一種三聚氰胺或三聚氰酸的測定方法及它的試劑盒或試紙條的製作方法

2023-07-26 14:49:01 4

專利名稱：一種三聚氰胺或三聚氰酸的測定方法及它的試劑盒或試紙條的製作方法
一種三聚氰胺或三聚氰酸的測定方法及它的試劑盒或試紙條技術領域：
本發明涉及醫學、食品或環境檢驗與測定技術領域。更具體地，本發 明涉及三聚氰胺或三聚氰酸的測定方法，還涉及三聚氰胺或三聚氰酸測定 試劑盒或試紙條。背景技術：
三聚氰胺(melamine)簡稱三胺，學名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿醯 胺、三聚醯胺，分子式C3N6H6或C3N3(NH2)3,分子量126.12,其機構式 如下三聚氰胺是一種重要的氮雜環有機化工原料。在強酸或強鹼液中，三 聚氰胺發生水解，胺基逐步地被羥基取代，首先生成三聚氰酸二醯胺，進 一步水解生成三聚氰酸一醯胺，最後生成三聚氰酸。三聚氰胺是一種重要 的化工材料，三聚氰胺與醛反應製成樹脂，三聚氰胺樹脂是一種多種用途 的材料，防火耐熱且有很高的穩定性，是建築業中常用的防火材料，並用 於生產塑料、廚房用具、防火纖維、商業濾膜、膠水和阻燃劑。三聚氰胺 不是食品、飼料的生產原料，也不是國家允許使用的食品、伺料添加物。早在2007年3月美國因寵物飼料致貓狗死亡而大量召回被三聚氰胺 汙染的寵物甸料，研究人員發現，這些召回的寵物食品在其小麥谷蛋白添 加物中含有較高濃度的三聚氰胺。美國食品藥品管理局調查顯示，在召收 的寵物食品、死亡動物的尿液晶體和腎臟細胞中都發現有三聚氰胺。蛋白質主要由胺基酸組成。蛋白質平均含氮量約16%,而三聚氰胺的含氮量約66%。目前釆用的蛋白質測定方法"凱氏定氮法"是通過測定 樣品中的含氮量來確定蛋白質含量的。由於現有食品和飼料蛋白質含量測 定方法存在的這種缺陷，由於在植物蛋白粉和飼料中使測定蛋白質含量增 加一個百分點，使用三聚氰胺的成本只是實際蛋白原料的1/5，於是一些 人有意將三聚氰胺用作食品和飼料添加劑，以便在食品和飼料質量檢測中 抬高蛋白質含量，欺騙國家質檢部門和消費者。三聚氰胺是一種白色結晶粉末，沒有氣味和味道，所以摻雜後不易被 發現。目前檢測三聚氰胺的方法有氣相色譜-質譜法、超高效液相色譜-電噴 霧串聯質譜法、反相高效液相色譜法、高效液相色譜-二極體陣列法、高 效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-四極杆質譜聯用、固相萃取與高效 液相色譜聯用、液相色譜串聯質譜法(LC-MS),測試成本高昂，測試速度 較慢。但目前還沒有釆用酶法測定三聚氰胺或三聚氰酸的方法。因此，本 發明人經過大量的研究工作，終於作出了本發明。
發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種三聚氰胺的測定方法，該方法靈敏度高、精 確度好，線形範圍寬廣，專一性好，測試速度快速、測試成本低廉、穩定 期長，適於廣泛地推廣應用。本發明的目的是提供 一種三聚氰胺檢測試劑盒或試紙條。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的三聚氰胺測定方法是一種將強酸水解、酶聯法(Couple Reaction)與其他物理法、化學法、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶循環擴增比色法(Enzymatic Recycling Method)組合而成 的一種三聚氰胺或三聚氰酸(cyanuric acid)測定方法。為了表述簡便起見，除非另外特別地指出，在本文中提到三聚氰胺時，實際上它應該理解既是三聚氰胺，也是三聚氰酸。本發明涉及三聚氰胺的測定方法，其特徵在於該方法的步驟如下A、樣品準備三聚氰胺在強酸的作用下可以進行水解反應，其三聚氰胺中的胺基逐 步地被羥基取代，生成相應的三聚氰酸二醯胺、三聚氰酸一醯胺，最後變 成三聚氰酸。因此，如果待測定物是三聚氰酸，則無需該處理步驟。A-l)標準樣品的製備將1-3重量份三聚氰胺溶於3-9重量份含有10-40重量％無機強酸與 10-40重量％硫酸氫鈉的溶液中，然後，讓該混合溶液在溫度150-17(TC 下加熱3-5小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後進行離心分離得到上清液， 往其中加入與所述無機強酸同等當量的無機強鹼，中和在其溶液中存在的 無機強酸，再將三聚氰胺濃度調整到200ppm，得到的溶液作為標準樣品；A-2)樣品處理稱取1-3重量份待測定樣品，溶於3-9重量份含有10-40重量％無機 強酸與10-40重量％硫酸氫鈉的溶液中，然後，讓該混合溶液在150-170。C 下加熱3-5小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後進行離心得到上清液，往 其中加入與所述無機強酸同等當量的無機強鹼，中和在其溶液中存在的無 機強酸，這樣得到的上清液作為待測樣品；A-3)空白的製備含有10-40重量％無機強酸與10-40重量％硫酸氫鈉的溶液在溫度 150-17(TC下加熱3-5小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後進行離心得到 的上清液，往其中加入與所述無機強酸同等當量的無機強鹼，中和其溶液 中存在的無機強酸，這樣得到的上清液作為空白樣品，其三聚氰胺濃度為 Oppm。在本發明中，所述的含有10-40重量％無機強酸與10-40重量％硫酸 氫鈉的溶液可以用55重量％無機強酸代替。 所述的無機強酸選自硫酸、硝酸或鹽酸。優選地，所述的無機強酸是硫酸。所述的無機強鹼選自氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫氧化鋰。 優選地，所述的無機強鹼是氫氧化鈉。 B、三聚氰酸酶解在步驟A)得到的標準樣品、待測樣品、空白樣品在下述條件下分別進行三聚氰酸的酶解反應B-l )該酶解反應介質含有緩衝液 80-700mmol/L穩定劑 0.01 - 7mol/L三聚氰酸醯胺水解酶 1000 - 80000U/L雙縮脲醯胺水解酶 1000 - 80000U/L脲基甲酸水解酶 1000 - 80000U/L上述這些試劑組成單劑試劑，在實際操作中稱之試劑2;這些試劑可以 是粉末狀的，在使用前加水進行溶解製成溶液；也可以配製成液體試劑， 直接使用。根據本發明，在所述的三聚氰酸酶解反應中，使用的緩衝液應該是能 夠使其三聚氰酸酶解介質的pH在其水解反應期間基本保持在6.5 - 8.5的 溶液。如果該pH高於8.5或pH低於6.5,則酶活性達不到預期的活性效 果，需要添加更多的介質與酶，才有可能達到預期的活性效果。所述的緩衝液選自三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝 液、三乙醇胺緩衝液、2-氨基-2-甲基-l-丙醇緩衝液或雙甘氨肽緩衝液。優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸 (Tris-HCl)緩衝液、磷酸鹽緩衝液或三乙醇胺緩衝液的緩衝液。更優選地，所述的緩衝液例如選自三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸 (Tris-HCl)緩衝液或磷酸鹽緩衝液的緩衝液。在本發明的意義上，所述的穩定劑應該理解是一種能保護試劑中的介 質(底物)與酶不會隨著時間推移而改變其性質，進而失去活性的物質， 它會使得試劑具備很長的活性壽命，通常長達數月，甚至一、二年。如果沒有所述的穩定劑，則試劑的活性在溶液中只能維持數小時，頂多數十小 時，就會失去活性而不再具備檢測性能。在本發明中，所述的穩定劑使用量是0.01-7mol/L。如果所述的穩定劑使用量不夠，則試劑活性的壽命就 會縮短；如果所述的穩定劑使用量過高，則會增加成本。在本發明中，所述的穩定劑是本技術領域的技術人員熟知的，例如是 一種或多種選自氯化鈉、丙二醇、乙二醇、甘油、硫基乙醇、葡萄糖、腺 苷二磷酸、牛血清白蛋白、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸或穀氨酸鈉等的穩定劑。優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自丙二醇、甘油、葡萄糖、 牛血清白蛋白、氯化鈉的穩定劑。更優選地，所述的穩定劑例如是一種或多種選自甘油、牛血清白蛋白 的穩定劑。B-2)所述的三聚氰酸酶解進行下述三個酶催化反應 三聚氰酸依次在三聚氰酸醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶與脲基甲酸水解酶的作用下最後得到二氧化碳(碳酸氫根；HCOf )和氨(胺；NH4+)，其反應如下三聚氰酸+水 三聚氰酸醯胺水解酶雙縮脲+ 二氧化碳 雙縮脲+水雙縮脲醯胺水解酶脲基甲酸+氨 脲基甲酸+水脲基甲酸水解酶2二氧化碳+2氨 三聚氰酸在三聚氰酸醯胺水解酶(cyanuric acid amidohydrolase; EC 3.5.2.15)的作用下生成雙縮脲和二氧化碳(碳酸氫根；HC03—),而雙 縮脲在雙縮脲醯胺水解酶(biuret amidohydrolase; EC3.5丄84)的作用下 生成脲基甲酸和氨(胺；NH4+),接著脲基甲酸在脲基甲酸水解酶 (allophanate hydrolase; EC3.5.1.54)的作用下生成二個二氧化碳(碳酸 氫根；HC03—)和二個氨(胺；NH4+)，因此，三聚氰酸經過三聚氰酸 醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶、脲基甲酸水解酶的酶解作用後， 一個三 聚氰酸分子可以生成三個二氧化碳(HC03—)分子及三個氨(NH4+)分 子。這樣，可以將測試靈敏度提高6倍。B-3)反應溫度36-38。C,反應時間8-12分鐘。 C、 二氧化碳與氨的定量測定釆用比色法，可以通過檢測三聚氰酸酶解產物(二氧化碳及氨)的含量 測定三聚氰胺或三聚氰酸的含量。測定二氧化碳與氨的方法有很多，大致可以分成二類 一類是儀器測 試法，目前直接測試三聚氰胺或三聚氰酸的方法例如有HPLC、 GC、 MS 及其聯用法，這些方法比釆用化學法直接測定三聚氰胺或三聚氰酸的靈敏 度提高三倍,但是過程繁瑣；目前巿場有多種儀器測定二氧化碳及氨含量, 它們主要用於臨床測試及大氣監測；另 一類是離子選擇性電極法、電位法、 電化學法、離子交換技術、比色法等。這些方法的靈敏度都太低，即使靈 敏度提高三倍，也無法測定微量三聚氰胺或三聚氰酸。酶法測定二氧化碳 或氨有許多方法，目前巿場也有測定二氧化碳或氨的相應產品出售，本發 明人及申請人提出多項專利申請，其中涉及二氧化碳的有34項發明專利 申請，涉及氨的有37項發明專利申請。對於微量三聚氰胺或三聚氰酸的 測定，這些現有方法因其含量低還難以滿足其要求。為此本發明人經過大量研究，獲得一種靈敏度、精密度與再現性均好、 專一性與準確性高的微量三聚氰胺或三聚氰酸的測定方法。本發明是釆用酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method )、酶比色 法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction ) 技術，通過測定煙醯胺輔酶或輔酶在340nm波長處的吸光度變化測定二 氧化碳及氨的濃度；或通過生成丐l嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色 原(Quioneimine dye )在400—700nm波長處的吸光度上升測定二氧化碳 及氨濃度的方法，從而測定微量三聚氰胺或三聚氰酸的含量。在該方法中，三聚氰胺與三聚氰酸水解時生成的氨和二氧化碳是採用 以下述反應為基礎的測定方法測定的(1)氨+ a-酮戊二酸+還原型輔酶穀氨酸脫氫酶穀氨酸+輔酶+水(2) 穀氨酸+水+氧穀氨酸氧化酶氨+ a-酮戊二酸十過氧化氫(3) 二氧化碳+乙醯輔酶A +還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶(4) 丙酮酸+磷酸根+氧+水丙酮酸氧化酶乙醯磷酸+二氧化碳+過氧化氫(5) 2過氧化氫+2還原型輔酶NADH過氧化物酶 2輔酶+4水由前面所述可知， 一個三聚氰酸分子可以生成三個二氧化碳 (HC03一)及三個氨(NH4+)。 一個銨(胺)離子可以將二個還原型輔 酶分子氧化成一個輔酶分子，一個二氧化碳分子也可以將二個還原型輔酶 分子氧化成一個輔酶分子；通過上述酶反應， 一個三聚氰酸分子可以將 12個還原型輔酶分子氧化成輔酶，因此提高靈敏度12倍，加上上述的酶 循環擴增，氨離子及二氧化碳重複循環作用，5分鐘可以循環數10次以 上，靈敏度總共可以提高至少數百倍，因此，這種方法具有非常高的靈敏 度。在測定氨時，使用穀氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4丄2; EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4 )酶(偶)聯穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11)、 NADH過氧化物酶(NADH peroxidase; EC l.ll丄l; EC1.11丄2)。所述的穀氨酸脫氫酶作為作用酶，將氨酶解成谷 氨酸。所述的穀氨酸氧化酶作為循環酶將穀氨酸再次轉化成氨，使氨不斷 地被重複循環利用。穀氨酸氧化酶又可以作為作用酶，在酶解穀氨酸時同 時產生過氧化氫。穀氨酸脫氫酶作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)；NADH過氧化物 酶也作為顯色酶，在過氧化氫的作用下，也將還原型輔酶(在340nm處 有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)；從而能夠通過測定 還原型輔酶在340nm處吸光度的下降速率(程度)；利用比色法，與標準 品吸光度的下降速率(程度)相比可以計算出氨的含量。測定二氧化碳時，使用丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )酶(偶)聯的丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3 )、 NADH 過氧化物酶(NADHperoxidase; EC 1.11.1.1; EC 1.11.1.2)。所述的丙酮 酸脫氫酶作為作用酶，將二氧化碳酶解成丙酮酸。丙酮酸氧化酶作為循環 酶再將這種丙酮酸轉變成二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重複循環利用。 丙酮酸氧化酶又可以作為作用酶，在酶解丙酮酸時也同時產生過氧化氫。 丙酮酸脫氫酶作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化 成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)；NADH過氧化物酶也作為顯色酶， 在過氧化氫的作用下，也將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成 為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)；從而能夠通過測定還原型輔酶在340nm 處吸光度的下降速率(程度)；利用比色法，與標準品吸光度的下降速率 (程度)相比可以計算出二氧化碳的含量。通過大量實驗研究表明，在測定樣品中三聚氰胺與三聚氰酸含量時， 應該在下述測定條件下進行以達到比色法測定二氧化碳(碳酸氫根； HCO;T)及氨(銨(胺)；NH4+)所要求的準確性與再現性。製備試劑1:分別移取或稱取下述緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、 穀氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、還 原型輔酶、(x-酮戊二酸、乙醯輔酶A,然後將它們混合均勻，使用時用水 將它們溶解得到 一種溶液，它們的濃度分別是50 — 500 mmol/L緩衝液 穩定劑穀氨酸脫氫酶穀氨酸氧化酶NADH過氧化物酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸氧化酶還原型輔酶a-酮戊二酸0.01-7 mol/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000 - 80000 U/L 1000 - 80000 U/L 0.2 - 0.30 mmol/L 1 一 20 mmol/L乙醯輔酶A 0.5-20mmol/L它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；在實際搡作中將單劑試劑稱之 試劑l，而將雙劑試劑分別稱之試劑1與試劑3;穀氨酸脫氫酶、穀氨酸 氧化酶、NADH過氧化物酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、還原型輔 酶、a-酮戊二酸、乙醯輔酶A在試劑1和試劑3的位置是不限定的。所 述的還原型輔酶選自NADPH、 NADH或thio- NADH。這些試劑可以是 粉狀的，使用前用水溶解得到水溶液；當然，也可以配製成液體試劑直接 使用。然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使這些 試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38。C下在主波長340nm與副波長 405nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行同樣的檢測；標準樣品和空白樣品進行如前面所描述的同樣測定。在本發明中這種測定可以使用在目前巿場上銷售的紫外/可見光分析 儀、半、全自動生化分析儀進行。例如由邁瑞公司以商品名BS300、奧林 帕斯公司以商品名AU400、東芝公司以商品名120、日立公司以商品名 7600、雅培公司以商品名CB8000或貝克曼公司以商品名CX20銷售的全 自動生化分析儀。D、結果數據處理D-l根據前面測定結果按照下式計算樣品中的三聚氰胺含量△A (樣品)—AA (空白)三聚氰胺濃度^- x標準濃度(ppm)△A (標準)-AA (空白)式中△A (待測樣品)表示待測樣品在儀器上的吸光度變化； △A (空白)表示空白品在儀器上的吸光度變化； △A (標準)表示標準品在儀器上的吸光度變化。 D-2測定線性範圍試驗從B-5-l試驗結果中，製備1200ppm標準品，再按比例稀釋，測試結果呈線性，R值應符合1200ppm線性的規定。 D-3靈敏度試驗 按校準結果計算。 D-4精密度試驗將B-5-3試驗結果按下式計算出精密度(CV):S=《(X—XilVn-l式中X -試驗結果平均值； Xi -各次試驗結果； n -試驗次數.N210 CV=S/X* 100% D-5相對極差試驗將B-5-3試驗結果按下式計算相對極差 A IT- T(x + y + Z)，x^^第一lfb各次試驗結果平均值 7^第二批各次試驗結果平均值 Z~—第三批各次試驗結果平均值U——為X， Y, Z中的最大值V——為X， Y， Z中的最小值每批試樣數取nS3根據本發明的另一種優選實施方式，三聚氰胺或三聚氰酸水解時生成 的氨和二氧化碳可以釆用以下述反應為基礎的測定方法進行測定(1)氨+過氧化氫+ a-酮戊二酸穀氨酸氧化酶 穀氨酸+氧+水(2) 穀氨酸+水+輔酶 穀氨酸脫氫酶 氨+01-酮戊二酸+還原型輔酶(3) 二氧化碳+過氧化氫+乙醯輔酶A 丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧(4) 丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+乙醯輔酶A+還原型輔酶 由前面的反應可知，一個三聚氰酸分子可以生成三個二氧化碳分子與 三個氨分子。 一個氨離子可以將一個輔酶分子還原成一個還原型輔酶分 子， 一個二氧化碳分子也可以將一個輔酶分子還原成一個還原型輔酶分 子；通過上述這些酶反應， 一個三聚氰酸分子可以將6個輔酶分子還原成 還原型輔酶，因此可以提高靈敏度6倍，再加上酶循環擴增，氨離子及二 氧化碳重複循環作用，在5分鐘內可以循環數10次以上，因此，該靈敏 度可提高至少上百倍。在測定氨時，使用穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11),酶(偶)聯穀氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4丄3; EC 1.4丄4)。穀氨酸氧化酶作為作用酶，將氨酶解生成穀氨 酸。穀氨酸脫氫酶作為循環酶將穀氨酸再次轉變成氨，使氨不斷地被重複 循環利用。穀氨酸脫氫酶也作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收 峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)；從而能夠通過測定還 原型輔酶在340nm處吸光度的上升速率(程度)；利用比色法，與標準品 吸光度的上升速率(程度)相比可以計算出氨的含量。在測定二氧化碳時，使用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6) 酶(偶)聯丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )。丙酮酸氧 化酶作為作用酶將二氧化碳酶解生成丙酮酸。丙酮酸脫氫酶作為循環酶將 丙酮酸再次轉變成二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重複循環利用。丙酮酸 脫氫酶也作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)；從而能夠通過測定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的速率(程度)；利用比色法，與標準品吸光度的上升速率(程度)相比可以計算出二氧化碳的含量。在該實施方式中使用前面描述的試劑2,而需要製備下述試劑1。試劑1的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、谷 氨酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶、a-酮戊二酸、過氧化 氫、乙醯輔酶A、輔酶A,然後將它們混合均勻，使用時再用水將它們溶 解得到一種溶液，它們的濃度分別是緩衝液 50- 500mmol/L穩定劑穀氨酸脫氫酶 穀氨酸氧化酶 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶 輔酶a-酮戊二酸過氧化氫 乙醯輔酶A 輔酶A0.01 - 7mol/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.5 - 2.5 mmol/L 1 _ 20 mmol/L 1 _ 20 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；在實際操作中將單劑試劑稱之 試劑l,而將雙劑試劑分別稱之試劑1與試劑3;穀氨酸脫氫酶、穀氨酸 氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶、a-酮戊二酸、過氧化氫、 乙醯輔酶A、輔酶A在試劑1和試劑3中的位置是不限定的。所述的還 原型輔酶選自NADP+、 NAD+或thio-NAD+。這些試劑可以是粉狀的，使 用前用水溶解得到水溶液；當然，也可以配製成液體試劑直接使用。然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使這些 試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38。C下在主波長340nm與副波長 405nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行同樣的檢測；其數據處理如前面所描述的。根據本發明的第三種優選實施方式，三聚氰胺或三聚氰酸水解時生成的氨和二氧化碳可以釆用以下述反應為基礎的測定方法進行測定(1) 氨+穀氨酸+腺苷三磷酸穀氨醯胺合成酶穀氨醯胺+腺苷二磷酸+磷酸根(2) 磷酸根+腺苷二磷酸+草酖乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳(3) 二氧化碳+過氧化氫+乙醯輔酶A丙酮酸氧化酶丙酮酸+輔酶A+氧(4) 2丙酮酸+ 2輔酶A + 2輔酶丙酮酸脫氫酶 2二氧化碳+2乙醯輔酶A + 2還原型輔酶 由前面的反應可知，一個三聚氰酸分子可以生成三個二氧化碳分子與 三個氨分子。 一個氨離子可以將一個輔酶分子還原成一個還原型輔酶分 子， 一個氨離子還可以生成二個二氧化碳分子，因此會生成9個二氧化碳分子； 一個二氧化碳分子還可以將一個輔酶分子還原成還原型輔酶；通過上述這些酶反應， 一個三聚氰酸分子可以將12個輔酶分子還原成還原型 輔酶，提高靈敏度12倍，加上酶循環擴增，氨離子及二氧化碳重複循環 作用，在5分鐘內可以循環數10次以上，，因此，該靈敏度可提高至少數 百倍。在測定氨時，使用穀氨醯胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2 )， 酶(偶)聯丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、丙酮酸脫氫酶 (pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)。穀氨醯胺合成酶將氨酶解生成 磷酸根。丙酮酸羧化酶在腺苷二磷酸及草醯乙酸作用下，將磷酸根酶解生成丙酮酸與二氧化碳；丙酮酸脫氫酶作為顯色酶，在丙酮酸作用下，將輔 酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)； 從而能夠通過測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速率(程度)；利 用比色法，與標準品吸光度的上升速率(程度)相比可以計算出氨的含在測定二氧化碳時，使用丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6) 酶(偶)聯丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )。丙酮酸氧化酶作為作用酶將二氧化碳酶解生成丙酮酸。丙酮酸脫氫酶作為循環酶， 再將丙酮酸轉變成二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重複循環利用。丙酮酸脫氫酶也作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原 型輔酶(在340nm處有吸收峰)；從而能夠通過測定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的速率(程度)；利用比色法，與標準品吸光度的上升速率 (程度)相比可以計算出二氧化碳的含量。在該實施方式中使用前面描述的試劑2，而需要製備下述試劑1。 試劑l的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨醯胺合成酶、 丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、穀氨酸脫氫酶、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷 酸、腺苷二磷酸、草醯乙酸、過氧化氫、乙醯輔酶A、輔酶A，然後將它 們混合均勻，使用時再用水將它們溶解得到 一種溶液，它們的濃度分別是50 - 500 mmol/L 0.01 -7mol/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000 - 80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.5 - 2.5 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5-5 mmol/TL 1 - 20 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5-5 mmol/L 緩衝液不得使用磷酸緩衝液。它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；在實際操作中將單劑試劑稱之 試劑1，而將雙劑試劑分別稱之試劑1與試劑3;穀氨醯胺合成酶、丙酮緩衝液 穩定劑穀氨醯胺合成酶丙酮酸羧化酶丙酮酸氧化酶丙酮酸脫氫酶輔酶穀氨酸腺苷三磷酸腺苷二磷酸草醯乙酸過氧化氫乙醯輔酶A輔酶A酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、 腺苷二磷酸、草醯乙酸、過氧化氫、乙醯輔酶A、輔酶A在試劑1和試劑3中的位置是不限定的。所述的還原型輔酶選自NADP+、 NAD+或thio-NAD+。這些試劑可以是粉狀的，使用前用水溶解得到水溶液；當然，也 可以配製成液體試劑直接使用。然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使這些 試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38'C下在主波長340nm與副波長 405nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行同樣的檢測；其數據處理如前面所描述的。根據本發明的第四種優選實施方式，三聚氰胺或三聚氰酸水解時生成 的氨和二氧化碳可以釆用以下述反應為基礎的測定方法進行測定(1) 氨+ a-酮戊二酸+還原型輔酶穀氨酸脫氫酶穀氨酸+輔酶+水(2) 穀氨酸+水+氧穀氨酸氧化酶氨+01-酮戊二酸+過氧化氫(3) 二氧化碳+乙醯輔酶A +還原型輔酶丙酮酸脫氫酶丙酮酸+輔酶A+輔酶(4) 輔酶A+丙酮酸+氧丙酮酸氧化酶過氧化氫+ 二氧化碳+乙醯輔酶A(5) 2過氧化氫+ 2還原型色原組合過氧化物酶2吲嗒胺色原或醌亞胺色原+ 2水 由前面的反應可知，一個三聚氰酸分子可以生成三個二氧化碳分子與 三個氨分子。 一個氨離子可以生成一個過氧化氫分子， 一個二氧化碳分子 也可以生成一個過氧化氫分子；通過過氧化物酶的作用，過氧化氫將還原 型色原組合(無色)氧化成有顏色的吲嗒胺色原或醌亞胺色原，通過上述 這些酶反應， 一個三聚氰酸分子可以生成6個過氧化氫分子，提高靈敏度 6倍，加上酶循環擴增，氨離子與二氧化碳重複循環作用，在5分鐘內可 以循環10次以上，因此，該靈敏度可提高至少上百倍。吲嗒胺色原或醌亞胺色原的摩爾消光係數是12-20,比還原型輔酶的摩爾消光係數6.2 高2倍以上，因此本方法的靈敏度還要比上述三個方法都要高。在測定氨時，使用穀氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase; EC 1.4.1.2; EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4 )酶(偶)聯穀氨酸氧化酶(Glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11 )、過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11.1.7)。穀氨 酸脫氫酶作為作用酶將氨酶解生成穀氨酸。穀氨酸氧化酶作為循環酶，再 將穀氨酸轉變成氨，使氨不斷地被重複循環利用，因此連續不斷地產生過 氧化氫。過氧化物酶作為顯色酶，通過與過氧化氫的作用，使無色的還原 型色原體組合氧化成有色染料(吲嗒胺色原或醌亞胺色原)，從而可以使 用可見光分析儀器，在400 - 700nm (根據還原型色原體組合的不同而定) 波長處測定染料一吲嗒胺色原(Indamine dye )或醌亞胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收上升速率(程度),；利用比色法，與標準品吸 光度的上升速率(程度)相比可以計算出氨的含量。在測定二氧化碳時，使用丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51 )酶(偶)聯丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、過氧化 物酶(peroxidase ; EC Lll丄7)。丙酮酸脫氫酶作為作用酶將二氧化碳 酶解生成丙酮酸。丙酮酸氧化酶作為循環酶，再將丙酮酸轉變成二氧化碳， 使二氧化碳不斷地被重複循環利用，因此連續不斷地產生過氧化氫。過氧 化物酶作為顯色酶，通過與過氧化氫的作用，使無色的還原型色原體組合 氧化成有色染料(吲嗒胺色原或醌亞胺色原)，從而可以使用可見光分析 儀器，在400—700nm (根據還原型色原體組合的不同而定)波長處測定 染料一吲嗒胺色原(Indamine dye )或醌亞胺色原(Quioneimine dye )— 含量高低的光吸收上升速率(程度)；利用比色法，與標準品吸光度的上 升速率(程度)相比可以計算出二氧化碳含量。在該實施方式中使用前面描述的試劑2，而需要製備下述試劑1。試劑1的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、谷 氨酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、還原型輔酶、 a-酮戊二酸、乙醯輔酶A、輔酶A、還原型色原體組合，然後將它們混合均勻，使用時再用水將它們溶解得到一種溶液，它們的濃度分別是:緩衝液 穩定劑穀氨酸脫氫酶 穀氨酸氧化酶 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶還原型輔酶a-酮戊二酸 乙醯輔酶A 輔酶A還原型色原體組合50- 500 mmol/L 0.01 -7mol/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.1 -2mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L 0.1-20 mmol/L它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；在實際操作中將單劑試劑稱之 試劑1，而將雙劑試劑分別稱之試劑1與試劑3;穀氨酸脫氫酶、穀氨酸 氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、還原型輔酶、a-酮戊二酸、乙醯輔酶A、輔酶A、還原型色原體組合在試劑1和試劑3 中的位置是不限定的。所述的還原型輔酶選自NADPH、 NADH或thio-NADH。在本發明中，所述的還原型色原體組合(Chromogen)可以選自如下 (但不僅限於)組合 3-甲基-2-苯蓬哇酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯瘞唑酮腙N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯瘞唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯P塞唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3_甲基_2-苯蓬唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯謹哇酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯蓬哇酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯蓬哇酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯鬼唑酮腙 雙甲基苯胺3-甲基-2-苯虔唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯嚷哇酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯。塞哇-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯瘞唾酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-蓬p定腔4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯卩塞哇-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺。然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使這些 試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38。C下在主波長400-700nm與副波 長410-800nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行同樣其數據處理如前面所描述的。所有這些試劑可以是粉狀的，使用前用水溶解得到水溶液；當然， 也可以配製成液體試劑直接使用。本發明還涉及一種三聚氰胺檢測試劑盒，其特徵在於它含有試劑1:緩衝液50 _ 500mmol/L、穩定劑0.01 - 7 mol/L、穀氨酸脫氫 酶1000 - 80000 U/L、穀氨酸氧化酶1000 - 80000 U/L、 NADH過氧化物 酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脫氫酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸氧化酶1000 -80000 U/L、還原型輔酶0.2 - 0.30 mmol/L、 a-酮戊二酸1 - 20 mmol/L、 乙醯輔酶A0.5 - 20 mmol/L;上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑；試劑2:緩衝液80-700mmol/L、穩定劑0.01 - 7mol/L、三聚氰酸醯 胺水解酶1000- 80000U/L、雙縮脲醯胺水解酶1000-80000 U/L、脲基 甲酸水解酶1000 _ 80000U/L。根據本發明的一種優選實施方式，一種三聚氰胺檢測試劑盒的特徵在 於它含有試劑1:緩衝液50 - 500 mmol/L、穩定劑 0.01 - 7 mol/L、穀氨酸脫 氫酶1000 - 80000 U/L、穀氨酸氧化酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脫氫酶 1000- 80000 U/L、丙酮酸氧化酶1000- 80000 U/L、輔酶 0.5 - 2.5 mmol/L、 a-酮戊二酸1 -20mmol/L、過氧化氫1 - 20mmol/L、乙醯輔酶 A0.5-5mmol/L、輔酶A 0.5-5 mmol/L;上述試劑可以組成單劑試劑 或雙劑試劑；試劑2:緩衝液80 — 700mmol/L、穩定劑0.01 — 7mol/L、三聚氰酸醯 胺水解酶1000- 80000U/L、雙縮脲醯胺水解酶1000 - 80000U/L、脲基 甲酸水解酶1000 - 80000U/L。根據本發明的另一種優選實施方式，一種三聚氰胺檢測試劑盒的特徵 在於它含有試劑1:緩衝液50 - 500 mmol/L、穩定劑 0.01 - 7 mol/L、穀氨醯胺 合成酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸羧化酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸氧化 酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脫氫酶1000 - 80000 U/L、輔酶0.5-2.5 mmol/L、穀氨酸1 - 20 mmol/L、腺苷三磷酸0.5 - 5 mmol/L、腺苷二磷酸0.5-5mmol/L、草醯乙酸1 _ 20 mmol/L、過氧化氫1 - 20 mmol/L、乙醯 輔酶A0.5-5mmol/L、輔酶A 0.5 - 5 mmol/L;其中所述的緩衝液是非磷 酸鹽緩衝液；上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑；試劑2:緩衝液80 — 700mmol/L、穩定劑0.01 - 7mol/L、三聚氰酸醯 胺水解酶1000-80000U/L、雙縮脲醯胺水解酶1000 - 80000 U/L、脲基 甲酸水解酶1000 - 80000U/L。根據本發明的另一種優選實施方式，一種三聚氰胺檢測試劑盒的特徵 在於它含有試劑1:緩衝液50 - 500 mmol/L、穩定劑0.01 -7 mol/L、穀氨酸脫 氫酶1000 - 80000 U/L、穀氨酸氧化酶1000 - 80000 U/L、丙酮酸脫氫酶 1000 - 80000 U/L、丙酮酸氧化酶1000 - 80000 U/L、過氧化物酶1000 -80000 U/L、還原型輔酶0.1 - 2mmol/L、 a-酮戊二酸1 - 20 mmol/L、乙醯 輔酶A0.5-5mmol/L、輔酶A 0.5 - 5 mmol/L、還原型色原體組合0.1-20 mmol/TL;上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑；其中所述的還原型色原體組 合如在前面所描述的。試劑2:緩衝液80-700mmol/L、穩定劑0.01 - 7mol/L、三聚氰酸醯 胺水解酶1000- 80000U/L、雙縮脲醯胺水解酶1000-80000 U/L、脲基 甲酸水解酶1000 _ 80000U/L。另外，在本發明中，還可以將上述這些試劑盒的試劑按照其試劑盒 組成吸附在試紙條上，乾燥後得到三聚氰胺檢測試劑條，它們可以作為快 速檢測之用。本發明的測定方法可以用於測定奶粉、鮮奶、奶製品或含奶產品等 各種產品中的三聚氰胺或三聚氰酸，還可以用於測定鮮牛、羊、豬、雞肉 以及各種蛋及其它們的製品中的三聚氰胺或三聚氰酸。[有益效果]發明的方法測定速度快，每小時可測試120—3200個樣品，每毫升試 劑可測試4一8個樣品；靈敏度高，可測到0.05ppm;靈敏度可達到0.0015± 0.0005A/ppm、精確度可達到(誤差《％),再現性好，測定成本低(每 亳升試劑人民幣30-120元；每條試紙條成本0.5-2元)，因而具有廣泛應 用的前景。
具體實施方式實施例l:奶粉中三聚氰胺的測定A、 樣品預處理1) 標準樣品稱2mg純三聚氰胺溶於30亳升含有35重量％硫酸與35重量％硫酸 氫鈉的溶液中，在16(TC下加熱4小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後在 室溫條件下進行離心，得到的上清液加入8亳升與所述硫酸同等當量的氫 氧化鈉中和在該溶液中存在的硫酸，再用蒸餾水將該溶液調整到最終體積 40亳升；標準樣品的三聚氰胺濃度為200ppm。2) 待測樣品lg奶粉溶於3毫升含有35重量％硫酸與35重量％硫酸氫鈉的溶液 中，在16(TC下加熱4小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後在室溫條件下 進行離心，得到的上清液加入0.8毫升與所述硫酸同等當量的氫氧化鈉中 和在該溶液中存在的硫酸，再用蒸餾水將該溶液調整到最終體積4毫升； 該溶液作為樣品待測。3) 空白樣品30亳升含有35%重量°/。硫酸與35重量％硫酸氫鈉的溶液，在160°C 下加熱4小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後在室溫條件下進行離心，得 到的上清液加入8亳升與所述硫酸同等當量的氫氧化鈉中和在該溶液中 存在的硫酸，再用蒸餾水將該溶液調整到最終體積40亳升；空白樣品的 三聚氰胺濃度為Oppm。B、 樣品的測定測定樣品使用日立7080全自動生化分析儀。 B-l、該全自動生化分析儀主要操作參數如下 計量方法 兩點終點法測試計量時間點:19,31主波長:340副波長:405反應溫度:37樣品體積:20試劑1 ( Rl )體積:200試劑2 ( R2 )體積:25試劑3 ( R3 )體積:25反應方向:負標準樣品1:0標準樣品2:200B-2、試劑1的製備分別移取或稱取所述的磷酸緩衝液(pH 8.0)、還原型輔酶、a-酮戊 二酸，然後將它們混合起來，再用水溶解得到試劑1溶液，它們在該溶液 中的濃度分別是100mmol/L、 0.32mmol/L、 15mmol/L。B-3、試劑2的製備分別移取或稱取所述的磷酸緩衝液(pH 8.0)、甘油、三聚氰酸醯胺 水解酶、雙縮脲醯胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然後將它們混合起來，再 用水溶解得到試劑2溶液，它們在該溶液中的濃度分別是10Ommol/L、 3mol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L。B-4、試劑3的製備分別移取或稱取磷酸緩衝液(pH 8.0)、甘油、穀氨酸脫氫酶、穀氨 酸氧化酶、NADH過氧化物酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、乙醯輔 酶A,然後將它們混合起來，再用水溶解得到試劑3溶液，它們在該溶液 中的濃度分別是10Ommol/L、 3mol/L、 60000mmol/L、 50000U/L、 70000U/L、 70000U/L、 50000U/L、 20mmol/L。然後，待測樣品、標準樣品和空白樣品置入儀器進行檢測。B-5得到測定的結果按照說明書中說明的數據處理方法進行處理，其結果如下該奶粉中三聚氰胺含量是4.55ppm 測定線性範圍試驗表明R值符合1200ppm線性的規定。 靈敏度達到0.0018/ppm。 精密度是2% 相對極差是3%。實施例2:液態奶中三聚氰胺的測定A、 樣品預處理與上述實施例1描述的相同，但使用的樣品是液態奶。B、 樣品的測定樣品的測定使用全自動生化分析儀。B-l、該儀器的主要參數與前面實施例1描述的相同，除了反應方向 改為正。B-2、試劑1的製備分別移取或稱取所述的Tris-鹽酸緩衝液(pH8.2)、輔酶、過氧化氫、 a-酮戊二酸，然後將它們混合起來，再用水溶解得到試劑1溶液，它們在 該溶液中的濃度分別是10Ommol/L、 7mmol/L、 20mmol/L、 15mmol/L。B-3、試劑2的製備與前面實施例1描述的相同。B-4、試劑3的製備分別移取或稱取Tris-鹽酸緩衝液(pH8.2)、甘油、穀氨酸脫氫酶、 穀氨酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶、乙醯輔酶A，然後 將它們混合起來，再用水溶解得到試劑3溶液，它們在該溶液中的濃度分別是10Ommol/L、 3mol/L、 60000U/L、 50000U/L、 70000U/L、 50000U/L、 10 mmol/L 、 10 mmol/L 。B-5、結果數據處理與前面實施例1描述的相同。其結果如下: 該液體奶中三聚氰胺含量是0.87ppm 測定線性範圍試驗表明R值符合1200ppm線性的規定。 靈敏度達到0.0012/ppm。精密度是3% 相對極差是3%。實施例3:麵包中三聚氰胺的測定A、 樣品預處理與前面實施例l描述的相同，但使用的樣品是麵包。B、 樣品的測定樣品的測定在全自動生化分析儀，與前面實施例l描述的相同。 B-l、主要參數與前面實施例2描述的相同。 B-2、試劑1的製備分別移取或稱取所述的Tris-鹽酸緩衝液(pH8.2)、輔酶、穀氨酸、 腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、草醯乙酸、過氧化氫，然後將它們混合起來, 再用水溶解得到試劑1溶液，它們在該溶液中的濃度分別是100mmol/L、 8mmol/L、 20mmol/L 、 1Ommol/L 、 1Ommol/L 、 15mmol/L 、 20mmol/L。B-3、試劑2的製備(三聚氰酸的水解)與前面實施例1描述的相同。B-4、試劑3的製備分別移取或稱取Tris-鹽酸緩衝液(pH8.2)、甘油、穀氨醯胺合成酶、 丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶A、乙醯輔酶A，然 後將它們混合起來，再用水溶解得到試劑3溶液，它們在該溶液中的濃度 分別是10Ommol/L、 3mol/L、 60000mmol/L、 70000U/L、 80000U/L、 80000U/L、 1Ommol/L、 1Ommol/L。B-5、結果數據處理與前面實施例l描述的相同。其結果如下該麵包中三聚氰胺含量是1.52ppm測定線性範圍試驗表明R值符合1200ppm線性的規定。靈敏度達到0.0019/ppm。精密度是2%相對極差是4%。實施例4:奶粉中三聚氰胺的測定 A、樣品預處理與前面實施例1描述的相同，但使用的樣品是奶粉。B、樣品的測定使用常州若諾基儀器有限公司722可見光分光光度計。 B-l、單一試劑的製備分別移取或稱取所述的Tris-鹽酸緩衝液(pH8.0)、甘油、還原型輔 酶、(x-酮戊二酸、4-氨基抗砒、石碳酸、乙醯輔酶A、輔酶A、三聚氰酸 醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶、脲基甲酸水解酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨 酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶，然後將它們混合 起來，再用水溶解得到試劑溶液，它們在該溶液中的濃度分別是 10Ommol/L、 2mol/L、 lmmol/L、 12mmol/L、 2mmol/L、 10mmol/L、 3 mmol/L、 3mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 60000mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 100000U/L。所述的單一試劑1亳升加到分光光度計的恆溫比色皿中，再將0.08 毫升的樣品同樣加入比色皿中，混合均勻，在溫度36-38。C下在波長505nm 處，進行檢測，計量l-5分鐘的吸光度的變化；標準樣品和空白樣品進行B-2、結果數據處理與前述相同。其結果如下 該奶粉中三聚氰胺含量是1.3郵pm 測定線性範圍試驗表明R值符合1200ppm線性的規定。 靈敏度達到0.00n/ppm。 精密度是1% 相對極差是3%。實施例5:液態奶中三聚氰胺的試紙條檢測A、 樣品預處理與前面實施例l描述的相同，但使用的樣品是液態奶。B、 樣品的測定B-l、單一試劑的製備分別移取或稱取所述的Tris-鹽酸緩衝液(pH8.0)、甘油、還原型輔 酶、a-酮戊二酸、4-氨基抗砒、石碳酸、乙醯輔酶A、輔酶A、三聚氰酸 醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶、脲基甲酸水解酶、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶，然後將它們混合 起來，再用水溶解得到試劑溶液，它們在該溶液中的濃度分別是100mmol/L、 2mol/L、 lmmol/L、 12mmol/L、 2mmol/L、 10mmol/L、 3 mmol/L、 3mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 60000mmol/L、 50000U/L、 60000U/L、 50000U/L、 100000U/L。將試紙條侵入溶液中後，乾燥備用， 是為試紙條。將本發明的試紙條侵入液態奶中，立即取出，5分鐘後觀看顏色變化， 比較事前用不同濃度標準樣品做成的比色板，可以得到初步結果。
權利要求
1、一種三聚氰胺的測定方法，其特徵在於該方法的步驟如下A、樣品準備1)標準樣品的製備將1-3份三聚氰胺溶於3-9重量份含有10-40重量％無機強酸與10-40重量％硫酸氫鈉的混合溶液中，然後，讓該混合溶液在溫度150-170℃下加熱3-5小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後進行離心分離得到上清液，往其中加入與所述無機強酸同等當量的無機強鹼，中和在其溶液中存在的無機強酸，再將三聚氰胺濃度調整到200ppm，得到的溶液作為標準樣品；2)樣品預處理稱取1-3重量份待測定樣品，溶於3-9重量份含有10-40重量％無機強酸與10-40重量％硫酸氫鈉的溶液中，然後，讓該混合溶液在150-170℃下加熱3-5小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後進行離心得到上清液，往其中加入與所述無機強酸同等當量的無機強鹼，中和在其溶液中存在的無機強酸，這樣得到的上清液作為待測樣品；3)空白樣品含有10-40重量％無機強酸與10-40重量％硫酸氫鈉的溶液在溫度150-170℃下加熱3-5小時，再將該溶液冷卻到室溫，然後進行離心得到的上清液，往其中加入與所述無機強酸同等當量的無機強鹼，中和其溶液中存在的無機強酸，這樣得到的上清液作為空白樣品，其三聚氰胺濃度為0ppm；B、三聚氰酸酶解在步驟A)得到的標準樣品、待測樣品、空白樣品在下述條件下分別進行三聚氰酸的酶解反應B-1)該酶解反應介質含有緩衝液80-700mmol/L、穩定劑0.01-7mol/L、三聚氰酸醯胺水解酶1000-80000U/L、雙縮脲醯胺水解酶1000-80000U/L、脲基甲酸水解酶1000-80000U/L；B-2)三聚氰酸依次在三聚氰酸醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶與脲基甲酸水解酶的作用下進行酶催化反應，最後得到二氧化碳和氨；B-3)反應溫度36-38℃，反應時間8-12分鐘；C、二氧化碳與氨的定量測定首先，製備試劑試劑1的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、穀氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、還原型輔酶、α-酮戊二酸、乙醯輔酶A，然後將它們混合均勻，使用時用水將它們溶解得到一種溶液，它們的濃度分別是50-500mmol/L、0.01-7mol/L、1000-80000mmol/L、1000-80000U/L、100-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、0.2-0.3mmol/L、1-20mmol/L與0.5-20mmol/L；它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；試劑2的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、三聚氰酸醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然後將它們混合均勻，使用時用水將它們溶解得到一種溶液，它們的濃度分別是80-700mmol/L、0.01-7mol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L；然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使這些試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38℃下在主波長340nm與副波長405nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行同樣的檢測；D、數據處理由主波長340nm的吸光度變化，根據下式計算得到三聚氰胺含量ΔA(標準)-ΔA(空白)式中ΔA(待測樣品)表示待測樣品的吸光度變化；ΔA(空白)表示空白品的吸光度變化；ΔA(標準)表示標準品的吸光度變化。
2、 根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述方法的步 驟C如下C、 二氧化碳與氨的定量測定 首先，製備下述試劑1與試劑2。試劑1的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、 穀氨酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、輔酶、a-酮戊二酸、 過氧化氫、乙醯輔酶A、輔酶A,然後將它們混合均勻，使用時再用 水將它們溶解得到一種溶液，它們的濃度分別是50 - 500mmol/L、0.01 - 7mol/L 、 1000 -訓00mmol/L 、 1000 - 80000mmol/L 、 1000 -80000mmol/L、 1000 - 80000mmol/L、 0.5 — 2.5mmol/L、 1 — 20mmol/L、 1-20mmol/L、 0.5-5 mmol/L、 0.5-5 mmol/L;它們可以組成單劑試劑 或雙劑試劑；試劑2的製備分別移取或稱取所述的緩衝液、穩定劑、三聚氰 酸醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然後將它們混 合起來，再用水將溶解得到一種溶液，它們在該溶液中的濃度分別是 80-700mmol/L、 0.01 — 7mol/L、 1000 — 80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L;然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使 這些試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38。C下在主波長340nm與 副波長405nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行 同樣的檢測。
3、 根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述方法步驟 C如下C、 二氧化碳與氨的定量測定首先，製備下述試劑1與試劑2。試劑1的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨醯胺合成酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸氧化酶、穀氨酸脫氫酶、輔酶、穀氨酸、腺苷三磷酸、腺苷二磷酸、草醯乙酸、過氧化氫、乙醯輔酶A、輔酶 A,然後將它們混合均勻，再用水將它們溶解得到一種溶液，它們的 濃度分別是50500mmol/L、 0.01 - 7mol/L、 1000 _ 80000U/L、 1000 -80000U/L、 1000- 80000U/L、 1000 - 80000U/L、 0.5 - 2.5 mmol/L、 1 - 20mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 1 - 20mmol/L、 1 -20mmol/L、 0.5-5mmol/L、 0.5 - 5mmol/L;其中所述的緩衝液是非 磷酸鹽緩衝液；它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；試劑2的製備分別移取或稱取所述的緩衝液、穩定劑、三聚氰 酸醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然後將它們混 合起來，再用水將溶解得到一種溶液，它們在該溶液中的濃度分別是 80-700mmol/L、 0.01 - 7mol/L、 1000 - 80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L;然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使 這些試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38。C下在主波長340nm與 副波長405nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣品和空白樣品進行
4、根據權利要求1所述的測定方法，其特徵在於所述方法的步 驟C如下C、 二氧化碳與氨的定量測定 首先，製備下述試劑1與試劑2。試劑1的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、穀氨酸脫氫酶、 穀氨酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、還原型 輔酶、a-酮戊二酸、乙醯輔酶A、輔酶A、還原型色原體組合，然後 將它們混合均勻，使用時用水將它們溶解得到一種溶液，它們的濃度 分別是50- 500mmol/L、 0.01-7mol/L、 1000 - 80000mmol/L、 1000-80000mmol/L、 1000 - 80000mmol/L、 1000 - 80000mmol/L、 1000 -80000mmol/L、 0.1-2mmol/L、 1 - 20mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 0.5 - 5mmol/L、 0.1 - 20mmol/L;它們可以組成單劑試劑或雙劑試劑；試劑2的製備分別移取或稱取所述的緩衝液、穩定劑、三聚氰 酸醯胺水解酶、雙縮脲醯胺水解酶和脲基甲酸水解酶，然後將它們混 合起來，再用水將溶解得到一種溶液，它們在該溶液中的濃度分別是 80-700mmol/L、 0.01 - 7mol/L、 1000 - 80000U/L、 1000-80000U/L、 1000-80000U/L;然後，把待測樣品、所述的試劑1和試劑2加到生化分析儀中使 這些試劑濃度達到上述濃度，再在溫度36-38。C下在主波長 400-700nm與副波長410-800nm處分別進行檢測8-12分鐘；標準樣 品和空白樣品進行同樣的檢測。
5、 一種三聚氰J 試劑1:穩定劑穀氨酸脫氫酶 穀氨酸氧化酶 NADH過氧化 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶 還原型輔酶 a-酮戊二酸 乙醯輔酶A其特徵在於它含有50 - 500 mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 0.2 - 0.30 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5 — 20 mmol/L上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑； 試劑2:緩衝液 80-700mmol/L 穩定劑 0.01 _ 7mol/L三聚氰酸醯胺水解酶 雙縮脲醯胺水解酶 脲基甲酸水解酶
6、 一種三聚氰胺檢測試劑盒，試劑1:緩衝液 穩定劑穀氨酸脫氫酶 穀氨酸氧化酶 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶 輔酶a-酮戊二酸乙醯輔酶A 輔酶A1000 - 80000U/L 1000- 80000U/L 1000- 80000U/L。其特徵在於它含有50 - 500 mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000 - 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 0.5 - 2.5 mmol/L 1 - 20 mmol/L 1 - 20 mmol/L 0.5-5 mmol/L 0.5 — 5 mmol/L上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑 試劑2:緩衝液穩定劑三聚氰酸醯胺水解酶雙縮脲醯胺水解酶脲基甲酸水解酶
7、 一種三聚氰胺檢測試劑盒 試劑1:緩衝液穩定劑穀氨醯胺合成酶80 - 700mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000- 80000U/L 1000- 80000U/L 1000-80000U/L。 其特徵在於它含有0-500 mmol/L 0.01 _7mol/L 1000- 80000 U/L丙酮酸羧化酶1000-80000 U/L丙酮酸氧化酶1000 - 80000 U/L丙酮酸脫氫酶1000-80000 U/L輔酶0.5 — 2.5 mmol/L穀氨酸1 _ 20 mmol/L腺苷三磷酸0.5-5 mmol/L翁 黌 變0.5-5 mmol/L草醯乙酸1 _ 20 mmol/L過氧化氫1 _ 20 mmol/L乙醯輔酶A0.5-5 mmol/L輔酶A0.5-5 mmol/L其中所述的緩衝液是非磷酸鹽緩衝液；上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑; 試劑2:緩衝液穩定劑三聚氰酸醯胺水解酶雙縮脲醯胺水解酶脲基甲酸水解酶
8、 一種三聚氰胺檢測試劑盒 試劑1:緩衝液穩定劑穀氨酸脫氫酶 穀氨酸氧化酶 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸氧化酶 過氧化物酶80 - 700mmol/L 0.01 - 7mol/L 1000-80000U/L 1000- 80000U/L 1000- 80000U/L 其特徵在於它含有:50 — 500 mmol/L 0.01-7 mol/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000- 80000 U/L 1000-80000 U/L 1000- 80000 U/L還原型輔酶 0.1-2 mmol/La-酮戊二酸 1-20mmol/L乙醯輔酶A 0.5-5 mmol/L輔酶A 0.5-5 mmol/L還原型色原體組合 0.1 - 20 mmol/L上述試劑可以組成單劑試劑或雙劑試劑；試劑2:緩衝液 80-700mmol/L 穩定劑 0.01 _ 7mol/L三聚氰酸醯胺水解酶 1000 - 80000U/L雙縮脲醯胺水解酶 1000 - 80000U/L脲基甲酸水解酶 1000 - 80000U/L。
9、 根據權利要求1-8中任一項權利要求所述的測定方法，其特 徵在於所述的緩衝液選自三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液、磷酸鹽 緩衝液、三乙醇胺緩衝液、2-氨基-2-甲基-l-丙醇緩衝液或雙甘氨肽緩衝液。
10、 根據權利要求1-8中任一項權利要求所述的測定方法，其特 徵在於所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、丙二醇、甘油、硫基 乙醇、葡萄糖、腺苷二磷酸、牛血清白蛋白、碳酸鈉、葡聚糖、乙二 胺四乙酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、黃素單核苷酸或穀氨酸鈉的穩定劑。
全文摘要
本發明涉及醫學、食品或環境檢驗與測定技術領域。更具體地，本發明涉及一種三聚氰胺或三聚氰酸的測定方法及它的試劑盒或試紙條，其中所述測定方法包括樣品準備、三聚氰酸酶解、二氧化碳與氨的定量測定和數據處理等步驟。本方法測定速度快，靈敏度高，精確度高，再現性好，測定成本低，因而具有廣泛應用的前景。
文檔編號G01N21/31GK101403691SQ200810172189
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月14日 優先權日2008年11月14日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司