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細菌脂多糖的新用途的製作方法

2023-07-26 15:51:21 4

專利名稱:細菌脂多糖的新用途的製作方法
細菌脂多糖的新用途技術領域:
本發明涉及細菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)即內毒素 (endotoxin)的一種新用途,具體說就是將細菌脂多糖製備成用於預防和/或治療中風、結 石、痛風的藥物,背景技術:
當今人類社會進步,文明發達,而人類本身進化的速度遠遠落後於社 會進步的速度,短短幾十年的歷程,人類的飲食結構、生活習慣得到了大幅的提升,而勞動 強度則大幅下降,導致一系列疾病的發生率大幅增加,各類腫瘤、中風、痛風和結石等疾病 時有發生。在中國,癌症是第二死亡病因,心腦血管疾病才是第一死亡病因,中風患者比比 皆是,大多數人到了中年之後;在體內都會有結石痛風石沉積。而針對此類疾病的藥物大多 有毒副作用,且療效甚微。 一般情況下藥物的主攻方向也是越皰代俎,繞過機體免疫系統而 直接作用於發病因素,往往是治標不治本。 腦中風就是由於腦血管破裂或堵塞,引起出血或血流不暢,致使腦內局部受到壓
迫、血液循環不良,造成腦部部分失去功能而留下的神經症狀。痛風是一種嘌呤代謝紊亂所
致的全身性疾病,其特點是高尿酸血症及痛風性急性關節炎,以單足或雙足拇趾關節或踝
關節腫痛為多見,易反覆發作。某些代謝產物與鈣等結合沉積在組織器官內導致結石形成,
而且久治不愈。中風痛風結石三者都是瘀阻導致的疾病,活血化瘀才是治療方向。 細菌脂多糖LPS(內毒素)增強機體非特異性免疫力及佐劑作用 少量細菌脂多糖注入機體,可產生一定程度的非特異免疫力,即由一種革蘭氏陰
性菌脂多糖剌激產生的免疫力對多種微生物均有作用。它能間接增強機體非特異性防禦機
能而發揮抗感染作用。 (1)增加體液防禦功能;如備解素、補體、溶菌酶及幹抗素等的含量均有所增加, 但體液抗菌物質量的增高有時與抗感染效應不相平行,因為抗感染能力的提高不僅限於體 液因子的增加,尚需其他因素的配合。 (2)增強單核巨噬細胞系統的活性即吞噬細胞數量增多,吞噬能力和殺菌活性 增強。動物注射脂多糖後,肝、脾體積和重量增加,肝、脾、肺、淋巴結等單核巨噬細胞系統組 織增生,細胞分裂增速。 (3)脂多糖與其他顆粒性或可溶性抗原一併注射,能使後者剌激機體產生抗體的 效價明顯增高。佐劑主要作用於巨噬細胞和免疫活性細胞,從而增強免疫反應。脂多糖對 噬細胞與T淋巴細胞和B淋巴細胞均有直接或間接的激活作用,表明脂多糖具有佐劑性質。 如應用傷寒、副傷寒、破傷風類毒素及"百、白、破"三聯疫苗等時,傷寒、副傷寒或百日咳杆 菌脂多糖不但作為預防接種用的菌苗,且對類毒素而言,尚可起到佐劑作用,以增強免疫效 果。 (4)中性粒細胞和血小板對細菌脂多糖LPS的解毒進入血循環的脂多糖能被中 性粒細胞所吞飲,在1 3小時內喪失引致Shwarhzman反應的能力。Skarnes (1971)發現 家兔中性粒細胞含有富於酯酶的成分,能解除內毒素的致死作用,故中性粒細胞對循環脂 多糖具有清除與解毒功能。Das等(1973)於實驗家兔體內注入大腸桿菌脂多糖,10分鐘 即被清除,若動物血小板減少,則清除率降低,表明血小板具有對內毒素的清除與解毒的能力。並發現革蘭氏陰性菌感染的患者的血小板中含有脂多糖。Walker(1979)也認為微循環 中脂多糖的清除有賴於血小板。業已證明,對脂多糖有耐受力的家兔血漿中,血小板的凝聚 加速,凝聚的血小板易被吞噬細胞所吞噬而消除。 (5)細菌脂多糖LPS使機體獲得抗腫瘤能力Du卯er(1774)發現,一位乳腺癌患者 遭細菌感染後癌症漸消,治癒感染腫塊後又復發,人工再感染卻又使癌消失。腫瘤"自行" 消退絕非僅此一例。為控制惡性感染,科利(Coley,1893)用殺死的靈桿菌及化膿性鏈球菌 濾過液治癌,稱Coley療法。卡斯韋爾(Carswell)和奧爾德(Old) (1975)發現注射脂多糖 LPS及卡介苗的兔血清中有TNF。 細菌脂多糖使機體的非特異性抵抗力加強對志願者和動物研究表明,脂多糖激活 巨噬、T、 B、 NK和K細胞等免疫活性細胞,並激活補體、凝血和激肽系統等體液調節系統,增 強機體抗病菌、病毒及原蟲感染的能力。這很大程度上源於脂多糖誘生的TFNs、ILs、TNF和 CSFs(集落剌激因子)等。 綜上所述,細菌脂多糖(LPS)既是致病因子,又可對機體發揮有益的生物學活性。 目前比較清楚的由LPS剌激產生的細胞因子有TFNs、ILs、CSFs、TNFs和TGFs(轉化生長因 子類),它們介導了LPS(或類脂A)的生物學效應。不少學者正在尋找低毒或無毒內毒。

發明內容本發明的目的是提供細菌脂多糖的新用途,即在製備溶解人體內血 栓、結石、痛風石藥物中的應用。 所述細菌脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)為革蘭氏陰性細菌的細胞壁成分, 又叫內毒素,革蘭氏陰性細菌的死菌體,是預防和/或治療中風、結石、痛風的藥物,可在 製備人體溶解血栓、結石、痛風藥物中應用,所述預防和/或治療中風、結石、痛風的藥物, 為包括凍乾粉針的注射液類型,其中以假單胞菌的內毒素為主,因其毒性最低,現已證明, 按每公斤體重的最小致熱劑量比較,不同菌株之間稍有差異傷寒沙門菌是O. 1-1. 14yg/ kg, E. coli是1. 0ii g/kg,假單胞菌為50—70 ii g/kg。 人類的免疫系統因為與微生物鬥爭而進化,也因為與微生物鬥爭而存在。人體的 免疫系統功能也因與微生物鬥爭而發展壯大,試驗證明,細菌脂多糖能非特異地影響感染 過程。致病性增強或減弱取決於感染的微生物,注射脂多糖的劑量和途徑,以及脂多糖處理 和感染開始之間的間隔時間。對一些與產脂多糖完全無關的病原體增加抵抗力,如寄生蟲 (錐蟲,瘧原蟲),真菌(念珠菌,根黴菌,芽生菌,組織胞漿菌,隱球菌),病毒(流感,鼠疫, 腦炎,新城病),革藍氏陽性菌(葡萄菌,肺炎球菌,鏈球菌),革藍氏陰性菌(克雷伯桿菌, 假單胞菌,沙門菌,大腸桿菌)以及分枝桿菌等。感染前幾小時給脂多糖,抵抗力增強,如果 臨給病原體前給脂多糖,試驗動物對感染更敏感。在大多數動物體內注射異物時,如果一起 或稍前稍後注射脂多糖,它就會起抗體反應剌激物作用,加速對異物特異的IgG, IgM抗體 的產生,起免疫佐劑的作用。現已證明,細菌脂多糖預處理增強宿主抵抗力的機制是早期非 特異的,與抗體依賴的晚期有明顯區別。這涉及不同體液和細胞間的相互作用,由此引起的 單核吞噬系統激活和隨之有效地從機體內清除感染因子最為突出。 本發明第一方面探索出了細菌脂多糖的一種新用途,即利用細菌脂多糖(內毒 素)剌激機體免疫系統,激活巨噬細胞的吞噬功能,化解血栓結石痛風石等。需要的時候, 可在上述藥物中加入一種或幾種藥學上可接受的輔料,如生理鹽水、磷酸鹽緩衝液、免疫 佐劑等。
本發明製備的藥物可以製成水針、粉針等適用於注射的藥物形式,其中以水針為 優選劑型。 本發明第二方面提供了一種需要治療疾病的臨床治療方案,上述細菌脂多糖藥 物在使用時,可在上臂皮下注射,也可在病灶部位肌肉注射,一般隔日使用一次,六次為一 療程,根據個人體質和病情可再增加兩三個療程,所述治療包括治癒、、緩解、減輕或補充治療。 本發明第三方面提供了一系列的治療注意事項和處理方法,避免藥物不良反應發 生,增強患者的依從性。 本發明第四方面提供了製備藥物的基本方法,即將細菌脂多糖製備成用於預防和 /或治療中風結石痛風等疾病的藥物,製備方法如下 1.菌種革蘭氏陰性細菌,包括假單胞菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、變形杆 菌等,主要以假單胞菌為主。
2.擴大培養將檢定好了的菌種接種於試管或三角瓶普通營養肉湯中,置於37°C 培養18小時左右,經純粹檢驗合格後即可使用。根據需要量,可採用發酵罐或玻璃瓶進一 步擴大培養,取樣作純粹檢驗,合格者使用;若有雜菌汙染,則菌液要廢棄。
3.收集菌泥對上述擴大培養的合格培養物,離心收集菌體。並用生理鹽水洗滌 菌體三次,離心收集菌泥,冷凍保存備用。 4. 1.將菌泥經酶消化提取製得細菌脂多糖。製成每毫升含細菌脂多糖O. 5毫克的 濃度。 4. 2.將菌泥稀釋成約每毫升50億菌體的濃度,按0. 5_1. 0%的比例加入甲醛(按 100% ),封口並混合均勻後置37t:保溫殺菌24-48小時。然後做無菌檢驗,離心清洗甲醛, 用生理鹽水配成約每毫升20億菌體的液體。 5.將上述4. 1. ,4. 2.製備好了液體,無菌操作分別分裝於安瓶中,貼標做好記錄,
置於2—8t:低溫存放。 6.安全檢驗選擇健康且未經感染過的小白鼠,按使用劑量三倍的劑量注射3-5
只,觀察io天,均應健活。 7.效力檢驗選擇健康且未經感染過的小白鼠,按正常使用劑量注射三次後,測
定小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬指數。與對照組作比較測定。
8.物理性狀檢查經上述檢驗合格後,還需逐瓶進行物理性狀檢查等等。 含細菌脂多糖的菌體注射液,在上述濃度內,動物試驗證明是安全有效的,臨床驗
證治療中風痛風結石疾病顯效率的100%,中風疾病患者康復程度可達5_9成,結石痛風
患者治癒率可達75%。具體實例細菌脂多糖(內毒素)對組織細胞的選擇性不強,不同革蘭氏陰性細 菌的內毒素引起的病理變化和臨床症狀大致相同致死性、熱原性、瀰漫性血管內凝血等, 大劑量細菌脂多糖可引起免疫耐受性。為了緩衝了菌體脂多糖的毒性,又增強了脂多糖類 等的免疫佐劑活性,避免免疫耐受發生,含脂多糖的菌體注射液為最佳選擇。研究表明大 分子及多分子混合物不易產生耐受,Helge等發現,結合在膜上的脂多糖免疫小鼠,比用等 量的純脂多糖免疫小鼠產生的反應強得多,純脂多糖引起的反應以IgM為主,而結合在膜 上的脂多糖引起的反應以IgG為主。所述細菌脂多糖注射液,包括皮下注射,肌肉注射,胸腔腹腔盆腔注射等。所述細菌脂多糖注射液每次使用量為50-1000 g,或5-150億革蘭 氏陰性菌菌體.,每日使用一次或隔日使用一次。所述細菌脂多糖注射液若在病灶部位接近 病灶部位給藥,但要偏離血栓部位10-20釐米給藥,可提高療效。中風患者在腦溢血發生 15天之後方能使用細菌脂多糖注射液;中風或其他因素引起腦溢血發生後,患者成為植物 人,患病15天之後方能使用細菌脂多糖注射液;患者處於疲勞、飢餓、感冒狀態時,不能使 用細菌脂多糖注射液;所述細菌脂多糖注射液切不可注入血管內直接進入血液,可與其他 藥物聯合使用;所述細菌脂多糖注射進入體內,一星期後再配合腥羶發物飲食,可起到事半 功倍的療效,特別是更年期患者一定要配合腥羶發物治療疾病,腥羶發物包括雄雞、鯉魚、 牛羊肉、海鮮、韭菜、扁豆、南瓜、紫蘇、生薑、啤酒、甜酒等,也包括從動植物中純化的發物成 分如各種血凝素;所述細菌脂多糖注射進入體內,許多痛風患者一星期後出現3-7天耳鳴 甚至耳聾現象,或細菌脂多糖注射進入體內,4-一7天內中風患者腦部會有異樣的動靜,緊 接著癱瘓的部位會有異樣的感覺如麻木、疼痛、蟻行感等,或細菌脂多糖注射進入體內,注 射部位出現紅腫發熱及硬塊,是正常的免疫反應,屬正常情況,是轉好的前兆;,無需處理 會自然消失,第二次注射要偏離上次注射的紅腫部位,不然會引起更大的發熱紅腫甚至全 身反應 本發明的製備方法是,即將細菌脂多糖製備成用於預防和/或治療中風結石痛風 等疾病的藥物,製備方法如下 1.菌種革蘭氏陰性細菌,包括假單胞菌、霍亂弧菌、大腸桿菌、傷寒桿菌、變形杆 菌等,主要以假單胞菌為主。
2.擴大培養將檢定好了的菌種接種於試管或三角瓶普通營養肉湯中,置於37°C 培養18小時左右,經純粹檢驗合格後即可使用。根據需要量,可採用發酵罐或玻璃瓶進一 步擴大培養,取樣作純粹檢驗,合格者使用;若有雜菌汙染,則菌液要廢棄。
3.收集菌泥對上述擴大培養的合格培養物,離心收集菌體。並用生理鹽水洗滌 菌體三次,離心收集菌泥,冷凍保存備用。 4. 1.將菌泥經酶消化提取製得細菌脂多糖,製成每毫升含細菌脂多糖0. 5毫克的 濃度。 4.2.將菌泥稀釋成約每毫升50億菌體的濃度,按0.5_1.0%的比例加入甲醛(按 100% ),封口並混合均勻後置37t:保溫殺菌24-48小時。然後做無菌檢驗,離心清洗甲醛, 用生理鹽水配成約每毫升20億菌體的液體。 5.將上述4. 1,4.2.製備好了液體,無菌操作分別分裝於安瓶中,貼標做好記錄,
置於2—8t:低溫存放。 6.安全檢驗選擇健康且未經感染過的小白鼠,按使用劑量三倍的劑量注射3-5
只,觀察io天,均應健活。 7.效力檢驗選擇健康且未經感染過的小白鼠,按正常使用劑量注射三次後,測 定小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬指數。與對照組作比較測定。
8.物理性狀檢查經上述檢驗合格後,還需逐瓶進行物理性狀檢查等等。本發明 以含菌體脂多糖的銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)注射液作臨床應用,藥物的組 方20億死菌體/ml , NaCl 0. 9 % ,苯甲醇0. 6 % , pH7. 2磷酸鹽緩衝液。藥物為深圳衛武光明 生物製品廠生產,使用的產品批號為980308, 20030502, 20031005, 20040701。本發明人於2006年至2007年在河北張藥集團試製了幾批樣品,批號為20071205也用於臨床試驗.主 要針對中風痛風結石患者,以自願為原則,歷時近十載,相關病例數十例,初步統計顯示治 療顯效率達100%,中風患者緩解康復程度達5-9成,結石痛風患者治癒率達75%以上。
藥物的臨床應用試驗病例如下 例1. 1999年。向工程師,男,61歲,深圳寶安區人,中風癱瘓在床三年,言語不清, 口眼歪斜,流口水,背部有直徑為5-8釐米的肉瘡兩個,使用銅綠假單胞菌注射液三針之 後,唾液被嘴包住了 ,使用十針後,能獨立坐穩和站立,右腿有邁步的意向,但不能行走。
例2.2000年。覃中尉,男,40歲,深圳某部隊,痛風患者,長期服用秋水仙鹼等藥 物,使用銅綠假單胞菌注射液三針之後,出現了耳鳴的現象,剛開始本發明人不知所措,後 經多方查證,才得知是耳蝸結締組織裡有痛風石,患者耳鳴了 5天左右,最後停止了用藥。
例3. 2003年。席,男,62歲,湖南省安鄉縣人,腦溢血中風偏癱,患病一月後在家療 養,使用銅綠假單胞菌注射液,使用三針後,痙攣的右臂舒展開了,彎曲緊張的手指也舒緩 了,第四針之後,他的大指和中指開始有意識的活動了。 一月後因高血壓的其他併發症而死 亡。 例4.2004年。夏,男,56歲,湖南省安鄉縣人,口眼歪斜,嘴角向右歪出近1釐米, 患病三月後使用銅綠假單胞菌注射液,使用兩針後,腦內出現了異動現象,口眼歪斜開始好 轉,共使用了六針之後,面部幾乎已看不出異樣了 。 例5. 2004年。張,男,58歲,湖南省安鄉縣人,53歲時中風,有後遺症,語言有輕微 障礙,右手不能拿筆寫字,也不能拿筷子吃飯,使用銅綠假單胞菌注射液十針後,語言功能 得到了提高,右手能寫字和拿筷子吃飯了。他同時又是一個痛風患者,注射銅綠假單胞菌注 射液三針之後,耳聾了 3天,十針之後痛風部位再未見疼痛了 。 例6.2004年。曾,女,41歲,湖北人,子宮左側附件腫瘤,直徑約4釐米,左側腎有 四顆直徑約0.2釐米的結石,右腎有一顆結石。本發明人直接在腫瘤附近部位給藥,患者於 第四針時,吃了雄雞發物,導致腫瘤結石等部位疼痛難忍,趕忙去醫院檢查,結果是腫瘤直 徑為2. 4X 1. 8釐米,由以前的空心瘤變成了實心瘤(良性),結石也有明顯鬆動,後來繼續 用藥五針,腫瘤結石全部消退。注該患者平常很少打針吃藥,免疫系統功能強健。
例7.2006年。楊,女,43歲,湖南省津市人,右腎有一顆0. 5釐米結石,雙腎都有泥 沙型結石,患病多年,吃藥無數,不見痊癒,本發明人在患者的背部雙腎位置,使用銅綠假單 胞菌注射液十針後,結石已全部清除,兩年多未見復發。 例8. 2006年。程,男,48歲,湖南省澧縣人,痛風患者,右腳踝關節腫痛,本發明人 直接在腫痛部位注射銅綠假單胞菌注射液,僅用了兩針,即治好了踝關節腫痛。後來又按此 方法治好了其他幾例痛風患者。 例9.2009年。唐,男,55歲,湖南省津市人,中風兩次,第一次比較輕微,導致左邊 手腳不靈光。第二次中風較重,已全身不能動彈,一月後,本發明人使用銅綠假單胞菌注射 液進行治療,第一針藥注射後,注射部位不見紅腫,這是更年期的現象,不得已本發明人讓 患者吃多種發物,配合治療,後來才逐見好轉能翻身,能坐穩,能認人和講話,能拿勺子吃 飯,能扶著行走,能扶拐杖行走,能上桌拿筷子吃飯,能獨立上廁所。共使用了 30針銅綠假 單胞菌注射液,治療了兩月時間。
權利要求
一種細菌脂多糖的新用途,其特徵是細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是預防和/或治療中風、結石、痛風的藥物,可在製備人體溶解血栓、結石、痛風藥物中應用。
2. 根據權利要求1所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖亦包括 所有滅活的革蘭氏陰性菌的菌體,其中以假單胞菌屬的菌體為主。
3. 根據權利要求1或2所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述預防和/或治 療中風、結石、痛風的藥物,為包括凍乾粉針的注射液類型。
4. 根據權利要求3所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖注射液, 包括皮下注射,肌肉注射,胸腔腹腔盆腔注射等。
5. 根據權利要求4所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖注射液每次使用量為50-1000 ii g,或5-150億革蘭氏陰性菌菌體,每日使用一次或隔日使用一 次。
6. 根據權利要求5所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖注射液若在病灶部位接近病灶部位給藥,但要偏離血栓部位10-20釐米給藥,可提高療效。
7. 根據權利要求1所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於中風患者在腦溢血發生 15天之後方能使用細菌脂多糖注射液;中風或其他因素引起腦溢血發生後,患者成為植物 人,患病15天之後方能使用細菌脂多糖注射液;患者處於疲勞、飢餓、感冒狀態時,不能使 用細菌脂多糖注射液。
8. 根據權利要求1所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖注射液 切不可注入血管內直接進入血液,可與其他藥物聯合使用。
9. 根據權利要求1所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖注射進 入體內, 一星期後再配合腥羶發物飲食,可起到事半功倍的療效,特別是更年期患者一定要 配合腥羶發物治療疾病,腥羶發物包括雄雞、鯉魚、牛羊肉、海鮮、韭菜、扁豆、南瓜、紫蘇、生 姜、啤酒、甜酒等,也包括從動植物中純化的發物成分如各種血凝素。
10. 根據權利要求1所述的細菌脂多糖的新用途,其特徵在於所述細菌脂多糖注射進 入體內,許多痛風患者一星期後出現3-7天耳鳴甚至耳聾現象,或細菌脂多糖注射進入體 內,4-7天內中風患者腦部會有異樣的動靜,緊接著癱瘓的部位會有異樣的感覺如麻木、疼痛、蟻行感等,或細菌脂多糖注射進入體內,注射部位出現紅腫發熱及硬塊,是正常的免疫反應,屬正常情況,是轉好的前兆;,無需處理會自然消失,第二次注射要偏離上次注射的 紅腫部位,不然會引起更大的發熱紅腫甚至全身反應。
全文摘要
本發明公開了細菌脂多糖的新用途,即在製備人體溶解體內異物(如血栓、結石、痛風石)藥物中的應用。研究表明細菌脂多糖能激活網狀內皮系統細胞吞噬功能,提高巨噬細胞和中性白細胞的殺菌作用,並釋放內源性細胞因子(補體,備解素,溶菌酶,乙型溶素,幹擾素IFN,白細胞介素IL,腫瘤壞死因子TNF等)激發宿主對細菌感染的防衛,引起腫瘤壞死,亦可吞噬溶解血栓、結石、痛風石等體內異物。因此,可以以細菌脂多糖為活性成分製備成預防和/或治療中風、結石、痛風的藥物。本發明所述含細菌脂多糖的菌體注射液,經動物試驗證明是安全有效的,臨床驗證治療中風痛風結石疾病顯效率為100%,中風患者康復程度可達5-9成,結石痛風患者治癒率可達75%。
文檔編號A61K31/739GK101791318SQ20091022669
公開日2010年8月4日 申請日期2009年12月19日 優先權日2009年12月19日
發明者韓少坤 申請人:韓少坤

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