一種雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑及其複合冷凍保護劑的製作方法
2023-12-10 10:12:17
專利名稱：一種雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑及其複合冷凍保護劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑及其複合冷凍保護劑。
背景技術：
作為一種經典的益生菌，雙歧桿菌的益生功能已得到了普遍的認識，在功能食品中的應用也得到了廣 泛的關注，其中在乳製品中的應用最具有代表性。但是雙歧桿菌在發酵性能與生產性能上具有種種弊端。 首先，雙歧桿菌對於外界環境極度敏感，在發酵劑的製備過程中經歷低溫，乾燥，等逆境刺激存活率較低; 其次，雙歧桿菌是專性厭氧菌，對發酵條件要求較高，有氧發酵產酸速度低，並且風味較差；在混合菌種 直投發酵劑的製備中菌種比率較難控制，最終產品中的活菌數不穩定。將雙歧桿菌製備成直投發酵劑，作 為輔助發酵劑與傳統的乳酸菌直投發酵劑混合使用，既能保證產品中益生菌的數量，又能保證酸奶的質地 和口味，控制凝乳時間，在功能乳製品中具有廣泛的應用前景。
雙歧桿菌有效應用於乳品發酵主要依賴於發酵劑的製備和保藏技術。目前雙歧桿菌發酵劑的開發主要 集中在冷凍乾燥和噴霧乾燥領域，但是這些技術會引起一系列副作用首先乾燥過程中存活率僅為 30%-40%左右，由於雙歧桿菌對營養和生長條件要求較高，菌體生產成本較高，提高發酵劑製備過程中的 存活率對於生產應用具有重大意義；其次發酵劑製備和保藏過程中持續的低水分活度會引起細胞壁，細胞 膜，DNA等的損傷，很多存活的細胞會失去其生理功能，從而失去益生菌的價值；第三，由於細胞損傷， 菌體耐受逆境的能力以及耐受產品和腸道中氧，酸，膽鹽等的能力也會下降，從而使得達到腸道和在腸道 中定殖的菌數不能保證，這也是雙歧桿菌應用過程中的瓶頸。
深層冷凍技術通常用於組織，細胞，菌種等的保藏，對於生物活性的保持具有良好的效果，保藏時間 長保藏效果好。利用有效保護劑，深層冷凍技術用於發酵劑的製備存活率可接近100%，對於降低雙歧杆 菌的培養成本具有重要作用。常用的深冷保護劑包括二甲基亞碸，聚乙二醇，血清等價格昂貴，且不適宜 用於食品，限制了其在發酵劑生產中的應用。本發明涉及一種食源性的雙歧桿菌深層冷凍發酵劑，用於雙 歧桿菌直投發酵劑的製備，以保證雙歧桿菌在產品中菌數和功能特性。
根據保護劑作用機理的不同，可將保護劑分為滲透性保護劑，半滲透性保護劑和非滲透性保護劑。滲 透性保護劑能滲透到細胞內部，在細胞內充分水和，防止細胞過度脫水，可以降低高鹽對細胞的毒性，也 可以防止細胞內冰晶的形成。半滲透性保護劑可以防止冷凍前細胞的質壁分離，可以集中在細胞壁和細胞 質之間作為一個緩衝層防止冰晶的生長，對細胞膜起到化學保護作用。非滲透性保護劑吸附在微生物細胞 的表面形成一個黏度較高的保護層通過增加溶液的粘度來阻止冰晶的生長，在細胞附近形成無定形結構。各種機理的冷凍保護劑聯合使用對於活菌數和菌株功能的保持有顯著的作用，是製備高效深冷雙歧桿菌發 酵劑的關鍵。
脫脂乳是一種很好的緩衝體系，本身含有大量的蛋白質、糖類等是一種理想的保護介質，可以通過保 護細胞膜的穩定性來阻止細胞損傷，其中的蛋白質也可以作為被膜而對細胞起到保護作用，在脫脂乳中添 加不同的保護劑也可以不同程度的增強其保護效果。
糖類作為半滲透保護劑其作用在於，在冷凍過程中通過形成高粘度的玻璃態物質而對蛋白質起到保護 作用；與蛋白結合作為水的替代物防止蛋白質的變性。除了保護蛋白質的結構和功能外，海藻糖和其它碳 水化合物還可以通過取代脂質的親水頭部來降低細胞膜的相變溫度，從而可以防止細胞膜的相變和由此引 起的細胞膜的破漏。
穀氨酸的冷凍保護作用是保護劑的氨基和微生物蛋白質的羧基結合從而起到對蛋白質的穩定作用，並 且穀氨酸還可能提高細胞中的固定水分。
雙歧桿菌是嚴格厭氧菌發酵劑，製備過程中氧的脅迫會影響菌體的存活和活力，在發酵劑的組成中添 加抗氧化劑對雙歧桿菌的菌數和活力保持會有顯著效果。
發明內容
本發明的目的是製備一種雙歧桿菌深層冷凍發酵劑及其有效冷凍保護劑。解決常規雙歧桿菌發酵劑 製備過程中存活率低，菌株活力下降的問題。
本發明用於雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑的保護劑重量分組成為脫脂乳6%-16%;海藻糖 2.5%-7.5%;果糖2.5°/0-7.5%;甘油1%-40/0; Vc0.01%-0.1%; L-Glu0.01%-0.1%。
所述雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，優選由下述重量分組成脫脂乳8%;海藻糖5%;果糖5%; 甘油3%; VcO.05%; L-Glu0.05%。
本發明製備的雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，是雙歧桿菌菌體加入上述保護劑後，經-80'C深層冷凍 後得到。
上述保護劑按照雙歧杆原菌液體積的20/1-1/5加入充分混合迅速於-8(TC冷凍。
所述雙歧桿菌菌體使用玉米漿乾粉培養基或NPNL培養基或MRS培養基於37°C ， p恥.5-PH7. 0恆pH 厭氧培養15-24h培養得到。
所述菌體通過4000rpra-8000rpm, 8-20min離心得到。
所述玉米漿乾粉培養基由下述組分製成玉米漿乾粉55g/L,葡萄糖10g/L， L半胱氨酸鹽酸鹽0.05g/L, A液10mL/L， B液5ml/L。
所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04.7H20 2g/L， Nacl 2g/L， MnS041.3g/L。 所述NPNL培養基由下述組分組成牛肉浸汁粉3g/L，蛋白腖10g/L，胰蛋白腖5g/L，植腖3g/L，
酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，可溶性澱粉0.5g/L,溶液A 10ml/L，溶液B 5ml/L，
吐溫80 lg/L，鹽酸半胱氨酸鹽0.5g/L。
所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04.7H20 2g/L,， NaCl 2g/L， MnS04'1.3g/L。
所述MRS培養基由下述組分組成蛋白腖10g/L，牛肉膏10g/L,酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L 醋酸鈉5g/L,檸檬酸二銨2 g/L， KH2P04 2g/，吐溫80 lg/L,硫酸鎂0. 58g/L，硫酸錳0. 28g/L,鹽酸 半胱氨酸鹽0.5g/L。
實驗表明雙歧桿菌在本發明的保護劑作用下製備深層冷凍保護劑，冷凍後菌數保持穩定，滴定酸度 測定菌株活力保持良好，貯藏期間穩定性良好，用於酸奶發酵產品活菌數達到107cfu/mL以上，達到直投 發酵劑要求。
圖1:酸奶發酵與貯藏過程中雙歧桿菌BBMN68活菌對數值變化。 . 圖2:酸奶發酵與IC藏過程中雙歧桿菌BBMN23活菌對數值變化。 圖3:酸奶發酵與貯藏過程中雙歧桿菌BBMN01活菌對數值變化。
具體實施方式
實施例1-24
(1)菌株培養將保藏的長雙歧桿菌BBMN68 (保藏於中國農業大學)傳代兩次恢復活力，鏡檢 培養液菌株形態，將活化菌株以107cfli/mL接種於玉米漿乾粉培養基'恆pH7. 0厭氧培養24h。
玉米漿乾粉培養基由下述組分製成玉米漿乾粉55g/L，葡萄糖10g/L, L半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g/L, A液10mL/L, B液5ml/i:。
所述A液由下述組分組成KIWU lOOg/L, K2HP04 100g/L。
所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L， FeS04 .7H20 2g/L， Nacl 2g/L ， MnS041.3g/L。(2) 收集菌體將(1)得到菌液4000rpm， 10min離心得到菌體，收集菌泥。
(3) 添加保護劑-雙歧桿菌深層冷凍保護劑組成為
表l
保護劑組成
——賣愈MT 實施例2
實施例3 實施例4 實施例5 實施例6 實施例7 實施例8 實施例9 實施例10 實施例11 實施例12 實施例13 實施例14 實施例15 實施例16 實施例17 實施例18 實施例19 實施例20 實施例21 實施例22 實施例23 實施例24
脫脂乳w/w海藻糖w/w —6%2.5% —
10%
6%
10%
6%
10%
6%
10%
6%
10%
6%
10%6%.
腦
6%
10%
4% 12%
8%
8%
8%
8%
8%'
8%
2.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5%
5% 5%
10%
5%
5%
5%
5%
5%
果糖w/w —.—2 0 2.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 7.5% 7.5% 2.5% 2.5% 2.5% 2.5% 7.5% 7.5% 7.5% 7.5%
5% 5%
5%
10%
5%
5%
5%
5%
甘油w/w 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 2% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4% 4%
3% 3%
3%
3%
1%
5%
3%
3%
0.075% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.075%
0.05% 0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.1%
0.05%
L-Gluw/w冷凍後活力(°T) '0.075化—49.—4廠—一
0.075% 0.075% 0.075% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.025% 0.075% 0.075% 0.075% 0.075%
0.05% 0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
0.05%
43.03 52.56
51.82
52.83 49.97 48.9 46.28 51.09 39.34 46.05
42.91 47.16 49.22 50.09 48.3
47.33 43.32
50.73
49.92 46.92 51.03 42.63 51.73將收集的菌體，加入1/10原菌液體積的表1所述述保護劑，攪拌混勻，得到濃縮菌體懸浮液，迅速 與-8(TC冷凍保藏。
(4)菌株活力測定
冷凍濃縮物接種於12%脫脂乳中，接種量1% (V/V), 37t培養7h，測定滴定酸度(。T)。
所述滴定酸度測定方法為取10mL上述發酵乳，用20mL蒸餾水稀釋，加2滴1%酚酞，用0. lmol/LNaOH 滴定，所消耗NaOH毫升數乘以10，即為中和100mL發酵乳所需的0. lmol/LNaOH毫升數，消耗lmL為1°T。 可以反映菌株的活力。
上述表l所列結果表明，保護劑作用下冷凍後菌株活力保持良好，最優結果為質量分數為8%的脫脂 乳；質量分數為5%的闢藻糖；質量分數為5%的果糖；體積分數為3%的甘油；質量分數為0.05%的Vc; 質量分數為0.05%的L-Glu。
實施例25雙歧桿菌深層冷凍發酵劑的製備及應用
(1)菌株培養將保藏的長雙歧桿菌BBMN68 (保藏於中國農業大學)傳代兩次恢復活力，鏡檢 培養液菌株形態，將活化菌株以107cfu/mL接種於玉米漿乾粉培養基，恆pH7. 0厭氧培養24h。
玉米漿乾粉培養基由下述組分製成玉米漿乾粉55g/L，葡萄糖10g/L， L半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g/L， A液10mL/L, B液5ml/L。
所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L，， FeS04 .7H20 2g/L,， Nacl 2g/L ， MnS041.3g/L。
(2) 收集菌體將(1)得到菌液4000rpm， lOmin離心得到菌體，收集菌泥。
(3) 添加保護劑.-
雙歧桿菌深層冷凍保護劑組成為實施例24所述。
將收集的菌體，加入1/10原菌液體積的上述保護劑，攪拌混勻，得到濃縮菌體懸浮液，迅速與-8(TC 冷凍保藏。 .
(4) 發酵劑用於酸奶發酵
上述製得的發酵劑與傳統發酵劑同時接種12%的脫脂乳，42"C發酵至酸奶凝固，4'C保藏，測定保藏期間雙歧桿菌菌數。圖1為酸奶貯藏期間活菌數變化。
上述酸奶中雙歧桿菌活菌計數使用雙歧桿菌選擇性計數培養基。 ' 雙歧桿菌選擇性計數培養基組成為牛肉浸汁粉3g/L，蛋白腖10g/L，胰蛋白腖5g/L,植腖3g/L，
酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L,可溶性澱粉0.5g/L,溶液A 10ml/L，溶液B 5ml/L，
C液40ml/L,吐溫80 1g/L，鹽酸半胱氨酸鹽0.5/L,瓊脂15g/L。
所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L，， FeS04 .7H20 2g/L，， Nacl2g/L ， MnS041.3g/L。 所述溶液C組成為硫酸巴龍黴素lOOmg,硫酸新黴素400mg ，丙酸鈉15g ，氯化鋰3g，置於40ml 無菌水，0.45um微孔濾膜過濾，現配現用。
實施例26雙歧桿菌深層冷凍發酵劑的製備及應用
(1) 菌株培養將保藏的青春雙歧桿菌BBMN23 (保藏於中國農業大學)傳代兩次恢復活力，鏡 檢培養液菌株形態，將活化菌株以107cfu/mL接種於MRS培養基，恆p朋.5厭氧培養18。
MRS培養基由下述組分組成蛋白腖10g/L，牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L，葡萄糖20 g/L醋酸 鈉5g/L，檸檬酸二銨2 g/L, KHaPOJg/,吐溫80 lg/L,硫酸鎂0. 58g/L,硫酸錳0. 28g/L,鹽酸半胱氨 酸鹽0.5g/L。
(2) 收集菌體-將(1)得到菌液4500rpra， 8min離心得到菌體，收集菌泥。
(3) 添加保護劑
雙歧桿菌深層冷凍保護劑組成為實施例io所述。
將收集的菌體，加入1/20原菌液體積的上述保護劑，攪拌混勻，得到濃縮菌體懸浮液，迅速與-80"C 冷凍保藏。
(4) 發酵劑用於酸奶發酵
上述製得的發酵劑與傳統發酵劑同時接種12%的脫脂乳，42'C發酵至酸奶凝固，4'C保藏，測定保藏期 間雙歧桿菌菌數。圖2為酸奶貯藏期間活菌數變化。
上述酸奶中雙歧桿菌活菌計數使用雙歧桿菌選擇性計數培養基。
雙歧桿菌選擇性計數培養基組成為..牛肉浸汁粉3g/L,蛋白腖10g/L,胰蛋白腖5g/L，植腖3g/L， 酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，可溶性澱粉0.5g/L，溶液A !Om/L，溶液B 5m/L， C液40ml/L，吐溫80 1g/L,鹽酸半胱氨酸鹽0.5/L,瓊脂15g/L。所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L, K2HP04 100g/L。
所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04 .7H20 2g/L,， Nac， 2g/L ， MnS041.3g/L。 所述溶液C組成為硫酸巴龍黴素lOOmg，硫酸新黴素400mg ，丙酸鈉15g ，氯化鋰3g,置於40ml 無菌水，0.Mum微孔雄膜過濾，現配現用。
實施例27雙歧桿菌深層冷凍發酵劑的製備及應用
(1) 菌株培養將保藏的動物雙歧桿菌BBMN01 (保藏於中國農業大學)傳代兩次恢復活力，鏡 檢培養液菌株形態，將活化菌株以107cfu/mL接種於NPNL培養基，恆p朋.8厭氧培養12。
所述NPNL培養基由下述組分組成牛肉浸汁粉3g/L,蛋白腖10g/L,胰蛋白腖5g/L，植腖3g/L， 酵母浸出汁5g/L,牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L，可溶性澱粉0.5g/L,溶液A 10ml/L,溶液B 5ml/L， 吐溫80 lg/L,鹽酸半胱氨酸鹽0.5g/L。
所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
所述B液由T述組分組成MgS04.7H20 2g/L， FeS04.7H20 2g/L, Nacl 2g/L MnS04l. g/L。
(2) 收集菌體將(1)得到菌液5000rpm， 15min離心得到菌體，收集菌泥。
(3) 添加保護劑 雙歧桿菌深層冷凍保護劑組成為實施例18所述。
將收集的菌體，加入1/5原菌液體積的上述保護劑，攪拌混勻，得到濃縮菌體懸浮液，迅速與-8(TC 冷凍保藏。
(4) 發酵劑用亍酸奶發酵
上述製得的發酵劑與傳統發酵劑同時接種12%的脫脂乳，42'C發酵至酸奶凝固，4'C保藏，測定保藏期
間雙歧桿菌菌數。圖3為酸奶n藏期間活菌數變化。
上述酸奶中雙歧桿菌活菌計數使用雙歧桿菌選擇性計數培養基。
雙歧桿菌選擇性計數培養基組成為牛肉浸汁粉3g/L，蛋白腖10g/L，胰蛋白腖5g/L，植腖3g/L, 酵母浸出汁5g/L,牛肝浸粉10g/L，葡萄糖10g/L,可溶性澱粉0.5g/L，溶液A 10ml/L，溶液B 5ml/L, C液40ml/L,吐溫80 1g/L，鹽酸半胱氨酸鹽0.5/L，瓊脂15g/L。
所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L。
9所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04 .7H20 2g/L,， Nacl 2g/L ， MnS041.3g/L。 所述溶液C組成為硫酸巴龍黴素100mg，硫酸新黴素400mg ，丙酸鈉15g ，氯化鋰3g，置於40ml 無菌水，0.45um微孔濾膜過濾，現配現用。
權利要求
1、一種用於製備雙歧桿菌深層冷凍發酵劑的複合保護劑，其特徵在於該保護劑由下述重量份的組分組成脫脂乳6％-16％；海藻糖2.5％-7.5％；果糖2.5％-7.5％；甘油1％-4％；Vc0.01％-0.1％；L-Glu0.01％-0.1％；其餘為水。
2、根據權利要求1所述的用於製備雙歧桿菌深層冷凍發酵劑的複合保護劑，其特徵在於該保護劑由 下述重量份的組分組成:.脫脂乳8%;海藻糖5%;果糖5%;甘油3%; VcO.05%; L-GluO.05%;其餘為水。
3、 一種雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，其特徵在於在雙歧桿菌菌體中加入如權利要求1-2中任一所述的複合保護劑後，經深層冷凍得到。
4、 根據權利要求3所述的雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，其特徵在於，其製備方法為(1)將雙歧桿菌接種到玉米漿乾粉培養基或NPNL培養基或MRS培養基中，於37'C, p朋.5-PH7. 0下 厭氧培養15-24h，離心，鄰00rpm-8000rpm, 8-20min收集菌體；(2)將收集的菌體加入1/20-1/5原菌液體積的上述複合保護劑，攪拌混勻，得到濃縮菌體懸浮液， 迅速於-8(TC下冷凍保藏。
5、 根據權利要求4所述的雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，其特徵在於所述玉米漿千粉培養基 由下述組分製成玉米漿乾粉55g/L,葡萄糖10g/L， L半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g/L， A液10mL/L, B液5ml/L;所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L， K2HP04 100g/L;所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L,， FeS04 .7H20 2g/L,， Nacl2g/L，， MnS041.3g/L。
6、 根據權利要求4所述的雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，其特徵在於所述NPNL培養基由下述組 分組成牛肉浸汁粉3g/L，蛋白腖10g/L，胰蛋白腖5g/L，植腖3g/L，酵母浸出汁5g/L，牛肝浸粉 10g/L,葡萄糖10g/L,可溶性澱粉0.5g/L，溶液A 10ml/L,溶液B 5ml/L，吐溫80 lg/L，鹽酸半胱氨 酸鹽0.5g/L。所述A液由下述組分組成KH2P04 100g/L, K2HP04 100g/L;所述B液由下述組分組成MgS04.7H20 2g/L, FeS04.7H20 2g/L, Nacl 2g/L， MnS041.3g/L。
7、 根據權利要求4所述的雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑，其特徵在於所述MRS培養基由下述組 分組成蛋白腖10g/L,'牛肉膏10g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖20gZL,醋酸鈉5g/L，檸檬酸二銨2 g/L， KH2P042g/,吐溫80 lg/L，硫酸鎂0.58g/L,硫酸錳0. 28g/L,鹽酸半胱氨酸鹽0.5g/L。 '
8、 如權利要求3-7任一項所述的雙歧桿菌深層冷凍直投發酵劑在發酵酸奶中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種雙歧桿菌深層冷凍發酵劑及其冷凍保護劑。通過高密度培養得到雙歧桿菌菌體，離心收集菌泥，並利用優選復配保護劑重懸菌體，於-80℃深層冷凍保藏，有效的保持了雙歧桿菌的菌數和功能特性。本發明的雙歧桿菌深層冷凍發酵劑作為一種輔助發酵劑，對於益生菌有效應用於乳品發酵有顯著效果。
文檔編號A23C9/12GK101606552SQ20091013651
公開日2009年12月23日 申請日期2009年5月6日 優先權日2009年5月6日
發明者任發政, 劉松玲, 劉愛萍, 明 張, 楊海鶯, 田寒友, 蔣菁莉, 亮 趙 申請人:任發政