治療糖尿病的楤木提取物及楤木皂苷在治療糖尿病中的應用的製作方法

2023-07-27 02:34:06

專利名稱：治療糖尿病的楤木提取物及楤木皂苷在治療糖尿病中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的治療糖尿病的藥物。具體的說，本發明涉及治療糖尿病的含有楤木皂苷A和C等的植物提取物在，以及楤木皂苷A和C在治療糖尿病中的應用。
背景技術：
消渴病(糖尿病)在世界範圍內仍是一種未被徵服的頑症，據不完全統計，在全世界發病率佔3-5％，50歲以上的中老年人發病率佔5-7％，我國就有2700多萬患者。目前由糖尿病及其併發症導致傷殘和死亡的人數僅決於心血管病和腫瘤病，佔第三位。糖尿病病因的中心環節是由於胰島素分泌相對不足，引起糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂，並繼發維生素、水、電解質代謝障礙。主要臨床表現為「三多一少」(即多飲、多食、多尿、體重減少)，體力減退，並有頭暈、失眼多夢、周身不適等症狀，並易引發嚴重的併發症，如心腦血管病、高血壓、腎病、糖尿病眼病、肢體壞疽、神經病變等，嚴重者可導致死亡。
1995年，原國家醫藥局醫藥經濟信息中心站對全國28個主要城市共28家中西醫醫院、醫藥批發公司(站)進行了口服糖尿病用藥的市場調查目前市場佔有率較高的西藥品種為優降糖(格列本脲，glybenclamide)、降糖靈(苯乙雙胍，phenformine)、格列齊特等。中藥品種主要有消渴丸(中西結合方)、降糖丹、天安糖泰、玉泉丸、金芪降糖片和新產品糖脈康等。
上述這些中西藥為防治糖尿病起到了重大作用，但這份調查報告中也指出，長期口服西藥僅是對症的治療，且易引起高胰島素血糖、低血糖、肥胖症、噁心、頭痛等毒副作用。中藥品種絕大多數為大的複方製劑，質量難以控制，並且具有直接降糖作用的極少。從中藥或天然產物中提取有效部位，研製開發符合國內外市場需要的現代的中藥，既能達到「安全、有效」，質量上又可「穩定、可控」，是目前急需解決的課題之一。
遼東楤木(龍牙楤木)(Aralia elata(Miq.)Seem)，又名刺老牙、刺老鴉、虎牙刺等，是五加科楤木屬植物，為黑龍江、吉林、遼寧等省民間所食用之野菜。《中藥大辭典》第1268頁載本品功用「補氣安神，強精滋腎，祛風活血。治神經衰弱、風溼性關節炎、糖尿病以及陽虛氣弱、腎陽不足等證。」但是並沒有對此作出詳細說明。
五十年代初，自楤木中分得皂苷類成分。蘇聯、波蘭、日本及我國等通過藥理實驗證明皂苷類化合物是其主要有效成分。前蘇聯以楤木根生產出了楤木浸劑、膠囊劑，後來又生產出楤木皂苷A、B和C的總銨鹽製劑，用作中樞神經系統的興奮劑，治療腦力和體力的疲勞過度等，發現其具有適應原樣作用。
在對皂苷的研究中，各國學者先後研究分得數十種特有皂苷，分別稱為Aralosides、Elatosides、Tarasaponin、Congmunosides等。這些化合物均顯示皂苷反應，其苷元結構主要為齊墩果烷類五環三萜如齊墩果酸等。其中主要成分為楤木皂苷(Araloside)A、B、C等，都是最早從楤木中提取出的。其中楤木皂苷A和C的結構分別如下。但是上述皂苷對於糖尿病的治療活性從未被報導過。
楤木皂苷A 楤木皂苷C1994、1995年，日本人吉川(Yoshikawa)等報導，自日本產的龍牙楤木中分離得到的Elatoside類化合物(Elatoside A、C、E、F、G～K等)，其中Elatoside E、G、H、I、K具有降血糖作用(Chem.Pharm.Bull.1994，42，1354-1356；ibid，1995，43，1878-1882)。但是這些化合物均為自龍牙楤木以甲醇或醇-水提取得到，其含量甚微，其中Elatoside C、E、F略高於萬分之一，其它均不足萬分之一。與龍牙楤木(遼東楤木)中5％乃至20％以上的總皂苷含量相去甚遠(中藥通報，1986，11，428-430)。
對於楤木類的皂苷等的提取方法，以往公開的多是以甲醇、乙醇等醇或者含少量水的醇提取並分離的，如上述吉川等(Chem.Pharm.Bull.43，1878-1882，1995)，瀋陽藥學院學報(1991，8，265-268)，Phytochemistry(2001，56，491-497)等。
方乍浦等(植物學報，1992，34，461-465)雖然採用了水提取黃毛楤木的方法製得了黃毛楤木皂苷，但是並未有收率、含量等的數據。
CN1355171A，雖然給出了用水提取龍牙楤木總皂苷的方法，但是並未有主要成分含量等的數據，也沒有主要成分含量的內容，而且該發明提取的總皂苷是用於治療心、腦血管疾病的，是否可以用於治療糖尿病也屬未知。
另外，以往報導楤木有小毒(《中藥大辭典》，2583，上海人民出版社，1977年)，但是迄今為止並無降低毒性的方法，也不知道毒性的來源。

發明內容
本發明人等在長期從事遼東楤木(龍牙楤木)等的研究中，意外地發現楤木水提皂苷類成分具有很強的降血糖作用，在此基礎上經反覆深入研究，完成了本發明。
本發明具有以下內容本發明第1方面涉及一種治療糖尿病的楤木提取物，其特徵在於該提取物是以水提取而得到的，其中總皂苷含量在50％以上，且楤木皂苷A和C的總含量在10％以上。
本發明的提取物，優選總皂苷含量在60％以上，不多於90％，更優選不超過80％。
本發明的提取物中，楤木皂苷A和C的合計含量優選在15％以上，更優選不少於20％。
本發明的楤木提取物優選不含有無梗五加苷D。
本發明第2方面涉及楤木皂苷A和/或C的製備治療糖尿病藥物的應用。
本發明第3方面涉及採用含有楤木皂苷A和/或C的組合物治療糖尿病的方法。
本發明第4方面涉及一種治療糖尿病的楤木提取物的製備方法，其特徵在於包括用水提取楤木活性成分，之後將所得提取物用醇沉澱，將所得濾液通過大孔吸附樹脂吸附，然後用醇洗脫、並用吸附劑脫色等步驟。
本發明第5方面還涉及降低楤木提取物毒性的方法，其特徵在於在獲得以皂苷為主要成分的楤木提取物後，用吸附劑進行脫色，同時脫去造成毒性的無梗五加苷D。
本發明的其他實施方式和優良效果，從以下的具體敘述中可以了解。
附圖簡要說明

圖1是楤木皂苷A的HPLC色譜圖。
圖2是楤木皂苷C的HPLC色譜圖。
圖3是製備實施例1所得的提取物的薄層色譜圖。
圖4是製備實施例4所得的各提取物的薄層色譜圖。
具體實施例方式
以下敘述中，若非特別註明，百分含量均指重量(質量)百分含量。
一、關於楤木本發明中所述的楤木是指雙子葉植物綱五加科楤木屬的植物，例如遼東楤木Aralia elata(Miq.)Seem或稱龍牙楤木A.mandshuriaRupr.、楤木A.chinensis L.、黃毛楤木A.decaisneana Hance、虎陽刺楤木A.armata(Wall)Seem、長刺楤木A.spinfolia Merr.、遠東楤木A.schmidtii、長白楤木A.continentalis Kitagawa、多刺楤木A.spinosa L.、太白楤木A.taibaiensis Z.Z.Wang et H.C.Zheng等。其中從分布廣泛，活性成分含量高等方面，優選遼東楤木Araliaelata(Miq.)Seem即龍牙楤木A.mandshuria Rupr.，以下內容中，若非特別指出，所說楤木就是指上述楤木屬植物，特別是遼東楤木Aralia elata(Miq.)Seem。本發明的治療糖尿病的楤木提取物就是主要從遼東楤木Aralia elata(Miq.)Seem的根皮或樹皮提取分離得到的，當然只要能獲得本發明所述的治療糖尿病的效果，也可以從楤木的芽、葉或木質部分等部位進行提取，本發明中對此不進行限制。
經本發明人對上述植物的各種提取物的研究，現發現特定的提取物以及單體楤木皂苷A和C具有抗糖尿病的活性。在這些具有抗糖尿病活性的提取物中，總皂苷含量總在50％以上，且其中楤木皂苷A和C的含量在10％以上。通過我們的研究也首次發現，單體楤木皂苷A或C等也具有抗糖尿病活性。
本發明的楤木提取物中，總皂苷量應該在50％以上，優選60％以上，更優選75％以上，最優選85％以上。楤木提取物中總皂苷的含量上限沒有特別限制，在50％～100％的範圍內均具有抗糖尿病活性。從工藝路線的選擇和成本方面考慮，總皂苷的含量在60％以上即可較好的實現本發明的目的，如果把總皂苷的量提高到90％以上，不僅原料的成本要上升，而且還要增加額外的處理工序，因此總皂苷的含量最優選在50％～90％的範圍內。
在本發明的提取物中，楤木皂苷A和C的合計含量應不少於10％，優選不少於15％，更優選不少於20％，由於提取工藝的限制以及出於化合物協同作用的考慮，楤木皂苷A、C的和為以不超過50％為宜。
我們提取了楤木的含楤木皂苷A和C的提取物(如上述所定義的)。通過後文實驗及臨床研究表明，根據本發明方法製備的楤木提取物確有較好的抗糖尿病效果。
對於楤木提取物的毒性成分，通過我們的研究，發現主要源於其中所含的無梗五加苷D。在小鼠灌胃給藥的急性毒性實驗中，無梗五加苷D的半數致死量LD50為11.45mg/kg，而去除該成分的本發明提取物的半數致死量LD50達到1028mg/kg，屬於實際無毒的範圍。雖然無梗五加苷D並不影響楤木皂苷的活性，但是由於抗糖尿病的藥物通常需要長期服用，因此最好從提取物中除去。本發明的楤木提取物優選不含有無梗五加苷D。
在此，所謂「不含有」並不是指絕對的不含有，而是指僅有生理學上無顯著意義量以下的含量。在此基礎上雖然越少越好，但是通常只要低於0.01％就可以基本實現本發明的目的了。
以下討論本發明楤木提取物的製備方法。
本發明楤木提取物的典型製備方法包含如下步驟〔藥材粉碎→〕水煎煮→(醇沉澱/過濾)→樹脂吸附→(水洗→)醇/水洗脫→後處理上述方法中，藥材的粉碎是本領域技術人員所熟知的常規步驟。對於粉碎的方法，本發明不加限制。粉碎後的粉末，如果粒度過粗，則有效成分難以充分提出；如果粉末過細，則會給煎煮後的分離提取液的步驟帶來不利，對此，本領域技術人員可以根據實際經驗加以選擇，對此也不做限制。
在中藥提取中，為了提取出有效成分，可以採用水和/或醇浸潤提取的方式，但是由於有效成分的浸出不容易完全，所以採用加熱抽提的方式。加熱溫度為室溫-抽提溶劑的沸點。本發明中，為了避免不需要的雜質，優選水提取。
加熱提取時，優選在水(或含水溶劑)的沸點進行(回流)。
如單純用水時，優選在常壓或加壓下進行提取，從成本角度看優選常壓提取。加壓提取可以減少提取時間，因此也可以採用。本申請對此不作限制。
常壓提取下，總提取時間為2-24小時，提取次數1-4次，每次提取加入的水量為生藥量的2-20倍。如果用醇或醇水溶液回流提取，則用量為生藥量的5-30倍，上述數據僅作為參考，實際中根據需要，本領域技術人員可以根據經驗進行適當變動，應予理解，這種變化不超過本發明的範圍。
獲得提取液以後，根據需要可以對提取液進行減壓濃縮等以縮小體積，或者再加以過濾(例如用超濾膜等)或者用醇沉澱，以除去不需要的澱粉、粘液、蛋白質等。此種操作屬於本領域技術人員在提取中藥過程中的常規操作，對此不加限制。例如可以加醇到40％～80％(v/v)左右進行沉澱等，也可以根據和沉澱效果溶劑回收情況進行確定。
然後把提取液用樹脂吸附。可以用來吸附的樹脂是弱極性的大孔吸附樹脂，例如D-101、D-201、D-301樹脂等(滄州市寶恩化工有限公司)、AB-8樹脂(天津骨膠廠)、WLD樹脂(四川省中藥研究所)、CAD-40(華北製藥廠)等，但本發明方法並不受上述樹脂柱型號的限制，只要是弱極性的大孔吸附樹脂，即可以完成本發明方法。對於樹脂吸附的方法參見CN1072089A、WO02053164A等，上述文獻中對樹脂吸附方法進行了詳細的描述，本申請引用了文獻中公開的方法，並作為本發明方法的一部分，記載在本申請文件中。
根據本發明人的研究結果，在提取本發明的楤木提取物的時候，這幾種樹脂中以D-101樹脂吸附容量最大，洗脫也更容易。故本提取方法優選D-101型吸附樹脂為吸附劑。原藥材提取液與吸附樹脂的比例，視提取液的濃度而變，可以在0.3～2∶1(體積)之間適當選擇，優選0.6～1.6∶1，最優選1∶1左右，本領域技術人員可以根據經驗適當選擇。如果比例小於0.3∶1，則可能吸附不完全，如果大於2∶1，則因為吸附的皂苷量不再增加，會浪費樹脂，不利於成本控制。
在使用吸附樹脂的時候，根據本領域技術人員熟悉的常識，樹脂應該先進行預處理然後才能使用，預處理可以採用已知方法進行，例如可以按如下方法操作將樹脂裝柱，用95％乙醇衝洗，洗至流出液用2倍量水稀釋時，不顯渾濁後，再用水衝洗流出液無醇味，然後將藥液上柱。
以上說明僅為示例性質，具體應根據所使用的吸附樹脂的說明進行。
吸附時當然須控制提取液的流速，才能保證吸附完全和保證適當的速度。對於適當吸附速度的選擇屬於本領域的常規操作，在此不作限制。例如，在20mL樹脂的情況下，吸附流速在0.5～10ml/分左右都可以比較好的實現本發明的目的。高於或低於此值將降低分離效率或者造成收率的損失。本領域技術人員可以根據實際情況加以決定。
上柱後洗脫所用的醇可以是低級醇如甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇等。從健康角度看優選乙醇，採用乙醇洗脫時，濃度為30-80％(v/v)左右，優選40-70％(v/v)。從乙醇可以回收利用的角度來看，最好50～70％(v/v)(因實際條件而變，也可以±5％)左右。
用醇洗脫後，收集洗脫液，回收洗脫液中的乙醇後再濃縮，最後，經噴霧乾燥或冷凍乾燥或直接乾燥後粉碎，得到本發明的楤木提取物的粉末，所得粉末可以進一步精製，或直接製成適當的劑型，例如，膠囊劑、丸劑、片劑、顆粒劑、溶液劑或注射劑等。
另外，洗脫液也可以經過脫色後再製成粉末。脫色可以採用氧化鋁、氧化鎂、硅藻土、活性炭、分子篩、碳酸鈣等或者它們的組合進行。脫色時，可以採用常規脫色工藝，即將適量脫色劑加入洗脫液中，回流，之後放冷、過濾，以後按照上述方法製成粉末。
本發明人發現，通過脫色可以出乎意料的同時降低無梗五加苷D在提取物中的含量，就是說脫色可同時去除無梗五加苷D，降低楤木提取物的毒性。在CN1355171A和CN1355172A中沒有提到對楤木提取物進行脫色的步驟，因此本發明也提供了對楤木提取物降低毒性的方法。
在脫色過程中的脫色劑優選氧化鎂、氧化鋁、碳酸鈣、明膠、分子篩、活性炭、硅藻土等中的一種或多種的組合。特別優選氧化鎂或者含有氧化鎂的脫色劑組合，如氧化鎂-活性炭、氧化鎂-氧化鋁、氧化鎂-硅藻土等。組合使用時，氧化鎂與另一組分的使用量比例可以根據情況適當調整，比如在20∶1～1∶20間進行調整。
如上所述本發明的提取物，可以按照常規的製劑工藝，製備成任何適用於臨床使用的藥物劑型，例如，膠囊劑、丸劑、片劑、顆粒劑，溶液劑或注射劑等。其中各劑型所含提取物的量依據劑型組成、所治療患者的狀況、臨床使用條件等而有所不同。由於糖尿病屬於慢性疾病，因此優選各種口服劑型。大體來說，當提取物中總皂苷含量以50％計時，體重70公斤左右的患者可以每天給藥0.1～10克(相當於原藥材2～3克到2～300克左右)，分1～3次服用。由於本發明的提取物的原料楤木本身具有適應原樣作用和滋補強壯作用等，因此用量適當加大也不會有明顯的毒副作用。
動物實驗表明，本發明的楤木提取物對四氧嘧啶、鏈脲黴素、外源性葡萄糖、腎上腺素所致的多種試驗性高血糖動物模型均具有顯著的降糖作用。同時楤木提取物還可以增加肝糖元的含量，增加血清胰島素水平。
另外，初步臨床試驗表明，本發明的楤木提取物對中醫診斷為氣陰兩虛證消渴病患者，總療效63.33％，顯效率43.33％；對於消渴病證候療效，總療效83.33％，愈顯率56.67％。
以下舉出製備實施例、製劑實施例和藥理實驗例具體說明本發明。但本發明不受以下實施例的任何限制。
製備實施例1稱取楤木藥材粗粉1kg，粉碎。水24升，分3次煎煮提取，每次提取前可適當浸泡。每次時間分別為2小時、1小時40分、1小時。合併提取液，減壓濃縮至相對密度為1.10～1.15。
在攪拌下加乙醇使含醇量達60％，放置過夜，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，濃縮至相對密度為1.20～1.25。將此濃縮濾液通過已處理完畢的大孔吸附樹脂(D101型)柱(2kg)以進行吸附。水洗一個柱體積，再用10％乙醇洗脫一個柱體積，最後用60％乙醇洗脫樹脂柱，使吸附於樹脂柱上的皂苷被完全洗脫止，收集60％的洗脫液。
洗脫液中加入0.02kg脫色劑(MgO∶活性炭＝1∶1)，加熱至70-80℃，回流30分鐘，放冷，濾過。減壓回收乙醇，真空乾燥。得到淺黃白色的本發明的提取物45克。
按本實施例方法製取的楤木總皂苷產品收率4.5％。
按比色法檢測總皂苷含量儀器722型紫外-可見分光光度計測定方法取楤木皂苷C，用甲醇製成每1ml含2mg的溶液。精密吸取對照品溶液30μl，60μl，90μl，120μl，150μl，180μl，置於具塞試管中，揮去甲醇，精密加入5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，搖勻，於70度水浴加熱20分鐘，取出，冷卻至室溫後精密加入醋酸乙酯5ml，搖勻，以相應的試劑為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VB)，在595nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪製標準曲線。
本發明提取物約50mg，精密稱取，置於具塞試管中，精密加入甲醇5ml，超聲處理20分鐘，濾過，棄去初濾液，精密吸取續濾液25μl，置於具塞試管中，照標準曲線製備項下的方法，自「揮去甲醇」起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液楤木皂苷C的量，計算，即得。
含量，以楤木皂苷C計，含總皂苷87％。
HPLC法檢測楤木皂苷A、楤木皂苷C含量之和色譜條件設備PE-1022色譜工作站色譜柱C18(Dikmosil，250×4.6mm，5μm)流動相乙腈∶0.2％磷酸水溶液(32∶68)柱溫30℃檢測波長207nm。
按照面積歸一化法測定，該產品含楤木皂苷A、楤木皂苷C含量之和25％。
楤木皂苷A、楤木皂苷C的高效液相(HPLC)色譜圖見附圖1和2。
本實施例的所得提取物的薄層色譜圖見圖3，展開系統為CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1。從圖中可見不含無梗五加苷D。
製備實施例2除大孔吸附樹脂分別改以D201樹脂、AB-8樹脂、WLD樹脂、CAD-40樹脂以外，按照上述製備實施例1同樣方法進行提取，得到提取物。按照製備實施例1的方法測定總皂苷含量。樹脂種類、樹脂-提取液用量比(吸附量)、總皂苷含量、收率如表1所示。
表1

製備實施例3除洗脫乙醇濃度分別為30、40、50、70％以外，按照上述製備實施例1同樣方法進行提取，得到提取物。按照製備實施例1的方法測定總皂苷含量以及楤木皂苷A和C的含量。乙醇濃度、收率、總皂苷含量、楤木皂苷A和C的含量和如表2所示。
表2

製備實施例4除脫色劑分別改為活性炭、氧化鋁、活性炭+氧化鋁、氧化鎂、活性炭+氧化鎂或者不進行脫色以外，按照上述製備實施例1同樣方法進行提取，得到提取物。按照製備實施例1的方法測定總皂苷含量。脫色劑用量(相對於提取物)、總皂苷含量、所得提取物的性狀和收率如下表3所示。
表3

本實施例的所得提取物的薄層色譜圖見圖4，其中1是未經脫色的，2是以活性炭為脫色劑的，3是氧化鋁的，4是活性炭+氧化鋁的，5是氧化鎂的，6是活性炭+氧化鎂的。展開系統為CHCl3∶MeOH∶H2O＝6∶4∶1。從圖中可見加入脫色劑後無梗五加苷D明顯減少，尤其是採用含有氧化鎂的脫色劑後效果更明顯。
製劑實施例1膠囊劑取製備實施例1方法得到的提取物35g，粉碎，過80目篩，依次加入過80目篩的微晶纖維素55g、可壓性澱粉10g和適量澱粉，混勻，再過80目篩，裝入2號膠囊，製成1000粒，即得。
製劑實施例2片劑取按製備實施例1方法所得的提取物105g，以乙醇為粘和劑，一步法制粒。顆粒依次加入羧甲基纖維素鈉220g、硬脂酸鎂75g，混勻，壓片，分裝，製成1000片，即得。
藥理實驗例1
消渴病是以多尿、多飲、多食、形體消瘦、或尿有甜味為主要臨床表現的病症。中老年糖尿病患者中，還多呈現氣陰兩虛之證。這類病人，由於年事已高，通常在服用西藥降糖藥後，會因血糖突然下降而感到頭暈、乏力等症愈加明顯。因此他們期有一種使血糖呈緩慢型下降的降糖藥。以下實驗例證明本發明提取物可以緩慢降低血糖，同時能改善氣陰兩虛之症狀。
因此我們用本發明的楤木提取物對氣陰兩虛證消渴病(II型糖尿病)患者46例(含對照組16例)，進行了臨床試驗，其結果如下(一)病例標準參照《新藥(中藥)治療消渴病(糖尿病)臨床研究指導原則》確診為消渴病(糖尿病)且辨徵為氣陰兩虛的病人同時，根據1980年WHO暫行標準(靜脈血漿真糖法)，診斷為分類屬輕、中度非胰島素依賴型(NIDDM，II型)糖尿病，分期屬糖尿病症狀期(II期)，糖尿病合併症早期(III期)者。
(二)、臨床試驗方法給藥方法1.治療組服用製劑例1製備的膠囊(50mg/粒)，2粒/次，3次/日，口服。
2.對照組①口服降糖靈片，南通製藥廠生產，25mg/片，1片/次，3次/日。②口服優降糖，北京雙橋製藥公司生產，按說明服用。
3.治療療程治療組與對照組均以用藥兩個月為一療程，療程結束，即結束臨床觀察。
(三)觀察指標1.中醫療效性觀測按以下評價指標，除特別指出外，相應於正常、輕度、中度和重度分別評分為0、2、4、6分。
A.倦怠乏力正常，症狀無或消失；輕度，易疲勞，但可勝任日常工作；中度，疲勞於休息後可緩解，不耐重工作或持久工作；重度，疲乏於休息後不能恢復，不能勝任工作。
B.頭暈正常，症狀無或消失；輕度，偶有，輕微；中度，明顯，時有；重度，嚴重，持續不斷。
C.氣短懶言正常，症狀無或消失；輕度，運動後氣短，不喜多言；中度，稍動即氣短，不喜多言；重度，平靜時亦氣短，不欲言語，呈無欲狀。
D.口渴喜飲正常，症狀無或消失；輕度，口渴，飲水後可緩解，日飲水量增加1/2倍以上；中度，口渴明顯，日飲水量＜4000ml，或增加1/2-1倍；重度，口乾甚飲水不解，日飲水量＞4000ml，或增加＞1倍。
E.五心煩熱正常，症狀無或消失；輕度，手足心熱，偶有心煩；中度，手足欲露衣被外，時感心煩；重度，手足熱，喜觸冷物，心煩不寧。
F.自汗正常，症狀無或消失；輕度，動則微汗出；中度，不動即皮膚潮溼，稍動則汗出；重度，經常汗出，動則汗出如水洗。
G.盜汗正常，症狀無或消失；輕度，寐則偶汗出；中度，寐則汗出；重度，寐則大汗出如珠。
H.多食易飢正常，症狀無或消失；輕度，有輕度飢餓感，食量略增加；中度，時感飢餓，尚能控制，或食量增加1/2-1倍；重度，易飢多食，不能自控，或食量增加1倍以上。
I.大便乾結(0、1、2、3分)正常，症狀無或消失；輕度，便幹，排之不暢；中度，大便乾結，排之困難，2-3日/次；重度，大便硬結，乾澀難解，數日/次。
J.多尿或溲赤(0、1、2、3分)正常，症狀無或消失；輕度，尿色深黃，或尿量增加1倍以上；中度尿色黃赤，或尿量增加1-2倍；重度尿呈茶褐色，尿量增加2倍以上。
K.心悸(0、1、2、3分)正常，症狀無或消失；輕度，活動量稍大即感心悸；中度，輕微活動即感心悸；重度，休息時可感心悸。
F.失眠(0、1、2、3分)正常，症狀無或消失；輕度，睡眠不足6小時；中度，睡眠不足4小時；重度，睡眠不足3小時。
I.舌象、脈象舌紅少津1分舌體胖大1分苔薄黃或少苔1分脈弦細或細數1分中醫症狀分級標準以上累積分＞44分為重度；20分～44分為中度；＜20分為輕度2.空腹及餐後兩小時血糖檢測，用藥後每兩周一次。
3.24小時尿糖定量檢測，用藥後每兩周一次。
4.血脂測定5.糖基化血紅蛋白測定。
6.血液流變學測定。
(四)療效判定標準根據臨床症狀及化驗檢查變化作為判定標準(以衛生部一九九三年中藥新藥臨床研究指導原則為標準)。
1.顯效治療後症狀基本消失，空腹血糖＜7.2mmol/L(130mg/dl)，餐後2小時血糖＜8.3mmol/l(150mg/dl)，24小時尿糖定量＜10.0克；或血糖、24小時尿糖定量較治療前下降30％以上。
2.有效治療後症狀明顯改善，空腹血糖＜8.3mmol/l(150mg/dl)，餐後2小時血糖＜10.0mmol/L(180mg/dl)。24小時尿糖定量＜25.0克；或血糖、24小時尿糖定量較治療前下降10-29％。
3.無效治療後症狀無明顯改善，而血糖、尿糖下降未達上述標準。
(五)中醫證侯療效標準證侯療效評定按半定量評分法。
綜合證侯療效評定方法

1.痊癒積分比100％2.顯效積分比≥70％3.有效70％＞積分比≥30％4.無效30％＞積分比(六)、臨床總結及統計處理所有資料匯總，輸入IBM/PC兼容計算機，建立資料庫，用POMS(醫學統計程序)、PEMS(華西醫科大學醫學統計程序)進行統計處理。
統計處理方法計數資料用χ2檢驗，等級資料用Ridit分析，計量資料用t檢驗。
結果1.總療效(表4)表4

2.中醫證候療效(表5)表5

具體實施例方式
實施例1(a)取三七330g、冰片3.3g、木糖醇12g、黃原膠3g備用；(b)取三七加水煎煮5次，合併煎液，濾過，濾液濃縮，加入2倍量90％乙醇，靜置20小時，濾過，回收乙醇，濾液濃縮至在50℃條件下、相對密度為1.15～1.25的稠膏(1)；(c)取冰片溶於適量的乙醇中，得溶液(2)；將(1)(2)加入水浴融化的木糖醇和澱粉混合物中，攪拌均勻，保溫，在55～75℃溫度下滴制、滴管口徑為1.30～4.0毫米，以每分鐘30～60滴的速度滴制，滴入甲基矽油中，製成1000粒，成形後，將丸取出，用吸水紙拭乾滴丸表面，即得。
實施例2(a)取三七20g、冰片1.5g、乳糖醇83g、澱粉17g備用；(b)取三七加水煎煮2次，合併煎液，濾過，濾液濃縮，加入4倍量85～95％乙醇，靜置36小時，濾過，回收乙醇，濾液濃縮至在70～80℃條件下、相對密度為1.10～1.25的清膏(1)；(c)取冰片溶於適量的乙醇中，得溶液(2)；將(1)(2)加入水浴融化的乳糖醇與澱粉的混合物中，攪拌均勻，保溫，在65～95℃溫度下滴制、滴管口徑為1.10～3.0毫米，以每分鐘20～50滴的速度滴制，滴入植物油中，製成1000粒滴丸，成形後，將丸取出，用吸水紙拭乾滴丸表面，即得。
小結1.本發明的楤木提取物對氣陰兩虛證消渴病患者30例臨床預試，其療效觀察結果示總療效63.33％，顯效率43.33％。
2.本發明的楤木提取物證候療效分別為總療效83.33％，愈顯率56.67％。
3.本發明提取物對中醫症狀改善情況優於降糖靈、優降糖，尤其對倦怠乏力、頭暈、氣短懶言、口渴喜飲、五心煩熱、自汗、盜汗之氣陰兩虛症狀的改善效果更為明顯。
4.另外發現本發明的楤木提取物對血糖的下降不及降糖靈、優降糖迅速，具有起效相對緩慢的特點，但患者一當血糖下降後，一般不再出現反跳。
5.30例服用製劑例1膠囊的患者，在臨床觀察中，未發現1例毒、副反應。
藥理實驗例2.本發明楤木提取物對正常動物血糖的影響(1)單次給藥對正常動物血糖的影響取正常家兔48隻，隨機分為6組，在飼養觀察室內觀察7天，給藥前禁食12小時，耳緣靜脈取血，測定給藥前血糖值。分別灌胃給提取物100mg/kg、50mg/kg，25mg/kg，參芪降糖膠囊300mg/kg及優降糖3.5mg/kg，給藥容積為5m/kg，空白對照組給相當容積0.5％CMC-Na，給藥後3小時取血，離心，取血清20ul，加入葡萄糖氧化酶試劑，混勻後37℃保溫15分鐘，505nm波長處測定吸收度(A)。與標準葡萄糖吸收度比較，計算血清中葡萄糖含量。並與給藥前血糖濃度比較。試驗結果如下表7所示，各給藥組給藥前後血糖值無明顯差異。
表7

注X±SD，給藥前後血糖值比較*p＜0.05(2)多次給藥對正常動物血糖的影響取正常小鼠60隻，隨機分為6組，在飼養觀察室內觀察7天，給藥前禁食12小時，眼球後靜脈取血，測定給藥前血糖值。分別灌胃給提取物120mg/kg、60mg/kg，30mg/kg，參芪降糖膠囊800mg/kg及優降糖4mg/kg，空白對照組給相當容積0.5％CMC-Na，給藥容積為0.2ml/10g，連續給藥7天，末次給藥後3小時眼球後靜脈取血，離心，取血清20ul，加入葡萄糖氧化酶試劑，混勻後37℃保溫15分鐘，505nm波長處測定吸收度A。與標準葡萄糖吸收度比較，計算血清中葡萄糖含量。並與給藥前血糖濃度比較。結果如表8所示。各給藥組給藥前後血糖值明顯下降，與給藥前血糖值比較有非常顯著差異(p＜0.01)表8

注X±SD，給藥前後血糖值比較*p＜0.05，**p＜0.01
藥理實驗例3.本發明楤木提取物對四氧嘧啶致高血糖動物血糖的影響(1)單次給藥對血糖影響的時效關係取正常家兔，禁食12小時後用固定箱固定之。以酒精塗擦兔耳，使耳緣靜脈輪廓清晰，於試驗前用生理鹽水配製四氧嘧啶，以150mg/kg從耳緣靜脈注入，誘導成高血糖動物模型，另準備高滲葡萄糖溶液，以便在給藥初期低血糖痙攣發作時及時給予。待其血糖值穩定後，取血，離心，測血糖值，取空腹血糖值在200mg/dl以上的家兔隨機分為6組，每組8隻，分別灌胃給提取物100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，參芪降糖膠囊300mg/kg及降糖靈35mg/kg及相當容積的0.5％CMC混懸液，分別在給藥後1、2、3、4小時取血，離心，用葡萄糖氧化酶法測血糖濃度，並與給藥前血糖值比較，結果如表9所示，楤木單次灌胃給藥後對四氧嘧啶高血糖家兔有降低血糖作用，但僅第3小時與模型組比較有顯著差異。
表9

X±SD，與給藥前相比*p＜0.05，**p＜0.001(2)連續給藥對四氧嘧啶所致高血糖家兔血糖影響如前所述方法製備四氧嘧啶高血糖模型家兔48隻，測給藥前空腹血糖後，選合格動物均分為6組，每組8隻，分別是模型對照組、楤木提取物組100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg、兩組陽性對照組(包括參芪降糖膠囊300mg/kg，降糖靈35mg/kg)、空白對照組另取8隻僅靜脈注射相當容積的四氧嘧啶溶劑生理鹽水的正常家兔。每天灌胃給藥一次，給藥容積為5.0ml/kg，空白對照組和模型對照組給相當容積的0.5CMC-Na，連續給藥4周(28天)，每給藥7天測定一次空腹血糖進行組間比較並於末次給藥(28天)後不同時間(1，2，4，24h)採血，進行比較，給藥後第7天楤木提取物100mg/kg和50mg/kg組開始出現明顯降糖作用，並隨給藥時間延長，降糖作用日趨明顯，停藥後其降糖作用可維持4小時左右(表10，11)表10連續給藥對血糖影響

X±SD，各給藥組血糖與模型對照組血糖值相比*p＜0.05，**p＜0.01
表11連續灌胃血糖影響

X±SD，各給藥組血糖與模型對照組血糖值相比*p＜0.05，**p＜0.01藥理實驗例4.楤木提取物對鏈脲黴素致高血糖小鼠血糖的影響取昆明種小鼠，體重20-22g，禁食12小時後尾靜脈注射用生理鹽水新鮮配製的鏈脲黴素溶液，劑量180mg/kg，造成務糖模型，穩定一周後取空腹血糖值在180mg/dl以上的小鼠60隻，均分6組，各組給藥劑量如表6-7所示，模型對照組灌胃給相當容積0.5CMC-Na。於給藥後0、2、4、6小時分別採血用葡萄糖氧化酶法測血糖，各給藥組血糖與模型組血糖進行比較顯著性檢驗、結果如表12所示，楤木皂苷對鏈脲黴素高血糖小鼠有明顯降糖作用。
表12楤木提取物對鏈脲黴素致高血糖小鼠血糖的影響

X±SD，各給藥組血糖值與對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01
藥理實驗例5.楤木提取物對腎上腺素致高血糖小鼠血糖的影響取小鼠70隻，均分為7組，1、2組灌胃生理鹽水0.2ml/10g，3、4、5組灌胃給提取物(劑量120mg/kg、60mg/kg、30mg/kg)，第6組灌胃給參芪降糖膠囊(300mg/kg)，第七組灌胃給降糖靈(40mg/kg)，連續給藥9天，末次給藥前禁食12小時，末次給藥後2小時，2、3、4、5、6組小鼠腹腔注射腎上腺素50ug/kg，30分鐘後眼眶取血，葡萄糖氧化酶法測血糖。結果見表13。腎上腺素能促進肝臟及肌肉糖原分解，並能促進糖異生作用，使動物血糖升高，本發明提取物對腎上腺素所致的試驗性高血糖動物模型具有顯著的降糖作用。
表13對腎上腺素引起的高血糖小鼠血糖的影響

注X±SD，與模型對照組作t檢驗p＜0.05，**與模型對照組作t檢驗p＜0.01藥理實驗例6.楤木提取物對葡萄糖致糖耐量的影響取四氧嘧啶致高血糖家兔48隻，分為6組，分別是模型對照組(給0.5％CMC混懸液)、提取物組(100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg)、陽性對照組參芪降糖膠囊(300mg/kg)、降糖靈(35mg/kg)，禁食12小時，取血，測血糖後分別給藥30分鐘後，以2.5g/kg劑量灌胃給葡萄糖，給糖後分別在30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘耳緣靜脈取血，離心，用葡萄糖氧化酶法測血糖。結果見表14，試驗結果表明楤木提取物能提高受試動物的糖耐受性。
表14楤木提取物對高血糖家兔糖耐量的影響

注X±SD，各給藥組血糖與模型對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01藥理實驗例7.楤木提取物對肝糖元含量的影響取四氧嘧啶誘發糖尿病小鼠60隻，均分為6組，分別為提取物高劑量組(120mg/kg)、提取物中劑量組(60mg/kg)、提取物低劑量組(30mg/kg)及模型對照組(0.5％CMC)、陽性對照組為參芪降糖膠囊(800mg/kg)、降糖靈(40mg/kg)另取正常小鼠10隻，作為空白對照組(0.5％CMC)，灌胃給藥，連續9天，末次給藥前禁食12小時，末末次給藥後2小時處死小鼠取小鼠肝臟，以生理鹽水洗淨血液，用濾紙吸乾表面水分後分別稱取各組小鼠肝組織0.5g，加入事先加及1.5ml 30％KOH的溶液的試管中，置沸水浴中煮沸20min，取出冷卻，轉移到100ml容量瓶中，蒸餾水清洗，合併清洗液至刻度，混勻。用蒽酮法測定肝糖元的含量。結果如表15所示，試驗結果表明楤木提取物可使四氧嘧啶高血糖小鼠肝糖元含量增加，與模型對照組肝糖元含量間有顯著差異。楤木提取物可以增加肝糖元的含量，說明其降糖作用與促進動物的糖的合成代謝有一定關係。
表15楤木提取物對肝糖元含量的影響

注X±SD，*與模型對照組作t檢驗p＜0.05，**與模型對照組作t檢驗p＜0.01藥理實驗例8.楤木提取物對血清胰島素含量的影響取四氧嘧啶誘發高血糖小鼠60隻，分為6組，分別為提取物高劑量組(120mg/kg)、提取物中劑量組(60mg/kg)、提取物低劑量組(30mg/kg)及模型對照組參芪降糖膠囊(800mg/kg)，降糖靈組(40mg/kg)，另取正常小鼠10隻，為正常對照組(0.5％CMC)，連續給藥9天，末次給藥前禁食12小時，於末次灌胃給藥後2小時眼眶取血，離心，取血清，測血清中的胰島素含量。結果見表16，本發明提取物可以增加血清胰島素水平。
表16楤木提取物對四氧嘧啶致高血糖小鼠血清胰島素含量的影響

注X±SD，*與模型對照組作t檢驗p＜0.05，**與模型對照組作t檢驗p＜0.0權利要求
1.一種治療糖尿病的楤木提取物，其特徵在於該提取物是以水提取而得到的，其中總皂苷含量在50％以上，且楤木皂苷A和C的總含量在10％以上。
2.權利要求1的提取物，其中總皂苷含量在60％以上和/或總皂苷中，楤木皂苷A和C的合計含量在15％以上。
3.權利要求1的提取物，其中總皂苷含量在75％以上和/或在提取物中，楤木皂苷A和C的合計含量在20％以上。
4.權利要求1的提取物，其中楤木皂苷A和C的合計含量在50％以下。
5.權利要求1～4任一項的楤木提取物，其中不含有無梗五加苷D。
6.楤木皂苷A和/或C用於製備治療糖尿病藥物的應用。
7.採用含有楤木皂苷A和/或C的中藥提取物治療糖尿病的方法。
8.一種楤木提取物的製備方法，其特徵在於包括用水提取楤木活性成分，之後將所得提取物用醇沉澱，將所得濾液通過弱極性的大孔吸附樹脂吸附，然後用醇洗脫、並用含有氧化鎂的吸附劑脫色的步驟。
9.權利要求8的提取方法，其中大孔吸附樹脂為D101樹脂。
10.權利要求8的提取方法，其中所用醇為乙醇。
全文摘要
一種治療糖尿病的楤木提取物，其特徵在於該提取物是以水提取而得到的，主要含有楤木皂苷A和C，而且其中優選不含有無梗五加苷D。
文檔編號A61P3/10GK1626099SQ20031012038
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月11日 優先權日2003年12月11日
發明者徐綏緒, 宋少江, 謝鳳瑛, 陸全才, 張國剛, 曹穎林 申請人:岐黃藥業科技投資有限責任公司, 瀋陽藥科大學