用於檢測某些自身免疫疾病的生物標記抗體和診斷裝置的製作方法

2023-07-20 04:15:56 2

專利名稱：用於檢測某些自身免疫疾病的生物標記抗體和診斷裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫學領域，即抗原和抗體間相互作用的領域。更具體而言，本發明涉及一種人工合成抗原(TCSP)在檢測與美洲錐蟲病(Chagas disease)不相關的抗體中的用途，所述用途使得診斷人類患者中的某些自身免疫疾病成為可能，其中所述抗原來源於單細胞寄生蟲克氏錐蟲(Trypanosoma Cruzi)的一個蛋白質，所述克氏錐蟲能導致所述美洲錐蟲病。
背景技術：
眾所周知，通過幹擾有效的體液免疫反應的正常成熟，以及通過使所誘導的抗體指向自身抗原，傳染原能夠逃脫宿主的免疫系統。此外，由於某些傳染性抗原和自體抗原之間的結構相似性，某些傳染原被認為能夠引起具有遺傳傾向的宿主中的自身免疫反應。美洲錐蟲病是拉丁美洲和南美洲的地方性疾病，是在其肆虐的國家中的發病和死亡的主要原因。它在其它大洲中實際上是不存在的。每年大約16至18萬人被感染，以及約50，000例患者死於該病。它是由單細胞寄生蟲克氏錐蟲(T.cruzi)感染引起的，所述克氏錐蟲是動質體目錐蟲科的成員，所述錐蟲科可引發人類中的美洲錐蟲病；該原生動物寄生蟲是通過大量血液寄生的昆蟲，特別是由錐獵蝽亞科(血液寄生的盲蝽)傳染的。當寄生蟲的傳染形式寄生在昆蟲的蜇中時，當媒介昆蟲的排洩物與宿主的血液或黏膜相接觸時，即發生了傳染。媒介昆蟲因此釋放了傳染性的終結寄生型的錐蟲成蟲形式，通過血液循環，其可移生於多種類型的細胞中。該寄生蟲複雜的生命周期，使其能夠逃脫宿主的免疫反應，而不會導致宿主的死亡。該寄生蟲經歷了以下階段媒介昆蟲中的短膜蟲期階段、哺乳動物宿主的血液中的錐鞭毛體階段，以及細胞內的無鞭毛體階段在該最後的階段中，該寄生蟲通過二分裂繁殖。另一種沾染途徑是用受汙染的血液進行輸血；已開發出大量的篩選方法(參見(例如)專利EP 0976763和US 6458922)。眾所周知克氏錐蟲感染心臟細胞和骨骼肌細胞、神經膠質細胞以及單核吞噬細胞系統的細胞。在被動侵入宿主細胞後，寄生蟲的三鞭毛細胞形式分化成無鞭毛體形式；它主動分裂，然後釋放出錐鞭毛體形式，從而導致新的細胞侵染。約有30%的患有這種疾病的患者出現嚴重的臨床心肌病型症狀(參見以下文章K. Karratolios等，『『hflammatory Cardiomyopathy 「，2006 年發表在 Hellenic Journal of Cardiology 的綜述，卷 47， 第 54-65 頁，以及 J. Burian 等， 「Myocarditis :the immunologist 『 s view on pathogenesis and treatment" , 2005 年發表於 Swiss Medical Weakly 的綜述，卷 135,第 359-364頁)；上述心肌病可以是急性的或慢性的。在受到人類免疫缺陷病毒(HIV)或美洲錐蟲病範圍以外的其他傳染原感染的患者中，可觀察到類似的心臟病。表觀健康者也可能在較小程度上存在類似的心臟病；已知這些疾病是由原因不明的自身免疫機製造成的(參見以下文章F.Kierszenbaum，「 Views on the autoimmunity hypothesis for Chagas disease pathogenesis" , 2003
在〃 FEMS Immunology and Medical Microbiology"，卷 1545，第 1-11 頁，以及 R. Jahns等, 「Pathological autoantibodies in cardiomyopathy 「 , 2008 ￥ 9 月胃 ^ Τ" Autoimmunity的綜述，卷41 (6)，第454-461頁)。事實上，在沒有確切起因的、或抗體特異性的，或特別是已知的免疫原相關的特異性的心肌病患者中，能夠觀察到自體免疫反應。還沒有文獻描述過一個確定的能導致所述自身免疫的抗原結構，並且更具體而言還沒有文獻描述過這樣一種針對克氏錐蟲(TCSP)的抗原。已經描述了針對受體(腎上腺素的或膽鹼能的)的抗體，但是沒有它們對於TCSP肽的特異性的任何定義；並且也沒有任何描述涉及美洲錐蟲病固有範圍以外的克氏錐蟲寄生蟲的抗原。如(例如)Hoft 等的文章中所述(〃 Trypanosama cruzi Expresses Diverse Repetitive Protein Antigens" , 1989 年 7 月發表在 Infection and Immunity 的綜述， 卷57 (7)，第1959-1967頁)，已知克氏錐蟲寄生蟲生命周期的每一階段均可表達特異性的抗原蛋白。在該出版物所描述的研究中，作者用人抗血清篩選了克氏錐蟲的表達庫，並發現了編碼具有重複單元的多肽的cDNA，其中所述重複單元包括6-34個胺基酸。TCR70(其與 TCR69同源)的胺基酸序列高度保守，僅有一些偶然性的替換。它們頻繁地出現在所有分離的片段中，以及這些重複單元的多樣性表明，它們與規避免疫系統的破壞作用有關。由於這些重複單元是免疫系統的有效調製器，因此可以認為其它傳染原使用類似的策略，甚至是相同的重複單元。篩選直接針對克氏錐蟲的抗體的方法包括間接免疫螢光法(IFA)、間接血凝集法(IHA)和免疫酶分析技術(ELISA)，其中所述方法是在血庫使用的(特別是在巴西，這項檢查是強制性的)。這些市售可得的分析試劑盒大多使用未經處理的寄生蟲提取物或亞細胞片斷作為抗原製劑。已經發現寄生蟲提取物與患有其它疾病的患者的血清發生反應，所述其它疾病如利什曼病、讓氏錐蟲(Trypanosoma rangeli)感染、梅毒、類風溼發熱。因此， 不同的病原微生物的類似重複單元的使用使得診斷和治療變得複雜化。此外，美洲錐蟲病篩選中的假陽性反應能夠導致誤診，這將伴隨不必要的和/或無效的治療。因此，人們迫切需要能夠檢測不同的病原微生物所使用的重複單元。但是，現有技術中沒有任何文獻表明或暗示在克氏錐蟲中鑑定的多肽基序TCR70，存在於其他與美洲錐蟲病不相關的疾病中，或者導致了自身免疫失調。現有技術中也沒有表明或暗示這些重複單元能夠用於開發診斷和治療與美洲錐蟲病有關或無關的心臟病或自身免疫失調的可靠工具，或有效地預防上述疾病。為此還需要提供一種免疫診斷方法，以檢測能夠與克氏錐蟲所表達的抗原特異性地結合的病原性的抗體，所述方法優選快速的或能夠以試劑盒的形式使用的方法。最後，還沒有方法能夠降低血液中的這些病原性的抗體的濃度。

發明內容
根據本發明，所述的問題可以通過使用與具有以下序列的肽特異性地結合的抗體得以解決Ala-A1a-A1a-Pro-A1a~Lys~Ala~A1a-A 1a-A 1a-Pro-A1a-Lys-Thr-A1a-A 1a-A Ia-P ro-Val(SEQ ID No. 1)，並且所述抗體不是在克氏錐蟲感染宿主之後在宿主內誘導產生的。這些抗體本身代表本發明的第一主題。本發明的第二主題是與根據第一主題所述的抗體特異性地結合的抗原，所述抗原不包括與克氏錐蟲誘導的抗體結合併且由克氏錐蟲寄生蟲遺傳編碼的抗原，即，不包括具有序列SEQ ID No. 1的抗原。本發明的第三主題是一種肽或蛋白質在檢測和/或沉澱根據本發明第一主題所述的抗體中的用途，所述肽或蛋白質對於根據本發明第一主題所述的抗體具有特異性的活性，其中所述肽或蛋白質具有以下序列Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 2)，以及優選為以下序列Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 3)，以及更優選序列SEQ ID No. 1。特別是，所述肽或所述蛋白質可以是TCSP肽或 TCSP肽的變體，所述變體對於根據本發明的第一主題所述的抗體具有特異性的活性。所述抗體能夠與傳染原的抗原、過敏原和/或自體抗原相結合；所述傳染原可以是病原體，並且所述抗體的存在與傳染性疾病或自身免疫疾病有關。所述病原體也可選自由朊病毒、病毒、原核生物以及單細胞或多細胞的微真核生物所組成的組。所述傳染性疾病或自身免疫疾病選自由心肌病、心肌炎和系統性紅斑狼瘡所組成的組。本發明的另一主題為一種檢測液體樣品中的根據第一主題所述的抗體的方法，其包括以下步驟(a)將生物樣品與具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體相接觸，所述肽或蛋白質對於第一主題所述的抗體具有特異性的活性，其中所述生物樣品優選為體液樣品和/或細胞培養物的上清液樣品(「液體樣
口」、
m )；(b)採用一種或多種合適的標記物，確定所述液體樣品中的根據權利要求1所述的抗體與所述肽或所述蛋白質的結合，其中所述標記物能夠確定所述肽或蛋白質與根據權利要求1所述抗體所形成的複合物。所述標記物可選自由以下物質所組成的組化學發光標記物、凝集標記物、膜標記物、免疫酶標記物和放射性標記物。本發明的另一主題為一種用於實施根據前一主題所述的方法的試劑盒或裝置，其包括(a)確定量的一種或多種具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，和/或TCSP肽或TCSP肽的變體，所述肽或蛋白質對於根據本發明第一主題所述的抗體具有特異性的活性；(b) 一種或多種合適的標記物，其中所述標記物能夠確定所述肽或蛋白質與根據本發明第一主題所述的抗體所形成的複合物；(c)任選的，固體載體，該固體載體優選用所述肽或蛋白質浸漬過。所述標記物可選自由以下物質所組成的組中化學發光標記物、凝集標記物、膜標記物、免疫酶標記物和放射性標記物。另一主題為一種免疫診斷方法，所述方法包括以下步驟通過採用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，而定性或定量地檢測根據第一主題所述的抗體，在所述肽或蛋白質對第一主題所述的抗體具有特異性的活性的情況下。
另一主題為一種降低生物流體樣品如血液樣品或生物流體流如血流中的根據第一主題所述抗體的濃度的方法，所述方法包括以下步驟通過採用具有序列SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，沉澱所述抗體，所述肽或蛋白質對於根據第一主題所述的抗體具有特異性的活性。使用TCSP肽或其變體，來獲得具有相當於NCRA(非克氏錐蟲病相關抗體，即不是由克氏錐蟲誘導的抗體)的結合活性的抗體或抗體片段，也成為可能；這是本發明的另一個主題。具有肽序列之一 (SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3)的肽或蛋白質，能夠用於對誘導NCRA抗體的免疫原進行鑑定甚至是分離。採用高級算法進行的計算機檢索序列同源性的方法，可以作為識別免疫原性候選物的工具。所述免疫原性候選物可以是合成的，然後檢測它們與被懷疑包含NCRA的生物樣品的反應性。本發明的另一主題為具有序列 SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，在鑑定或分離與NCRA特異性地結合的或被NCRA特異性地識別的病原體中的用途，所述肽或所述蛋白質對於根據本發明的第一主題所述的抗體具有特異性的活性。這種相互作用是建立在病原體和TCSP或後者的變體之間的同源性的基礎上的。本發明的另一主題為具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，在用於獲得具有相當於NCRA的結合活性的抗體或抗體片段中的用途，所述肽或所述蛋白質對於根據本發明第一主題所述的抗體具有特異性的活性。本發明的最後一個主題為一種藥物製劑，其包含具有相當於NCRA的結合活性的抗體或抗體片段、藥學上可接受的注射液、以及任選地一種或多種載體(如聚山梨酯和/或蔗糖)或添加劑，其中所述抗體或抗體片段是通過根據第三主題所述的用途在有生命的有機體中獲得的，從而導致所述有機體針對TCSP肽的免疫，或者是通過採用TCSP對表達特異抗體的噬菌體庫進行篩選而獲得的。


圖1示出了與抗體的存在相關的信號的強度分布，其中所述抗體與TCSP肽特異性地結合，並且與克氏錐蟲的感染無關(這些抗體被稱為NCRA，非錐蟲相關抗體)。該數據來自患者數為N的流行病學試驗，其中所述患者分屬於以下四組DS =健康獻血者[法語dormeurs sains](即，所監測和所選擇的獻血者，其具有比平均一般人群更好的健康狀況)HIV非洲對愛滋病毒篩查具有陽性反應的非洲患者HIV西方對愛滋病毒篩查具有陽性反應的西方患者美洲錐蟲病感染了克氏錐蟲的患者該表中的數據來自ELISA-型分析。可用表1和2中的數字表示。圖2示出了對79例患者進行的流行病學研究的結果，即以NCRA的濃度對在研究中的患者被納入的時間(年)作圖。
具體實施方式
^Ji在本發明的範圍中，以下術語具有特定的含義術語「美洲錐蟲病」是指由克氏錐蟲寄生蟲感染所引起的病理狀態，所述感染可通過或不通過腸道途徑。術語「非美洲錐蟲病」是指任何不是由克氏錐蟲寄生蟲感染所引起的病理狀態，其導致針對新抗原的抗體增強的反應性，此處所述的新抗原為TCSP，TSCP的定義如下。術語「胺基酸」是指天然和非天然胺基酸。「天然」胺基酸包括天然來源的蛋白質中發現的L型胺基酸，即丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸(F)、半胱氨酸(C)、 穀氨醯胺(Q)、穀氨酸(E)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、 甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y) 和纈氨酸(V)。「非天然」胺基酸包括D型天然胺基酸、某些天然胺基酸(如精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和絲氨酸)的同源型(Homo form)胺基酸、和亮氨酸和纈氨酸的正型(nor form)胺基酸。它們也包括其它的合成胺基酸。「肽類化合物」特別包括肽和多肽，其包括通過(例如)糖基化、乙醯化、磷酸化、 或與脂肪酸反應而得到的衍生物。該術語也包括天然來源的蛋白質和多肽。術語「抗體」包括多克隆和單克隆抗體。術語「單克隆抗體」是指具有同質群體的抗體組合物，而不考慮物種、來源和獲得所述抗體的方法。此外，術語「抗體」包括至少存在某些免疫球蛋白結構域的人的抗體，如抗體片段和所謂的VHVL域(可變重鏈和可變輕鏈)， 和小抗體。術語「NCRA」或「NCRA抗體」(非克氏錐蟲相關抗體)是指與TCSP抗原特異性地結合的抗體，以及這些抗體不是在克氏錐蟲感染宿主後在宿主內誘導產生的。術語「 TCSP 」 (克氏錐蟲合成肽)、「 TCSP抗原」、「 TCSP肽」或「 TCSP蛋白質」都是指本發明所定義的新的肽(其具有在蛋白質TCR70和TCR69中也發現了的胺基酸序列，即 SEQ ID No. 1，其定義如下，所述序列可從克氏錐蟲中分離得到，並作為NCRA的抗原)以及其所有變體和功能等價物，例如可被如上定義的NCRA識別的線性或非線性抗原決定簇。對應於SEQ ID No. 2的抗原決定簇的最小結構定義如下。術語「自體抗原」是指存在於宿主的內源性分子中的抗原決定簇，其可被所述宿主的免疫系統識別，從而可能引發免疫反應。這種機制可導致「自身免疫疾病」，在此將所述自身免疫疾病定義為由宿主針對自體抗原(也稱為自體表位)的不希望發生的免疫反應引起的病理狀態。術語「傳染原」在此是指能誘發免疫反應的任何有生命或無生命的物質。更具體而言，它是指病原體、過敏原和半抗原。「病原體」特別包括朊病毒、病毒、分離出或未分離出的原核生物和真核微生物。「過敏原」包括能自發引起宿主內的免疫反應的所有物質或分子 (當所述宿主暴露於所述物質或分子的時候)。術語「生物流體」是指有生命的有機體(如人類患者)的體液，即取自患者身上的任何流體，如血清、血漿、全血、尿、腦脊液、唾液或細胞培養物的上清液。發明詳述根據本發明，所述技術問題通過使用與新抗原(TCSP)反應的新抗體得以解決，所述新抗原來源於單細胞寄生蟲克氏錐蟲(T. Cruzi)的一個蛋白質，其中所述克氏錐蟲可導致美洲錐蟲病。本發明的特徵在於與克氏錐蟲寄生蟲不相關的抗體(稱為NCRA抗體)特異性地識別TCSP抗原，因此不被所述抗原誘導。可通過TCSP抗原與其它免疫原(內源性或外源性的、已經免疫個體的和已經誘導NCRA的免疫原)的結構性擬態，解釋該異源識別的現象。TCSP抗原的肽序列來源自一個已知的蛋白質，並且在資料庫Swissprot、Uniprot 和TrEMBL中記錄有所述蛋白質(登記號Q7M3W1)。該蛋白質被稱為TCR69 ；它類似於蛋白質 TCR70。根據本發明，用於定義NCRA抗體的蛋白質的肽序列，用三個字母的胺基酸代碼表示是Ala-A1a-A 1a-Pro-A1a~Lys~Ala~A1a-A 1a-A 1a-Pro-A1a-Lys-Thr-A1a-A Ia-AIa-P ro-Val(SEQ ID No. 1)。只要它們具有與所述肽同樣的抗原性能，所述肽的免疫反應性的變體也包含在本發明的範圍內。在保留原序列的生物活性的條件下，(例如)通過其它化學實體替換一個或多個胺基酸，可得到一個肽序列的變體；也可以通過添加化學化合物，如生物素或天然聚合物或合成聚合物(如聚賴氨酸或多糖)，得到所述變體。本發明涵蓋了所有保留了原序列的生物活性的這些變體。這些變體可特別由以下序列構成Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 2)並且更優選以下序列Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(S EQ ID No. 3)該序列可以重複一次或多次，並且在重複中，如SEQ ID No. 1中末端單元(指的是 「C-末端」)的丙氨酸可被蘇氨酸單元取代。由這些序列構成的肽也具有相同的生物活性， 並且可在本發明的範圍內使用。可以通過將克氏錐蟲寄生蟲的蛋白提取物進行純化，而得到TCSP，其中所述純化通常產生具有序列SEQ ID No. USEQ ID No.2和SEQ ID No. 3的蛋白質TCR69或TCR70 (見上文所引用的Hoft等的文獻)。TCSP和它的變體也可通過化學合成獲得(例如，根據本領域技術人員公知的Merrifield法)。還可以通過分子克隆技術獲得，如重組DNA，其包括 在微生物表達系統中表達蛋白質，其中所述微生物表達系統為插入了編碼所述肽序列的核苷酸序列後的微生物表達系統，然後培養、提取以及純化目的肽。由於會導致假陽性反應，因此TCSP抗原及其變體不能用於甄別美洲錐蟲病。本發明人發現TCSP與NCRA可發生特異性的反應。這意味著TCSP具有能夠結合NCRA的特定的肽序列。可以通過任何已知的方法檢測這種結合，如化學發光法、凝集法、免疫酶或放射性方法。生物標記抗體存在於生物流體中，並且它的存在與患有心肌病的患者中的臨床症狀有關，例如感染了人類免疫缺陷病毒HIV的患者，所述患者已出現了心臟病併發症。本發明涉及TCSP的肽序列以及任何能夠與所述同樣的生物標記抗體結合的結構類似物，並且所述TCSP的肽序列以及結構類似物並不一定是由克氏錐蟲寄生蟲所誘導的(NCRA)。本發明還涉及一種免疫學分析方法，其可用於檢測和監測傳染病患者或自身免疫炎症患者中的心肌炎和心肌症。本發明的一個實施方案為定性或定量地檢測生物樣品中NCRA濃度的方法，其包括以下步驟a)得到生物樣品，如血清、血漿、全血、尿、腦脊液、唾液、或組織標本樣品、或細胞培養物的上清液；b)確定所述生物樣品中的NCRA的濃度。所述生物樣品可以為液體、凝膠或固體形式。其可來自於患者或體外培養物。本發明還涉及通過確定NCRA的濃度來監測心肌症的治療。事實上，上述方法也可用於估測，由於孕婦體內存在NCRA，由子宮內心臟驟停所引起的胎兒死亡的概率。事實上， 這些抗體的經胎盤轉運能夠破壞胚胎發育過程中的心肌細胞。在心臟組織未發育完全的情況下，其效果更為顯著。在該方法中，可得到患者即孕婦的生物液體樣品，並確定該樣品中的NCRA濃度。此外，NCRA分析能夠得出對心肌病患者的治療策略，或者針對這種疾病進行疫苗的研發。目前，能誘導生物標記抗體的免疫原的性質是未知的；然而，本發明中所公開的 TCSP序列能夠給所述疾病的病因進行定性，以及用於對在人體(未與克氏錐蟲寄生蟲接觸)中誘導的所述NCRA的傳染原或非傳染原進行分離，從而有助於研發新的治療策略。作為一個例子，可以將抗體或抗TCSP抗體片段進行設計，以便其能競爭性抑制 NCRA與它們的生物靶位的結合，從而抑制其致病作用。本發現使得這種競爭性抗體的設計成為可能。此外，NCRA的縱向測量(在同一患者中隨著時間的推移進行測量)能夠顯示出心肌病的變化及其治療的功效。從血液循環中除去相同的NCRA，即通過免疫吸附技術，能夠降低甚至完全抑制其致病作用。本發明是基於從克氏錐蟲寄生蟲分離的蛋白質在從未接觸過該寄生蟲的患者中的令人驚訝的抗原特性。事實上，所述TCSP抗原具有與NCRA的特殊的「異種特異性」活性， 所述NCRA在該寄生蟲地方性區域之外的有生命的人類患者中廣泛存在。它顯然與肽的擬態機制有關；這些抗體可引起篩選美洲錐蟲病的測試中的假陽性反應。這種機制使得TCSP肽能夠與NCRA特異性地結合，所述NCRA直接對應於自體抗原或克氏錐蟲以外的傳染原。因此，本發明的一個實施方案針對的是TCSP多肽或其免疫反應性變體在檢測NCRA中的用途。這些NCRA抗體也能夠與自體抗原或傳染性微生物的抗原相結合，其具有與TCSP的結合差不多的親和力和特異性。更具體而言，本發明提供了一種用於識別或分離傳染原或非傳染原的如上所述的多肽，所述傳染原或非傳染原可誘導能轉而導致自身免疫疾病的抗體。本發明還提供了一種如上所述的多肽，其中所述傳染原為在表觀健康的人體中分布相對廣泛的病毒或微生物，其中特別是在感染了(例如)人類免疫缺陷病毒、支原體和其它隨機傳染原的患者中分布廣泛。本發明也使得使用如上所述的多肽成為可能，其中所述自身免疫疾病選自心臟病症中所述的疾病，如心肌病和心肌炎。此外，本發明提供了一種檢測針對TCSP多肽的抗體的方法，所述方法將TCSP或變體與存在於生物流體樣品中的NCRA相接觸，並且通過本領域技術人員所公知的方法檢測所述生物樣品中的NCRA的結合。此外，本發明提供了一種檢測針對TCSP多肽的抗體的分析方法，其包括通過免疫分析領域的科學家已知的方法，能夠檢測抗原-抗體結合的試劑或工具。在本發明的另一實施方案中，採用的是TCSP多肽或其變體(該變體對於NCRA具有特異性的活性)，以提高血清學篩查分析美洲錐蟲病的特異性。從圖1所示的結果可以明確看到，篩查測試中檢測到的NCRA不是由克氏錐蟲寄生蟲感染引起的。因此，TCSP抗原對這些抗體的抑制可以提高美洲錐蟲病的診斷測試的特異性。本發明中的免疫反應性測試採用的是本領域技術人員所公知的ELISA(酶聯免疫吸附法)技術；然而，本發明也可應用任何能夠檢測或測量抗原-抗體的結合的其它技術， 特別是為了實施本發明主題之一的新的免疫診斷方法。本發明的另一個主題是TCSP肽或其變體的治療用途，以獲得具有相當於NCRA的結合活性的抗體或抗體片段。在該用途中，首先對有生命的有機體(例如動物)進行針對 TCSP肽的免疫，從而製備抗體或抗體片段。然後製備包含以下物質的藥物製劑所述抗體或抗體片段、藥學上可接受的注射液、以及任選的佐劑(如聚山梨酯、蔗糖)。然後，對患者施用(例如注射)上述藥物製劑，以與病原性的NCRA競爭。從而降低了病原性的NCRA的濃度，以及改善了患者的臨床症狀。本發明的另一個主題是一種降低生物流體樣品(特別是血液樣品或血流)中的根據本發明的抗體的濃度的方法，所述方法包括以下步驟通過採用具有序列SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，來沉澱所述抗體，其中所述肽或蛋白質對根據本發明所述的抗體具有特異性的活性。可根據診斷目的、大量生物液體的處理目的或血漿取出法的治療目的，來實施該方法。上述方法可以靜態實施，或在所述生物流體流中實施。優選的是，作為免疫吸附法實施。在一個典型的實施方案中，生物流體與固體載體相接觸，在所述固體載體上固定有所述肽，或所述蛋白質，或具有序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的所述蛋白質，或TCSP肽或所述TCSP肽的變體。所述抗體，如果存在的話，之後就會沉澱在該固體載體上，並被從生物流體中除去。本發明的另一個方面是一種藥物製劑，其包含具有相當於NCRA的活性的抗體或抗體片段、藥學上可接受的注射液，以及任選的一個或多個佐劑(如聚山梨酯和/或蔗糖)。 該抗體或抗體片段可以以不同的方式獲得。在一個實施方案中，可以通過使用TCSP對表達特異性抗體的噬菌體庫進行篩選，獲得該抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，可以通過以下方法在有生命的有機體中獲得該抗體或抗體片段使用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，該肽或蛋白質的使用導致所述有機體針對TCSP肽產生免疫，檢測與具有序列SEQ ID No. 1的肽特異性地結合的抗體，但是所述抗體不是在克氏錐蟲感染宿主後在宿主內誘導產生的。本發明的另一個方面是TCSP在疫苗組合物中的用途，特別是具有序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、或SEQ ID No. 3的TCSP，所述用途使得人類針對以下疾病至少部分地產生免疫成為可能美洲錐蟲病以外的疾病，特別是自身免疫性心肌病、心肌炎和系統性紅斑狼瘡。這種疫苗可以進行單劑量或多劑量的注射。在這些組合物中，可以以肽、或以生物素化的形式和/或連接到抗生物素蛋白衍生物，以及特別是通過化學和酶改性而獲得的抗生物素蛋白衍生物(稱為NeutraLite Avidin)的形式，使用所述TCSP。所述組合物可以包含溶劑、添加劑、緩衝液和藥學上可接受的載體，以及視情況而定的其它有效成分。根據本發明的另一個方面，採用的是具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2,SEQ IDNo. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，所述肽或蛋白質對本發明所述的抗體具有特異性的活性，以鑑定或分離與NCRA特異性地結合的或被NCRA特異性地識別的病原體。 這種新方法使得鑑定能夠誘發以下疾病的病原體成為可能，其中所述疾病不包括美洲錐蟲病，並且能夠誘導NCRA的形成。在根據本發明的TCSP的一些用途中，標記TCSP是有益的，例如可通過發色團或螢光團，或另一種能容易地被檢測到的化學實體(酶、放射性同位素、生物素、半抗原等)。實施例以下例子是對本發明的某些主題進行舉例說明，而非是對本發明的限定。群組研究的例子實施例1 這些例子對應於數目為N的幾個人群的篩選試驗。表1和2以及圖1示出了這些篩選試驗的結果。在此將描述這些試驗所使用的ELISA診斷技術，以及所述試驗的連續步
馬聚οELISA 技術將TCSP肽(用序列SEQ ID No. 1的合成肽代表)以1 μ g/m的濃度吸附在聚苯乙烯微孔板上。然後用免疫中性蛋白(在此為白蛋白)使自由附著位點飽和。用洗滌緩衝液衝洗微孔板，然後乾燥備用。在稀釋緩衝液中進行1/20稀釋後，在微孔中孵育待測樣品；洗滌3次除去未固定在抗原表面的抗體。通過針對人IgG的抗體以及用酶示蹤標記的抗體， 檢測固定在微孔板上的TCSP的特異性抗體。通過測量與生色團在適當的波長範圍內(特別是約450nm的波長)的吸收相對應的光密度，所用酶的生色底物用來顯示抗-TCSP的吸附。1. TCSP肽與血清中的NCRA的反應，其中所述血清得自於感染了人類免疫缺陷病毒的患者檢測感染了人類免疫缺陷病毒的患者的血清樣品中是否存在NCRA，所述患者分為以下兩個群體非洲患者和西方患者(歐洲和美國來源)。2. TCSP肽與從「健康」獻血者中獲得的血清(即抗-HIV、抗-HVC、抗-HVB抗體以及梅毒陰性)的反應。在以下假設的基礎上針對TCSP的抗體不是由克氏錐蟲感染誘導的，採用歐洲血清樣品來評價針對TCSP的抗體的普遍存在程度。如上所述，這些血清得自於健康獻血者中；這些獻血者由此比一般人群(從其中得到這些獻血者)具有更好的健康狀態。為了完全確定針對TCSP的這些抗體的來源，採用市售可得的試劑盒以隨機順序對所有的樣品進行測試，其中所述試劑盒能夠檢測出克氏錐蟲感染；沒有發現陽性樣品。然而，完全出乎預料的是，發現顯著比例的這些樣品卻含有針對TCSP的抗體。結論是克氏錐蟲使用的是高免疫原性基序，其也被其它病原體使用和/或可導致自身免疫性抗體。3. TCSP肽與患者血清中的NCRA的反應通過血清樣品和預先吸附了 TCSP的固體表面的相互作用。4. TCSP與感染了克氏錐蟲的患者的血清的反應鑑於TCSP抗原來源於克氏錐蟲寄生蟲的一個蛋白質，因此通過傳統技術難以區分克氏錐蟲感染所誘導的抗體和自身免疫機制所誘導的抗體(NCRA)。在使用TCSP作為抗原的ELISA試驗中，發現兩類抗體被混淆在一起；EIA的結果無法辨別。結果記錄在表1和2以及圖1中。對於有N個患者的各個群體，這些數字表明了試驗中所用的NCRA與TCSP肽之間的反應性的分布(由光密度表示)。各個點的分布代表每個群體；矩形(盒)示出了半-四分位差。水平實線示出了每個群體的算術平均數，水平點線界定的是95%的群體。表 權利要求
1.一種抗體，該抗體與具有以下序列的肽特異性地結合Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-V al(SEQ ID No. 1)，並且所述抗體不是在克氏錐蟲(T. cruzi)感染宿主之後在宿主體內誘導產生的。
2.一種與根據權利要求1所述的抗體特異性地結合的抗原，該抗原不包括由克氏錐蟲寄生蟲遺傳編碼的抗原。
3.一種肽或蛋白質在檢測和/或沉澱根據權利要求1所述的抗體中的用途，所述肽或蛋白質對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性，其中所述肽或蛋白質具有以下序列Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala(SEQ ID No. 2),所述序列優選為以下序列Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID No. 3)，並且更優選為序列SEQ ID No. 1。
4.根據權利要求3所述的用途，其特徵在於所述肽或所述蛋白質為TCSP肽或TCSP肽的變體，所述變體對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性。
5.根據權利要求3或4所述的用途，其特徵在於所述抗體與傳染原的抗原、過敏原和 /或自體抗原相結合。
6.根據權利要求5所述的用途，其特徵在於所述傳染原為病原體，並且根據權利要求 1所述的抗體的存在與傳染性疾病或自身免疫疾病有關。
7.根據權利要求6所述的用途，其特徵在於所述病原體選自由朊病毒、病毒、原核生物以及單細胞或多細胞的真核微生物所組成的組。
8.根據權利要求6所述的用途，其特徵在於所述傳染性疾病或自身免疫疾病選自由心肌病、心肌炎和系統性紅斑狼瘡所組成的組。
9.一種檢測液體樣品中的根據權利要求1所述的抗體的方法，其包括以下步驟(c)將生物樣品與具有序列SEQID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質， 或TCSP肽或TCSP肽的變體相接觸，所述肽或蛋白質對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性，其中所述生物樣品優選為體液樣品和/或細胞培養物的上清液樣品(「液體樣品」)；(d)採用一種或多種合適的標記物，來確定所述液體樣品中的根據權利要求1所述的抗體與所述肽或所述蛋白質的結合，其中所述標記物能夠確定所述肽或蛋白質和根據權利要求1所述的抗體形成的複合物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述標記物選自由以下物質所組成的組化學發光標記物、凝集標記物、膜標記物、免疫酶標記物和放射性標記物。
11.一種用於實施根據權利要求10所述的方法的試劑盒或裝置，其包括(d)確定量的一種或多種具有序列SEQID No. USEQ ID No. 2,SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，和/或TCSP肽或TCSP肽的變體，所述肽或蛋白質對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性；(e)一種或多種合適的標記物，該標記物能夠確定所述肽或蛋白質與根據權利要求1 所述的抗體所形成的複合物；(f)任選的，固體載體，該固體載體優選為用所述肽或蛋白質浸漬過。
12.根據權利要求11所述的試劑盒或裝置，其特徵在於所述標記物選自由以下物質所組成的組化學發光標記物、凝集標記物、膜標記物、免疫酶標記物和放射性標記物。
13.一種免疫診斷方法，包括以下步驟通過採用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、 SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，而定性或定量地檢測根據權利要求1所述的抗體，所述肽或所述蛋白質對權利要求1所述的抗體具有特異性的活性。
14.一種降低生物流體樣品如血液樣品或生物流體流如血流中的根據權利要求1所述的抗體的濃度的方法，包括以下步驟通過採用具有序列SEQ ID No. USEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或TCSP肽的變體，來沉澱所述抗體，所述肽或蛋白質對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性。
15.具有序列SEQID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或 TCSP肽的變體，在用於獲得具有相當於NCRA的結合活性的抗體或抗體片段中的用途，所述肽或所述蛋白質對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性。
16.具有序列SEQID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3的肽或蛋白質，或TCSP肽或 TCSP肽的變體，在鑑定或分離與NCRA特異性地結合的或被NCRA特異性地識別的病原體中的用途，所述肽或所述蛋白質對於根據權利要求1所述的抗體具有特異性的活性。
17.一種藥物製劑，其包含具有相當於NCRA的結合活性的抗體或抗體片段、藥學上可接受的注射液、以及任選地一種或多種載體(如聚山梨酯和/或蔗糖)或添加劑，其中所述抗體或抗體片段是通過根據權利要求3-8中的任意一項所述的用途在有生命的有機體中獲得的，從而導致所述有機體針對TCSP肽的免疫。
全文摘要
本發明涉及一種新抗體，所述抗體與具有以下序列的肽特異性地結合Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val(SEQ ID No.1)，並且所述抗體不是在克氏錐蟲(T.cruzi)感染宿主之後在宿主內誘導產生的。
文檔編號C07K16/20GK102448988SQ201080020080
公開日2012年5月9日 申請日期2010年5月6日 優先權日2009年5月7日
發明者菲利普·范海姆斯, 馬安·茲雷恩 申請人:克勞德貝爾納裡昂第一大學, 因菲尼迪生物標誌公司, 法國國家科學研究中心, 裡昂公民濟貧院