使用肺癌特異性甲基化標記基因檢測肺癌的方法

2023-07-13 18:59:26 1

使用肺癌特異性甲基化標記基因檢測肺癌的方法
【專利摘要】本發明涉及使用肺癌特異性生物標記物檢測肺癌的方法，尤其是肺癌診斷的生物標記物，其可檢測其5』UTR或者外顯子1區域是在肺癌細胞中特異性甲基化的PCDHGA12基因的甲基化；和使用所述生物標記物檢測肺癌和它的發展階段的方法。根據本發明的診斷試劑盒使得相比於傳統方法，在早期以準確和快速的方式診斷肺癌成為可能，可用於肺癌和它的發展階段的預後和監測。
【專利說明】使用肺癌特異性甲基化標記基因檢測肺癌的方法
[0001] 本申請是發明專利申請200980108952. 2的分案申請。

【技術領域】
[0002] 本發明涉及一種使用肺癌特異性生物標記物檢測肺癌的方法，尤其是用於肺癌診 斷的生物標記物，其可檢測PCDHGA12的甲基化作用，它的5, UTR或外顯子1區域在轉化的 肺癌細胞內特異性地甲基化；和使用該生物標記物檢測肺癌和其發展階段的方法。

【背景技術】
[0003]在20世紀抽菸變得普遍之前，肺癌是一個非常稀有的疾病。肺癌的發生率快速增 長，在西方國家，肺癌在男性和女性中均是最多發的癌症。在韓國，肺癌通常發生在男性中， 它的發病率在女性中也驚人得增長。肺癌發病率的這種增長是歸根於抽菸、空氣汙染和工 業汙染等等。
[0004]即使在藥物科學發達的現代，肺癌病人的5年生存率，尤其是實體瘤患者（除了血 癌患者）小於50%，所有癌症患者中的大約2/3在晚期被診斷，大多數是在癌症診斷後兩年 內死亡。癌症治療中的這種拙劣的結果不僅是治療方法的問題，還因為在早期診斷癌症和 精確地確診晚期癌症，和在癌症治療後實施癌症患者的跟蹤（follow-up)並不容易。
[0005]最近，基因檢測方法被積極地用於診斷癌症的嘗試。在它們中，典型的方法是使 用PCR技術確定是不是ABL :BCR(AbelS〇n鼠科白血病病毒致癌基因同源體：斷裂點叢集 區）的融合基因，其是存在於血液中的白血病的基因指示物。此外，已嘗試另一個方法，由 癌細胞表達的基因的存在性通過RT-PCR檢測和印跡檢測，由此診斷血液細胞中癌細胞的 存在。然而，這個方法具有缺點：它只能運用於某些癌症，包括前列腺癌和惡性黑色素瘤，具 有較高的錯誤陽性率。而且，它難於在這種方法中的檢測和讀取的標準化，它的應用也受到 限制（Kopreski，M. S.等人，Clin. Cancer Res.，5:1961，1999 ;Miyashiro, L 等人，Clin. Chem.，47:505, 2001)。另外，最近已積極地嘗試使用在血清或血漿中的DNA的基因檢測。 使用從癌症中分離的DNA以分析癌症特異性基因異常，比如致癌基因和腫瘤抑制基因的突 變、缺失和功能喪失，允許癌症的診斷。
[0006] 同時，正在嘗試通過基因或者抗體測試來檢測在肺癌患者的痰或者支氣管 肺泡灌洗液中癌細胞或者致癌基因的存在的方法（Palmisano, W. A.等人，Cancer Res·，6〇:5954,2000;Sueoka，E.等人，Cancer Res·,59:1404, 1999)。然而，為了準確地診 斷涉及大量的基因異常和顯示不同突變的癌症，需要能夠以準確和自動的方式同步分析大 量基因的方法，但這樣的方法仍未建立。
[0007] 因此，最近提出通過測量DNA甲基化的診斷癌症的方法。DNA甲基化主要發生在特 異性基因的啟動子區域的CpG島的胞嘧啶上，因此阻斷了轉錄因子的結合，從而特異性基 因的表達被沉默。如此，腫瘤抑制基因的啟動子CpG島的甲基化的分析是非常有助於癌症 研究的。活躍的嘗試已經用於分析啟動子CpG島的甲基化，通過比如甲基化特異性PCR(此 後，稱為"MSP"）的方法或者自動的鹼基配對和使用分析結果診斷和篩選癌症的方法。
[0008] 雖然存在啟動子CpG島的甲基化是否直接誘導致癌基因或是在致癌基因中導致 二級反應的爭論，已肯定在不同癌症中的腫瘤抑制基因、DNA修復基因、細胞循環調控基因 和類似物是高度甲基化的（hyper-methylationed)，從而這些基因的表達被沉默。尤其是， 眾所周知特異性基因的啟動子區域的高甲基化發生在致癌基因的早期。
[0009] 因此，腫瘤相關的基因的啟動子甲基化是癌症的重要指標，可以用於許多應用中， 包括癌症的診斷和早期檢測，致癌基因的風險預測，癌症預後的預測，治療後的隨診，抗癌 治療的反應的預測。事實上，最近已經活躍地嘗試檢查血液、痰、唾液、糞便或者尿液中的 腫瘤相關基因的啟動子甲基化，和利用檢測結果診斷和治療不同的癌症（Esteller，M.等 人，Cancer Res·，59:67,1999 ;Sanchez_Cespedez，M.等人，Cancer Res·, 60:892, 2000; Ahlquist, D_ Α·等人，Gastroenterol.，119:1219, 2000)。
[0010] 最近，通過不同檢查診斷肺癌是可能的，如果疑似肺癌的症狀存在，實施胸部 X-射線的檢測、顯微檢測、視頻成像檢測、活組織切片檢查、轉移的檢測或類似的檢查確定 是否症狀是肺癌或確定肺癌的發展階段。然而，這種檢查方法需要昂貴的系統，是花費大 的，具有難度的，不適於肺癌早期診斷，另外，存在取樣的困難。這樣，考慮到具有小於3cm 的腫瘤尺寸的一期肺癌患者的5年存活率大於70%，在病變的尺寸是小的時候，早期診斷 肺癌是最好的辦法。因此，迫切得需要發展比各種現有肺癌檢查方法更有效的檢查方法。也 就是，需要開發新的肺癌特異性生物標記物，其可診斷早期的肺癌，處理大量的樣品和具有 高度敏感性和特異性。
[0011] 因此，本申請的發明人已申請並獲得了用於癌症診斷的微陣列和試劑盒的專利， 包括克隆癌症特異性表達降低的基因 LAMA2 (層粘連蛋白分區蛋白a 2 (laminin merosin alpha 2))、FABP4 (脂肪酸結合蛋白4)、GSTA2 (穀胱苷肽S-轉移酶A2)、STMN2 (類微管去 穩蛋白2(stathmin-like 2))、NR4A2(核受體亞族4、組A、成員2)、DSCR1L1 (類唐氏綜合 症關鍵區域基因-11 (down syndrome critical region gene Ι-like 1))、Α2Μ(α-2-巨球 蛋白）和SEPP1(硒蛋白P、原生質血漿1 (selenopr〇tein P，plasma, 1))(韓國專利註冊號 10-0617649)。
[0012]本申請的發明人已作出許多努力開發能夠有效診斷肺癌的診斷試劑盒，結果發現 肺癌和它的進展階段可通過利用PCDHGA12的（GenBank NM_032094)基因的甲基化的5，UTR 或者甲基化的外顯子1的區域檢測甲基化程度來診斷，其在肺癌細胞中特異性甲基化，作 為癌症特異性標記物，由此完成了本發明。
[0013] 發明概述
[00M]本發明的目的是提供一種包括基因甲基化區域的用於肺癌診斷的生物標記物，所 述基因在肺癌中特異性甲基化。
[0015]本發明的另一個目的是提供一種利用肺癌診斷生物標記物來檢測肺癌和它的進 展階段的方法。
[0016]為達到上述目的，本發明提供用於肺癌診斷的生物標記物，其包括癌症特異性表 達降低基因 PCDHGA12(GenBank NM-032094、原粘鈣蛋白Y亞族A，12)的甲基化的5，UTR 或外顯子1區域。
[0017]本發明還提供用於肺癌診斷的生物標記物，其包括一個或多個甲基化CpG島，且 由SEQ ID N0:2到4的任一鹼基序列表示。
[0018] 本發明還提供檢測肺癌和它的進展階段的方法，所述方法包括以下步驟：(a)從 臨床樣品中分離DNA ;和（b)在分離的DNA中檢測肺癌特異性基因 PCDHGA12 (GenBank NM_032094,原粘鈣蛋白Y亞族A，12)的5' UTR或外顯子1區域的甲基化作用。
[0019] 本發明還提供一種檢測肺癌的試劑盒，包括用於檢測在從生物樣品中分離的基因 組中，原粘鈣蛋白Y亞族A，12,也就是PCDHGA12基因的5'UTR(非翻譯區域）和外顯子1 區域中一個或多個區域的CpG甲基化的工具，其中CpG甲基化的存在表示肺癌的存在。
[0020] 本發明的其它特徵和實施例將從以下描述和所附權利要求中更為明確。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是發現用於肺癌診斷的甲基化生物標記物PCDHGA12的過程的示意圖。
[0022] 圖2顯示通過亞硫酸鹽測序法測量基因區域㈧的甲基化程度、和UTR和外顯子 區域（B)的甲基化程度，以確定在正常細胞和肺細胞株中PCDHGA12的甲基化程度的結果。 [0023]圖3顯示在正常細胞中和四種肺細胞中通過焦磷酸測序法測量p⑶ HGA12基因的 甲基化程度的結果。
[0024]圖4顯示通過焦磷酸測序法測量PCDHGA12基因在五種正常組織和四十種成對的 肺癌組織中的甲基化程度的結果。
[0025]圖5顯示測量正常人（η = 51)和肺癌患者（η = 81)的痰細胞的基因組DNA的甲 基化作用的結果。
[0026]圖6顯示利用正常和肺癌細胞株以及正常和肺癌患者的每個的痰DNA測量 PCDHGA12基因的啟動子甲基化程度的結果。

【具體實施方式】
[0027] -方面，本發明涉及肺癌診斷的生物標記物，其包括肺癌特異性表達降低的基因 PCDHGA12(GenBank麗一032094,原粘鈣蛋白γ亞族A，12的甲基化的5'UTR或者甲基化的 外顯子1區域。
[0028]在本發明中，甲基化的5'UTR(非編譯區）或者甲基化的外顯子！區域優選包括至 少一個甲基化CpG二核苷酸，且5'UTR和外顯子1區域優選由SEQ ID NO: 1表示。
[0029]篩選甲基化標記基因的方法的一個例子可以是包括以下步驟的方法：（丨）僅從轉 化細胞株和非轉化細胞株中的轉化細胞株中選擇DNA-高度甲基化的基因；(2)包括轉化的 肺癌細胞和鄰近那些的非轉化的細胞的基因表達譜，產生一份在非轉化的細胞中更高表達 的基因的列表；( 3)用甲基化抑制劑處理轉化的肺癌（細胞）株，產生一份與非處理的轉化 的肺癌細胞系比較，在用甲基化抑制劑處理的轉化的肺癌細胞株中更高程度表達的基因的 列表；和⑷比較從上述步驟（1)、（2)、⑶中獲取的基因列表，觀察在上述三個列表中都 存在的基因，作為由從非轉化狀態轉變到轉化的肺癌細胞形式的細胞的基因組中由甲基化 調控的標記基因。
[0030]在本發明中，通過上述篩選方法從肺癌細胞株的基因組DNA中篩選而來的肺癌特 異性表達降低基因 PCDHGA12在5' UTR和外顯子1區域中具有甲基化CpG島。
[0031]在另一方面，本發明涉及生物標記物，其包括一個或多個甲基化CpG島，且由SEQ ID N0:2和3的任何一個鹼基序列表示。
[0032] 在本發明中，DNA片段優選分離自肺癌特異性表達降低的基因 PCDHGA12(GenBank NM_032〇94,原粘鈣蛋白γ亞族A，12)。
[0033] 在本發明中，肺癌特異性表達降低的基因 PCDHGA12的5' UTR和外顯子1區域在 肺癌細胞株中的R1(SEQ ID N0:2)、R2(SEQ ID N0:3)和R3(SEQ ID N0:4)區域中具有甲基 化。
[0034] 在本發明的一個實施例中，來自肺癌患者的肺癌組織中的PCDHGA12基因的R1、R2 和R3顯示高甲基化水平，在成對的肺癌組織和在其附近的正常組織中的R1區域的甲基化 在40個臨床樣品中的：34個（g卩，臨床樣品的85% )中顯示，且在36個臨床樣品，這些組 織中的R3區域的甲基化高（g卩，臨床樣品的90% )。這個表示肺癌可以有效地通過測量 P⑶HGA12基因的R1、R2和R3區域的高度甲基化作用來診斷。
[0035]在另一方面，本發明涉及檢測肺癌或其發展階段的方法，該方法包括以下步驟： (a)從臨床樣品中分離DNA ;和（b)在分離的DNA中檢測PCDHGA12(GenBank NM_032094,原 粘鈣蛋白Y亞族A，12)基因的5' UTR或外顯子1區域的甲基化程度。
[0036] 在本發明中，甲基化的檢測優選在具有從由下組中選擇的序列的DNA區域中實 施，該組由 SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 和 SEQ ID N0:4 組成。
[0037] 在本發明中，甲基化的檢測優選使用選自下組中的一種方法，該組由PCR、甲基化 特異性PCR、實時甲基化特異性PCR、利用甲基化DNA特異性結合蛋白質的PCR、定量PCR、基 於DNA晶片的檢測方法、焦磷酸測序法和亞硫酸鹽測序法組成，且所述臨床樣品是來自疑 似癌症的患者或將被診斷的對象中的組織、細胞、血液或尿液。
[0038] 通過在本發明的實施例中使用的篩選甲基化作用的生物標記基因的方法，不僅可 以篩選肺癌，還可以篩選向癌症發展的組織的各種混合體型階段差異性地甲基化的基因。 篩選的基因可用於肺癌篩選、風險評估、預後、疾病識別、病症階段的診斷和治療性靶標的 選擇。
[0039]在肺癌中的甲基化的基因和在肺癌不同階段的異常的識別，使得肺癌的準確和有 效地早期診斷成為可能，允許多重基因的甲基化圖譜和治療性幹預的新靶標的識別。此外， 根據本發明的甲基化數據可與其它非甲基化相關的生物標記物檢測方法結合以獲取肺癌 診斷的更為精確的系統。
[0040] 根據本發明的方法，肺癌在不同階段或時期的進展可通過從樣品中獲取的一個或 多個核酸生物標記物的甲基化程度的測量進行診斷。通過比較從肺癌的每個階段的樣品中 分離出的核酸的甲基化程度與從沒有細胞增殖性異常的肺部組織中的樣品中分離出的一 個或多個核酸的甲基化程度，可檢測樣品中肺癌的具體階段。這裡，甲基化程度可以為高度 甲基化。
[0041] 在本發明的一個實施方式中，核酸可以在基因的調控區域中被甲基化。在另一個 實施方式中，涉及細胞轉化的基因可通過檢測基因的調控區域外部的甲基化來診斷，因為 甲基化作用由基因的外部向內部發展。
[0042] 在本發明的另一個實施方式中，樣品中的肺部組織細胞的異常生長（發育異常） 可以使用試劑盒通過對於PCDHGA12(NM_032094,原粘鈣蛋白γ亞族A,12基因的5，UTR和 外顯子1區域的甲基化程度檢測來診斷的。
[0043]本發明的診斷性試劑盒的使用可確定樣品中肺部組織細胞的異常生長（發育異 常的進展）。本發明的診斷性方法包括確定一個或多個從樣品中分離的核酸的甲基化狀態， 其中所述一個或多個核酸的甲基化程度是與從肺部組織細胞的沒有異常生長（發育異常） 的樣品中分離的核酸的甲基化程度進行比較。
[0044] 本發明的另一個實施方式中，甲基化基因標記物的使用允許可能形成肺癌的細胞 的早期診斷。當確定在癌症細胞中甲基化的基因在臨床上或形態學上正常表象的細胞中甲 基化時，這就表明該正常表象的細胞向癌症發展。這樣，肺癌可在早期通過在正常表象的細 胞中的肺癌特異性基因的5' UTR和外顯子1區域的甲基化作用而診斷。
[0045]本發明的甲基化標記基因的使用允許樣品中肺部組織細胞的異常生長（發育異 常的進展）的檢測。本發明的檢測方法包括將含有至少一個從臨床樣品中分離出來的核酸 的樣品與至少一種能夠確定核酸甲基化狀態的試劑接觸，其中該核酸的甲基化作用不同於 沒有異常生長（發育異常的進展）的樣品中存在的核酸的相同區域的甲基化狀態。
[0046] 在本發明的另一個實施方式中，肺癌的進展的可能性可通過使用上面描述過的試 劑盒檢查顯示正常的顯型的樣品中的標記基因的5, UTR和外顯子1區域的甲基化來診斷。 樣品可以是固體或液體組織、細胞、尿液、血清或者血漿。
[0047] 本發明中，檢測PCDHGA12基因的5'UTR和外顯子1區域的甲基化的方法包括以下 步驟：(a)從臨床樣品中分離樣品DNA ; (b)用重亞硫酸鹽處理分離的DNA ; (c)利用能夠擴 增包括PCDHGA12基因的5'UTR和外顯子1區域的CpG的片段的引物擴增經處理的DNA ;和 (d)對步驟（c)中擴增的產物進行焦磷酸測序以測定pCDHGA12基因的甲基化作用。
[0048]^在本發明的一個實施例方式中，將側檢測方法可通過使用試劑盒實施該檢測方法 來進行。用於本發明中的試劑盒包括：劃分區域從而在其內部容納樣品的載體工具；和一 個或多個容器，包括第一容器，其包含靈敏地割裂未甲基化的胞嘧啶的試劑；第二容器，其 包含擴增包含CpG的核酸的引物；第三容器，其包含用於檢測斷裂的或非未斷裂的核酸的 存在的工具。用於本發明中的引物包括在SEQ ID N0:5至21的序列中提出的序列，和它們 的任何功能性組合和片段。載體的工具適用於包含一個或多個容器的工具，比如小瓶、管、 和類似物，每個容器的工具包含一個用於本發明的方法的獨立的要素。根據本發明說明書， 本領域技術人員可容易確定在容器工具中必要試劑的分配。例如，容器工具中的一個可包 括包含了甲基化敏感性限制酶的容器。一個或多個容器工具還可以包含與目的核酸位點互 補的引物。另外，一個或多個容器工具還可以包含所述甲基化敏感性限制酶的同裂酶。 [00 49]本發明p另一個實施方式中，使用所述試劑盒檢測肺癌的方法包括以下步驟：（D 從臨床樣品中分離基因組DNA ; (2)用甲基化敏感性限制酶處理分離出來的基因組DNA ; (3) 使用能夠擴增用於本發明的肺癌診斷的生物標記物的引物擴增經處理的基因組DNA;和 (4)確定經擴增的產物中用於肺癌診斷的生物標記物的存在與否。在這個方法中，存在該生 物標記物片段的樣品可診斷為肺癌或肺癌進展階段。為了確定PCR擴增產物的存在與否， 試劑盒可額外包含能夠與在嚴格條件下用於肺癌診斷的生物標記物雜交的片段。
[0050]可用於本發明中確定用於肺癌診斷的生物標記物的存在與否的方法還可以包括 重亞硫酸鹽測序法、焦磷酸測序法、甲基化特異性PCR、甲基化螢光檢測、使用甲基化DNA結 合蛋白的PCR和DNA晶片陣列。
[0051]如在此所用的，術語"細胞轉化"指的是細胞的特徵從一個形式向另一個形式的變 化，比如正常向異常變化、非腫瘤向腫瘤變化、未分化向分化變化、幹細胞向非幹細胞變化。 此外，轉化作用可通過細胞的形態學、表現型、生物化學表徵和類似性質而識別。
[0052]如在此所用的，術語癌症的"早期檢測"指的是在轉移之前發現癌症的可能性，優 選在可觀察到組織或者細胞的形態學變化之前。此外，術語細胞轉化的"早期檢測，，指的是 細胞在其形態學上顯示已轉化之前的早期階段經受轉化的高度可能性。
[0053]如在此所用的，術語"高度甲基化"指的是CpG島的甲基化。如在此所用的，術語 "樣品"或者"臨床樣品"指的是其廣義，包括任何從個體、體液、細胞株、組織培養獲取的生 物樣品，取決於實施檢測的類型。從哺乳動物中獲取組織活檢和體液的方法在本領域是公 知的。肺部組織活檢是優選的來源。
[0054] 甲基化生物標記的篩選
[0055] 在本發明中，篩選在細胞或組織轉化時或細胞形態學上改變時的甲基化的生物標 記基因。如在此所用的，術語"轉化"指的是細胞或組織在形態學上從一個形式向另一個形 式的變化，比如正常狀態向異常狀態變化、非腫瘤狀態向腫瘤狀態變化、或者未分化狀態向 分化狀態變化。
[0056]依照本發明，向肺癌細胞轉化中的甲基化的生物標記物基因被系統地篩選。例 如，篩選生物標記基因的方法可為包含以下步驟的方法：（1)使用甲基化特異性結合蛋白 MBD2bt從轉化細胞株和非轉化細胞株中僅僅選擇性地分離甲基化的DNA ; (2)擴增每個 DNA,用螢光染料標記擴增的DNAs ; (3)將每個標記的DNAs雜交到能夠測量甲基化的微陣列 上；(4)基於雜交的結果，篩選在轉化細胞中篩選高度甲基化的基因；（ 5)比較轉化的肺癌 細胞和其附近非轉化細胞的基因表達譜，產生一份在非轉化細胞中更高度表達的一系列基 因的列表；(6)用甲基化抑制劑處理轉化肺癌細胞株，產生相比於未處理的轉化的肺癌（細 胞）株，在經處理的轉化的肺癌中具有更高表達的一系列基因的列表；和（7)比較從步驟 (5)和（6)中獲取的基因譜，觀察所有三個基因列表中都存在的基因作為標記基因，其是通 過在從非轉化狀態轉換成轉化的肺癌細胞形式的細胞基因組中的甲基化調控的。
[0057]這裡所用的術語"核酸"或者"核酸序列"指的是寡核苷酸、核苷或者聚核苷酸，或 它們的片段，基因組或合成的單鏈或雙鏈DNA或RNA、基因組或合成的有義鏈或反義鏈DNA 或RNA、肽核酸（PNA)、天然的或者合成的任何類似DNA或類似RNA材料。對於本領域技術 人員明確的是，當核酸是RNA時，脫氧核糖核苷A、G、C和T分別被核苷酸A、G、C和U替換。 [0058]只要有可檢測差異性甲基化CpG島，任何的核酸可以用於本發明。 CpG島是核酸序 列中CpG富集區域。
[0059] 甲基化作用
[0060]在本發明中，可以使用任何純化或非純化形式的核酸樣品，只要其包含或推測包 含具有靶位點的核酸序列（例如含有CpG的核酸）。一個能夠被差異性甲基化的核酸區域 是CpG島，一個相對於其它二核苷酸CpG的核酸區域具有增強密度的核酸序列。 CpG雙聯 體在脊椎動物DNA中以僅約20%的頻度發生，其可從G*C配對的比例中預期。在特定區域 中，CpG雙聯體的密度達到預期值，相對於剩餘的基因組增加了十倍； CpG島具有平均G*c 配對的含量大約60%，相比於在大量DNA中40%的平均值。該島具有大約一千到兩千鹼基 對-DNA典型的長度。在人類基因中有大約45, 000這種島。
[0061]在許多基因中，CpG島開始於啟動子的上遊，向下遊延伸至轉錄區域。在啟動子上 的CpG島的甲基化通常抑制基因的表達。該島還可以環繞基因編碼區域的5,區域和編碼 區域的3'區域。這樣，CpG島可在包括含有啟動子區域的調控區域中的編碼序列的上遊的 核酸序列的多重區域、在編碼區域中（例如，外顯子）、編碼區域的下遊，例如，在增強岡城 和在內含子中內找到。 ~
[0062]通常，含CpG的核酸是DNA。然而，本發明的方法可適用，例如，包含DNA、或者DNA 和含有mRNA的RNA的樣品，其中DNA或者RNA可以是單鏈的或者雙鏈的，或者0嫩-_雜 交鏈也可能包括在樣品中。 。
[0063] 還可以使用核酸的混合物。待測的特異性核酸序列可以是更大分子的片段，或者 初始就以離散的分子存在，從而特異序列構成整個核酸。待研究的序列不必初始就以純化 的形式存在；核酸可以是複合混合物的較小的一部分，例如含在整個人類DNA的核酸中。包 含在樣品中用於甲基化CpG島的檢測的核酸可以通過多種技術，如Sambrook等人描述的技 術（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Ν·Υ·，1989)提取。
[0064] 核酸可包含調控區域，其是編碼核酸的信息或者控制核酸的轉錄的DNA區域。調 控區域包括至少一個啟動子。"啟動子"是足以指引轉錄的最小序列，且調控啟動子-依賴 型基因表達中的細胞型特異性、組織特異性，或者經外部信號或者試劑誘導。啟動子可定位 於基因5'或3'區域。啟動子的全部或部分內的核酸的數量可以是用於測量 CG島的甲基 化作用。而且，通常認為靶標基因啟動子的甲基化天然地從外邊界向內發展。因此,細胞轉 化的早期階段可通過分析啟動子區域的這些外部區域的甲基化來檢測。
[0065] 從實驗對象中分離的核酸是從實驗對象中取得的生物樣品中獲取的。如果想要檢 測肺癌或肺癌發展的階段，核酸可以通過刮取或活組織檢查從肺部組織中分離出來。這樣 的樣品可以通過本領域技術人員己知的各種醫學程序獲取。
[0066]如這裡所用的，術語"高度甲基化"指的是在腫瘤細胞的特異性CpG位點或在由 CpG島組成的特異性鹼基序列區域的甲基化是高於在正常細胞中的。
[0067] 樣品
[0068] 本發明描述肺癌的早期診斷和採用肺癌特異性基因甲基化。本發明的發明人已 經發現肺癌特異性基因甲基化還發生在鄰近腫瘤區域的組織中。因此，在肺癌的早期診斷 方法中，任何樣品，包括液體或固體組織，可以被用於檢查肺癌特異性基因的甲基化的存在 性。這樣的樣品包括，但不限於，痰、血清或者血漿。
[0069] 甲基化檢測的方法
[0070] 差異性甲基化-甲基化-特異性PCR的檢測
[0071] 當基因組DNA經重亞硫酸鹽處理時，如果被甲基化，在5'-CpG_3'區域內的胞嘧啶 保持完整，但是，如果沒有被甲基化，胞嘧啶變成尿嘧啶。因此，基於經重亞硫酸鹽處理之後 轉變的鹼基序列，對應於具有5'-CpG-3'鹼基序列的區域的PCR引物組被構建。這裡，構建 的引物組是兩種引物組：對應於甲基化鹼基序列的引物組，和對應於非甲基化鹼基序列的 引物組。當基因組DNA經重亞硫酸鹽轉化，然後使用上述兩種引物組通過PCR擴增時，若基 因組DNA被甲基化，PCR產物是採用對應於甲基化鹼基序列的引物在PCR混合物中檢測，但 若基因組DNA未甲基化，基因組DNA在採用對應於非甲基化的鹼基序列的引物在PCR混合 物中檢測。這種甲基化可以通過瓊脂糖凝膠電泳定量分析。
[0072] 差異性甲基化-實時甲基化特異性PCR的檢測
[0073] 實時甲基化特異性PCR是從甲基化特異性PCR方法改良的實時測量方法，包括用 重亞硫酸鹽處理基因組DNA，設計對應於甲基化鹼基序列的PCR引物，和利用引物進行實時 PCR。檢測基因組DNA的甲基化的方法包括以下兩種方法：一種使用與擴增的鹼基序列互補 的TanMan探針的檢測方法；和使用Sybergreen的檢測方法。這樣，實時甲基化特異性PCR 允許甲基化的DNA的選擇性的定量分析。這裡，標準曲線是使用體外甲基化DNA樣品繪製， 在鹼基序列中未包含5' -CpG-3'序列的基因還擴增為用於標準化的陰性對照組，以定量分 析甲基化的程度。
[0074] 差異性甲基化-焦磷酸測序法的檢測
[0075] 焦磷酸測序法是從重亞硫酸鹽測序法改良而來的定量的實時測序法。類似於 重亞硫酸測序法，基因組DNA是經重亞硫酸鹽測序法轉化的，然後，構建對應於未包含 5' -CpG-3'鹼基序列的區域的PCR引物。特定地，基因組DNA是經重亞硫酸鹽處理，使用 PCR引物擴增，然後使用測序引物作用於實時鹼基序列分析。甲基化的程度是通過分析 5' -CpG-3'區域內的胞嘧啶和胸腺嘧啶的數量來作為甲基化指標來表達。
[0076] 差異性甲基化-PCR的檢測-使用甲基化DNA特異性結合蛋白的PCR、定量PCR、和 DNA晶片陣列
[0077] 當僅僅特異性地結合到甲基化的DNA的蛋白與DNA混合時，蛋白僅特異性地結合 甲基化DNA。這樣，不管是使用甲基化特異性結合蛋白的PCR還是DNA晶片陣列都允許選擇 性地僅分離甲基化的DNA。基因組DNA與甲基化特異性結合蛋白混合，然後僅選擇性地分離 甲基化DNA。分離的DNA是使用對應於啟動子區域的PCR引物擴增的，然後DNA的甲基化是 通過瓊脂糖凝膠電泳測量。
[0078] 另外，DNA的甲基化還可以通過定量PCR法進行測量，用甲基化DNA特異性結合蛋 白分離的甲基化DNA可通過螢光探針標記，雜交到含互補探針的DNA晶片上，從而測量DNA 甲基化。這裡，甲基化DNA特異性結合蛋白可以是，但不限於，McrBt。
[0079] 差異性甲基化檢測-甲基化敏感性限制酶
[0080] 差異性甲基化的檢測可通過將核酸樣品與僅剪切非甲基化CpG位點的甲基化敏 感性限制內切酶接觸來完成。
[0081] 在單獨的反應中，樣品進一步接觸甲基化敏感性限制酶的同裂酶，其均剪切甲基 化的和非甲基化CpG位點，從而剪切甲基化核酸。
[0082] 特異性引物加入到核酸樣品中，核酸是經通過任何傳統方法擴增。在經甲基化敏 感性限制酶處理的樣品中擴增的產物是存在的，但經與甲基化敏感性限制酶的同裂酶處理 的樣品中擴增的產物是不存在的，說明甲基化已發生在被經分析的核酸區域。然而，在經甲 基化敏感性限制酶處理的樣品中擴增的產物的不存在，與同經甲基化敏感性限制酶的同裂 酶處理的樣品中的擴增的產物的不存在一起表明在被分析的核酸區域沒有發生甲基化。 [00 83] 如用於此處的，術語"甲基化敏感性限制酶"是指限制酶（例如，SamI)，其包括CG 作為它的識別位點的部分，當C被甲基化時與當C未被甲基化時相比，具有活性。甲基化敏 感性限制酶的非限制性例子包括MspI、Hpall、BssHII、BstUI和Notl。這樣的酶可以單獨 或者聯合使用。其它甲基化敏感性限制酶的例子包括，但不限於SacII和EagI。
[0084]甲基化敏感性限制酶的同裂酶是限制酶，其與甲基化敏感性限制酶識別相同的識 別位點，但均剪切甲基化的和非甲基化的CGs。其例子包括MspI。
[0085] 本發明的引物設計成"充分地"互補於將擴增的位點的每個鏈，包括如上所述的適 當的G或者C核苷酸。這意味著引物在聚合反應條件下必須充分互補地與它們各自的鏈雜 交。本發明的引物可用於擴增反應中，其是酶鏈反應（例如，PCR)在其中靶位點經過許多 反應步驟呈現指數級增長。典型地，一個引物與位點的陰性（-）鏈（反義引物）具有同源 性，另一個引物與陽性（+)鏈（有義引物）具有同源性。在引物退火到變性的核酸之後，核 酸鏈通過例如DNA聚合酶I (Klenow)的酶和如核苷酸的反應物延伸，結果，合成了新的包括 靶位點序列的+和-鏈。當新合成靶位點用作模版並進行變性、引物退火和延伸的重複循 環時，發生靶位點序列的指數級合成。結果反應產物是離散的核酸二聚體，具有對應於採用 的特異性引物的末端的終端（termini)。
[0086] 擴增反應是本領域中常用的PCR。然而，還可以使用可選的方法比如實時PCR或者 使用等溫酶的線性擴增。另外，還可以使用多重擴增反應。
[0087] 差異性甲基化檢測-重亞硫酸鹽測序法
[0088] 檢測甲基化的含CpG的核酸的另一個方法包括以下步驟：將含有核酸的樣品與修 飾未甲基化的胞嘧啶的試劑接觸；使用CpG特異性寡核苷酸引物擴增在樣品中的含CpG的 核酸，其中寡核苷酸引物區分經修飾的甲基化核苷酸和非甲基化核苷酸，檢測甲基化核苷 酸。擴增步驟是可選的和理想的，但不是必要的。該方法依賴於區分經修飾的（例如，化學 修飾的）甲基化DNA和未甲基化的DNA的PCR反應。這樣的方法在美國專利號為5, 786, 14 用於甲基化核酸的檢測的重亞硫酸鹽測序法中有描述。
[0089] 基底
[0090] 在靶核酸區域擴增之後，核酸擴增產物可與粘附於固相支持物（基底）上的已知 的基因探針雜交，來檢測核酸序列的存在。
[0091] 如用於此的，術語"基底"，當用於關於物質、結構、表面或者材料時，表示包含非 生物學的、合成的、無生命的、平坦的或圓的表面的組合物，不是迄今為止已知的包括特異 性結合、雜交或催化識別位點或大量的不同的識別位點或者超過包括表面、結構或者材料 的不同分子種類的數量的大量不同識別位點。基底的例子包括，但不限於，半導體、合成的 (有機的）金屬、合成半導體、絕緣體和摻雜物；金屬、合金、元素、化合物和礦物質；合成的、 分裂的、侵蝕的、平版印刷的、印刷的、機械製造的和微製作的片、設備、結構和表面；工業聚 合物、塑料、膜矽、矽酸鹽、玻璃、金屬和陶瓷；和木材、紙張、紙板、棉花、羊毛、布、機織織物 和非織物纖維、材料和織品；和具有雙重性的表面。
[0092] 本領域已知的多種類型的膜對核酸序列具有粘附力。這些膜的特異性非限制性例 子包括硝化纖維或者其它用於檢測基因表達的膜，比如聚氯乙烯、重氮化紙和其它市面上 可購買到的膜，比如GENESCREEN?、ZETAPROBE TM(Biorad)、和NYTRAN?。還可以包括珠、玻璃、 膠片和金屬基底。將核酸粘附到這些物體上的方法是本領域已知的。可選地，篩選可在液 相中實施。
[0093] 雜交條件
[0094] 在核酸雜交反應中，用於達到嚴格的特殊水平的條件將根據所要雜交的核酸的特 性而變化。例如，核酸的雜交區域的互補的長度、程度、核苷酸序列組成（例如，GC/AT含量） 和核酸類型（例如，RNA/DNA)可被認為在所選的雜交條件下。另外的考慮是核酸中的一個 是固定的，例如，在濾器上。
[0095] 發展的更高的嚴格條件的例子如下：室溫下的2X SSC/0. 1% SDS (雜交條件）；室 溫下的〇· 2x SSC/O. 1% SDS (低嚴格條件）；在42°C的0· 2X SSC/O. 1% SDS(中等嚴格條 件）；和在大約68°C的0. IX SSC (高嚴格條件）。
[0096] 洗脫可以僅使用這些條件中的一個條件進行實施，例如，高嚴格條件，或者可用的 條件中的每一個，例如，如上所列的順序每個10-15分鐘，重複任何或全部的所列步驟。然 而，如上所述，優化的條件將根據涉及的特殊的雜交反應而變化,可以經驗為主地決定。通 常，高嚴格條件是用於目的探針的雜交。
[0097] 標記
[0098] 目的探針可被可檢測地標記，例如，放射性同位素、螢光化合物、生物發光的化合 物、化學發光化合物、金屬螯合劑或者酶。這樣的探針的適當的標記是本領域眾所周知的， 可通過任何傳統方法實施。
[0099] 試劑盒
[0100] 本發明涉及用於在實驗對象中檢測異常細胞生長的試劑盒。本發明的試劑盒包 括：劃分成其內接收樣品的載體工具，一個或多個容器，包括第一容器，其包含敏感地割裂 未甲基化的胞嘧啶的試劑；第二容器，其包含擴增含有CpG的核酸的引物；第三容器，其 包含用於檢測斷裂的或非斷裂的核酸的存在的工具。預期用於本發明的引物包括SEQ ID NO: 5至21的表示的序列，和它們的任何功能性組合和片段。功能性組合或片段用作引物檢 測是否在基因組的區域發生甲基化。
[0101] 載體工具是適於包括一個或多個容器工具，比如小瓶、管和類似物，每個容器包含 一個用於該方法的分離要素。根據本發明的的說明書，本領域技術人員可容易確定在容器 中必要試劑的分配。例如，容器工具中的一個可包括含有甲基化敏感性限制酶的容器。一 個或多個容器工具可包括互補於目的核酸位點的引物。另外，一個或多個容器工具可包含 甲基化敏感性限制酶的同裂酶。
[0102] 實施例
[0103] 在下文中，本發明將通過參考實施例將進一步詳細描述。然而，可理解這些實施例 僅用於解釋目的，而不是構建於限制本發明的範圍。
[0104] 實施例1 :在肺癌細胞株中高度甲基化的基因的篩選
[0105] 在肺癌中高度甲基化的基因通過使用肺癌細胞株A549(Korean Cell Line Bank(KCLB) 10185)和正常肺細胞株NHBE(Cambrex cc-2541)通過以下方式選擇。
[0106] 首先，每個細胞株中的500ug的gDNA在超聲波下降解為300-400bp(Vibra Cell, S0NICS)大小，根據製造商提供的說明書使用MethylcaptureTM(Genomictree，Kore a)從每個細胞株中選擇性地富集甲基化的dna。該富集的甲基化dna使用GeiiomePlex? 全基因組擴增試劑盒（Complete Whole Genome Amplification Kit) (Sigma)經擴增，然後 每個擴增的從細胞株Αδ49和NHBE中衍生而來的甲基化的DNA分別經Cy5-dUTP和Cy3-dUTP 標記，而後混合。然後，根據Agilent的說明書將DNA雜交到含有CpG探針的CpG微陣列 (Agilent)，該探針由表示存在於人類基因組中的大約27, 800CpG島表示，隨後進行掃描。 接下來，在A549中高度甲基化的候選基因通過統計技術選擇（圖1和表1)。
[0107] 表1 :在Αδ49肺癌細胞株中高度甲基化的基因的列表
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【權利要求】
1. 一種檢測肺癌的試劑盒，包括用於檢測在從生物樣品中分離的基因組中，原粘鈣蛋 白Y亞族A，12,也就是TCDHGA12基因的5' UTR(非翻譯區域）和外顯子1區域中一個或 多個區域的CpG甲基化的工具，其中CpG甲基化的存在表示肺癌的存在。
2. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述CpG甲基化位於選自由SEQ ID NO: 2-4所示序 列組成組中的一個或多個區域。
3. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述試劑盒還包括重亞硫酸鹽試劑。
4. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述用於檢測PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具選 自下述中的一種或多種：（i)能夠擴增包括甲基化CpG區域的片段的引物組，（ii)能夠與甲 基化CpG區域雜交的探針，（iii)能夠結合甲基化CpG區域的甲基化特異性結合蛋白，（iv) 甲基化敏感性限制酶和（v)測序引物。
5. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述用於檢測PCDHGA12基因的CpG甲基化的工 具是引物組，該引物組能夠擴增包括甲基化CpG區域的片段；並且該引物組選自SEQ ID N0s:5-6、SEQ ID N0s:7-8 和 SEQ ID N0s:9-10。
6. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述用於檢測PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具 是能夠擴增包括甲基化CpG區域的片段的引物組和測序引物的組合；並且所述引物組選自 SEQ ID N0s:ll-12,而所述測序引物是 SEQ ID N0:13。
7. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述用於檢測PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具 是能夠擴增包括甲基化CpG區域的片段的引物組和測序引物的組合；並且所述引物組選自 SEQ ID N0s:14-15,而所述測序引物是 SEQ ID N0:16。
8. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述用於檢測PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具 是能夠擴增包括甲基化CpG區域的片段的引物組和測序引物的組合；並且所述引物組選自 SEQ ID N0s:17-18,而所述測序引物是 SEQ ID N0:19。
9. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述用於檢測PCDHGA12基因的CpG甲基化的工具是 能夠擴增包括甲基化CpG區域的片段以及能夠結合甲基化CpG區域的甲基化特異性結合蛋 白的引物組的組合；並且所述引物組是SEQ ID N0s:20-21。
10. 根據權利要求1的試劑盒，其中所述生物樣品選自組織、痰液、細胞、血清、血漿、尿 液及其組合。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232763SQ201410441729
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2009年2月18日 優先權日:2008年3月14日
【發明者】安成晥, 文永鎬, 吳泰禎 申請人:基因特力株式會社