高複雜度哺乳動物展示文庫及其篩選方法

2023-08-11 06:21:21 4

專利名稱：高複雜度哺乳動物展示文庫及其篩選方法
技術領域：
本申請涉及哺乳動物多肽展示文庫、特別是哺乳動物的全長抗體展示文庫的構建和篩選。
背景技術：
通過細胞表面展示技術，包括噬菌體展示、核糖體/mRNA展示和酵母展示，有可能進行特異性結合靶抗原的抗體的高通量篩選。(Hoogenboom等，Nature Biotechnology (2005)，23 (9) 1105-1116)。儘管這些篩選平臺各自具有其特殊的優點，但它們都基於抗體在不同於哺乳動物細胞的環境中的表達。在那些系統中產生的蛋白質，與哺乳動物細胞中產生的相比，蛋白質摺疊、糖基化、二硫鍵形成和/或修飾可能不同。為了避免這些問題，已經開發了基於抗體在其自然環境、即哺乳動物細胞中表達的篩選平臺。例如，通過研究，已開發了允許在哺乳動物細胞表面上展示免疫球蛋白小型文庫的抗體展示技術。參見例如Higuchi等，J. Immun. Methods (1997) 202 :193-204。在哺乳動物細胞中執行抗體篩選的一個主要缺點是能夠篩選的抗體的數量受限。因為每個哺乳動物細胞在轉染過程中能夠攝取編碼不同抗體的大量不同多核苷酸，從產生抗體的哺乳動物細胞分離出編碼抗體的多核苷酸既困難又繁瑣。因此，在哺乳動物展示領域的嘗試集中於建立的哺乳動物展示系統在每個哺乳動物細胞中存在較少量不同多核苷酸。例如， W005/063817公開了一種篩選全長抗體小型文庫的方法。在將單基因拷貝均勻整合到每個細胞中之後，將群體通過流式細胞術進行分揀，以獲得表達具有高結合親和性抗體的細胞。 也參見US2005/0059082和W008/070367。大多數目前可用的哺乳動物展示技術不能用於篩選編碼大量不同抗體的多核苷酸的高度複雜的文庫。儘管噬菌體展示技術允許在單次淘選循環中篩選IOltl至甚至IO15個克隆，但現有方法中的哺乳動物展示篩選程序的通量限於同時分析約IO6至IO7個克隆。因此，對於允許高複雜度哺乳動物展示文庫篩選的篩選方法和系統，存在著需求。在本文中提到的所有出版物、專利、專利申請和公布的專利申請的公開內容，在此以其全文引為參考。發明概述本發明提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其包括編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的篩選方法、編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的富集方法、含有編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的哺乳動物細胞的分離方法、含有編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的哺乳動物細胞的篩選方法、具有所需性質的多肽的鑑定方法以及獲得具有所需性質的多肽的方法。在某些實施方案中，方法包含a)從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染) 的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用多核苷酸的子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，將步驟b)和c)重複一次以上。在某些實施方案中，方法還包含a)將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸子文庫，其中細胞亞群通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，方法包含從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得。在某些實施方案中，多肽是異聚蛋白。在某些實施方案中，多肽是抗體。在某些實施方案中，提供了編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c) 從用多核苷酸的子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，初級文庫中的多核苷酸編碼至少IO9種(包括例如約101(1、 10"、1012、1013、1014、1015和IO"5種中的任一個數量)不同多肽。在某些實施方案中，哺乳動物細胞的初始群體在群體中的各個哺乳動物細胞能夠攝取約100個以上、例如約103、104、105 或IO6個中的任一個數量以上的不同多核苷酸拷貝的條件下，用初級文庫進行瞬時轉染。在某些實施方案中，步驟C)中的篩選條件比步驟a)的條件更嚴緊。在某些實施方案中，提供了編碼具有所需性質的異聚蛋白的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中哺乳動物細胞的初始群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的初級文庫進行轉染(例如瞬時轉染)，並且其中第一種多肽和第二種多肽在細胞表面上形成異聚蛋白；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成 cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從隨後的哺乳動物細胞群體篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群，其中所述隨後的哺乳動物細胞群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的子文庫進行轉染，並且其中第一種多肽和第二種多肽形成異聚蛋白；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。
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在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼抗體的多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群； b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，初級文庫中的多核苷酸編碼至少IO9種不同抗體。在某些實施方案中，步驟a)包含(i)將哺乳動物細胞的初始群體在適當的結合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟c)包含(i)將富集的哺乳動物展示文庫在適當的結合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟d)包含i)從細胞亞群分離mRNA，ii)將mRNA擴增成cDNA ；iii)將cDNA克隆到克隆載體中；以及iv)測定DNA的序列。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別特定抗原的抗體的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)篩選出用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個初級文庫瞬時轉染、並在細胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動物細胞的初始群體，以獲得哺乳動物細胞的亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成 cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)篩選出用多核苷酸子文庫轉染並在細胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動物細胞群體，以獲得哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別特定抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重複至少一次。在某些實施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重複不超過約3次。在某些實施方案中，初級文庫中的多核苷酸編碼至少IO9種不同抗體。在某些實施方案中，步驟a)包含(i)將哺乳動物細胞的初始群體在適當的結合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟c)包含(i)將富集的哺乳動物展示文庫在適當的結合條件下與抗原相接觸；以及(ii)回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟d)包含i)從細胞亞群分離mRNA，ii)將mRNA擴增成cDNA;iii)將cDNA 克隆到克隆載體中；以及iv)測定DNA的序列。在某些實施方案中，哺乳動物細胞的初始群體在群體中的各個哺乳動物細胞能夠攝取約100個以上、例如約103、104、105或IO6個中的任一個數量以上的不同多核苷酸拷貝的條件下，用初級文庫進行瞬時轉染。在某些實施方案中，方法還包含將多核苷酸的初級文庫瞬時轉染到哺乳動物細胞的初始群體中。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸初級文庫轉染的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞， 並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生編碼輕鏈的第一個多核苷酸子文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸子文庫；c)從用第一個多核苷酸子文庫和第二個多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；d)將從所述哺乳動物細胞的第二個亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生編碼輕鏈和重鏈的第三個多核苷酸子文庫；e)從用第三個多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第三個亞群；以及f)從所述哺乳動物細胞的第三個亞群分離編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。另一方面，提供了用編碼抗體的多核苷酸瞬時轉染的哺乳動物細胞群體，其中多核苷酸總計編碼至少約IO9種不同重組抗體。還提供了用於執行本文描述的方法的文庫和試劑盒。還提供了在篩選過程中產生的子文庫和從本文描述的方法獲得的多核苷酸/多肽。附圖簡述

圖1提供了示意圖，其顯示了本文描述的示例性篩選方法。圖2提供了示意圖，其顯示了示例性的單盒表達載體。酶1-3是指能夠被不同限制性酶識別(例如識別非迴文序列的限制性酶)的限制性酶切割位點，其中用所述限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。圖3提供了構建單盒表達載體pDGB-HC-TM的程序的示意圖。HC-TM片段通過 RT-PCR擴增和PCR裝配產生。在PCR反應過程中將限制性酶識別序列合併到片段中。將片段插入到載體PCDNA5-FRT中以形成過渡載體。然後從過渡載體刪除潮黴素表達盒，以形成載體 pDGB-HC-TM。圖4顯示了載體pDGBHC-TM的限制性酶消化結果。將載體用5種限制性酶以四種方式進行消化，並通過在瓊脂糖凝膠中電泳來分析。Μ:11Λ以上DNA分子量梯 (Invitrogen) ；A =Nhel+Xhol ；B =Sfil ；C =BsmBI ；D :BstXI。圖5A提供了構建雙盒表達載體的程序的示意圖。通過PCR擴增4個片段，並通過四路G-way)連接將它們連接在一起，以形成載體pDGB4。然後將FCS插入到載體中以形成載體 pDGB4-FCS。圖5B顯示了載體pDGB4的限制性酶消化結果。將pDGB4的16號克隆的純化質粒 DNA用3種限制性酶以5種方式進行消化，並在1 %瓊脂糖-TBE凝膠中進行電泳分析。M DNA 分子量梯；1 =SfiI I ；2 =BstX I ；3 =BsmB I ；4 =BstX I+Sfi I ；5 =BsmB I+Sfi I。發明詳述本發明提供了從哺乳動物展示文庫篩選出具有所需性質的多肽的高效方法。方法是基於下述事實，即儘管用外來DNA質粒轉染的每個哺乳動物細胞能夠含有多達IO6個質粒拷貝，但只有一小部分(例如約IO2-IO3個拷貝)質粒被轉錄成mRNA並表達成多肽。因此，來自從哺乳動物展示文庫篩選中獲得的陽性細胞的mRNA，與那些細胞中的DNA相比，複雜度明顯更低(例如複雜度低至少1000倍)。本發明的方法利用了這種複雜度的降低。在從原始哺乳動物展示文庫中對展示具有所需性質的多肽的細胞進行初始篩選並獲得富集有那些細胞的哺乳動物細胞亞群後，從哺乳動物細胞的富集亞群分離mRNA並通過方法例如RT_PCR(反轉錄酶PCR)進行擴增，以產生多核苷酸的合併物(子文庫)。將該多核苷酸合併物繼而導入哺乳動物細胞並進行另一輪文庫篩選。第二輪篩選過程可以重複例如一次、兩次或多次。本文描述的方法允許對哺乳動物展示文庫進行高效篩選，使得能夠以至少IO9的多樣性篩選哺乳動物展示文庫。本文提供的方法特別適合於篩選異聚蛋白。例如，提供了篩選抗體的方法。在一個示例性方法中，將抗體輕鏈的初級文庫和抗體重鏈的初級文庫共轉染到哺乳動物細胞中，允許在細胞表面上展示抗體。在對哺乳動物細胞進行初始篩選以獲得富集有表達所需抗體的細胞的哺乳動物細胞亞群後，從所述哺乳動物細胞亞群提取mRNA，通過RT-PCR擴增並克隆到適合的載體中，以產生重鏈的子文庫和輕鏈的子文庫。將重鏈和輕鏈的子文庫繼而導入哺乳動物細胞中，並進行另一輪文庫篩選。第二輪篩選可以重複例如一次、兩次或多次。 在篩選方法的最後階段，將抗體輕鏈和重鏈克隆到雙表達盒載體中，以產生單一抗體文庫 (與兩個不同文庫相反)。然後將單一文庫進行最後一輪篩選，以獲得編碼所需抗體的多核苷酸。圖1進一步提供了示意圖，其顯示了篩選抗體展示文庫的示例性方法。因此，一方面，本發明提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法或利用哺乳動物展示文庫篩選來分離編碼具有所需性質的多肽(例如抗體)的多核苷酸的方法。另一方面，提供了用編碼多肽(例如抗體)的多核苷酸瞬時轉染的哺乳動物細胞群體，其中所述多核苷酸在哺乳動物細胞表面上總計編碼至少IO9種不同的重組多肽。另一方面，提供了產生用於哺乳動物展示篩選的多核苷酸文庫的方法，其中所述多核苷酸總計編碼至少IO9種不同的重組多肽(例如抗體)。還提供了用於執行本文描述的方法的試劑盒。還提供了通過本文描述的方法分離的多核苷酸和由所述多核苷酸編碼的多肽。應該理解，前面的一般性描述和下面的詳細描述都僅僅是實例性和解釋性的，並且不對本文描述的組合物和方法構成限制。在本申請中，除非另外特別指明，否則單數形式的使用包括了複數形式。此外，「或」的使用意味著「和/或」，除非指明不是如此。同樣地， 「包含」和「包括」不打算是限制性的。應該理解，本文描述的本發明的方面和實施方案包括「由方面和實施方案構成」和 /或「基本上由方面和實施方案構成」。定義當在本文中使用時，下列術語和詞組打算具有下列含義「展示」或「哺乳動物展示」是指在哺乳動物宿主細胞表面上呈遞不同的重組多肽。本文中使用的「文庫」是指多核苷酸的多樣化集合體或混合物，其包含編碼不同重組多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，多核苷酸文庫可以在給定的多核苷酸集合體內包含至少IO6UO7UO8UO9UOiqUOiiUOi2UO13UO14UO15種或更多的不同多核苷酸。典型地， 文庫中的不同多核苷酸是相關的，例如它們源自於單一動物物種(例如人、小鼠、兔、山羊、 馬)、組織類型、器官或細胞類型。「文庫」可以包含共同屬類的多核苷酸。例如，屬類可以是編碼某一型和類的免疫球蛋白亞基多肽的多核苷酸，例如，文庫可以編碼抗體μ、Y 1、Y2、 Υ3, γ4、α 1、α 2、ε或δ重鏈，或抗體κ或λ輕鏈。儘管本文描述的任一文庫的每個成員可能編碼相同的重鏈或輕鏈恆定區，但文庫可以總計包含至少106、107、108、109、101(1、 10"、1012、1013、1014或IO15種不同的可變區，即與共同恆定區相伴的「多種」可變區。「哺乳動物展示文庫」是指包含編碼能夠展示在哺乳動物細胞上的不同重組多肽的多核苷酸的文庫。在某些情形中，術語還通常用於包括用多核苷酸文庫轉染的哺乳動物細胞。文庫的「多樣性」是指文庫中由多核苷酸編碼的不同重組多肽的數量。本文中使用的「篩選」是指對包含所需物質的合併物進行可以檢測到所需物質的測定、然後回收或獲得其中所需物質被檢測到並任選被富集的合併物的等份試樣的方法。
本文中使用的「回收」是指將所需物質與合併物的不需要的其餘部分粗略分離。篩選條件的「嚴緊性」是指用於篩選方法的測定條件。例如，當執行與特定結合配偶體的結合測定時，篩選條件的嚴緊性是指結合測定條件的嚴緊性。「哺乳動物細胞群體」是指其中可以導入並展示多核苷酸文庫的哺乳動物細胞群。 儘管優選情況下細胞群體是單一培養物，即群體中的每個細胞是相同細胞類型的，但也設想了細胞的混合培養物。細胞可以是黏附的，即附著於固相基質生長的細胞，或供選地，細胞可以處於懸浮狀態。哺乳動物細胞可以是源自於原發腫瘤的細胞、源自於轉移腫瘤的細胞、初級細胞、已經失去接觸抑制的細胞、轉化的初級細胞、永生化的初級細胞、可以經歷凋亡的細胞，以及從它們衍生的細胞系。「抗體」是免疫球蛋白分子，其能夠通過位於所述免疫球蛋白分子可變區中的至少一個抗原識別位點與靶例如糖類、多核苷酸、脂類、多肽等結合。當在本文中使用時，該術語不僅涵蓋完整的多克隆或單克隆抗體，而且包含其片段(例如Fab、Fab』、F(ab』)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、天然存在的變體、包含具有所需特異性的抗原識別位點的抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體，以及包含具有所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。「人源化」抗體是指這樣的分子，其具有基本上源自於非人類物種免疫球蛋白的抗原結合位點，並且分子的其餘免疫球蛋白結構是基於人類免疫球蛋白的結構和/或序列。 抗原結合位點可以包含融合到恆定結構域上的完整可變結構域，或只含有嫁接到可變結構域中適合的構架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型，或可以通過一個或多個胺基酸取代加以修飾，例如被修飾成與人類免疫球蛋白更類似。某些形式的人源化抗體保留了所有CDR序列(例如包含來自於小鼠抗體的所有6個CDR的人源化小鼠抗體)。其他形式的人源化抗體具有相對於原始抗體來說改變的一個或多個CDR(1、2、3、4、5、6個)， 其也被稱為「源自於」 一個或多個⑶R的一個或多個⑶R。「嵌合抗體」是指這樣的抗體，其中重鏈和輕鏈的每個胺基酸序列的一部分與源自於特定物種或屬於特定類型的抗體的相應序列同源，而鏈的其餘區段與與另一種抗體的相應序列同源。典型地，在這些嵌合抗體中，輕鏈和重鏈兩者的可變區都模擬源自於一個哺乳動物物種的抗體的可變區，而恆定區部分與源自於另一物種的抗體中的序列同源。這種嵌合形式的一個明顯優點是，例如，可以使用來自非人類宿主生物的容易獲得的雜交瘤或B 細胞，從當前已知的來源方便地產生可變區，並與源自於例如人類細胞製備物的恆定區組合。在可變區具有容易製備的優點、並且特異性不受其來源影響的同時，當注射抗體時，人類的恆定區與來自於非人類來源的恆定區相比，引發人類對象的免疫應答的可能性更低。 然而，定義不限於該具體實例。抗體的「可變區」是指單獨或組合的抗體輕鏈可變區或抗體重鏈可變區。重鏈和輕鏈可變區各由四個構架區(FR)構成，所述架構區通過三個互補決定區(CDR)、也稱為超變區相連。每條鏈中的CDR由FR保持緊鄰在一起，並且與來自另一條鏈的CDR共同促成抗體的抗原結合位點的形成。至少存在兩種確定CDR的技術(1)基於物種交叉序列變異性的方法(艮口 Kabat等，《免疫重要的蛋白質的序歹lj》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第五版，1991，National Institutes of Health, Bethesda MD))；以及(2)基於抗原-抗體複合物的晶體學研究的方法(ΑΙ-lazikani等，(1997) J. Molec. Biol. 273 927-948)。當在本文中使用時，CDR可以是指由任一種方法或兩種方法的組合定義的CDR。抗體的「恆定區「是指單獨或組合的抗體輕鏈恆定區或抗體重鏈恆定區。抗體或多肽與抗原或靶「特異性結合」或「優先結合」，是指它的結合與它對其他物質的結合相比親和性、親合力更高、更容易結合和/或持續時間更長。通過閱讀本定義，應該理解，與第一個靶特異性或優先結合的抗體或多肽，可以或不可以與第二個靶特異性或優先結合。因此，「特異性結合」或「優先結合」不是必定要求(儘管可以包括)排他性結合。一般來說，但不是必需的，結合是指優先結合。術語「全長抗體」、「完整抗體」或「整個抗體」在本文中可互換使用，是指抗體處於其基本上完整的形式而不是抗體片段。具體來說，該術語是指具有包含Fc區的重鏈的抗體。全長抗體可以是天然序列的抗體或抗體變體。「抗體片段「只包含完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結合位點，從而保留了結合抗原的能力。本定義涵蓋的抗體片段的實例包括(i)Fab片段，其具有VL、CL、 VH和CHl結構域；(ii) Fab'片段，其是在CHl結構域的C-端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CHl結構域；(iv)Fd'片段，其具有VH和CHl結構域並在CHl結構域的C-端具有一個或多個半胱氨酸殘基；(v)Fv片段，其具有單個抗體的VL 和VH結構域；(vi)dAb片段，其由VH結構域構成；(vii)分離的CDR區；(viii)F(ab' )2片段，其是二價片段，包含在鉸鏈區由二硫橋相連的兩個Fab'片段；(ix)單鏈抗體分子(例如單鏈Fv ；scFv) ； (χ)具有兩個抗原結合位點的「雙抗體(diabodies) 」，其包含連接在同一個多肽鏈中的重鏈可變結構域(VH)和輕鏈可變結構域(VL) ； (xi) 「線性抗體「，其包含一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，與互補的輕鏈多肽一起形成了一對抗原結合區。當在本文中使用時，術語「重鏈」是指較大的免疫球蛋白亞基，其通過氨基端區域與免疫球蛋白輕鏈結合。重鏈包含可變結構域和恆定結構域。恆定結構域還包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3結構域。在IgE、IgM和IgY的情況下，重鏈包含CH4結構域但是不具有鉸鏈結構域。詞組「免疫球蛋白重鏈恆定結構域」是指CH1、鉸鏈、CH2、CH3、CH4結構域或其任何組合。本文中使用的術語「輕鏈」是指較小的免疫球蛋白亞基，其與重鏈的氨基端區域結合。與重鏈相同，輕鏈包含可變區和恆定區。存在兩種不同類型的輕鏈，κ和λ，其在本文中被稱為「免疫球蛋白輕鏈恆定結構域」。一對輕鏈可以與一對任一種的各種重鏈結合，形成免疫球蛋白分子。在輕鏈的意義中還涵蓋了具有與κ恆定區(C-K)相連的λ可變區 (V-λ)或與λ恆定區(C-λ)相連的Κ可變區(V-K)的輕鏈。術語「抗體變體」當在本文中使用時，是指在重鏈和/或輕鏈中具有單個或多個突變的抗體。在某些實施方案中，突變存在於可變區中。在某些實施方案中，突變存在於恆定區中。當在本文中使用時，「核酸」或「多核苷酸」或語法等價物是指共價連接在一起的至少兩個核苷酸。核酸和多核苷酸是任何長度的聚合物，包括例如200、300、500、1000、2000、 3000、5000、7000、10，000等。本文描述的核酸一般含有磷酸二酯鍵，儘管在某些情況下包括了可以具有至少一個不同鍵例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或0-甲基氨基磷酸酯鍵以及肽核酸骨架和鍵的核酸類似物。可以製造天然存在的核酸和類似物的混合物； 或者，可以製造不同核酸類似物的混合物以及天然存在的核酸和類似物的混合物。
當在本文中使用時，術語「多肽」是指胺基酸殘基的聚合物。當在本文中使用時， 術語「多肽」包含蛋白、肽和異聚蛋白。術語多肽還適用於其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然存在胺基酸的人造化學模擬物的聚合物，以及含有修飾殘基的天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。在本發明的情形中，術語「多肽」涵蓋異聚蛋白，例如抗體(例如全長抗體)。本文中使用的「異聚蛋白」是指具有至少兩個多肽鏈的蛋白，其中至少兩個多肽鏈彼此不同。例如，異聚蛋白可以是具有輕鏈和重鏈的抗體。在某些實施方案中，異聚蛋白是 T細胞受體。在某些實施方案中，異聚蛋白是本文所述的抗體樣肽體(peptibody)。本文中使用的「肽體」是指其中多肽與抗體的重鏈或輕鏈恆定區的N-端融合的嵌合分子。例如，多肽可以融合到抗體重鏈的Fc區。或者，多肽可以融合到重鏈的全長恆定區。多肽也可以融合到抗體輕鏈的CL區。本文中的術語「重組」多核苷酸是指正常情況下在其天然環境中不能發現的多核苷酸。應該理解，當重組多核苷酸被製造並重新導入宿主細胞或生物體後，它將非重組地複製，即使用宿主細胞的體內細胞機制而不是體外操作；然而，這種核酸一旦重組產生後，儘管隨後非重組地複製，但出於本發明的目的仍被當作是重組的。術語「重組多肽」是使用重組技術、例如通過如上所述的重組核酸的表達所製造的多肽。術語「異源的」當用於指稱核酸的部分時，表示核酸包含兩個或多個正常情況下彼此不能發現相同的關係的子序列。例如，核酸典型通過重組產生，使得兩個或多個來自於例如不相關基因的序列、例如來自一個來源的啟動子和來自另一個來源的編碼區進行排列以製造新功能性核酸。同樣地，異源蛋白經常是指兩個或多個彼此不能發現相同關係的子序列，例如融合蛋白。「啟動子」典型是一批指導核酸轉錄的核酸控制序列。當在本文中使用時，啟動子包括轉錄起始位點附近的必需核酸序列，例如II型聚合酶啟動子情況下的TATA元件。啟動子還任選包括遠處的增強子或阻遏子元件，其可位於距轉錄起始位點多達幾千鹼基對的位置。「組成型」啟動子是在大多數環境和發育條件下有活性的啟動子。「誘導型」啟動子是在環境或發育調控下有活性的啟動子。「可操作連接的」是指兩個或多個組分的並置，其中所描述的組分處於允許它們以所打算的方式起作用的關係下。例如，啟動子和/或增強子如果以順式起作用控制或調節相連編碼序列的轉錄，則其與編碼序列是可操作連接的。一般來說，但不是必需地，「可操作連接的」DNA序列是鄰接的，在需要連接兩個蛋白編碼區時或在分泌前導區的情況下，是鄰接並且同閱讀框的。然而，儘管可操作連接的啟動子一般位於編碼序列的上遊，但它不是必需與其鄰接的。聚腺苷化位點如果位於編碼序列的下遊末端，使得轉錄經過編碼序列進入聚腺苷化序列，則聚腺苷化位點與編碼序列可操作連接。連接通過本技術領域已知的重組方法實現，例如使用PCR方法、通過退火、或通過在方便的限制性位點連接。如果不存在方便的限制性位點，那麼按照常規實踐使用合成的寡核苷酸適配體或接頭。當在本文中使用時，術語「轉染」或「轉化」或「轉導」是指將外源核酸轉移或導入到宿主細胞中的過程。轉化的細胞包括對象的初級細胞及其後代。宿主細胞可以是細菌、 酵母、哺乳動物細胞和植物細胞。
當在本文中使用時，「細胞表面束縛結構域(tether domain) 」是指賦予多肽與宿主細胞外膜相連的能力的胺基酸序列，並且其有時不總是天然存在於目標蛋白中。正如在本文中所述，細胞表面束縛結構域包括例如跨膜結構域或糖基化磷脂醯肌醇(GPI)信號序列。當在本文中使用時，術語「表達載體」是指自我複製的多核苷酸，並且在本發明中， 包含表達構建物。表達載體將包含至少一個複製原點(也稱為「複製起點」)。複製原點賦予在宿主中複製的能力，並可以是病毒、真核或原核生物的。表達載體可用於穩定或瞬時轉染真核細胞系，或可用於原核細胞的轉化。表達載體可以存在於瞬時轉染體中的染色體之外。在穩定轉染體中，表達載體可以作為游離體載體繁殖，或者可以整合到宿主細胞染色體中。本發明的表達載體可以進一步包含至少一個選擇性標記基因，以便於原核或真核轉染體的識別。當在本文中使用時，表達載體可以包括真核和原核的複製起點。當在本文中使用時，術語「信號肽」是指介導蛋白通過包圍ER的膜插入的疏水序列。I型跨膜蛋白也包含信號序列。當在本文中使用時，「信號序列」是氨基端疏水序列， 其通常在一部分或整個蛋白通過ER膜插入到ER腔中之後被酶切除。因此，在本技術領域中已知序列的信號前體形式可以作為蛋白前體形式的一部分存在，但是在蛋白的成熟形式中一般不存在。當蛋白被稱為包含信號序列時，應該理解為儘管蛋白的前體形式包含信號序列，但蛋白的成熟形式將可能不包含信號序列。在哺乳動物細胞中有功能的信號肽或序列的實例包括下列美國專利No. 4，965，195中描述的白介素_7(IL_7)的信號序列；Cosman等((1984)，Nature 312 :768)中描述的白介素_2受體的信號序列；歐洲專利 No. O 367 566中描述的白介素-4受體的信號肽；美國專利No. 4，968，607中描述的I型白介素-1受體的信號序列；歐洲專利No. O 460 846中描述的II型白介素_1受體的信號肽；人類IgG的信號序列(其是METDTLLLWVLLLWVPGSTG)；以及人類生長激素的信號序列 (MATGSRTSLLLAFGLLCLPffLQEGSA) 0許多其他信號序列在本技術領域中是已知的。在某些實施方案中，信號肽可以是目標蛋白的天然存在的信號肽，或者它可以是異源信號肽。術語「結合配偶體」在本文中以其最廣的含義使用，是指兩個或多個在體外/體內條件下能夠互相結合的多肽序列。這種結合配偶體的實例包括但不限於抗體與抗原、配體與受體、酶與底物。當在本文中使用時，除非另有指明，否則不帶具體數量指稱的名詞可以是指單數或複數(即可以是指一個或多個)。本發明的方法本發明提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其包括編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的篩選方法、編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的富集方法、含有編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的哺乳動物細胞的分離方法、含有編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的哺乳動物細胞的篩選方法、具有所需性質的多肽的鑑定方法以及獲得具有所需性質的多肽的方法。方法一般需要將從以前的文庫篩選中回收的哺乳動物細胞亞群提取的 mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫。該步驟可以重複一次或多次。在某些實施方案中，本發明提供的方法包含a)從用多核苷酸的初級文庫轉染 (例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，
12並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用多核苷酸的子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，將步驟b)和c)重複一次以上。在某些實施方案中，方法包含a)將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸子文庫，其中細胞亞群通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，方法包含從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得。在某些實施方案中，多肽是異聚蛋白。在某些實施方案中，多肽是抗體。在某些實施方案中，本發明提供了編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用多核苷酸的子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，初級文庫中的多核苷酸編碼至少IO9種不同多肽。在某些實施方案中，哺乳動物細胞的初始群體在群體中的各個哺乳動物細胞能夠攝取約100個以上、例如約103、104、105或IO6個中的任一個數量以上的不同多核苷酸拷貝的條件下，用初級文庫進行瞬時轉染。在某些實施方案中，步驟c)中的篩選條件比步驟a)的條件更嚴緊。在某些實施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和C)重複至少一次。在某些實施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重複不超過約3次。在某些實施方案中，方法還包含將多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)到哺乳動物細胞的初始群體中。在某些實施方案中，步驟b)還包含將所述多核苷酸子文庫轉染(例如瞬時轉染)到哺乳動物細胞中。 在某些實施方案中，步驟b)中cDNA的擴增通過PCR執行。在某些實施方案中，cDNA使用一組引物通過PCR擴增。在步驟b)和C)被重複至少一次的某些實施方案中，後面步驟中的測定條件可以比前面步驟中的條件更嚴緊。在方法的後面步驟中高嚴緊性的篩選條件允許多核苷酸在後來的哺乳動物細胞亞群中進一步富集並便於分離。在某些實施方案中，提供了編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫，其中細胞亞群通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染) 的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及C)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，提供了編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得；以及b)從所述哺乳動物細胞亞群分離出編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其中方法包含a)從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用多核苷酸的子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其中方法包含a)將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸子文庫，其中細胞亞群通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其中方法包含從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得。在某些實施方案中，所需性質是與結合配偶體的特異性結合。例如，在某些實施方案中，提供了編碼識別結合配偶體的多肽的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示識別結合配偶體的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用多核苷酸的子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示識別結合配偶體的多肽的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。在某些實施方案中，步驟a)包含i)將哺乳動物細胞的初始群體與結合配偶體相接觸；以及ii)回收與結合配偶體結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟c)包含i)將哺乳動物細胞群體與結合配偶體相接觸；以及ii)回收與結合配偶體結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟c)中的結合條件比步驟a)中的更嚴緊。在步驟b)和c)被重複至少一次的某些實施方案中，後面步驟中的結合條件比前面步驟中的條件更嚴緊。在某些實施方案中，方法被用於分離編碼異聚蛋白的多核苷酸。例如，在某些實施方案中，提供了編碼具有所需性質的異聚蛋白的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a) 從哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞，並回收哺乳動物細胞的亞群，其中將哺乳動物細胞的初始群體用編碼第一種多肽和第二種多種的多核苷酸的初級文庫進行轉染(例如瞬時轉染)，並且其中第一種多肽與第二種多肽在細胞表面上形成異聚蛋白；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述 cDNA,以產生多核苷酸的子文庫；c)從隨後的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群，其中將所述隨後的哺乳動物細胞群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的子文庫進行轉染，並且其中第一種多肽與第二種多肽形成異聚蛋白；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼具有所需性質的多肽的多核苷酸。編碼異聚蛋白中不同多肽的多核苷酸可以存在於單一載體中(例如雙盒表達載體)或分開的載體上。因此，在某些實施方案中，上面描述的方法中的步驟a)包含對用編碼第一種多肽的第一個多核苷酸初級文庫和編碼第二種多肽的第二個初級文庫轉染的哺乳動物細胞初始群體進行篩選。在某些實施方案中，方法還包含將編碼第一種多肽的第一個初級文庫和編碼第二種多肽的第二個初級文庫轉染到哺乳動物細胞的初始群體中，其中第一種多肽和第二種多肽在細胞表面上形成異聚蛋白。在某些實施方案中，第一個初級文庫和第二個初級文庫一起編碼了至少IO9種不同的異聚蛋白。在某些實施方案中，上面描述的方法中的步驟b)包含擴增所述cDNA以產生編碼第一種多肽的第一個多核苷酸子文庫和編碼第二種多肽的第二個多核苷酸子文庫。在某些實施方案中，步驟b)還包含將兩個多核苷酸子文庫轉染到哺乳動物細胞群體中。在某些實施方案中，步驟a)和步驟c)都涉及用兩種(或多種)不同的多核苷酸文庫轉染的哺乳動物細胞。正如在下面更詳細討論的， 可以使用兩個不同的引物組來分別擴增編碼第一種多肽的多核苷酸和編碼第二種多肽的多核苷酸，從而允許將這些多核苷酸克隆到不同載體中。在不同水平的篩選循環中使用不同的多核苷酸文庫，增加了展示在哺乳動物細胞上的異聚蛋白的多樣性。例如，通過使用多樣性為IO4的第一個初級文庫和多樣性為IO5的第二個初級文庫，可以呈遞在哺乳動物細胞表面上的不同異聚蛋白的總數將為至少109。如果異聚蛋白可以具有兩種以上不同的多肽鏈，多樣性可能甚至更高。同樣地，使用第一個子文庫和第二個子文庫允許進行改組。例如，通過將第一個子文庫與第二個子文庫相組合，可以在異聚蛋白中產生多肽的新組合。這可以允許產生具有更好的所需性質的異聚蛋白。本技術領域的普通專業人員可以理解，當步驟b)和C)被重複至少一次時，一輪 RT-PCR能夠產生兩個或多個多核苷酸子文庫，而另一輪RT-PCR能夠產生多核苷酸的單一子文庫。例如，儘管在篩選的早期階段期間適宜使用不同的載體以增加多樣性，但在後面輪的篩選中有時優選使用編碼第一種多肽和第二種多肽兩者的單一載體，以便最終分離到的多核苷酸將能編碼這兩種所需多肽。例如，在某些實施方案中，提供了編碼具有所需性質的異聚蛋白的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從哺乳動物細胞的初始群體中篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞並獲得哺乳動物細胞的亞群，其中將哺乳動物細胞的初始群體用編碼第一種多肽和第二種多肽的多核苷酸的初級文庫進行轉染(例如瞬時轉染)，並且其中第一種多肽和第二種多肽在細胞表面上形成異聚蛋白；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生編碼第一種多肽的第一個多核苷酸子文庫和編碼第二種多肽的第二個多核苷酸子文庫；C)從隨後的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞並回收哺乳動物細胞的第二個亞群， 其中將所述隨後的哺乳動物細胞群體用編碼第一種多肽的第一個多核苷酸子文庫和編碼第二種多肽的第二個多核苷酸子文庫進行轉染，其中第一種多肽和第二種多肽形成異聚蛋白；d)將從所述哺乳動物細胞的第二個亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA， 以產生編碼第一種多肽和第二種多肽的第三個多核苷酸子文庫；e)從用第三個子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質的異聚蛋白的細胞，並回收哺乳動物細胞的第三個亞群；以及f)從所述哺乳動物細胞的第三個亞群分離出編碼具有所需性質的異聚蛋白的多核苷酸。正如在本文中進一步討論的，在某些實施方案中，展示在哺乳動物細胞表面上的多肽可以部分或完全從哺乳動物細胞釋放。這允許在功能研究中對多肽進行進一步分析。本文中描述的方法可應用於任何種類的多肽的篩選，並且特別適合於篩選異聚蛋白。方法特別適合於例如生產蛋白複合物，例如抗體、τ-細胞受體、I類和II類MHC分子、 整合蛋白、CD8、CD28和VIII因子分子。還設想了篩選具有所需性質的新異聚蛋白的系統和方法。在某些實施方案中，將不同多肽與二聚化結構域融合，並允許配成對以形成異聚蛋白。通過按照本文描述的方法， 可以鑑定具有所需性質的異聚蛋白。因此，在某些實施方案中，提供了包含異源多肽與二聚化結構域融合的融合蛋白。在某些實施方案中，融合蛋白還包含膜束縛結構域。二聚化結構域可以是抗體恆定區。例如，在某些實施方案中，提供了抗體樣肽體，即包含多肽與輕鏈恆定區融合和多肽與重鏈恆定區融合的多聚體肽體，其中重鏈和輕鏈恆定區二聚化以產生抗體樣分子。例如，在某些實施方案中，抗體樣肽體含有兩個多肽與輕鏈恆定區融合的和兩個多肽與重鏈恆定區融合。抗體樣肽體中的多肽可以是不同或相同的。在下面的部分中，提供了對抗體的詳細描述。然而，本技術領域的普通專業人員應該理解，該描述同樣適用於其他類型的多肽。因此，例如，關於抗體輕鏈和重鏈的討論同等地適用於T細胞受體的α和β鏈，或抗體樣肽體的不同多肽鏈。還應該理解，在某些實施方案中，下面的描述也可以適用於抗體片段(包括Fab、Fab'、Fd、Fd'、Fv、dAb、分離的 ⑶R區；F(ab' )2、scFv)、雙抗體、線性抗體和嵌合抗體。同樣地，儘管下面提供的描述聚焦於分離編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸，但方法同等地適用於分離編碼具有其他所需性質的多肽(例如抗體)的多核苷酸，所述的其他所需性質包括例如與配偶體特異性結合、對結合配偶體更高的結合親和性、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、激動劑或拮抗劑功能、凋亡的誘導或抑制、血管發生、增殖、信號傳導途徑抑制的活化。多種性質可以同時或獨立地進行篩選。用於這些所需性質的測定方法在本技術領域中是已知的。篩選抗體的方法本部分更詳細描述了篩選哺乳動物抗體展示文庫的方法。方法包括但不限於編碼具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的多核苷酸的篩選方法、編碼具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的多核苷酸的富集方法、含有編碼具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的多核苷酸的哺乳動物細胞的分離方法、含有編碼具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的多核苷酸的哺乳動物細胞的篩選方法、具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的鑑定方法、以及獲得具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的方法。在某些實施方案中，方法包含a)從用抗體的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA 並擴增所述cDNA，以產生抗體的子文庫；c)從用所述多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，步驟b)和c)重複一次以上。在某些實施方案中， 方法包含a)將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生抗體的子文庫，其中所述細胞亞群通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，方法包含從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示具有所需性質 (例如與抗原特異性結合)的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸的子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的細胞來獲得。在某些實施方案中，多肽是全長抗體。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼抗體的多核苷酸的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b) 將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用所述多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，初級文庫中的多核苷酸編碼至少IO9種不同抗體。在某些實施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和C)重複至少一次。在某些實施方案中，在步驟d)之前將步驟b)和c)重複不超過約3次。在某些實施方案中，方法還包含將多核苷酸初級文庫轉染到哺乳動物細胞的原始群體中。在某些實施方案中，步驟b)還包含將所述多核苷酸子文庫轉染到哺乳動物細胞中。在某些實施方案中，步驟a)包含i)將哺乳動物細胞的原始群體與抗原相接觸， 以及ii)回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟c)包含i)將哺乳動物細胞群體與抗原相接觸，以及ii)回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。在某些實施方案中，步驟c)中用於抗原結合的條件比步驟a)中的更嚴緊。在某些實施方案中，當步驟b)和c)被重複至少一次時，在後面步驟中用於結合的條件比前面步驟中的更嚴緊。在某些實施方案中，提供了分離特異性識別抗原的抗體的方法，所述方法包含a) 將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫，其中細胞亞群通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及C)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸的子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞來獲得，以及b)從所述哺乳動物細胞亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其中方法包含a)從用抗體的初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的 mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用所述多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其中方法包含a)將從哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫，其中細胞亞群通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞來獲得；b)從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群。在某些實施方案中，提供了篩選哺乳動物展示文庫的方法，其中方法包含從用多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞的中間群體提取的 mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA以產生多核苷酸的子文庫來產生，其中細胞的中間群體通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞來獲得。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)從用編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，第一個初級文庫和第二個初級文庫允許在細胞表面上表達和展示至少IO9種不同抗體。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸初級文庫轉染的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生編碼輕鏈的第一個多核苷酸子文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸子文庫；c)從用第一個多核苷酸子文庫和第二個多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。在某些實施方案中，提供了編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法， 所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生編碼輕鏈的第一個多核苷酸子文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸子文庫；c)從用第一個多核苷酸子文庫和第二個多核苷酸子文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；d)將從所述哺乳動物細胞的第二個亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA 並擴增所述cDNA，以產生編碼輕鏈和重鏈的第三個多核苷酸子文庫；e)從用第三個多核苷酸子文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第三個亞群；以及f)從所述哺乳動物細胞的第三個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。編碼抗體的多核苷酸初級文庫本文提供的方法適合於本技術領域已知的任何哺乳動物展示文庫。或者，可以使用本文描述的方法構建初級文庫(特別是高複雜度初級文庫)。在某些實施方案中，初級文庫是未接觸過抗原的抗體文庫。在某些實施方案中，初級文庫是從用抗原免疫接種的個體產生的抗體文庫。在某些實施方案中，初級文庫是人類抗體文庫。在某些實施方案中，初級文庫是編碼人源化抗體的多核苷酸的文庫。在某些實施方案中，初級文庫是嵌合抗體文庫。 在某些實施方案中，初級文庫是來自其他哺乳動物物種、包括但不限於小鼠、兔、山羊和馬的抗體文庫。在某些實施方案中，初級文庫從任何免疫組織產生，所述組織包括例如骨髓、 脾臟、淋巴結、淋巴細胞。在某些實施方案中，初級文庫是合成的。在某些實施方案中，初級文庫包含編碼抗體輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼抗體重鏈的第二個多核苷酸初級文庫。在某些實施方案中，由多核苷酸編碼的重鏈的3』 末端與細胞表面束縛結構域融合。細胞表面束縛結構域可以是任何跨膜結構域或膜連接序列。適合的細胞表面束縛結構域包括但不限於PDGFR跨膜結構域、B7-1跨膜結構域、唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)跨膜結構域。在某些實施方案中，細胞表面束縛結構域是GPI信號序列，其引導免疫球蛋白通過GPI接頭錨定到細胞表面上。在某些實施方案中，GPI信號序
19列來自於人類DAF。在某些實施方案中，十四烷基化序列可以用作細胞表面束縛結構域。本技術領域中已知的大多數抗體文庫含有scFV片段，或使用單一載體在雙盒中表達重鏈和輕鏈兩者。建立如同在噬菌體展示中那樣多樣性為IO9的SCFV文庫是可行的。 按照使用噬菌體展示所顯示的，有可能建立多樣性為IO9的scFV文庫以在細菌中表達Fab， 儘管更加困難和耗時。能夠做到建立多樣性為IO7的雙盒表達文庫以在哺乳動物細胞中表達全長抗體，儘管與噬菌體展示文庫相比要更加困難得多。然而，由於篩選哺乳動物細胞展示文庫的難度，多樣性為IO9或更大的哺乳動物展示文庫還沒有市售的。本發明的方法使得篩選多樣性等於或高於IO9的哺乳動物展示文庫成為可能，從而提供了製造具有這樣的高多樣性哺乳動物展示文庫的理由。因此，本發明還提供了構建編碼抗體的多核苷酸文庫的方法，其中多核苷酸總計編碼至少約109、包括例如至少約101(1、 IOiiUO12UO13, IO14或IO15種不同重組抗體。文庫中的每個多核苷酸可以編碼輕鏈和重鏈兩者。或者，可以將編碼輕鏈的第一個多核苷酸文庫與編碼重鏈的第二個多核苷酸文庫相組合。一旦轉染到哺乳動物細胞中之後，重鏈和輕鏈可以在細胞內配對，從而產生高度多樣性的不同抗體。因此，在某些實施方案中，提供了構建編碼抗體的多核苷酸文庫的方法，所述方法包含將輕鏈文庫與重鏈文庫相組合，以使多核苷酸總計編碼至少約IO9種不同重組抗體。在某些實施方案中，初級文庫源自於單一個體。因此，在某些實施方案中，提供了編碼來自單一個體的抗體的多核苷酸文庫的構建方法，其中多核苷酸總計編碼至少約109、 包括例如至少約101Q、IOllUO12,1013、IO14或IO15種不同重組抗體。因此，在某些實施方案中， 提供了編碼來自單一個體的抗體的多核苷酸文庫的構建方法，所述方法包含將個體的輕鏈文庫與個體的重鏈文庫相組合，以使多核苷酸總計編碼至少約IO9種不同重組抗體。在某些實施方案中，多核苷酸存在於質粒載體中。在某些實施方案中，提供了在表面上展示至少約109、包括例如至少約IOiciUOiiUO12UO13UO14或IO15種不同重組抗體的哺乳動物細胞群體。在某些實施方案中，提供了用多核苷酸文庫瞬時轉染的哺乳動物細胞群體，其中多核苷酸總計編碼至少約 ο9、包括例如至少約Ioi0UoiiUo12Uo13Uo14或 ο15種不同重組抗體。在某些實施方案中，提供了用編碼抗體輕鏈的第一個多核苷酸文庫和編碼抗體重鏈的第二個多核苷酸文庫瞬時轉染的哺乳動物細胞群體，其中多核苷酸總計編碼至少約 ο9、包括例如至少約IoiqUoiiUo12Uo13Uo14或 ο15種不同重組抗體。在某些實施方案中，提供了從上述哺乳動物細胞群體中篩選出編碼具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的多核苷酸。此外，在本發明中提供了編碼抗體樣肽體的多核苷酸文庫的構建方法，其中多核苷酸總計編碼至少約109、包括例如至少約101(1、IOllUO12, ο13、 ο14或 ο15種不同重組肽體。 在某些實施方案中，提供了在表面上展示至少約 ο9、包括例如至少約IoiciUo11Uo12Uo1^ IOw或 ο15種不同的重組抗體類肽體的哺乳動物細胞群體。在某些實施方案中，提供了用多核苷酸文庫瞬時轉染的哺乳動物細胞群體，其中多核苷酸總計編碼至少約 ο9、包括例如至少約ιο1(ι、 ο11、 ο12、 ο13、 ο14或 ο15種不同的重組抗體樣肽體。正如上面所討論的，儘管本文中的討論主要聚焦於抗體，但該描述在適合時也適用於抗體樣肽體。本申請還涵蓋了本文中所述的抗體樣肽體文庫的篩選方法。有各種各樣的技術可用於有效產生免疫球蛋白文庫，包括在下列文獻中描述或提到的技術《分子克隆實驗室指南》(Molecular Cloning ；A Laboratory Manual)第三版 (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，2001)、《ifLfijftf^ 方法》(Current Protocols in Molecular Biology) (John Wiley &amp ;Sons)、美國專利 No. 6. 403，312、美國專利申請序號09/782，004、美國專利申請序號09/927，790、美國專利申請序號10/218，102,PCT WO 01/40091和PCT WO 02/25588，其每個在此以其全文引為參考。這樣的方法包括但不限於基因裝配方法、基於PCR的方法和使用PCR的變化形式的方法、基於連接酶鏈反應的方法、合併的寡核苷酸方法例如在合成改組中使用的方法、易錯擴增方法和使用具有隨機突變的寡核苷酸的方法、經典的位點定向誘變方法、盒式誘變方法以及其他擴增和基因合成方法。各種可商購的用於基因裝配、誘變、載體亞克隆等的試劑盒和方法，可用於產生編碼免疫球蛋白胺基酸序列的核酸。用於在哺乳動物細胞表面上表達抗體(特別是全長抗體)的載體，可以按照本技術領域已知的方法來製備。在某些實施方案中，將編碼免疫球蛋白重鏈恆定區的多核苷酸以其3』末端融合到編碼細胞表面束縛結構域的多核苷酸上，允許將所表達的免疫球蛋白展示在哺乳動物細胞表面上。在某些實施方案中，在重鏈恆定區與膜束縛結構域之間存在酶切割位點，其切割允許將免疫球蛋白酶法除去，從而能夠將表達的免疫球蛋白從膜結合形式轉變成可溶形式。被切的抗體可以直接用於進一步功能分析，從而免去了將膜錨定形式轉變成可溶形式的步驟。在某些實施方案中，在重鏈恆定區與細胞表面束縛結構域之間存在弗林蛋白酶切割位點。弗林蛋白酶是一種存在於真核細胞的高爾基反面網絡中的蛋白酶。它的功能是剛好在將蛋白遞送到其最終細胞目的地之前的步驟中切割蛋白。弗林蛋白酶識別共有胺基酸序歹Ij RXRR(SEQ ID NO :1)、RXRK (SEQ ID NO 2)或 KXKR(SEQ ID NO :3)(其中 X 是任何胺基酸)，並在含有這些序列的蛋白到達反面高爾基網時切開它們。參見美國專利 No. 7，223，390 ；Poole 等，J. Biol. Chem. 2003, Vol. 278(38) :36183-36190 ；Chen 等，2001， Proc. Natl. Acad. Sci.，vol. 98(13) :7218_7223。所表達的含有弗林蛋白酶切割位點的蛋白典型地經歷其正常的摺疊和裝配加工，以獲得其天然構型。在從內質網輸出後，蛋白沿著分泌途徑移動，達到細胞表面。當蛋白到達高爾基反面網絡時，它被弗林蛋白酶切割。因為弗林蛋白酶切割是部分完成的，一部分抗體將釋放到介質中，而其餘部分抗體將保持附著在細胞膜上。這種構型允許對被切抗體進行功能測定，同時維持抗體與表達抗體的細胞之間的連接。適合用於在哺乳動物細胞中表達重組多肽的啟動子包括但不限於SV40啟動子、 小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、人類HIV長末端重複序列啟動子、莫洛尼病毒啟動子、鳥白血病病毒啟動子、Epstein-Barr病毒立即早期啟動子、勞氏(Rous)肉瘤病毒啟動子、人類肌動蛋白啟動子、人類血紅蛋白啟動子、CMV啟動子、人類EF-I α啟動子或人類肌肉肌氨酸啟動子。在某些實施方案中，載體包含與編碼免疫球蛋白重鏈的第一種多核苷酸操作性連接的第一個啟動子以及與編碼免疫球蛋白輕鏈的第二種多核苷酸操作性連接的第二個啟動子。在某些實施方案中，免疫球蛋白輕鏈和重鏈存在於兩種不同的載體中，所述載體各自具有與免疫球蛋白輕鏈和重鏈可操作連接的不同啟動子。
哺乳動物細胞用於文庫篩選的哺乳動物細胞可源自於任何真核物種，包括但不限於來自大鼠、 小鼠、牛、豬、綿羊、山羊和人類的細胞。細胞可以按照本技術領域的專業人員熟知的標準方法來維持。適合的哺乳動物細胞的實例包括HeLa細胞(HeLa S3細胞，ATCCCCL2. 2)、Jurkat 細胞、Raji 細胞、Daudi 細胞、人類胚胎腎細胞(293-HEK ；ATCC 293cl8，ATCC CRL 1573)、 非洲綠猴腎細胞(CV-I ；Vero ；ATCC CRL 1587)、SV40轉化的猴腎細胞(C0S-I ；ATCC CRL 1650)、狗腎細胞(MDCK ；ATCC CCL 34)、幼倉鼠腎細胞(BHK-21，BHK-570 ；ATCC CRL 8544， ATCC CRL 10314)、中華倉鼠卵巢細胞(CH0-K1 ；ATCC CCL61 ；CHO DG44(Chasin等，1986，Som Cell Molec Genet, 12,555))以及其他齧齒動物細胞系例如NS0、SP2/0、GH1 (ATCC CCL82)、 H-4-II-E (ATCC CRL 1548)、NIH-3T3 (ATCC CRL 1658)。在某些實施方案中，哺乳動物細胞選自293-HEK、Hela、Jurkat、Raji、Daudi、C0S或CV-I細胞。在某些實施方案中，哺乳動物細胞是上面描述的細胞的衍生物。可以使用適合的手段將哺乳動物細胞用多核苷酸轉化，並將所述哺乳動物細胞培養在根據適合於誘導啟動子而修改的常規營養培養基中。這類方法的代表性實例包括使用磷酸鈣沉澱進行轉染、脂類介導的轉染、將多核苷酸直接微注射到完整靶細胞中、以及電穿孔。在某些實施方案中，哺乳動物細胞被瞬時轉染。用於細胞的適合培養條件例如溫度和pH，是公知的。在本文描述的方法的不同步驟中使用的哺乳動物細胞可以相同或不同。應該指出，儘管在傳統的篩選方法中應當(並且有時是關鍵的)控制細胞所攝取的載體的拷貝，但在本發明的方法的初始步驟中，優選每個哺乳動物細胞可以攝取儘可能多的載體拷貝。例如，轉染條件可以被優化成使得每個哺乳動物細胞攝取至少約20個、例如至少約50、100、200、300、400、500、1000個或更多的質粒直到每個細胞IO6UO7個質粒中的任一種數量。可以通過調整參數例如細胞密度、載體 DNA的濃度、不同初級文庫(當可用時)的比率、轉染試劑和轉染程序，來優化轉染條件。因此，一方面，本發明提供了哺乳動物細胞群體，其至少某些(例如50%、60%、 70%,80%,90%,99%)在每個細胞中包含至少約20個、例如至少約50、100、200、300、400、 500、1000個或更多直到IO6或IO7個...不同多核苷酸中的任一種數量。在某些實施方案中，哺乳動物細胞被瞬時轉染。初始篩選在將多核苷酸文庫導入細胞中之後，允許抗體展示在哺乳動物細胞的細胞表面上。「允許展示」是指允許已被導入到細胞中的載體經歷多肽的轉錄和翻譯，並將抗體運輸到膜表面上。允許表達所需的條件和時間將隨著宿主細胞的選擇和載體的選擇而變，正如本技術領域的普通專業人員所公知的。在某些實施方案中，隨後將在表面上表達抗體的細胞通過允許抗原與所需抗體結合的方法與抗原相接觸，由此允許將表達抗體的細胞與不結合抗原的細胞區分開。初始篩選步驟允許回收到哺乳動物細胞的第一個亞群。「回收」是指將所需組分與不需要的組分分離。本技術領域的普通專業人員應該理解，儘管哺乳動物細胞亞群富集有展示特異性識別抗原的抗體的細胞，但亞群中的大多數細胞可能是非特異性結合細胞。在某些實施方案中，初始篩選在低嚴緊條件下進行，以最大化捕獲到展示特異性識別抗原的抗體的細胞的可能性。初始篩選可以使用下列方法中的任一種執行螢光活化細胞分揀(FACS)、基於珠子的分揀例如基於磁珠的分揀(MACS)、其組合或其他固相淘選技術。其他可以使用的技術也是本技術領域已知的。例如，如果細胞處於懸液中並且抗原附著於固相基質，那麼特異性結合抗原的細胞將被捕獲在固相基質上，允許不結合抗原的細胞被洗掉，並且隨後能夠回收結合的細胞。或者，如果細胞附著於固相基質，並且通過與抗原特異性結合而導致從基質上釋放，則可以從細胞上清液回收它們。抗原可以直接或間接附著於固相基質(例如磁珠)。例如，在某些實施方案中，固相基質可以用鏈親和素包被，其允許與生物素相連的抗原通過鏈親和素與生物素的相互作用附著到固相基質上。也可以使用其他結合對。在某些實施方案中，抗原可以表達並呈遞在細胞表面。抗原呈遞細胞與結合抗原的細胞之間的相互作用允許分離出結合抗原的細胞(例如表達所需抗體的細胞)。例如，可以利用FACS分離細胞複合物。在某些實施方案中，抗原呈遞細胞與結合抗原的細胞之間的相互作用能夠誘導可檢測的信號(在抗原呈遞細胞或結合抗原的細胞內)，其允許分離出結合抗原的細胞。在某些實施方案中，將細胞與用螢光標記物(例如螢光素-5-異硫氰酸酯(FITC)) 直接或間接標記的抗原溫育。與帶螢光標籤的抗原結合的抗體表達細胞可以通過螢光活化細胞分揀(FACS)來選擇，從而允許將特異性結合抗原的細胞與不結合抗原的細胞區分開。
在某些實施方案中，可以將一種或多種上述技術進行組合。例如，固相淘選可以與 FACS的使用組合，反之亦然。在某些實施方案中，當使用所需親和性作為篩選基礎時，可以使用ELISA測定法來確定分離的免疫球蛋白對靶抗原的結合親和性。正如上面討論的，在某些實施方案中，抗體可以從融合的束縛結構域上部分或完全切下，並可用於進一步測定和/或驗證所需性質。子文庫的產生和篩選本文描述的方法涵蓋了產生和篩選本文中所述的子文庫的方法。在回收哺乳動物細胞的初始亞群後，從細胞提取總mRNA。將mRNA轉錄成cDNA，並擴增(例如通過PCR)抗體基因或抗體基因的部分(例如抗體基因的VH和VL區)。與其中需要引物混合物來擴增抗體可變區的產生初級抗體文庫的傳統方法不同， 用於子文庫中多核苷酸的引物可以基於初級文庫的載體序列。例如，可以基於載體中的序列設計引物，以擴增輕鏈和重鏈序列二者。在某些實施方案中，將抗體序列的VH和VL區克隆到分別含有CH和CL區的骨架載體中，以構建兩個子文庫——重鏈和輕鏈子文庫。隨後將兩個子文庫轉染到哺乳動物細胞中。該步驟允許在細胞中進行重鏈和輕鏈的改組，其可以增加具有較高表達以及較高親和性的抗體的分離機會。在這樣的實施方案中，至少一個用於擴增輕鏈的引物與用於擴增重鏈的引物不同，以便可以將輕鏈和重鏈分別克隆到不同載體中，並分成不同子文庫。可以將擴增的抗體序列(例如VH和VL序列)返回克隆到在初級文庫中使用的相同載體中或克隆到不同載體中。例如，在某些實施方案中，初級文庫包含初級輕鏈文庫和不同的第二個初級重鏈文庫，其中輕鏈和重鏈在不同載體上(例如質粒載體)。在初始篩選後，將擴增的輕鏈和重鏈序列克隆到單一雙盒載體中。在某些實施方案中，載體與在 Higuchi等，J. Immun. Methods (1997) 202 :193-204中使用的載體類似。在某些實施方案中， 使用不同的文庫進行幾輪篩選，然後將輕鏈和重鏈克隆在單一雙重表達載體中。在篩選的最後階段克隆雙重表達載體，允許同時鑑定具有所需性質(例如與抗原特異性結合)的抗體的成對抗體輕鏈和重鏈。在隨後的篩選步驟中使用的哺乳動物細胞可以與第一輪篩選中使用的類型相同， 或者可以是不同的細胞，只要它們能夠在細胞表面上表達多肽即可。篩選可以使用任何上面對初始篩選所描述的任何方法來進行。本文中描述的RT-PCR和篩選步驟可以重複至少1、2、3、4、5、6或7次。在某些實施方案中，步驟被重複不超過約3次。不同篩選循環的嚴緊性可以相同或不同，以便於分離多核苷酸。例如，在接近篩選循環結束中使用較高嚴緊性的條件，以減少從富集的亞群獲得的多核苷酸的多樣性。在方法的各個步驟過程中可以評估子文庫的多樣性。如果多樣性低於約1000至10000個信號，則可以按照下面的描述執行分離步驟。編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離為了分離抗體序列，從最終的子細胞合併物分離總mRNA。將相關的區域進行 RT-PCR擴增、限制性酶消化，並克隆到穩定的表達載體中。然後在大多數哺乳動物細胞僅具有每個細胞一個表達載體的條件下，將DNA穩定轉染到哺乳動物細胞中。例如，可以使用滴定步驟稀釋用於細胞轉染的質粒的濃度，以減少在同一個細胞中表達多個編碼不同免疫球蛋白的載體的概率。或者，可以使用flip-in系統，例如FLP-in 系統(Invitrogen，he.)。可以通過例如上面描述的方法來分離表達所需抗體的細胞。可以分離並測序編碼所需抗體的多核苷酸。單盒表達載體和雙盒表達載體本發明還提供了在本文描述的方法中使用的特定表達載體。這些表達載體提供了高的克隆效率，並特別適用於構建高複雜度蛋白質文庫例如本文中描述的高複雜度抗體文庫，並供在篩選文庫的方法、例如本文所描述的方法中使用。本文提供的載體可用於快速構建任何抗體文庫、重鏈、輕鏈、嵌合和甚至融合蛋白，並用於這些抗體蛋白在哺乳動物細胞表面上的高表達，以有效篩選和選擇(例如當與 FACS偶聯時)。可以在載體中摻入兩個或多個獨特的核酸內切酶識別序列，用於插入和取出目標基因。使用這樣的載體，可以容易地構建大小為至少IO6複雜度的載體。CMV啟動子， 一種常用於蛋白在各種哺乳動物細胞中的高表達的啟動子，可用於驅動所插入基因(例如抗體基因)的表達。為了將表達的抗體錨定在哺乳動物細胞表面上，可以將來自於PDGFR 的跨膜結構域與重鏈一致區的C-端同框融合。本文還提供了雙盒表達載體。這樣的載體可以包含雙重哺乳動物表達盒，用於一步插入重鏈和輕鏈基因兩者，以在哺乳動物細胞表面上展示全長二價抗體。這可以通過將來自PDGFR的跨膜結構域融合到重鏈恆定區的C-端來實現。我們也可以在恆定區與PDGFR 跨膜結構域之間摻入弗林蛋白酶切割位點，以獲得分泌抗體。結果，抗體可以同時以膜錨定形式表達在細胞表面上以用於通過FACS分析進行篩選和選擇，以及以分泌形式表達在條件培養基中以用於功能分析。使用該程序，我們能夠在僅僅幾天內快速構建大小為IO6的抗體文庫。這種新的一步式雙表達哺乳動物展示系統對於快速篩選具有高親和性的生物活性的人類單克隆抗體來說，特別有用。因此，在某些實施方案中，提供了包含側翼帶有一對可以被限制性酶(例如識別非迴文序列的限制性酶)識別的切割位點的開放閱讀框的表達載體，其中用所述限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。在某些實施方案中，開放閱讀框編碼抗體重鏈。在某些實施方案中，抗體重鏈與跨膜結構域融合。在某些實施方案中，在抗體重鏈與跨膜結構域之間存在酶切割位點(例如弗林蛋白酶切割位點)。在某些實施方案中，開放閱讀框編碼抗體輕鏈。在某些實施方案中，載體還包含可以被不同限制性酶(例如識別非迴文序列的限制性酶)識別的第二對切割位點，其中用所述第二種限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。在某些實施方案中，第二對切割位點位於開放閱讀框側翼。在某些實施方案中， 第二對切割位點中的一個位於開放閱讀框側翼，其中第二對切割位點中的另一個位於開放閱讀框內。例如，在某些實施方案中，開放閱讀框包含抗體重鏈，並且第二對切割位點中的一個位於可變區與恆定區之間。這樣的載體可能適合於例如克隆抗體可變區。同樣地，在某些實施方案中，開放閱讀框包含抗體輕鏈，並且第二對切割位點中的一個位於可變區與恆定區之間。這樣的載體可能適合於例如克隆抗體可變區。在某些實施方案中，限制性酶選自Sfil、BstXI和BsmBl。應該理解，也可以使用具有類似性質的其他酶。在某些實施方案中，載體還包含與所述開放閱讀框可操作連接的啟動子。在某些實施方案中，載體具有圖2中顯示的限制性圖譜。在某些實施方案中，載體具有圖3中所顯示的限制性圖譜。在某些實施方案中，表達載體包含第二個開放閱讀框。因此，例如，在某些實施方案中，提供了雙表達盒載體，其包含1)側翼帶有可以被限制性酶(例如識別非迴文序列的限制性酶)識別的第一對切割位點的第一個開放閱讀框，其中用所述限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連；以及幻側翼帶有可以被限制性酶(例如識別非迴文序列的限制性酶)識別的第二對切割位點的第二個開放閱讀框，其中用所述第二種限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。在某些實施方案中，一個開放閱讀框編碼抗體重鏈。在某些實施方案中，將抗體重鏈與跨膜結構域融合。在某些實施方案中，在抗體重鏈與跨膜結構域之間存在酶切割位點(例如弗林蛋白酶切割位點)。在某些實施方案中，一個開放閱讀框編碼抗體輕鏈。因此，例如，在某些實施方案中，提供了雙表達盒載體，其包含1)編碼抗體重鏈的第一個開放閱讀框，其側翼帶有可以被限制性酶(例如識別非迴文序列的限制性酶) 識別的第一對切割位點，其中用所述限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連；以及 2)表達抗體輕鏈的第二個開放閱讀框，其側翼帶有可以被限制性酶(例如識別非迴文序列的限制性酶)識別的第二對切割位點，其中用所述第二種限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。還提供了從所述切割產生的片段，其可用於通過四路連接來克隆所需序列 (例如抗體序列)。還提供了使用雙盒表達載體表達全長抗體以及使用所述載體克隆所需序列的方法。在某些實施方案中，雙盒表達載體還包含能夠被第三種限制性酶(例如識別非迴文序列的第三種限制性酶)識別的第三對限制性酶切割位點，其中用所述第三種限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。在某些實施方案中，第三對切割位點中的一個位於載體上一個開放閱讀框的側翼，並且其中第三對切割位點中的另一個位於同一個開放閱讀框內。例如，在某些實施方案中，一個開放閱讀框包含抗體重鏈，並且第三對切割位點中的一個位於可變區與恆定區之間。同樣地，在某些實施方案中，一個開放閱讀框包含抗體輕鏈，並且第三對切割位點中的一個位於可變區與恆定區之間。在某些實施方案中，雙盒表達載體還包含可以被第三種限制性酶(例如識別非迴文序列的第三種限制性酶)識別的第四對限制性酶切割位點，其中用所述第三種限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。在某些實施方案中，第四對切割位點中的一個位於載體上一個開放閱讀框的側翼，並且其中第四對切割位點中的另一個位於同一開放閱讀框內部。設想了第三對切割位點和第四對切割位點可以各自位於雙盒表達載體中不同開放閱讀框的側翼(或位於內部)。例如，在某些實施方案中，一個開放閱讀框包含抗體重鏈，並且第三對切割位點中的一個位於可變區與恆定區之間，而另一個開放閱讀框包含抗體輕鏈， 並且第四對切割位點中的一個位於可變區與恆定區之間。在某些實施方案中，限制性酶選自Sfil、BstXI和BsmBl。在某些實施方案中，載體還包含與所述第一個開放閱讀框可操作連接的第一個啟動子以及與所述第二個開放閱讀框可操作連接的第二個啟動子。在某些實施方案中，載體具有如圖5A中顯示的限制性圖
■i並曰O試劑盒、文庫、子文庫、多核苷酸和多肽還提供了用於執行本文描述的方法的文庫和試劑盒。此外，提供了在篩選過程中產生的子文庫和從本文描述的方法獲得的多核苷酸/多肽。在某些實施方案中，提供了編碼抗體輕鏈的多核苷酸文庫和編碼抗體重鏈的多核苷酸文庫，其中兩個文庫允許表達至少109、包括例如IO10、IOllUO12,1013、1014、1015、IO"5、IO17 種或更多種中至少任一數量的不同抗體。在某些實施方案中，抗體輕鏈包含(i)輕鏈恆定區，(ii)免疫球蛋白輕鏈可變區和(iii)信號肽。在某些實施方案中，抗體重鏈包含(i) 至少一個抗體重鏈恆定區，(ii)免疫球蛋白重鏈可變區，以及(iii)信號肽。在某些實施方案中，抗體重鏈還包含位於重鏈恆定區C-末端的細胞表面束縛結構域。在某些實施方案中，抗體重鏈還包含重鏈恆定區與細胞表面束縛結構域之間的弗林蛋白酶切割位點。在某些實施方案中，在試劑盒中提供了兩個文庫，其存在於分開的容器或同一個容器中。在某些實施方案中，試劑盒還包含引物、試劑、細胞和用於執行本文描述的方法的說明書。例如，在某些實施方案中，提供了試劑盒，其包含1)編碼多種免疫球蛋白重鏈的多核苷酸的第一個質粒文庫，幻編碼多種免疫球蛋白輕鏈的多核苷酸的第二個質粒文庫。 在某些實施方案中，試劑盒還包含能夠表達免疫球蛋白分子的細胞群體。在某些實施方案中，試劑盒還包含用於RT-PCR的酶和引物。在某些實施方案中，第一和第二個質粒文庫包含在分開的容器中。在某些實施方案中，試劑盒還提供了用於執行本文描述的一種或多種方法的說明書。在某些實施方案中，提供了試劑盒，其包含1)用於產生初級文庫(例如抗體初級文庫)的引物組，2)用於瞬時和/或穩定轉染哺乳動物細胞的載體組；以及3)用於產生子文庫(例如抗體子文庫)的引物組。在某些實施方案中，試劑盒還提供了用於執行本文描述的方法的說明書。還提供了本文描述的方法所獲得的多核苷酸以及由這些多核苷酸編碼的多肽。多核苷酸和多肽可用作例如研究試劑、診斷試劑和用於治療疾病的治療劑。
還提供了通過本文描述的RT-PCR方法產生的子文庫。例如，在某些實施方案中， 提供了編碼多種多肽的多核苷酸子文庫，其中子文庫通過將從哺乳動物細胞群體提取的 mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA來產生，其中細胞群體通過從用多核苷酸初級文庫轉染(例如瞬時轉染)的哺乳動物細胞原始群體中篩選出展示具有所需性質的多肽的細胞來獲得。還提供了包含表達載體、例如本文中描述的單盒和雙盒表達載體的試劑盒。試劑盒可以包含整個載體或載體可直接用於連接(例如四路連接)的線性片段。下面的實施例為本發明提供了說明而不是限制。實施例1本實施例顯示了可以在哺乳動物細胞中同時表達表面錨定形式和分泌形式的抗體的載體的構建。為了從哺乳動物細胞表達抗體用於篩選，重要的是設計和構建特定的表達載體， 其能夠1.以足夠供檢測和分析的高水平在哺乳動物細胞中表達抗體；2.同時將抗體分子表達在哺乳動物細胞表面上和表達成分泌形式；3.容易在細菌中擴增並從細菌純化；4.以高效率遞送到哺乳動物細胞中。為此目的，使用來自^witrogen的載體pcDNA 3. 1作為起始材料。載體尺寸為 5. 41Λ，含有用於在哺乳動物細胞中表達蛋白的大多數必需組分。為了增加轉染效率(從每個細胞來看的拷貝數)，將1.81Λ Neo基因表達盒刪除以減小載體尺寸。為了便於插入目的基因，對MCS(多克隆位點)進行了修改以包含BstX I和Ml I。適合的載體形式具有約 3. 2kb的大小。將該3. 2kb載體用作骨架載體，用來構建抗體表達文庫。當目的基因被插入到該載體的MCS中時，在載體被遞送到哺乳動物細胞中時，基因表達。為了表達被展示的重鏈，對載體進一步修改，以將PDGFR編碼序列插入在重鏈恆定區的3』 -末端。為了同時表達展示和分泌形式的抗體，將弗林蛋白酶切割位點(FCS)插入到重鏈與PDGFR之間。下面的圖顯示了表達載體中重鏈中的組分的關係啟動子——V-------C--------FCS—PDGFR實施例2本實施例描述了用於在哺乳動物細胞中同時穩定表達表面錨定形式和分泌形式的抗體的載體的構建。為了從單一載體表達重鏈和輕鏈兩者，構建了雙重表達載體。將另一個表達盒插入到載體PCDNA3. 1中。將Ch和Cl基因序列插入到該載體中不同的表達盒處。這兩個表達盒的關係顯示如下，其中啟動子1和啟動子2是相同或不同的。啟動子1-—Ch或Cl-—PolyA——啟動子2-—Cl或Ch-—PolyA——選擇標記為了表達細胞表面展示的抗體，對載體進一步修改以將PDGFR編碼序列插入到重鏈恆定區的3』 -末端。
為了同時表達展示和分泌形式的抗體，將弗林蛋白酶切割位點(FCS)插入到重鏈與PDGFR之間。實施例3本實施例描述了全長人類抗體哺乳動物展示文庫的構建。本實施例顯示了具有IO9或更大多樣性的全長人類抗體哺乳動物展示文庫的建造。使用在實施例1中構建的載體作為骨架用於構建文庫。使用在書籍《噬菌體展示》(PhageDisplay (Carles 等，Cold Spring Harbor Laboratory Pr.))中描述的引物，通過PCR從人類免疫組織(骨髓、脾臟和外周血淋巴細胞)的即用cDNA(BioChain, South San Francisco, CA USA)擴增了人類抗體重鏈和輕鏈的可變結構域基因(Vh和VI)。對PCR條件進行優化，以確保Vh和Vl的有效準確的擴增。將PCR產物用與克隆載體匹配的適合的限制性酶消化。在消化後使用PCR純化試劑盒 (Qiagen)純化產物。對於重鍊表達來說，將IgGl的重鏈恆定區(Ch)、FCS和PDGFR序列克隆到實施例 1的載體的MCS中。然後使用T4連接酶將Vh混合物同框插入到載體中Ch區之前。在將連接混合物進行轉化後，通過測量轉化體數量來計算轉化效率和文庫大小，以確保文庫大小為10e5以上。通過對100個以上個體克隆進行序列分析，對文庫的多樣性進行更精確的分析和計算。如果只需要在細胞表面上表達抗體，FCS區不必包含在載體中。對於輕鍊表達來說，將κ (或λ )鏈恆定區(Cl)克隆到實施例1的載體的MCS中。 然後使用Τ4連接酶將Vl混合物同框插入到載體中Cl區之前。在將連接混合物進行轉化後，通過測量轉化體數量來計算轉化效率和文庫大小，以確保文庫大小為10e4以上。通過對100個以上個體克隆進行序列分析，對文庫的多樣性進行更精確的分析和計算。重鏈和輕鏈文庫載體兩者可以容易地在細菌中擴增，並安全地儲存在-20°C下。該文庫是初級的、未接觸過抗原的全長人類抗體文庫，其潛在多樣性> =10e9。從該文庫表達的抗體可以錨定在哺乳動物細胞表面上，直接用於親和性和功能篩選和選擇。 同時，一部分抗體作為可溶分子表達在條件培養基中，其可以直接用於抗體的進一步功能分析和特徵分析，而不用將抗體從膜錨定形式轉變成可溶形式，加快了篩選和選擇。實施例4本實施例描述了哺乳動物細胞表面展示的抗體文庫的表達和篩選以及選擇抗體候選物。從實施例3構建的文庫是載體DNA並可以被擴增。為了擴增載體文庫，將載體DNA 轉化到細菌感受態細胞中。收集抗生素抗性菌落，並使用max-prep試劑盒^jiagen)從細菌純化載體DNA。將四3細胞培養在增補有10% FBS並且不含抗生素的DMEM培養基(Invitrogen) 中。使用轉染優化試劑盒(Biocompare，S. San Francisco，CA)，在細胞密度、載體DNA劑量、 重鏈和輕鏈文庫的比率、轉染試劑和轉染步驟方面對轉染條件進行優化。為了製備用於轉染的細胞，根據需要將293細胞分開，並接種到包被有聚賴氨酸的T225培養瓶中。使用優化條件，將DNA文庫混合物轉染到T225培養瓶中的293細胞中。在轉染後48-72小時，使用解離緩衝液(Invitrogen)將細胞解離，並將其以Ie6-le7/ml的密度
28懸浮在染色緩衝液中(含有2% FBS的PBS)。將細胞用PE-標記的小鼠抗人IgGl重鏈和 FITC-標記的抗人κ鏈恆定區抗體(lug/ml)進行雙重染色。然後通過FACS分析細胞表面上抗體的表達。通常，與陰性對照相比，90%以上的細胞被陽性染色。這是初級細胞文庫。為了從文庫篩選特定抗體，將選定的抗原(針對特異性，參見其他實施例)用生物素標記，然後用於對符合如上所述的抗體陽性細胞群體進行染色。將鏈親和素結合的磁珠(Dynal/Invitrogen)與抗原染色的細胞群體混合。特異性抗體陽性細胞被磁珠捕獲，並按照產品手冊中的描述通過磁場進行收集。因為特異性抗體基因的百分率非常低，在細胞合併物中表達特異性抗體的細胞數量稀少。在該步驟中，施加低嚴緊性結合條件以確保所有與抗原的結合物都可以被捕獲。 這裡，目的是富集結合物，而純度可以忽略。在一個富集循環中，即使純度僅僅為萬分之一 (1/I0e4)，與=> 10e9的文庫多樣性相比，已經富集了至少10e5倍。下面的步驟對於從高度多樣性的文庫成功分離抗原特異性抗體來說是重要的，因為即使上面的富集可能已經高達10e5倍，但合併物中的大多數細胞仍表達非特異性抗體。1.為了進一步富集特異性結合物，從上述富集步驟的細胞子合併物提取總mRNA。 通過RT-PCR擴增總mRNA中抗體基因的Vh和Vl區，並將其分別克隆到含有Ch和Cl區的骨架載體中，以構建兩個子文庫——重鏈和輕鏈子文庫。2.將這些子文庫的混合物轉染到新鮮的293細胞中，並分析細胞表面上的抗體表達。3.如同對初級細胞文庫所做的，富集特異性抗原結合物。將上述步驟1至3重複所需的循環數。每個循環使用的結合條件的嚴緊性越來越高，以分離親和性越來越高的結合物。細胞合併物的純度變得越來越高，在2-4個富集循環後，大多數細胞應該為特異性抗原染色陽性。這種重複的篩選不僅富集了結合物，而且改組了細胞中的重鏈和輕鏈，其可以增加分離到具有較高表達以及較高親和性的抗體的機會。為了使用FACS分析細胞合併物，將細胞用FITC結合的抗輕鏈抗體或PE結合的特異性抗原或兩者進行染色。對初級細胞合併物和細胞子合併物進行FACS分析，以計算富集效率。為了分離抗體基因，從最終的細胞子合併物提取總mRNA。對Vh和Vl區進行 RT-PCR擴增、限制性酶消化和純化。將獲得的Ch和Cl插入到實施例2的穩定表達載體中並與其恆定配偶體同框，以形成全長重鏈基因和全長輕鏈基因，構建穩定表達的子文庫。在該載體中，重鏈和輕鏈對是固定的，並且如果只有一個載體被整合在基因組中，那麼只表達一種類型的抗體。將穩定表達的子文庫轉染到CHO細胞中。為了確保每個細胞基因組中整合一個載體，對轉染條件的多個參數包括DNA劑量、與不同量的非表達載體混合以及轉染程序進行優化。通過FACS分析抗體的表達水平和特異性結合親和性。通過單細胞FACS分揀分離出表現出高表達和高親和性的單個細胞。在擴增後，對這些單細胞群體進一步進行下列分析1.細胞表面上的抗原競爭分析。
2.抗體與其他物種抗原的交叉反應。3.使用條件培養基的功能分析。4.使用純化抗體的功能分析。從這些單細胞群體中通過RT-PCR克隆特異性抗體基因，並測序驗證它們是單一克隆。可以將選定的抗體基因進行大規模表達用於進一步分析。實施例5本實施例描述了全長小鼠-人類嵌合抗體哺乳動物展示文庫的構建。為了構建文庫，使用了與實施例3中描述的相同的策略。使用在書籍《噬菌體展示》(PhageDisplay (Carles 等，Cold Spring Harbor Laboratory Pr.))中描述的引物，通過PCR從小鼠免疫組織(骨髓、脾臟和外周血淋巴細胞)的即用cDNA(BioChain，South San Francisco, CA USA)擴增了小鼠抗體重鏈和輕鏈的可變結構域基因(Vh和VI)。對PCR條件進行優化，以確保Vh和Vl的有效準確的擴增。將PCR產物用與克隆載體匹配的適合的限制性酶消化。在消化後使用PCR純化試劑盒 (Qiagen)純化產物。對於小鼠-人類嵌合重鍊表達來說，將人類IgGl的重鏈恆定區(Ch)、FCS和PDGFR 序列克隆到實施例1的載體的MCS中。然後使用T4連接酶將小鼠Vh混合物同框插入到載體中Ch區之前。在將連接混合物進行轉化後，通過測量轉化體數量來計算轉化效率和文庫大小，以確保文庫大小為10e5以上。通過對100個以上個體克隆進行序列分析，對文庫的多樣性進行更精確的分析和計算。如果只需要在細胞表面上表達抗體，FCS區不必包含在載體中。對於小鼠-人類嵌合輕鍊表達來說，將人類κ (或λ)鏈恆定區(Cl)克隆到實施例1的載體的MCS中。然後使用Τ4連接酶將小鼠Vl混合物同框插入到載體中Cl區之前。 在將連接混合物進行轉化後，通過測量轉化體數量來計算轉化效率和文庫大小，以確保文庫大小為10e4以上。通過對100個以上個體克隆進行序列分析，對文庫的多樣性進行更精確的分析和計算。重鏈和輕鏈文庫載體兩者可以容易地在細菌中擴增，並安全地儲存在-20°C下。該文庫是初級的、未接觸過抗原的全長小鼠-人類嵌合抗體文庫，其潛在多樣性 >=10e9。從該文庫表達的抗體可以錨定在哺乳動物細胞表面上，直接用於親和性和功能篩選和選擇。同時，一部分抗體作為可溶分子表達在條件培養基中，其可以直接用於抗體的進一步功能分析和特徵分析，而不用將抗體從膜錨定形式轉變成可溶形式，加快了篩選和選擇。為了構建全長小鼠抗體展示文庫，使用小鼠的重鏈和輕鏈恆定區代替載體中的人類對應部分。實施例6本實施例描述了抗體樣二價肽體哺乳動物展示文庫的構建。使用在上面實施例中描述的方法，構建了抗體樣、二價的、可以哺乳動物展示的肽體文庫。在體外合成了多肽基因文庫。文庫的DNA序列具有36-72個核苷酸的大小，側翼在兩端帶有限制性酶識別序列，用於將文庫克隆到表達載體中。構建了兩個不同的肽體文庫。在一個文庫中，多肽與人類Ch融合，在另一個文庫中，多肽與人類Cl融合。兩個文庫的大小都=> 10e5。將這兩個DNA文庫以等量的分子混合，並轉染到哺乳動物細胞(CH0細胞)中。因為在細胞中離體配對，潛在的文庫大小能夠達到10e5以上。通過實施例4中描述的方法篩選出選定抗原的特異性結合物。在該抗體樣肽體中可能存在多達4種不同的多肽，兩種來自於重鏈融合，兩種來自於輕鏈融合。進一步的篩選和下遊開發例如在帶有雙表達盒的載體中配對，能夠最終鑑定到帶有成對多肽、具有所需功能的候選物。實施例7本實施例顯示了用於快速構建抗體文庫和在哺乳動物細胞表面表達抗體蛋白的單表達盒載體的構建。表達載體的設計和構建限制性酶SfiI識別非迴文序列並形成3個鹼基的突出末端。因為末端這三個位置中的每個可以是四種核苷酸G、A、T、C的任一種，因此末端序列總共可以具有64種不同可能性。因此有可能在片段的兩端設計不同切割序列，其在連接過程中將不自連。這種特點在文庫構建中對於增加連接和轉化效率來說是非常有用的。BstXI和BsmBI具有類似特點，並且各自能夠形成256種可能的末端。為了靈活插入抗體重鏈、輕鏈或重鏈的可變結構域，設計了一種通用載體，並且已經將上面列出的三種酶導入到載體中。選擇了 CMV啟動子驅動該載體中插入基因的表達。表1、用於載體構建的引物
權利要求
1.一種編碼特異性識別特定抗原的抗體的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)篩選用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個初級文庫瞬時轉染、並在細胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動物細胞初始群體，以獲得哺乳動物細胞的亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生多核苷酸的子文庫；c)篩選用所述多核苷酸子文庫轉染、並在細胞表面上展示由所述多核苷酸編碼的抗體的哺乳動物細胞群體，以獲得哺乳動物細胞的第二個亞群；以及d)從所述哺乳動物細胞的第二個亞群分離編碼特異性識別特定抗原的抗體的多核苷酸。
2.權利要求1的方法，其中在步驟d)之前將步驟b)和c)重複至少一次。
3.權利要求2的方法，其中在步驟d)之前將步驟b)和c)重複不超過約3次。
4.權利要求1的方法，其中初級文庫中的多核苷酸編碼至少IO9種不同抗體。
5.權利要求1的方法，其中將哺乳動物細胞的初始群體在群體中的各個哺乳動物細胞能夠攝取約1000以上個多核苷酸拷貝的條件下用初級文庫進行瞬時轉染。
6.權利要求1的方法，其還包含將多核苷酸的初級文庫瞬時轉染到哺乳動物細胞的初始群體中。
7.權利要求1的方法，其中步驟a)包含(i)將哺乳動物細胞的初始群體在適當的結合條件下與抗原相接觸；以及 ( )回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。
8.權利要求7的方法，其中回收通過FACS、磁珠或其組合來進行。
9.權利要求1的方法，其中步驟c)包含(i)將富集的哺乳動物展示文庫在適當的結合條件下與抗原相接觸；以及 ( )回收與抗原結合的哺乳動物細胞亞群。
10.權利要求9的方法，其中步驟(i)中的結合條件比權利要求7中步驟(i)的結合條件更嚴緊。
11.權利要求1的方法，其中步驟d)包含i)從細胞亞群分離mRNA；ii)將mRNA擴增成cDNA；iii)將cDNA克隆到克隆載體中；以及iv)測定DNA的序列。
12.權利要求1的方法，其中初始哺乳動物展示文庫從骨髓、脾臟、淋巴結和淋巴細胞的任一種產生。
13.權利要求1的方法，其中初始哺乳動物展示文庫從人產生。
14.權利要求1的方法，其中抗體是全長抗體。
15.權利要求14的方法，其中步驟a)包含篩選用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個初級文庫轉染、並在細胞表面上展示全長抗體的哺乳動物細胞的初始群體。
16.一種編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸的分離方法，所述方法包含a)從用編碼輕鏈的第一個多核苷酸初級文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸初級文庫轉染的哺乳動物細胞初始群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞亞群；b)將從所述哺乳動物細胞亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA，以產生編碼輕鏈的第一個多核苷酸子文庫和編碼重鏈的第二個多核苷酸子文庫；c)從用第一個多核苷酸子文庫和第二個多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第二個亞群；d)將從所述哺乳動物細胞的第二個亞群提取的mRNA反轉錄成cDNA並擴增所述cDNA， 以產生編碼輕鏈和重鏈的第三個多核苷酸子文庫；e)從用第三個多核苷酸子文庫轉染的哺乳動物細胞群體中篩選出展示特異性識別抗原的抗體的細胞，並回收哺乳動物細胞的第三個亞群；以及f)從所述哺乳動物細胞的第三個亞群分離出編碼特異性識別抗原的抗體的多核苷酸。
17.—種構建編碼抗體的多核苷酸文庫的方法，其中多核苷酸總計編碼至少約IO9種不同的重組抗體。
18.一種用編碼抗體的多核苷酸瞬時轉染的哺乳動物細胞群體，其中多核苷酸總計編碼至少約IO9種不同的重組抗體。
19.一種表達載體，其包含側翼帶有一對可被限制性酶識別的切割位點的開放閱讀框， 其中用所述限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。
20.一種雙表達盒載體，所述載體包含1)側翼帶有可被限制性酶識別的第一對切割位點的第一個開放閱讀框，其中用所述限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連；以及2)側翼帶有可被限制性酶識別的第二對切割位點的第二個開放閱讀框，其中用所述第二種限制性酶切割所產生的每個片段的末端不自連。
全文摘要
本發明提供了利用哺乳動物展示文庫篩選來分離出編碼具有所需性質的多肽例如抗體的多核苷酸的方法以及產生編碼多肽例如抗體的多核苷酸文庫的方法，其中多核苷酸總計編碼至少109種不同多肽。還提供了用於執行本發明描述的方法的試劑盒、通過本發明描述的方法分離到的多核苷酸、編碼不同物種包括人、小鼠、兔的抗體庫的文庫，以及由所述多核苷酸編碼的多肽。
文檔編號C12P19/34GK102282266SQ200980154588
公開日2011年12月14日 申請日期2009年11月20日 優先權日2008年11月21日
發明者周辰 申請人:德根生物科技有限公司