一種夏天無提取物及其製備方法和用途的製作方法
2023-07-15 23:41:01
專利名稱：一種夏天無提取物及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及夏天無提取物及其製備方法和用途，更具體是涉及夏天無生物鹼及其製備方法和它作為N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑和乙醯膽鹼酯酶抑制劑在製備防治由血管性痴呆或老年性痴呆症引起的記憶不良藥物中應用。
背景技術：
血管性痴呆是由於腦血管病變導致腦神經病變而至記憶能力障礙的病症。腦卒中、腦外傷、腦佔位性病變等均可導致腦血管性痴呆。阿爾滋海默症(AD)，也稱早老性痴呆，是腦神經退行性病變導致影響多種高級皮層功能如記憶、思維、行為和情感的退行性腦病，病因未明。
目前治療阿爾滋海默症和腦器質性病變引起記憶障礙的藥物治療手段主要包括通過使用石杉鹼甲、多奈哌齊等膽鹼酯酶抑制劑抑制腦組織中乙醯膽鹼酯酶活性，提高腦內乙醯膽鹼的水平；通過使用尼莫地平、氟桂利嗪等鈣離子拮抗劑擴張腦血管增加腦血流量；通過使用美金剛(memantine)等N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑選擇性地作用於腦內NMDA受體，阻斷病理狀態下過高的穀氨酸誘導的效應；通過使用吡拉西坦等促進代謝藥物改善各種類型腦缺氧及物理化學因素造成的腦損傷以達到輔助藥物治療。
其中NMDA受體拮抗劑是最有效的一種藥物，尤其可用於治療中到重度的痴呆症，而現有的膽鹼酯酶抑制劑只對輕到中度的痴呆症有效。過量的穀氨酸釋放與缺氧、局部缺血、中風和可能的阿爾茨海默病等一些急性和慢性疾病引起的神經退化有關，非競爭性NMDA受體拮抗劑通過阻斷病理狀態下過高的穀氨酸誘導的效應，起到治療作用(S.K.Sonkusare，C.L.Kaul and P.Ramarao，Pharmacological Research，2005，51(1)1-17)。
夏天無是罌粟科植物伏生紫堇(Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.)的乾燥塊莖。夏天無的傳統功能主治為祛風除溼，舒筋活血，通絡止痛，降血壓；主治風溼性關節炎，中風偏癱，坐骨神經痛，小兒麻痺後遺症，腰肌勞損，跌扑損傷，高血壓。
已有報導從中藥夏天無中提取的總鹼具有抗膽鹼酯酶活性(徐麗華、顧振綸、蔣小崗等，藥學學報2002，37(11)902-903)、可抑制血小板聚集(高健、王天佑、何相好等，蘇州大學學報(醫學版)2004，24(2)137-140)、增加痴呆大鼠腦內5-羥色胺和多巴胺含量(張熠、顧振綸、蔣小崗，蘇州大學學報(醫學版)2004，24(2)134-146，143)、對東莨菪鹼及D-半乳糖造成的兩種學習記憶獲得障礙大鼠的學習記憶能力均有明顯的改善作用(鄧湘平、顧振綸、謝梅林，中草藥2003，34(4)350-352)。未見有關夏天無提取物具有N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑的活性的報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種夏天無提取物，該提取物具有NMDA受體拮抗劑和乙醯膽鹼酯酶抑制劑的雙重活性，可用於製備防治由血管性痴呆或老年性痴呆症引起的記憶不良的藥物。
本發明的另一目的是提供該夏天無提取物的製備方法。
夏天無藥材符合《中華人民共和國藥典》2000年版一部231頁「夏天無」項下的各項規定。
一般方法提取的夏天物總鹼含有多量的季銨鹼型生物鹼，主要含小檗鹼(berberine)、巴馬汀(palmatine)、藥根鹼(jatrorrhizine)、小檗紅鹼(berberubine)，這一類化合物在生理pH條件下是離子型的，難以從胃腸道吸收，難以通過血腦屏障，與本發明揭示的提取物主要作用於中樞神經的用途無關；該類化合物，以小檗鹼為例，通常具有胃腸道副反應。故本發明揭示的夏天無活性提取物系從夏天無藥材中提取的主要含有生物鹼的有效部位，該有效部位不含季胺鹼成分(以小檗鹼和巴馬汀為代表)。夏天無總鹼中以右旋比扣扣靈鹼和右旋紫堇米定鹼為代表的內酯環生物鹼具有GABAA受體激動劑的活性，對部分總者具有導致癲癇發作的可能，該些成分也不具有與最終提取物的用途相關的作用，故本發明的提取物中除去了該些組分。
總的工藝路線是這樣的先將藥材按常規方法提取總生物鹼，總生物鹼中經矽膠柱層析，分離得到有效部位為幾乎不含季胺鹼的部位，該部位用熱鹼液處理，除去具有內酯環結構的生物鹼，最後得到有效部位一提取物A。
更具體的提取物A的製備方法採用一般植物化學教科書中收載的總生物鹼提取工藝及可提取夏天無藥材中的總生物鹼，總的來說是利用生物鹼的弱鹼性和易溶解於極性有機溶劑的性質加以提取的。比如以不同濃度的乙醇溶液，浸泡藥材後製得浸出液，回收溶劑後加以萃取或沉澱等操作的初步純化。還可以用離子交換樹脂進行總生物鹼的提取。
典型的工藝的包含這樣一些步驟1.總鹼的製備。一種方法是將藥材以濃度低於95％的乙醇加熱回流或室溫下滲漉製備浸出液，浸出液回收溶劑後殘渣為粗浸膏，粗浸膏溶解在稀礦酸中，用與水不互溶的弱極性有機溶劑，比如乙酸乙酯，進行萃取，以除去脂溶性的非生物鹼成分；萃取後分離的水層再用鹼調pH值至7.5～8.0，然後用與水不互溶極性或弱極性有機溶劑，比如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚等，萃取游離型的生物鹼，分離有機相，棄去水相，回收有機相的溶劑後即得總生物鹼。另一種方法是用稀酸溶液，比如稀硫酸、稀鹽酸、稀醋酸等為溶解，對藥材進行滲漉，滲漉液通過強酸型陽離子交換樹脂吸附生物鹼，再以鹼化乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，殘渣為總生物鹼。
2.總生物鹼再繼續以下分離純化步驟以100-200目的層析用矽膠(青島海洋化工廠出品)裝柱，總生物鹼用等量氯仿溶解後上樣，總生物鹼上樣量與矽膠用量之比為1∶20，以丙酮為洗脫劑，收集矽膠用量的5至10倍體積的洗脫液，回收溶劑，收集殘渣。
3.殘渣再以熱鹼液處理，使具有內酯環結構的生物鹼開環，形成水溶性的鹽，從提取物中除去。這裡熱的鹼液處理可以是將上一步得到殘渣加入到10～20％(w/v)的氫氧化鈉溶液中，在70～90℃，最佳為80C水浴上反應0.5～小時。反應液用氯仿或二氯甲烷萃取其他非內酯壞結構的生物鹼，回收溶劑後的殘渣即為提取物A。
對提取物A的化學成分進行分離和結構鑑定的研究。結果表明提取物A中主要成分有原阿片鹼、右旋四氫掌葉防己鹼。
用於成分研究的分離純化過程提取物A約100g，用500mL無水酒精熱溶，置冰箱過夜，析出沉澱，濾出，不溶物用100mL氯仿熱溶，再加入50mL無水酒精，先後析出CD-1和CD-4；取酒精溶解溶液1/2體積，濃縮，矽膠(100～200目)柱層析，石油醚，氯仿，氯仿-甲醇梯度衝洗，共收得16個流份石油醚部位1為空白，氯仿洗脫流份經再次矽膠(矽膠H，400目)柱層析(加0.5個大氣壓)，氯仿-甲醇梯度衝洗，收得6個流份，2-4流份析出CD-10；洗脫流份5-6析出CD-1。
化合物CD-1，無色稜晶(氯仿-甲醇)，熔點209～210℃。EI-MS顯示分子離子峰為353，基峰148；1H-NMR(400MHz，CDCl3，δ，ppm)顯示與原阿片鹼的結構相吻合。與文獻[Planta Med.65(1999)218-21.Protopine from Corydalis ternate has anticholinesterase andantiamnesic activities.]光譜數據和原阿片鹼對照品TLC對照，證實CD-1為原阿片鹼(Protopine)。
化合物CD-10，黃色針狀結晶。[α]D25+277.0°(c 1.0，CHCl3)，1H NMR(400MHz，CDCl3)與文獻氫譜數據[J.O.C.，1990，551932]相吻合。CD-10被鑑定為右旋四氫掌葉防己鹼(d-四氫掌葉防己鹼)。
採用高效液相色譜法測定提取物A中主要組分的含量(％w/w)。含量測定用的對照品均由中國科學院上海藥物研究所提供。對於提取物A，作為指標性組分，原阿片鹼和右旋四氫掌葉防己鹼的總和在提取物中的比例應不低於50％(w/w)。其中，原阿片鹼在提取物中含量可以從24％-50％(w/w)；右旋四氫掌葉防己鹼在提取物中含量可以從26％-50％(w/w)。
用於含量測定方法是反相高效液相色譜法。一個優選的方法是以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填料，甲醇-乙腈-0.2％H3PO4(10∶15∶75)為流動相，等度洗脫，檢測波長254nm。當選用色譜柱C18(Diamonsil C18，250×4.5mm，5μm)，室溫條件(17～22℃)，流動相流速1ml/min時，最先洗脫的成分是原阿片鹼，其後是右旋四氫掌葉防己鹼，保留時間分別約為17～19分鐘和20～22分鐘。採用外標法進行定量測定。
夏天無提取物A的生物活性提取物A委託國家新藥篩選中心進行NMDA受體拮抗劑和乙醯膽鹼酯酶抑制劑的兩項生物測試，測試模型分別是1.NMDA受體[3H]MK-801結合試驗；2.大鼠皮層乙醯膽鹼酯酶體外抑制。
NMDA受體[3H]MK-801結合試驗。測試方法在[3H]MK-801(Dupont，24Ci/mmol)結合於大鼠大腦皮層NMDA受體，觀察受試品對[3H]MK-801結合的影響。結果評定抑制率大於30％為有效，小於30％為無效。試驗結果，提取物A在濃度為0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml分別對NMDA受體與[3H]MK-801的特異性結合的抑制率為35％、82.5％和91.5％。表明提取物A在0.01mg/ml濃度上可以有效抑制NMDA受體。
膽鹼酯酶抑制作用的粗篩。採用大鼠大腦皮層乙醯膽鹼酯酶試驗方法。抑制率大於50％為有效，小於50％無效。結果顯示提取物A在濃度0.026mg/ml時，對乙醯膽鹼酯酶抑制率為52.7％，有效。
動物試驗。大鼠雙側頸總動脈結紮60分鐘，手術後第9天大鼠在Morris水迷津中的學習能力降低，到達終點的時間顯著增加，進入盲端的錯誤次數明顯增多。手術前10分鐘腹腔注射(ip)給予提取物A 300mg/kg，可顯著改善這一功能的降低，到達終點的時間(19.6±2.4秒vs 53.6±9.7秒)和進入盲端的錯誤次數(2.4±0.7vs 11.3±2.7)都明顯改善。提取物A 200mg/kg(ip)預處理，對小鼠icv輸注NMDA受體激動劑-喹啉酸引發的驚厥發作產生一定保護作用，動物驚厥發生率較對照組降低41±9.2％，對喹林酸誘發的海馬神經細胞損害也顯示明顯保護作用。
所以，提取物A具有用於與人中樞神經NMDA受體結合相關的，以及和膽鹼酯酶活性相關的，表現為記憶缺失以及衰退疾病的治療的用途。特別是腦血管病變導致腦缺血，進而導致神經受損的記憶不良如中風後遺症中記憶衰退的症狀，以及與NMDA受體相關的神經退化導致的老年性記憶不良的治療，比如老年性痴呆症的治療用途。
提取物A在臨床使用時可以製成片劑、膠囊、顆粒劑、口服溶液等口服製劑，也適合製成注射液和注射用粉針劑用於肌肉注射或靜脈注射。
圖1是提取物A的高效液相色譜圖(CD1＝原阿片鹼，CD10＝右旋四氫掌葉防己鹼)。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的描述，但不限制本發明。
實施例1提取物A製備10千克夏天無粗粉用8升95％工業酒精滲漉，滲漉液減壓濃縮得粗浸膏。將粗浸膏加熱下溶於1.5升pH 2的稀鹽酸中，用等體積乙酸乙酯萃取三次除去酯溶性非生物鹼部分，水層用濃氨水調pH至8，用等體積的氯仿萃取三次，氯仿萃取液減壓濃縮至幹，得120克總鹼。總鹼上減壓液相色譜柱純化。2千克矽膠(100-200目)，將100克總鹼用氯仿溶解上樣，15升丙酮洗脫，洗脫液蒸乾，得殘渣82.1克。取20克殘渣，攪拌下加入10％NaOH水溶液100ml於80℃水浴反應0.5小時。放冷至室溫，加水至總體積為500ml，用氯仿萃取三次(400ml，300ml，300ml)，合併氯仿液，用400ml水洗一次，氯仿液減壓濃縮至幹，60℃真空乾燥，得提取物A 15.7克。
實施例2提取物A製備10千克夏天無粗粉以10倍量1％硫酸滲漉提取，滲漉液通過731型陽離子交換樹脂(樹脂用量與生藥量相等)，水洗至流出液呈中性，再以1％氫氧化銨的乙醇溶液洗脫，收集5倍生藥量的洗脫液，回收乙醇至幹，得總鹼122克。稱取2千克矽膠(100-200目)裝柱，將100克總鹼用二氯甲烷溶解上樣，15升丙酮洗脫，洗脫液蒸乾，得殘渣80.4克。取20克殘渣，攪拌下加入10％NaOH水溶液100ml於80℃水浴反應0.5小時。放冷至室溫，加水至總體積為500ml，用二氯甲烷萃取三次(400ml，300ml，300ml)，合併有機相，用400ml水洗一次，減壓濃縮至幹，60℃真空乾燥，得提取物A 15.2克。
實施例3對實施例1和2獲得提取物A進行含量檢測。色譜條件以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填料(Diamonsil C18，250×4.5mm，5μm)，甲醇-乙腈-0.2％H3PO4(10∶15∶75)為流動相，流動相流速1ml/min，等度洗脫，檢測波長254nm，室溫條件。對照品溶液配製，取原阿片鹼和右旋四氫掌葉防己鹼對照品，用流動相分別配製成濃度為10μg/ml的溶液，即得。供試品溶液配製，取提取物A，用流動相配製成濃度為20μg/ml的溶液，即得。取上述兩種溶液注入色譜儀，測定峰面積，以外標法計算含量。結果如下
權利要求
1.一種夏天無提取物由原阿片鹼、右旋四氫掌葉防己鹼的總和不低於50％(w/w)，其中原阿片鹼在提取物中含量為24％-50％w/w；右旋四氫掌葉防己鹼在提取物中含量為26％-50％w/w。
2.如權利要求1所述的夏天無提取物的製備方法，包括如下步驟(1)總生物鹼的製備a.方法1.將藥材以濃度低於95％的乙醇加熱回流或室溫下滲漉製備浸出液，浸出液回收溶劑後殘渣為粗浸膏，粗浸膏溶解在稀礦酸中，用與水不互溶的弱極性有機溶劑，比如乙酸乙酯，進行萃取，以除去脂溶性的非生物鹼成分；萃取後分離的水層再用鹼調pH值至7.5～8.0，然後用與水不互溶極性或弱極性有機溶劑，比如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚，萃取游離型的生物鹼，分離有機相，棄去水相，回收有機相的溶劑後即得總生物鹼；b.方法2.用稀酸溶液，比如稀硫酸、稀鹽酸、稀醋酸為溶解，對藥材進行滲漉，滲漉液通過強酸型陽離子交換樹脂吸附生物鹼，再以鹼化乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，殘渣為總生物鹼；(2)總生物鹼分離純化總生物鹼等量氯仿溶解後上100-200目矽膠栓層析，樣品量與矽膠用量為1∶20，丙酮為冼脫劑，收集冼脫液，減壓濃縮得殘渣；(3)上述殘渣用熱鹼液處理殘渣用10％-20％w/v NaOH溶液反應0.5-1小時，除去具有內酯環結構的生物鹼，再用氯仿或二氯甲烷萃取其他非內酯環結構的生物鹼，減壓濃縮得提取物A。
3.根據權利要求2所述的夏天無提取物的製備方法，其特徵在於總生物鹼製備用矽膠柱層析時，用丙酮為溶劑洗脫。
4.根據權利要求2所述的夏天無提取物的製備方法，其特徵在於用熱鹼液處理，溫度為70～90℃。
5.如權利要求1所述夏天無提取物的用途，提取物A具有N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑及乙醯膽鹼酯酶抑制劑二重作用，對製備預防、治療因乙醯膽鹼酯酶和NMDA受體有關的記憶缺失及衰退疾病的藥物中應用。
全文摘要
本發明公開了一種夏天無提取物及製備方法和用途。該提取物含有原阿片鹼和左旋四氫掌葉防己鹼的總和不低於50％(w/w)，其中原阿片鹼在提取物中含量為24％－50％w/w；右旋四氫掌葉防己鹼在提取物中含量為26％－50％w/w。經藥理試驗證明它可以作為N－甲基－D天冬氨酸受體拮抗劑和乙醯膽鹼酯酶抑制劑在製備防治由血管性痴呆或老年性痴呆引起的記憶不良的藥物中應用。
文檔編號C07G5/00GK1891260SQ20051002763
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月8日 優先權日2005年7月8日
發明者潘俊芳, 曾佳烽, 朱大元, 李萬亥, 陳華莉 申請人:上海華拓醫藥科技發展有限公司