一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑及其製備方法

2023-07-26 10:46:06

一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，在人精液基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑中添加有一定濃度的二十二碳六烯酸，二十二碳六烯酸的加入能改善精子冷凍保護劑的應用效果；本發明還公開了上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備方法，該方法工藝簡單。
【專利說明】一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於人精液冷凍保護劑【技術領域】，具體涉及一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑及其製備方法。
【背景技術】
[0002]精子是帶有遺傳物質的特殊細胞。精液經過技術處理，在冷凍保護劑的保護下，經過一定的降溫程序，保存在超低溫(液氮中)，精子呈現玻璃樣的凍結，不會出現原生質脫水，其本來結構受到保護，所以解凍後的精子仍能復甦，恢復活力。冷凍狀態的精子代謝活動受到明顯抑制，其生命處於靜止狀態，從而達到能長期保存的目的。 [0003]精子冷凍保護劑是精子冷凍技術的最重要物質。目前最常用的精子冷凍保存劑是含甘油和卵黃的複合型冷凍液，由甘油、卵黃、單糖、枸櫞酸鈉等組成。冷凍保護劑根據作用機理分為滲透性冷凍保護和非滲透性冷凍保護，甘油屬於滲透性冷凍保護劑，非滲透性冷凍保護劑有果糖、蔗糖、卵黃、白蛋白等。滲透性冷凍保護劑滲入細胞內，降低細胞內外滲透壓的差距，當細胞外凍結時，減輕細胞皺縮的程度和速度；還能與細胞內水分及電解質結合，導致水合結構蛋白的穩定，發揮抗凍作用。非滲透性冷凍保護劑不能進入細胞，通過維持細胞膜的穩定起保護作用，冷凍時促進細胞內水分外溢，細胞發生皺縮，從而減少細胞內的冰晶形成。
[0004]人精子膜的脂類含量約佔50%以上。其中，脂質的主要成分為磷脂和膽固醇。細胞膜是由脂類構成的雙分子層結構，膜脂類具有親水和疏水的兩部分，為脂肪酸。脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸多含2個以上的雙鍵，稱多不飽和脂肪酸，由於多不飽和脂肪酸中雙鍵位置的不同，其構型則完全不同、功能也不同。因此，細胞膜中脂肪酸成分的不同，直接影響著細胞膜的結構、流動性和通透性，影響著膜上功能蛋白的構象和功能發揮。
[0005]研究表明，二十二碳六烯酸具有調節膜相關的生理過程、抗腫瘤抗炎、促進細胞生長、防止心腦血管疾病、有利於大腦視網膜形成、免疫調節和基因表達等很多重要的生理調節功能。作為細胞膜膜脂的重要組成成分，二十二碳六烯酸對細胞膜結構、流動性、相轉變、信號轉導、物質運輸、離子交換、能量傳遞以及酶活性大小等方面具有重要的調節作用。
[0006]人精子膜含有大量脂類，其中二十二碳六烯酸起著非常重要作用，二十二碳六烯酸屬於非滲透性冷凍保護劑，在維持細胞膜穩定性方面發揮保護作用。
[0007]目前，還未有人將二十二碳六烯酸用於人精液冷凍保護劑中。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在於提供一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，二十二碳六烯酸的加入能改善精子冷凍保護劑的應用效果。
[0009]本發明的目的還在於提供上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備方法，該方法工藝簡單。
[0010]本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的:一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，在人精液基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有二十二碳六烯酸。
[0011]本申請發明人經過研究表明，正常生育力男性精子二十二碳六烯酸含量明顯高於不育男性，此種差別可能與人精子的功能學密切相關。所以，本申請發明人得到啟發，在人精子冷凍保護劑中加入二十二碳六烯酸以降低人精子的冷凍損傷，從而提高人精子的功倉泛。
[0012]本發明所述基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑主要由以下濃度的組分組成:甘油15% (體積百分含量)，甘氨酸13g/L，卵黃20% (體積百分含量)，葡萄糖15g/L，檸檬酸三鈉二水13g/L。
[0013]評價精子冷凍水平的最重要和最常用的指標就是精子凍融復甦後的活力，具有前向運動能力的精子百分率最具代表性，因此，本申請發明人設計並實施了實驗研究，在目前常用的基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑配方中加入二十二碳六烯酸，組成多個不同配比的配方，應用於人精子冷凍，觀察精子凍融復甦後的活力和功能是否改善。本申請發明人不僅觀察了比較冷凍前後的前向運動精子百分率，還觀察比較了冷凍前後精子正常形態率、存活率、DNA完整率，這些指標能夠較好地評價精子功能以及精子生理和毒理安全性。通過大量試驗，本申請發明人發現:
本發明所述二十二碳六烯酸的濃度為在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中優選添加 有0.15-5.0g 二十二碳六烯酸。
[0014]本發明所述二十二碳六烯酸的濃度為在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中更優選添加有0.15-1.25g 二十二碳六烯酸。
[0015]本發明所述二十二碳六烯酸的濃度為在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中進一步優選添加有0.30-0.63g 二十二碳六烯酸。
[0016]當在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加0.15-1.25g 二十二碳六烯酸時，冷凍後復甦精子的前向活動率、存活率、正常形態率和DNA完整率均有所升高，尤其當二十二碳六烯酸濃度在0.30-0.63g/L時，冷凍後復甦精子的前向活動率、存活率、正常形態率和DNA完整率均明顯高於對照組，具有顯著性差異0°〈0.05)。
[0017]本發明的第二個目的是通過如下技術方案來實現的:上述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備方法，含以下步驟:
(1)製備基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑；
(2)在基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中加入二十二碳六烯酸，混勻後，冷凍保存即可。
[0018]與現有技術相比，本發明具有如下優點:甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑加入一定量的二十二碳六烯酸(二十二碳六烯酸濃度在0.30-0.63g/L)，對人精子冷凍效果有明顯改善，復甦後的人精子功能學參數:前向活動率、存活率顯著高於對照組(未添加二十二碳六烯酸)，且正常形態率和DNA完整率也明顯高於對照組，提示對人精子質量保護更具有良好的安全性。【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是實施例1-6和對照實施例(甘氨酸甘油複合型人精液冷凍保護劑)冷凍精液復甦後檢測精子前向活動率、存活率、正常精子形態率和精子DNA完整率結果，其中7指對照實施例甘氨酸甘油複合型人精液冷凍保護劑，2-6依次指二十二碳六烯酸+甘氨酸甘油複合型人精液冷凍保護劑中二十二碳六烯酸濃度分別為5.00g/L、2.50g/L、l.25g/L、
0.63g/L、0.30g/L、0.15g/L。
【具體實施方式】
[0020]第一部分實施例和對照實施例人精液冷凍保護劑組分及製備方法 實施例1
本實施例提供的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，在人精液基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有二十二碳六烯酸，其中在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有5.0Og 二十二碳六烯酸，IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑主要由以下濃度的組分組成:甘油15% (體積百分含量)，卵黃20% (體積百分含量)，葡萄糖15g/L，檸檬酸三鈉二水13g/L，甘氨酸 13g/L。
[0021]上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備方法如下: (一)基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑的製備(IOOmL)
(1)稱量1.5g葡萄糖和1.3g檸檬酸三鈉二水，加消毒的純淨水至65mL ；
(2)加入15mL甘油完全混勻；
(3)加入1.3g甘氨酸，完全溶解後用0.45微米微孔濾器過濾；
(4)加入20mL新鮮卵黃(無病原蛋):清洗雞蛋，去殼，刺破卵膜，用注射器吸取卵黃；
(5)所製成的懸浮液置56°C水浴中40分鐘，經常攪拌；
(6)檢測溶液的pH值，要求pH值在6.8-7.2之間;
(7)溶液送細菌培養，要求無菌；
(8)冷藏保存。
[0022](二)添加二十二碳六烯酸
其中二十二碳六烯酸組分的含量為5.00g/L, 二十二碳六烯酸購自sigma公司，純度大於等於98%，二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備過程如下:
(1)將甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑37°C水浴解凍；
(2)二十二碳六烯酸從冰箱內取出，置37°C恆溫試管架內20分鐘；
(3)分別取二十二碳六烯酸5.0Omg加入IOmL甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑，製成二十二碳六烯酸含量為5.00g/L的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑；
(4)在超淨臺中將溶液以0.4mL分裝，_70°C保存備用。
[0023]實施例2
本實施例提供的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，在人精液基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有二十二碳六烯酸，其中在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有2.50g 二十二碳六烯酸，IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑主要由以下濃度的組分組成:甘油15% (體積百分含量)，甘氨酸13g/L，卵黃20% (體積百分含量)，葡萄糖15g/L，檸檬酸三鈉二水13g/L。
[0024]上述二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備方法如下: (一)基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑的製備(IOOmL)
(1)稱量1.5g葡萄糖和1.3g檸檬酸三鈉二水，加消毒的純淨水至65mL ；
(2)加入15mL甘油完全混勻；
(3)加入1.3g甘氨酸，完全溶解後用0.45微米微孔濾器過濾；
(4)加入20mL新鮮卵黃(無病原蛋):清洗雞蛋，去殼，刺破卵膜，用注射器吸取卵黃；
(5)所製成的懸浮液置56°C水浴中40分鐘，經常攪拌；
(6)檢測溶液的pH值，要求pH值在6.8-7.2之間;
(7)溶液送細菌培養，要求無菌；
(8)冷藏保存。
[0025](二)添加二十二碳六烯酸
其中二十二碳六烯酸組分的含量為2.50g/L, 二十二碳六烯酸購自sigma公司，純度大於等於98%，二十二碳六烯酸-·甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備過程如下:
(1)將甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑37°C水浴解凍；
(2)二十二碳六烯酸從冰箱內取出，置37°C恆溫試管架內20分鐘；
(3)分別取二十二碳六烯酸2.50mg加入IOmL甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑，製成二十二碳六烯酸含量為2.50g/L的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑；
(4)在超淨臺中將溶液以0.4mL分裝，_70°C保存備用。
[0026]實施例3
與實施例1不同的是，在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有1.25g 二十二碳六烯酸。
[0027]實施例4
與實施例1不同的是，在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有0.63g 二十二碳六烯酸。
[0028]實施例5
與實施例1不同的是，在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有0.30g 二十二碳六烯酸。
[0029]實施例6
與實施例1不同的是，在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑中添加有0.15g 二十二碳六烯酸。
[0030]對照實施例
卵黃-甘油-檸檬酸鹽型人精液冷凍保護劑的製備方法如下:
(一)基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑的製備(IOOmL)
(1)稱量1.5g葡萄糖和1.3g檸檬酸三鈉二水，加消毒的純淨水至65mL ；
(2)加入15mL甘油完全混勻；(3)加入1.3g甘氨酸，完全溶解後用0.45微米微孔濾器過濾；
(4)加入20mL新鮮卵黃(無病原蛋):清洗雞蛋，去殼，刺破卵膜，用注射器吸取卵黃；
(5)所製成的懸浮液置56°C水浴中40分鐘，經常攪拌；
(6)檢測溶液的pH值，要求pH值在6.8-7.2之間;
(7)溶液送細菌培養，要求無菌；
(8)在超淨臺中將溶液以0.4mL分裝，_70°C保存備用。
[0031]第二部分實施例和對照實施例人精液冷凍操作和檢測指標 (一)實施例和對照實施例冷凍保護劑加入精液方法及冷凍程序
(1)37°C水浴解凍實施例和或對照實施例冷凍保護劑；
(2)1份體積實施例或對照實施例冷凍保護劑加入到2份體積精液中，逐滴加入同時旋
轉試管；
(3)加入冷凍保護劑後，混合液分裝在精子冷凍管，在30-35°C孵育5min；
(4)液氮蒸汽法冷凍。
[0032](二)檢測指標及操作
評價精子冷凍水平的最重要和最常用的指標就是精子凍融復甦後的活力，具有前向運動能力的精子百分率最具代表性，因此，本申請發明人設計並實施了實驗研究，在目前常用的精子冷凍保護劑配方中加入二十二碳六烯酸，組成多個不同配比的配方，應用於人精子冷凍，觀察精子凍融復甦後的活力和功能是否改善。我們不僅觀察比較冷凍前後的前向運動精子百分率，還觀察比較冷凍前後精子正常形態率、存活率、DNA完整率，這些指標能夠較好地評價精子功能以及精子生理和毒理安全性。
[0033]本發明 申請人:為研究不同二十二碳六烯酸濃度配比的精子冷凍保護劑的冷凍效果，經過預實驗探索，確定採用完全隨機區組設計結合重複測量設計，以30例取自自願者的精液樣本為實驗對象，每例樣本均分為7份，分別使用實施例1-6不同二十二碳六烯酸濃度的保護劑(二十二碳六烯酸濃度分別為:實施例1:5.00g/L ;實施例2:2.50g/L ;實施例3:1.25g/L ;實施例4:0.63g/L ;實施例5:0.30g/L ;實施例6:0.15g/L)和對照實施例(甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑作為對照組)進行精子冷凍，採用計算機自動分析技術觀察冷凍前後多個精液參數，並在精子凍融復甦後的多個時間點反覆觀察比對精子活力狀況。
[0034]具體的試驗過程如下:
精液加入二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑後，分別檢測冷凍前和復甦後的人精子以下功能學參數:前向活動率、存活率、正常形態率和DNA完整率，計算復甦率。
[0035](1)前向活動率的檢測:採用西班牙產全自動計算機輔助精子分析系統檢測人精子濃度和活力，結果見圖1。
[0036](2)存活率的檢測:解凍凍存的人精子膨脹液，使用前充分混勻；取ImL膨脹液置於微量離心管中，37°C溫熱5min ;取100微升充分混勻的精液加入膨脹液中，混勻；37°C孵育5min，然後取10 微升加到潔淨載玻片上，覆蓋22mmX 22mm蓋玻片，使用相差顯微鏡在X400倍視野下，計數未膨脹(死的精子)和膨脹(活的精子)精子百分率，得出人精子的存活率，結果見圖1。
[0037](3)精子形態學參數的檢測:按照WHO第五版的方法塗片，然後全自動染片機按照改良巴氏染色程序進行染色，西班牙產全自動智能精子形態分析系統進行精子形態學多種參數的檢測，結果見圖1。
[0038](4) DNA完整率的檢測:採用精子染色質結構試驗(SCSA)，能夠預示體內和體外的受精失敗。方法:精液液化並計數，取液化精液1.0mL加於離心管內，1000g離心5min，去除精漿。加ImL稀釋洗滌液，充分混勻。500g離心5min，去上清液，如此共洗滌3次；最後一次洗滌完畢，棄上清液，用稀釋洗滌液調整精子濃度為50X 106/mL。取5-10μ?懸浮液於清潔載玻片上塗片，晾乾，滴加數滴固定液固定lOmin，後將玻片直立於吸水紙上以除去固定液；滴加數滴新鮮配製的吖啶橙工作液染色5min，流水衝洗，晾乾；螢光顯微鏡高倍鏡下觀察。計數200條精子中綠色、紅色和橙黃色精子數，其中綠色為DNA雙鏈精子，紅色為DNA單鏈精子，橙黃色為DNA雙鏈不穩定精子。計算出綠色螢光DNA雙鏈精子的百分率，結果見圖1。
[0039]圖1中的數據分析結果表明:實施例4和實施例5冷凍復甦後精子活力明顯高於實施例1-3以及實施例6和對照實施例(P〈0.05)，精子形態學指標和精子DNA完整率明顯優於其它配方(P〈0.05)。所以，一定濃度範圍的二十二碳六烯酸能改善精子冷凍保護劑的應用效果。尤其是當二十二碳六烯酸濃度為0.30-0.63 g/L時，冷凍復甦後精子活力明顯偏聞。
[0040]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方 式，都包含在本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，其特徵是:在人精液基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑中添加有二十二碳六烯酸。
2.根據權利要求1所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，其特徵是:所述基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑主要由以下濃度的組分組成:甘油15% (體積百分含量)，甘氨酸13g/L，卵黃20% (體積百分含量)，葡萄糖15g/L，檸檬酸三鈉二水13g/L。
3.根據權利要求1或2所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，其特徵是:所述二十二碳六烯酸的濃度為在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑中添加有0.15-5.0 g 二十二碳六烯酸。
4.根據權利要求3所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，其特徵是:所述二十二碳六烯酸的濃度為在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑中添加有0.15-1.25 g 二十二碳六烯酸。
5.根據權利要求1或2所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑，其特徵是:所述二十二碳六烯酸的濃度為在IL基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑中添加有0.30-0.63 g 二十二碳六烯酸。
6.權利要求3所述的二十二碳六烯酸-甘氨酸-甘油複合型人精液冷凍保護劑的製備方法，其特徵是含以下步驟: (1)製備基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑； (2)在基礎冷凍保護劑甘氨酸-甘油複合型冷凍保護劑中加入二十二碳六烯酸，混勻後，冷凍保存即可。
【文檔編號】A01N1/02GK103651332SQ201310676861
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】唐立新, 馬春傑, 王奇玲, 江芳, 鄧順美, 唐運革, 王璐璐, 李月華, 程萍, 周穎儀 申請人:廣東省計劃生育科學技術研究所