，當腫瘤細胞生長密度達到60-80%左右時，使用蛋白消化酶將貼壁生長的細胞從容器壁上分離下來，懸浮在中性磷酸緩衝液低速離心洗滌若干次，最後將細胞重新懸浮在生長培養液中，並對細胞的密度進行計數，然後保存待用；在腫瘤細胞的培養液中添加胎牛血清、抗生素、1. 5%的瓊脂溶液以及上述的腫瘤細胞，將此細胞混合液添加在凝固冷卻的1. 5%的瓊脂凝膠層上，然後， 將其轉移到100%溼度的細胞培養箱中培養14天 21天以獲取腫瘤細胞單克隆球體；將長到直徑為0. 5毫米 1毫米的腫瘤單克隆細胞球體從低密度的瓊脂凝膠中離心沉澱，經過若干次中性磷酸緩衝液洗滌；然後使用添加抗生素的中性磷酸緩衝液將沉澱的腫瘤單克隆細胞球體重新懸浮並轉移到細菌培養皿中，挑取直徑為0. 5 0. 7毫米的腫瘤球體放到預加了冷基質凝膠溶液細胞混合物的孔中央，將此多孔盤轉移到含有100%溼度的細胞培養箱中使冷基質凝膠溶液凝固，之後，取出此多孔盤，將培養液加入各個孔中，最後，將培養盤放置在含100%溼度的培養箱中進行培養並觀察結果；b.組織活檢樣品的製備將採集的組織活檢樣品保存在保存液中備用；把活檢樣品從保存液中取出後，經過 70 %的酒精溶液浸洗若干次，中性磷酸緩衝液浸洗若干次後，轉移到細胞培養皿中，並分割成小塊，置於預加了冷基質凝膠溶液細胞混合物的多孔盤的孔中央；然後，將此多孔盤轉移到含有100%溼度的細胞培養箱中使冷基質凝膠溶液凝固；取出此多孔盤，將培養液加入各個孔中；最後，將培養盤放置在含100%溼度的培養箱中進行培養，觀察。
18.根據權利要求17所述的製備方法，其特徵在於所述基質凝膠溶液細胞混合物或培養液中添加有被測試的試劑。
19.根據權利要求17所述的製備方法，其特徵在於血管內皮細胞的使用密度為 140，000-1，000，000細胞/ml，周細胞或者其他種類細胞按照與血管內皮細胞1 50 1 5比例添加到基質凝膠溶液中；所述基質凝膠溶液為適合細胞培養的動物體內提取的基質凝膠或者人工合成的類基質凝膠產品或者是兩者按照1 3 1 1的比例的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種新型體外檢測新生血管的多種細胞三維立體共培養體系及其標準化試劑盒。本發明共培養體系主要包括兩層，第一層是基質凝膠細胞，或是基質凝膠細胞組織混合物，或是基質凝膠組織混合物，緊貼在培養器皿的底部，血管內皮細胞均勻分散在凝膠層中，以及腫瘤細胞類細胞團、或腫瘤組織的活檢樣品、或胰島組織的活檢樣品、子宮內膜組織活檢樣品、或其他組織器官的活檢樣品懸浮在凝膠層中；第二層是細胞培養液，在第一層上面。本發明試劑盒是高通量篩藥試劑盒或標準化個性化試劑盒。應用本發明，通過觀察血管內皮細胞的血管再生水平，可高通量地篩選抑制血管再生的和促進血管再生的新藥、特藥，可應用於癌症患者的個性化治療及耐藥性的監測。
文檔編號C12Q1/02GK102559579SQ201010593348
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月17日 優先權日2010年12月17日
發明者徐進, 朱小林, 郭衡 申請人:北京東方潤龍投資有限公司