來自檀香屬的萜烯合酶的製作方法

2023-07-06 05:16:11 4

專利名稱：來自檀香屬的萜烯合酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的萜烯合酶。本發明還涉及編碼萜烯合酶的核酸、用於製備變體萜烯合酶的方法和表達本發明多肽的宿主生物體。本發明還包括用於製備萜烯合酶的方法和用於製備萜類化合物(如萜烯)的方法。
背景技術：
以下技術背景的討論僅為了便於理解本發明。該討論並非確認或承認，截至本申請的優先權日，其所涉及的任何材料是或曾是普通常識的一部分。檀香(印度檀香Santalum album)(檀香科Santalaceae)是具有巨大的經濟價值的小型半寄生熱帶樹木，其被發現生長於印度南部、斯裡蘭卡、印尼東部和澳大利亞北部。由於其細粒性、高密度和出色的雕刻特性，檀香木材受到高度追捧。檀香木材含有樹脂和精油，尤其是檀香醇、檀香烯以及數十種其他微量倍半萜。這些化學物質提供了獨特的檀香香味。香木通常被磨碎並蒸汽蒸餾，其揮髮油用作許多高端香水的固定劑。幾個世紀的過度開採已導致檀香天然林消亡。正在整個澳大利亞北部建立大型種植園，以滿足需求並保護剩餘的儲備。檀香心材中含有高達6% (乾重)的倍半萜油，主要是a -和-植香醇，a -反式-香梓橡醇和表-P -植香醇，以及倍半職烯經a -和-植香烯，a-香檸檬烯和表-￠-檀香烯，￠-紅沒藥烯，a-、￠-和Y-薑黃烯。即使是在近乎相同的生長條件下，產於樹的心材油的量相差很大。這種產量差異的原因還不是很清楚，但可能是遺傳和環境因素兩者的結果。關於檀香中倍半萜類化合物(如倍半萜)的生物合成或其精油產生如何調控所知甚少。本發明解決了本領域對用於產生萜烯的方法的需要，所述萜烯與檀香所產生的萜烯類似。發明概述在一個實施方案中，本發明提供了分離的核酸分子，其編碼萜烯合酶並且選自a)包含SEQ ID NO :I、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的核酸分子;b)核酸分子，其為(a)的片段；c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補的核苷酸序列；和d)核酸分子，其編碼萜烯合酶並與(a)-(c)中任一核酸分子具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的相同性；其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。其它的實施方案包括本發明的核酸所編碼的多肽；包含本發明核酸的宿主細胞；非人生物體，其被修改以含有本發明的核酸；以及產生多肽的方法，其包括培養本發明的宿主細胞。在一個實施方案中，本發明提供了製備至少一種萜烯合酶的方法，其包括在有助於產生所述至少一種萜烯合酶的條件下培養宿主細胞，所述宿主細胞被修改以含有至少一種核酸序列。本發明還提供分離的職烯合酶,其中所述職烯合酶為檀香屬(Santalum)職烯合酶；並且所述萜烯合酶催化檀香烯的產生。在另一個實施方案中，本發明提供分離的萜烯合酶，其包括a) SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的胺基酸序列；b)由權利要求1-5中任一項的核酸分子所編碼的胺基酸序列；c)胺基酸序列，其與SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高相同性;或 d) (a)、(b)或(C)的片段;其中所述萜烯合酶催化萜烯產生。本發明還提供萜烯合酶，其中所述萜烯合酶同時催化a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯的產生。本發明還提供用於檢測樣品中萜烯合酶多肽或核酸的存在的方法。在另外的實施方案中，本發明提供了產生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇宿主生物體和/或細胞，其不表達具有SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQID NO 5所不序列的核酸分子；b)用具有SEQ ID NO :I、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示序列的核酸分子轉化所述生物體；和c)在有助於所述核酸編碼的萜烯合酶產生的條件下培養所述生物體。在另外的實施方案中，本發明提供了產生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟a)選擇宿主生物體和/或細胞，其不表達具有SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQID NO 5所不序列的核酸分子；b)用SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示序列的核酸分子以較高的量轉化所述生物體；和c)在有助於所述核酸編碼的萜烯合酶產生的條件下培養所述生物體。本發明還提供了製備萜烯的方法，包括a)使無環焦磷酸萜烯前體與本發明的萜烯合酶接觸，和，b)任選地,分離在步驟(a)中產生的職烯。優選地，所述方法實施於在細胞中異源表達的萜烯合酶上；其中無環焦磷酸萜烯前體與所述萜烯合酶在同一細胞中表達；並且接觸無環焦磷酸萜烯前體的步驟發生於所述細胞中。更優選地，所述至少一種萜烯選自(+)_表-￠-檀香烯、(-)-P-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+) - a -檀香烯、(-)-a -檀香烯、順式-a -香檸檬烯、反式-a -香檸檬烯，反式_ P _香朽1檬烯和順式_ P _香朽1檬烯。本發明的萜烯合酶產生的萜烯可進一步加工為醇，優選為a-檀香醇，￠-檀香醇，a-反式-香檸檬醇和/或表-￠-檀香醇。附圖簡述
圖I :印度檀香(S. album)天然檀香油的色譜圖。4個主峰是a -檀香烯、E_a -香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯。圖2 :與FPP溫育後的SaSSy產物譜的GC圖譜(trace)，以及用GC-MS檢測的來自與FPP溫育後的SaSSy產物譜的a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯的質譜數據。 圖3 :與FPP溫育後的SaSSy、SauSSy和SspiSSy產物譜的疊加GC圖譜，以及用GC-MS檢測的來自與FPP溫育後的SaSSy產物譜的a -檀香烯、a _反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯、順式-P -金合歡烯和反式-P -金合歡烯的質譜數據。圖4 :本發明的SaSSy萜烯合酶的核酸序列。圖5 :本發明的SaSSy萜烯合酶的胺基酸序列。圖6A和6B :萜烯合酶的Clustal比對FB299123_125_香根草(Vetiveria zizanoides)職烯合酶(W0 2006134523)、AF484125-菸草(Nicotianaattenuata) 5_ 表-馬 5 鈴烯(aristolochene)合酶、AB438045-梓樣香桃(Backhousiacitriodora)芳樟醇合酶、Santalene-本發明的來自檀香的SaSSy檀香烯合酶。圖7 :圖6中比對的蛋白質的系統發生樹。圖8 :28種不同的萜烯合酶基因的UPGMA比對樹。參考代碼如下
ISaSSy [印度擅香(Santalum album) ] ；2 SauSSy [新克裡多尼亞擅香(Santalumaustrocaledonicum) ] ；3 SspiSSy[澳洲擅香(Santalum spicatum) ] ；4 ACF24767. I 單職合酶[印度檀香];5 SauMonoTPSl [新克裡多尼亞檀香];6 SspiMonoTPSl [澳洲檀香]；7 ACF24768. I SaSesquiTPSl [印度檀香]；8 SausSesquiTPSl [新克裡多尼亞檀香];9 SspiSesquiTPSl [澳洲擅香];10 AAS79351. I (-) _a_ 松油醇合酶[葡萄(Vitisvinifera) ] ；11 BAG82825. I 芳樟醇合酶[朽1 樣香桃(Backhousia citriodora) ] ； 12AAV63788. I a -姜烯合酶[羅勒(Ocimum basilicum)] ；13 AAR99061. 1(_)_ 大根香葉烯 D合酶[毛果楊(Populus trichocarpa) X 美洲黑楊(Populus deltoides) ] ； 14 CAA06614. I5-表-馬5 鈴烯[辣椒原變種(Capsicum annuum var. annuum) ] ； 15 CAA77191. I (+) - 5-杜松烯合酶[亞洲棉(Gossypium arboreum) ] ； 16 AA073863. I (+) -3-蒈烯合酶[歐洲雲杉(Picea abies) ] ； 17 AAC05727. I d_ 療子稀合酶[大冷杉(Abies grandis) ] ；18AAF61453. I P -水芹烯合酶[大冷杉];19 AAC05728. I Y -蛇麻烯合酶[大冷杉];20AAS47691. I LAS[歐洲雲杉]；21 AAC39443. I ent-貝殼杉烯合酶[擬南芥(Arabidopsisthaliana) ] ；22 ADB55710. I (-) _ent_ 貝殼杉烯合酶[北美雲杉(Picea sitchensis)]；23 AAM53944. 1AF514287_1(+)-檸檬烯合酶 I [檸檬(Citrus limon)] ；24 AAA86337. Ivetispiradiene 合酶[純天仙子(Hyoscyamus muticus) ] ；25 AAF61439. I 紫穗槐-4,11-二烯合酶[青蒿(Artemisia annua) ] ；26 BAF02832. I 單職合酶[藍按(Eucalyptusglobulus) ] ；27桉葉素合酶[希臘鼠尾草(Salvia fruticosa) ] ；28香檜烯合酶[Salviapomifera]圖9 :28種不同的職烯合酶基因的Neighber joining比對樹。參考代碼如圖8。圖IOa-IOg :新克裡多尼亞檀香、澳洲檀香和印度檀香的萜烯合酶核酸序列的比對。圖lla-c :新克裡多尼亞檀香、澳洲檀香和印度檀香的萜烯合酶蛋白質胺基酸序列的比對。

圖12a_d:新克裡多尼亞檀香、澳洲檀香和印度檀香的萜烯合酶蛋白質胺基酸序列的比對，其與DQ785793. I-希臘鼠尾草桉葉素合酶和DQ785794. I-Salvia pomifera香檜烯合酶的胺基酸序列相比較。詳述發明詳述根據本發明，發現了來自印度檀香的新的萜烯合酶基因SaSSy。還發現了來自其它兩個不同系統發生的物種的直系同源基因(來自澳洲檀香的SspiSSy和來自新克裡多尼亞檀香的SauSSy)。新基因由SEQ ID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示的DNA序列表徵。
在SEQ ID NO 1中公開的新基因以下一般稱作SaSSy，在SEQ ID NO 3中公開的新基因以下一般稱作SauSSy，而在SEQ ID NO :5中公開的新基因以下一般稱作SspiSSy。SaSSy,SauSSy和SspiSSy的DNA和蛋白質序列是非常高度保守的，在ORF的胺基酸上具有94-98%的相同性。該基因的關鍵結構域是非常高度保守的(見圖4和5)。新的萜烯合酶催化由FPP產生萜類化合物，優選為萜烯，更優選為選自以下的倍半萜a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯。更具體地，SaSSy、SauSSy和SspiSSy為倍半職合酶，並且最具體地，為檀香烯合酶。如本文中所用，「萜烯合酶」是催化由底物產生一或多種萜類化合物，或更優選地產生一或多種萜烯的酶；「倍半萜合酶」是催化合成倍半萜類化合物，或更優選地合成倍半萜烯的酶，而「檀香烯合酶」是催化檀香烯合成的酶。由底物形成萜類化合物和/或萜烯可使用本領域已知的任何方法評估，包括但不限於，下述實施例6和7中描述的酶測定和質譜法。萜類化合物在本文定義為通過萜烯合酶活性和可能的其它酶的後續修飾而衍生自異戊二烯基二磷酸底物的化合物。包含在術語萜類化合物中的是非氧化的萜類烯烴(萜烯)、氧化的萜烯和其它衍生物如萜醇。如本文中所用，萜烯為基於異戊二烯單元(C5H8)的不飽和烴，並且具有CltlH16的通式。萜烯可以為無環的、單環的或多環的。萜烯包括，但不限於，單萜，其含有10個碳原子；倍半萜，其含有15個碳原子；二萜，其含有20個碳原子；和三萜，其含有30個碳原子。提及萜烯時包括所述萜烯的立體異構體。本發明中提及檀香烯時包括a -檀香烯和0 -檀香烯，以及其任何立體異構體，包括，例如，(+)_表-￠-檀香烯、(-)-3-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+)_a-檀香烯和(-)-a -植香烯。這些新萜烯合酶基因的分離將使得可以合成與天然油相似的檀香油。迄今為止，使用其它來源的倍半萜合酶合成一些倍半萜是可能的，但是其組分倍半萜的範圍和每個組分的終比例與天然檀香油並不相似。優選地，本發明的萜烯合酶基因分離自檀香屬的成員。更優選地，其分離自印度檀香(Indian Sandalwood、白擅、Chandana)、澳洲擅香(Australian Sandalwood)或新克裡多尼亞檀香。然而，所述基因還可分離自選自以下的植物密花澳洲檀香(S. acuminatum)(Desert Quandong, Sweet Quandong, Native Peach);濱海夏威夷擅香(S. ellipticum)(濱海檀香);智利檀香(S. fernandezianum);垂枝夏威夷檀香(S. freycinetianum);欖綠夏威夷檀香(S. haleakalae);大花澳洲檀香(S. Ianceolatum)(北澳檀香);巴布亞檀香(S. macgregorii)；鉤葉澳洲檀香(S. murrayanum)(苦Quandong);傘花澳洲檀香(S. obtusifolium);亮葉夏威夷擅香(S. paniculatum);柳葉擅香(S. salicifolium)(柳葉檀香);或斐濟檀香(S. yasi)。因此，提供了分離的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶為檀香屬萜烯合酶；並且所述萜烯合酶催化檀香烯產生。優選地,這樣的職烯合酶包括a)選自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :6所示序列的胺基酸序列；或
b)胺基酸序列，其與SEQ ID NO :2所示序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或c) a)或 b)的片段；其中所述萜烯合酶催化檀香烯產生。在另一個實施方案中，本發明提供了分離的萜烯合酶，其包括a) SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的胺基酸序列；b)由權利要求1-5中任一項的核酸分子所編碼的胺基酸序列；c)胺基酸序列，其與SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或d) (a)、(b)或(C)的片段；其中所述萜烯合酶催化萜烯產生。優選地，這樣的萜烯合酶包含選自對應於SEQ ID NO :2的32-42、221-425、321-325,314-315和423-426位胺基酸的胺基酸。更優選地，所述職烯合酶催化職烯的產生，所述職烯選自單環倍半職、雙環倍半職和三環倍半萜，特別地，其中所述萜烯是從無環焦磷酸萜烯前體如焦磷酸金合歡酯(FPP)合成。SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的核苷酸序列涵蓋單一 0RF。本發明提供了分離的DNA核苷酸序列，其對應於SEQ ID NO: I所示的萜烯合酶基因SaSSy的核苷酸序列、SEQ ID NO :3所示的職烯合酶SauSSy的核苷酸序列或SEQ ID NO :5所示的SspiSSy的核苷酸序列，或與SEQ ID NO U SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5基本同源的序列，或它們的片段。本發明還提供了 DNA序列，其包含以下序列的互補序列SEQ ID NO USEQ ID NO3或SEQ ID NO :5，或與SEQ ID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5基本上同源的序列，或它們的片段。因此本發明提供了編碼萜烯合酶的分離的核酸分子，其選自a)包含SEQ ID NO :I、SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列的核酸分子;b)核酸分子，其為(a)的片段；c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補的核苷酸序列；和d)核酸分子，其編碼萜烯合酶並與(a)-(c)中任一核酸分子具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的相同性；其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。
分離的核酸分子編碼優選地與(a)-(d)中任一核酸分子所編碼的萜烯合酶具有至少或至少約 61%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同性的萜烯合酶，其中序列中的差異為胺基酸取代。SaSSy、SauSSy和SspiSSy的核苷酸序列是非常高度保守的(見圖4)。SEQ ID NO :1所示的SaSSy核苷酸序列編碼在第143位胺基酸具有脯氨酸的多肽(SEQ ID NO 2) o然而，所編碼的多肽在第143位還可具有絲氨酸(SEQ ID NO :7和SEQ IDNO 8)。兩種變體序列為基本同源的，尤其由於這兩個殘基都是極性的，並且隨後的測試已表明，這兩種蛋白質在測定時具有基本相同的活性，並以基本相同的比例產生各種化合物。一般地，兩種變體蛋白具有相同的活性並以相同的比例產生各種化合物。所述DNA序列還可對應於SEQ ID NO U SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5的片段。優選地，所述片段選自SEQ ID NO 1的下列位置961-975位(通常對應於DDxxD基序)，94-126位(通常對應於R(R/P)X8W基序)。不受任何特定理論的約束，相信DDxxD基序負責螯合二價金屬離子(例如，鎂離子)，並且如果被去除，可能造成該蛋白質完全無功能。在蛋 白質起始處的R(R/P)X8I基序也被相信是萜烯合酶獨有的，並且被認為涉及非手性FPP或GPP分別特定地電離為手性的橙花叔醇二磷酸和橙花基二磷酸。通過Kampranis等人(2007)的工作推斷,其它對本發明的三種檀香烯合酶的特定功能來說可能是必不可少的區域是胺基酸位置314和315 (核苷酸位置940-945)。用具有相似極性的較大或較小的殘基取代這些殘基可能會改變活性中心的大小，並因此改變催化產生的產物。如Kampranis等人所證實的,所述檀香烯合酶的第422-426位胺基酸殘基(核苷酸1264-1278)還可能負責終產物譜。在a 19螺旋起始處的脯氨酸殘基的重要性是緊緊把握底物，而去除該脯氨酸可能引起功能性缺失。胺基酸位置221-426定義了涵蓋許多優選保留的更重要區域的較大的區域。因此，在這些位置的殘基優選為保守的(完整功能)，或有稍微變化(改變的功能)。因此，DNA序列還可能優選對應於SEQ ID N0U SEQID NO 3 或 SEQ ID NO 5 的片段，其選自 SEQ ID NO 1 的如下位置940-945、661_1278 或1264-1278 位。同源核酸分子是指預先確定的相同或同源的核苷酸數目。同源性包括不改變所編碼胺基酸的取代(即「沉默取代」)和相同的殘基。基本同源的核酸分子通常以中度嚴格性或高度嚴格性與感興趣的核酸分子的全長或至少約70 %、80 %或90 %的全長雜交。也考慮這樣的核酸分子，其含有替換雜交核酸分子中的密碼子的簡併密碼子。可用已知的計算機算法來確定任何兩個核酸分子是否具有至少
90 %、95 %、96 %、97 %、98 % 或 99 % 的「相同性」，例如 「FAST A」 程序，其使用如 Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =2444(1988)所述的默認參數(其它的程序包括GCG程序包(Devereux, J.等人，Nucleic Acids Research 12(1) :387 (1984))、BLASTP、BLASTN, FASTA (Atschul, S. F.等人，J. Molec. Biol. 215 :403 (1990) ;Guide to HugeComputers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego (1994)和 Carillo 等人，SIAM J Applied Math 48:1073(1988))。其它的商業或公開可用的程序包括DNAStar的「MegAlign」程序(Madison，WI)和威斯康星大學遺傳學計算機組(UWG)的「Gap」程序(Madison WI))。例如，核酸分子同源性或相同性的百分比可通過使用GAP電腦程式(例如，Needleman 等人，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970),如 Smith 和 Watermand 所修改的(Adv.AppI. Math. 2 :482(1981))來比較序列信息而確定。簡言之，GAP程序將相似性定義為相似的比對符號(即核苷酸)的數目除以兩條序列中較短那條的符號總數。GAP程序的默認參數可包括(I) 一元比較矩陣(對與相同性，值為I ;和對於非相同性，值為0)和加權比較矩陣，Gribskov 等人，Nucl. Acids Res. 14 :6745 (1986)，如 Schwartz 和 Dayhoff, eds.，Atlasof Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,pp. 353-358(1979)中所描述的；(2)對每個缺口 3. 0的罰分和每個缺口中每個字符0. 10的額外罰分；和(3)對末端缺口不罰分。當本發明的多核苷酸序列或其片段特異性地與另一 SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸(或其互補鏈)在選擇性的雜交條件下雜交時，貝1J存在基本上的同源性或相同性。如本文中所用，「特異性雜交」是指核酸分子(如，寡核苷酸)與靶核酸分子通過互補的鹼基配對退火。本領域技術人員熟悉影響特異性雜交的體外和體內參數(如特定分子的長度和組成)。與體外雜交特別相關的參數進一步包括退火和洗滌溫度、緩衝液組成和鹽濃度。去除非特異性結合的核酸分子的示範性洗滌條件在高度嚴格性下為0. 1XSSPE,0. 1%SDS，65°C，而在中度嚴格性為0. 2 X SSPE,0. 1% SDS，50°C。等效的嚴格性條件是本領域已 知的。技術人員可輕易地調整這些參數，以在低、中或高度嚴格性條件下實現核酸分子與靶核酸分子(適合於特定應用的)的特異性雜交。一般地，當至少約14個核苷酸的片段存在至少約55%，優選至少約65%，更優選至少約75%，最優選至少約90%相同性時，選擇性雜交將會發生。同源性長度比較，如所描述的，可在更長的片段上進行並且在某些實施方案中經常會在至少約9個核苷酸、通常至少約20個核苷酸、更通常至少約24個核苷酸、一般至少約28個核苷酸、更通常至少約32個核苷酸並且優選至少約36個或更多核苷酸的片段上進行。因此，本發明的多核苷酸序列優選與本文中的序列表所示的序列具有至少75%、更優選至少85%、更優選至少90%的同源性。更優選具有至少95%、更優選至少98%的同源性。核苷酸同源性比較可如下描述的用於多肽的比對進行。優選的序列比較程序是GCGWisconsin Bestfit 程序。在本發明中，同源性序列包括在核酸水平上與相應的SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3或 SEQ ID NO 5 所示的核苷酸序列在至少 20、50、100、200、300、500、1000、1500 或 1710 個核苷酸上具有至少60、70、80或90%相同性，優選至少95%或98%相同性的核苷酸序列。尤其是，同源性一般應考慮編碼已知對萜烯合酶基因功能是必不可少的連續胺基酸序列的核酸序列區域，而不是非必要的鄰近序列。例如，編碼胺基酸位置32-42(核苷酸94-126)和/或胺基酸位置321-325(核苷酸961-975)的核酸序列，和/或可選地編碼胺基酸位置221-426 (核苷酸661-1278)，位置314-315 (核苷酸940-945)和/或位置422-426 (核苷酸1264-1278)的核酸序列。本發明的SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列片段將優選為至少15個核苷酸的長度，更優選至少20、30、40、50、100或200個核苷酸的長度。一般地，多核苷酸序列的長度越短，獲得選擇性雜交所要求的同源性越高。因此，當本發明的多核苷酸序列由少於約30個核苷酸組成時，與本文中序列表所列出的多核苷酸序列相比，應優選相同性的百分比高於75%，優選高於90%或95%。相反地，當本發明的多核苷酸序列由例如多於50或100個核苷酸組成時，與本文中序列表所列出的多核苷酸序列相比，相同性的百分比可較低，例如高於50%，優選高於60%或75%。本發明的與SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示序列同源的核酸序列可根據本領域已知的任何技術表徵並分離，如通過序列特異性的引物擴增、在較高或較低嚴格性條件下與序列特異性的探針雜交、血清學篩查方法或通過LiPA分型系統。SaSSy的基因組DNA序列在SEQ ID NO 9中提供。還提供了 SaSSy、SauSSy和SspiSSy基因的RNA。RNA序列優選源自以上描述並提供於 SEQ ID NO USEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 5 的 DNA 序列。本發明還提供了可與SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因組DNA雜交的RNA片段。所述RNA或RNA片段序列還可源自SaSSy、SauSSy或SspiSSy或其片段的cDNA序列。本發明還提供了包含一些不會實質上改變其與SaSSy、SauSSy或SspiSSy雜交能 力的缺失或突變的核酸序列和片段。這樣的變體被認為形成了上述DNA、RNA或片段的顯而易見的等效物。本發明其它優選的變體核酸序列包括與任何上述給定的本發明的核酸序列相比冗餘的序列，冗餘由遺傳密碼簡併性導致。這些變體核酸序列會因此與其所來源的核酸序列一樣編碼相同的胺基酸序列。優選地，這些變體的DNA、RNA或CDNA可與SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因序列相應的部分雜交。本發明還包括SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的DNA序列或相應的RNA序列或其片段的序列變體，其包含一或多個核苷酸的缺失和/或插入，尤其是一或多個密碼子的插入或缺失。還包括一些非必須核苷酸由其它核苷酸(包括修飾的核苷酸和/或肌苷)的取代。本發明特別優選的變體多核苷酸還包括在嚴格性條件下與任何本發明的核酸序列雜交的序列。因此，優選與如上描述的本發明的任何序列顯示有高程度同源性(相似性)的序列。尤其優選的是與所述本發明的核酸序列具有至少80^^85^^90^^95%或更高同源性的序列。優選地，所述序列將具有所述核酸序列原始核苷酸的少於20 %、15 %、10 %或5%的變異。還提供了引物和探針，其可從本發明的任何DNA或RNA序列或序列片段出發來製備。優選地，這樣的探針或引物長約5至50核苷酸，更優選約10至25核苷酸。優選地，探針或引物寡核苷酸包含來自萜烯合酶核酸分子的至少或至少約15、20、25、30、35、40、45、
50、60個或更多的連續的核苷酸。本發明的探針和引物可用於PCR、測序反應、雜交反應和技術人員已知的其它應用。優選地，探針和/或引物會從易於由技術人員確定的高G和C含量的區域生成。本發明還涉及寡核苷酸引物，其包含SEQ ID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO 5的部分，所述引物能夠作為特異性擴增SaSSy、SauSSy或SspiSSy核酸的引物。優選地，所述引物是單鏈DNA寡核苷酸序列，其能夠作為弓I物延伸產物的合成起始點，所述引物延伸產物與待覆制的核酸鏈是互補的。所用引物的具體長度和序列取決於所需的DNA或RNA靶的複雜度以及引物使用的條件，如溫度和離子強度。擴增引物不是必須與對應的模板序列準確匹配以保證正確的擴增的事實在文獻(Kwok等人，1990)中充分記錄。所用擴增方法可為聚合酶鏈式反應(PCR ;Saiki等人，1988)、連接酶鏈式反應(LCR ；Langdren 等人，1988 ；ffu 和 Wallace, 1989 ；Barany, 1991)、基於核酸序列的擴增(NASBA ；Guatelli 等人，1990 ；Compton, 1991)、基於轉錄的擴增系統(TAS ；Kwoh 等人，1989)、鏈置換擴增(SDA ;Duck，1990 ;Walker等人，1992)或通過Q 3複製酶的擴增(Lizardi等人，1988 ；LomeIi等人，1989)或任何其它合適的使用引物延伸擴增核酸分子的方法。在擴增期間，擴增產物可通過使用標記的引物或摻入標記的核苷酸被方便地標記。標記可能為同位素的(32P、35S等)或非同位素的(生物素、地高辛等)。擴增反應重複20-70次，最好25-45次。本發明還涉及寡核苷酸探針，其包含SEQ ID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的部分，所述探針能夠作為SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因的雜交探針。優選地,所述探針為單鏈的序列特異性寡核苷酸序列，其具有與待測定的SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因的靶序列互補的序列。本領域技術人員會認可雜交的嚴格性會由這樣的條件所影響鹽濃度、溫度或有機溶劑，還有鹼基組成、互補鏈長度和雜交核酸間錯配核苷酸鹼基的數目。嚴格性溫度條件一般會包括超過30°C的溫度，通常超過37°C，並且優選超過45°C。嚴格性鹽條件通常會低於IOOOmM, —般低於500mM，並且優選低於200mM。然而，參數的組合比任何單個的參數更重要。嚴格性雜交條件的一個實例是65°C、0. 1XSSC(1XSSC = 0. 15M NaCl，0. 015M檸檬酸鈉，pH 7.0)。任選地，本發明的探針被標記和/或連接至固體基質。固體基質指寡核苷酸探針可偶聯的任何基質，條件是所述寡核苷酸探針保持雜交特性並使雜交背景保持低水平。固體基質通常是微量滴定板、膜(如尼龍膜或硝酸纖維素膜)或微球(珠)。在施加至膜或固定之前，可方便地修飾核酸探針以促進固定或改進雜交效率。這樣的修飾可涵蓋同聚物加尾、偶聯不同的活性基團(如脂肪基團、NH2基團、SH基團、羧基基團)或偶聯生物素或半抗原。本發明的探針還包括連接至標記或報告分子的分離的多核苷酸並 且可用於通過標準方法分離其它具有序列相似性的多核苷酸序列。用於製備和標記探針的技術見，如Sambrook 和 Russell (2001)或 Ausubel 等人，(2001)。本發明的用作引物或探針的寡核苷酸還可能含有或由核苷酸類似物(如硫代磷酸酯(Matsukura 等人，1987)、燒基磷酸酯(alkylphosphoriate) (Miller 等人，1979)或肽核酸(Nielsen等人，1991 ;Nielsen等人，1993))組成,或可能包含插層劑(Asseline等人，1984)。為了積極地影響如雜交動力學、雜交物形成的可逆性、寡核苷酸分子的生物學穩定性等等性狀，引入這些修飾可能是有益的。本發明還提供了含有SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因DNA序列片段的重組DNA，並且其可能用作，例如，探針。優選地，用於產生重組DNA的質粒是在原核或真核細胞中可擴增的並攜帶所述片段的質粒。例如，使用含有SaSSy基因DNA片段的克隆的DNA作為分子雜交探針，通過放射性核苷酸或螢光試劑標記，例如在檀香樹的不同組織中，該基因可被直接檢測。SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列(優選以探針的形式)還可被固定到固相支持物上來檢測SaSSy基因。在本發明可選的形式中，SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列與其他多核苷酸序列(如來自其他萜烯合酶基因)一起可以這樣的方式被固定於固相支持物，即其允許確定結合固相支持物的適當萜烯合酶基因和/或任何其他多核苷酸序列在材料(如樹樣品)中的存在。在本領域中已經描述了用於產生DNA分子的固定化文庫的技術。一般地，多數現有技術方法描述了單鏈核酸分子文庫的合成，例如使用屏蔽技術在固體基質上的不同的離散位置建立不同的序列排列(permutation)。美國專利號5，837，832描述了用於產生固定於矽基質上的DNA陣列的基於非常大規模的整合技術的改進方法。特別地，美國專利號5，837，832描述了叫做「覆瓦(tiling) 」的用於在基質上空間限定的位置合成特定探針組的策略，其可用於產生本發明的固定化DNA文庫。美國專利號5，837，832還提供了關於可使用的早期技術的參考文獻。因此多核苷酸序列探針可在基質表面原位合成。另外，單鏈分子可不在固體基質上合成而將每個預先形成的序列施加至固體基質上的離散位置。例如，多核苷酸序列可用配備了針腳或壓電器件的機械設備直接印於基質上。
文庫序列一般固定於固體基質的離散區域上或離散區域內。基質可以是多孔的(以允許在基質內的固定)或基本上非多孔的(在該情況下文庫序列通常固定於基質表面)。固體基質可由多肽可直接地或間接地結合的任何材料製成。適當的固體基質的實例包括平板玻璃、矽片、雲母、陶瓷和有機聚合物(如塑料，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯)。也還可能使用半透膜(如廣泛可獲得的硝酸纖維素或尼龍膜)。所述半透膜可安裝於更堅硬的固體表面如玻璃上。其表面可任選地塗有金屬層，如金、鉬或其它過渡族金屬。合適的固體基質的具體實例是商業可得的BiaCoreTM晶片(Pharmacia Biosensors)。優選地，固體基質通常為具有剛性或半剛性表面的材料。在優選的實施方案中，所述基質的至少一個表面為基本平的，不過在一些實施方案中，可能需要用例如凸起區域或蝕刻坑道為不同聚合物進行物理上的分區。所述固體基質還優選為適合於在一般為50至100 u m的離散區域以高密度施加DNA序列，給出10000至40000點/cnT2的密度。所述固體基質可方便地分為區段(section)。這可通過例如光蝕刻技術，或通過應用疏水性油墨，例如基於聚四氟乙烯的油墨(Cel-line, USA)來實現。多核苷酸序列與基質的連接可通過共價或非共價的方法。所述多核苷酸序列可通過文庫序列所結合的一層分子連接於基質。例如，多核苷酸序列可標記有生物素並且基質用抗生物素蛋白和/或鏈黴親和素包被。使用生物素化多核苷酸序列的一個便利的特點是可容易地測定偶聯至固體基質的效率。由於多核苷酸序列可能與一些固體基質僅很差地結合，因此通常有必要在固體基質(例如玻璃)與核酸序列之間提供化學界面。適當的化學界面的實例包括六乙二醇。另一個實例是使用聚賴氨酸包被的玻璃，然後使用標準方法化學修飾聚賴氨酸來引入親和配體。其它的通過使用偶聯劑將分子連接到固體基質表面的方法是本領域已知的，見例如W098/49557。互補多核苷酸序列與被固定的核酸文庫的結合可用各種方法測定，如結合的多核苷酸序列的光學特徵的變化(即通過使用溴化乙錠)或通過使用標記的核酸如用螢光團標記的多核苷酸。其它不需要使用標記的檢測技術包括光學技術如光聲學、反射法、橢圓偏光法和表面等離子共振(見W097/49989)。因此，本發明提供了固體基質，其具有固定於其上的至少一種本發明的多核苷酸，優選兩或多種不同的本發明的多核苷酸序列。在優選的實施方案中固體基質還含有源自除SaSSy、SauSSy或SspiSSy多核苷酸序列以外的基因的多核苷酸序列。優選地，SaSSy、SauSSy或SspiSSy基因的轉錄被上調或促進(例如在人工系統如宿主細胞或重組植物中)，其可導致提高的油產量。這種上調或提高可由極多方法完成，如插入額外的或可選的調控序列至考慮中的基因的上遊和/或下遊，或產生已存在的調控序列的突變體，所述突變體能夠由於例如其調控元件結合的提高而提高轉錄。本發明還覆蓋了由上述RNA和DNA核苷酸序列及其片段所編碼的多肽。本發明還提供了如 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的分離的 SaSSy、SauSSy 或SspiSSy胺基酸序列及其片段。更合乎需要地，所述SaSSy、SauSSy或SspiSSy胺基酸序列以基本上純化的形式提供。也提供多肽片段，其具有更低分子量並具有與SEQ ID N0:2、SEQID NO :4或SEQ ID NO :6所示那些一樣的肽序列或片段。如本文中所用，「胺基酸」為含有氨基基團和羧酸基團的有機化合物。多肽含有兩個或多個胺基酸。為了本文中的目的，胺基酸包括20種天然存在的胺基酸、非天然胺基酸和胺基酸類似物(即其中的a碳具有側鏈的胺基酸)。為了符合在 J. Biol. Chem.，243 :3552-3559(1969)中描述的和 37C. F. R. . § § I. 821-1. 822所採用的標準多肽命名法，胺基酸殘基的縮寫示於下列的對應表
中
權利要求
1.分離的核酸分子，其編碼萜烯合酶並選自 a)包含SEQID NO USEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示核苷酸序列的核酸分子； b)核酸分子，其為(a)的片段； c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補的核苷酸序列；和 d)核酸分子，其編碼萜烯合酶並與(a)-(c)的任一核酸分子具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的相同性； 其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。
2.權利要求I的分離的核酸分子，其編碼與(a)-(d)的任一核酸分子所編碼的萜烯合酶具有至少或至少約 61%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%的相同性的萜烯合酶，其中序列上的差異為胺基酸取代。
3.權利要求I或2的核酸分子，其包含編碼SEQID NO :2所示胺基酸序列的32-42、221-426、321-325、314-315或422-426位胺基酸的核苷酸序列。
4.權利要求1-3中任一項的核酸分子,其中所編碼的職烯合酶是檀香屬(Santalum)職烯合酶。
5.權利要求1-4中任一項的核酸分子，其編碼選自印度檀香(S.album)、澳洲檀香(S. spicatum)、新克裡多尼亞檀香(S. austrocaledonicum)、密花澳洲檀香(S. acuminatum)、濱海夏威夷擅香(S. ellipticum)、智利擅香(S. fernandezianum)、垂枝夏威夷檀香(S. freycinetianum)、欖綠夏威夷檀香(S. haleakalas)、大花澳洲檀香(S. Ianceolatum)、巴布亞擅香(S. macgregorii)、鉤葉澳洲擅香(S. murrayanum)、傘花澳洲擅香(S. obtusifolium)、亮葉夏威夷擅香(S. paniculatum)、柳葉擅香(S. salicifolium)和斐濟檀香(S. yasi)職烯合酶的職烯合酶。
6.分離的萜烯合酶，其中 所述萜烯合酶為檀香屬萜烯合酶；和 所述萜烯合酶催化檀香烯產生。
7.權利要求6的萜烯合酶，其包含 a)選自SEQID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示序列的胺基酸序列；或 b)胺基酸序列，其與SEQID N0:2所示胺基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或 c)a)或b)的片段； 其中所述萜烯合酶催化檀香烯產生。
8.分離的萜烯合酶，其包含 a)SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的胺基酸序列； b)權利要求1-5中任一項的核酸分子所編碼的胺基酸序列； c)胺基酸序列，其與SEQID N0:2所示的胺基酸序列具有至少或至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的相同性；或 d)(a)、(b)或(c)的片段； 其中所述萜烯合酶催化萜烯產生。
9.權利要求8的萜烯合酶，其包含選自對應於SEQID NO :2的32-42、221-425、321-325,314-315和423-426位胺基酸的胺基酸。
10.權利要求8或9的職烯合酶,其催化職烯的產生,所述職烯選自單環倍半職、雙環倍半萜和三環倍半萜。
11.權利要求6-10中任一項的職烯合酶,其中所述職烯是由無環焦磷酸職烯前體合成。
12.權利要求11的萜烯合酶，其中所述前體為焦磷酸金合歡酯(FPP)。
13.權利要求6-12中任一項的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶能夠在FPP的C3和C7碳原子之間形成鍵以產生至少一種包含C3-C7鍵的雙環或三環倍半萜。
14.權利要求13的萜烯合酶，其中所述具有C3-C7鍵的倍半萜構成所述萜烯合酶所合成的倍半萜產物總量的至少或至少約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
15.權利要求13或14的萜烯合酶，其中所述倍半萜為檀香烯。
16.權利要求15的萜烯合酶，其中所述檀香烯為a-檀香烯或0 -檀香烯。
17.權利要求15或16的萜烯合酶，其中所述檀香烯為選自(+)_表-￠-檀香烯、(-)-3-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+) - a -檀香烯和(-)-a -檀香烯的立體異構體。
18.權利要求6-17中任一項的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶能夠在FPP的C2和C7碳原子之間形成鍵以產生至少一種包含C2-C7鍵的雙環或三環倍半萜。
19.權利要求18的萜烯合酶，其中所述具有(2-(7鍵的倍半萜構成了所述萜烯合酶所合成的倍半萜產物總量的至少或至少約1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
20.權利要求18或19的萜烯合酶，其中所述倍半萜為香檸檬烯。
21.權利要求18-20中任一項的萜烯合酶，其中所述倍半萜為選自順式-a-香檸檬烯、反式-a -香檸檬烯、反式-香檸檬烯和順式-P -香檸檬烯的香檸檬烯立體異構體。
22.權利要求6-21中任一項的萜烯合酶，其中 所述萜烯合酶催化a-檀香烯產生，並且所產生的a-檀香烯的量至少為或至少約為所產生的萜烯總量的 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
23.權利要求6-22中任一項的萜烯合酶，其中 所述萜烯合酶催化￠-檀香烯產生，並且所產生的￠-檀香烯的量至少為或至少約為所產生的萜烯總量的 1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
24.權利要求6-23中任一項的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶催化兩種或多種萜烯產生。
25.權利要求24的職烯合酶,其中至少一種職烯選自(+)_表-P-檀香烯、(-)_0 -檀香烯、(+)-0-檀香烯、(+) - a -檀香烯和(-)-a -檀香烯、E- a -香朽1檬烯、Y -薑黃烯、3 -紅沒藥烯、￠-薑黃烯、a -薑黃烯、反式-反式-金合歡醇、a -菔烯、茨烯、朽1檬烯和a-異松油烯。
26.權利要求6-25中任一項的萜烯合酶，其中所述萜烯合酶同時催化a-檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-P -檀香烯和P -檀香烯的產生。
27.權利要求26的萜烯合酶，其在同一反應混合物中、在相同反應條件下催化至少a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯的產生。
28.權利要求26的萜烯合酶，其催化a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-￠-檀香烯和￠-檀香烯以下述彼此之間的比例產生a-檀香烯(38.0%)、a-反式-香檸檬烯(12. 1% )、表-￠-檀香烯(4.7% )和 ￠-檀香烯(45.2% )。
29.權利要求6-28中任一項的萜烯合酶，其催化a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-3 -檀香烯和3 -檀香烯的產生，使得進一步處理後，所述化合物產生以下彼此之間的比例的各自的醇a -檀香醇(25-65% )、a -反式-香檸檬醇(1-20% )、表-P -檀香醇(1-15% )和 ￠-檀香醇(20-50% )。
30.編碼權利要求6-29中任一項的萜烯合酶的核酸分子。
31.引物或探針寡核苷酸，其含有來自權利要求1-5中任一項的核酸分子的至少或至少約15、20、25、30、35、40、45、50、60個或更多的連續核苷酸。
32.用於檢測樣品中萜烯合酶存在的方法，包括以下步驟 a)使可能含有權利要求6-29中任一項的萜烯合酶的樣品與特異性結合萜烯合酶的抗體在使得包含所述抗體和萜烯合酶的反應複合物形成的條件下相接觸；和 b)檢測樣品中包含所述抗體和萜烯合酶的反應複合物的形成，其中檢測出所述反應複合物的形成表明在樣品中存在萜烯合酶。
33.權利要求32的方法，其進一步包括步驟 c)評估所形成的反應複合物的量，從而確定生物學樣品中萜烯合酶的量。
34.用於檢測生物學樣品中的核酸分子的方法，包括以下步驟 a)在合適的雜交條件下使所述生物學樣品與權利要求31的引物或寡核苷酸相接觸；和 b)檢測引物或寡核苷酸與所述樣品中的核酸分子之間形成的任何雙鏈體。
35.用於檢測生物學樣品中的萜烯合酶核酸分子的方法，包括以下步驟 a)用至少一種權利要求31的引物或寡核苷酸來擴增所述核酸分子，和 b)檢測擴增的核酸分子。
36.載體,其包含權利要求1-5或權利要求30中任一項的核酸分子。
37.權利要求36的載體,其中所述載體為原核載體、病毒載體或真核載體。
38.權利要求36或37的載體，其為表達載體。
39.細胞，其包含權利要求36-38中任一項的載體。
40.權利要求39的細胞，其為原核細胞。
41.權利要求39的細胞，其為細菌細胞。
42.權利要求39的細胞，其為真核細胞。
43.權利要求42的細胞，其中所述真核細胞為酵母細胞或植物細胞。
44.權利要求43的細胞，其中所述植物細胞來自茄科(Solaniaceae)或唇形科(Lamiaceae)植物。
45.權利要求39-44中任一項的細胞所產生的萜烯合酶。
46.用於製備萜烯合酶的方法，其包括步驟在使所編碼的萜烯合酶表達的條件下培養權利要求39-44中任一項的細胞。
47.權利要求46的方法,其進一步包括純化所述職烯合酶。
48.產生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟 a)選擇宿主生物體和/或細胞，其不表達具有SEQID NO U SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 5所不序列的核酸分子； b)用具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示序列的核酸分子轉化所述生物體；和 c)在有助於由所述核酸編碼的萜烯合酶產生的條件下培養所述生物體。
49.產生萜烯合酶的方法，所述方法包括以下步驟 a)選擇宿主生物體和/或細胞，其表達具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO:5所不序列的核酸分子； b)用具有SEQID NO USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示序列的核酸分子以較高的量轉化所述生物體；和 c)在有助於由所述核酸編碼的萜烯合酶產生的條件下培養所述生物體。
50.製備萜烯的方法，其包括 a)使無環焦磷酸萜烯前體與權利要求6-29或45中任一項的萜烯合酶相接觸，和， b)任選地，分離在步驟(a)中產生的職烯。
51.權利要求50的方法，其中 所述萜烯合酶在細胞異源表達； 所述無環焦磷酸萜烯前體與所述萜烯合酶表達於同一細胞中；和 所述與無環焦磷酸前體接觸的步驟發生在所述細胞中。
52.製備至少一種萜烯的方法，其包括 a)在有助於萜烯產生的條件下培養細胞，其中所述細胞異源表達權利要求6-29中任一項的萜烯合酶；並且所述細胞表達無環焦磷酸萜烯前體；和 b)任選地，從非人生物體分離所述職烯。
53.權利要求50-52中任一項的方法，其中所述無環焦磷酸萜烯前體選自焦磷酸香葉酯(GPP)、焦磷酸金合歡酯(FPP)和焦磷酸香葉基香葉酯(GGPP)。
54.權利要求50-53中任一項的方法,其中所述職烯選自倍半職、二職和單職。
55.權利要求50-54中任一項的方法，其中所述萜烯為雙環或三環倍半萜。
56.權利要求50-55中任一項的方法,其中所述職烯選自a-檀香烯、a-反式-香朽1檬烯、表-￠-檀香烯、￠-檀香烯、Y-薑黃烯、￠-紅沒藥烯、￠-薑黃烯、a-薑黃烯、反式-反式-金合歡醇、a -菔烯、莰烯、檸檬烯和a -異松油烯。
57.權利要求50-55中任一項的方法，其中所述職烯選自(+)-表-P-檀香烯、(-)-3-檀香烯、(+) - 3 -檀香烯、(+) - a -檀香烯和(-)-a -檀香烯。
58.權利要求50-57中任一項的方法，其中產生兩種或多種萜烯。
59.權利要求58的方法，其中至少一種萜烯選自a-檀香烯、￠-檀香烯、香檸檬烯、Y-薑黃烯、￠-紅沒藥烯、￠-薑黃烯、a-薑黃烯、反式-反式-金合歡醇、a-菔烯、莰烯、檸檬烯和a -異松油烯。
60.權利要求58的方法，其中至少一種萜烯選自(+)_表-￠-檀香烯、(-)-P-檀香烯、(+)-3-檀香烯、(+) - a -檀香烯、(-)-a -檀香烯、順式-a -香檸檬烯、反式-a -香檸檬烯、反式_香朽1檬烯和順式_香朽1檬烯。
61.權利要求50-60中任一項的方法，其中 所述萜烯為a-檀香烯；和 所產生的a -檀香烯的量至少或至少約為所產生的萜烯總量的1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
62.權利要求50-60中任一項的方法，其中 所述萜烯為￠-檀香烯；並 所產生的P -檀香烯的量至少或至少約為所產生的萜烯總量的I %、2 %、3 %、4 %、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 或更多。
63.權利要求53-62中任一項的方法，其中 至少產生四種萜烯； 所述四種萜烯包括a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯；和a-檀香烯、a-反式-香檸檬烯、表-￠-檀香烯和￠-檀香烯以下述彼此之間的比例產生a-檀香烯(38.0% )、a-反式-香檸檬烯(12. I %)、表-P -檀香烯(4.7%)和￠-檀香烯(45. 2% )。
64.權利要求50-63中任一項的方法，其進一步包括將所述萜烯處理為醇。
65.權利要求64的方法，其中所述醇選自a-檀香醇、￠-檀香醇、a-反式-香檸檬醇和表-檀香醇。
66.權利要求64或65的方法,其中 至少產生四種萜烯； 所述四種萜烯包括a -檀香烯、a -反式-香檸檬烯、表-0 -檀香烯和P -檀香烯；和在進一步處理後，a -檀香醇、a -反式-香檸檬醇、表-3 -檀香醇和0 -檀香醇以下述彼此之間的比例產生a -檀香醇(25-65% )、a -反式-香檸檬醇(1-20% )、表-P _檀香醇(1-15% )和P -檀香醇(20-50% )。
67.權利要求66的方法，其中a-檀香醇、a-反式-香檸檬醇、表-￠-檀香醇和￠-檀香醇彼此之間的比例為a_檀香醇(59. 28%)、a-反式-香檸檬醇(7. 32% )、表-P -檀香醇(3. 45% )和￠-檀香醇(29. 0% )0
68.用於證明萜烯合酶存在的試劑盒，其包括 a)預定量的至少一種配體，其結合權利要求6-29中任一項的萜烯合酶，其中所述配體包含可檢測的標記； b)其它試劑；和 c)使用所述試劑盒的說明書。
69.用於證明編碼萜烯合酶的核酸分子存在的試劑盒，其包括 a)預定量的至少一種標記的權利要求1-5中任一項的核酸分子或權利要求35的引物； b)其它試劑；和 c)使用所述試劑盒的說明書。
70.權利要求32-35中任一項的方法，其中所述樣品來自檀香樹。
71.權利要求70的方法，其中 在來自兩種不同檀香樹的至少兩個樣品上實施所述方法； 測定每個樣品中的萜烯合酶或編碼萜烯合酶的核酸的量； 選擇含有最高量的萜烯合酶或編碼萜烯合酶的核酸的樣品所來源的檀香樹；並 對所選擇的檀香樹進行選擇性育種或收穫以獲取檀香油。
72.權利要求6-29中任一項的萜烯合酶，其還包括化學、酶學或翻譯後修飾。
73.權利要求72的萜烯合酶，其中所述化學、酶學或翻譯後修飾選自乙醯化、糖基化、羧基化、羥基化、硫酸化、磷酸化、泛素化和標記。
74.標記的權利要求6-29中任一項的萜烯合酶，其中所述標記選自放射性同位素、抗配體、螢光團、化學發光劑和酶。
75.權利要求6-29中任一項的萜烯合酶，其為融合蛋白或嵌合蛋白。
76.權利要求6-29中任一項的萜烯合酶，其中位於對應於SEQID NO :2的143位胺基酸位置的胺基酸殘基為絲氨酸。
全文摘要
分離的核酸分子，其編碼萜烯合酶並選自a)包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示核苷酸序列的核酸分子；b)核酸分子，其為(a)的片段；c)核酸分子，其包含與(a)或(b)互補的核苷酸序列；和d)核酸分子，其編碼萜烯合酶並與(a)-(c)的任一核酸分子具有至少或至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的相同性；其中所述核酸分子編碼萜烯合酶。
文檔編號C12N15/63GK102725410SQ201080038885
公開日2012年10月10日 申請日期2010年6月25日 優先權日2009年6月29日
發明者C·瓊斯, J·博爾曼, J·莫尼奧迪斯, K·G·楚拉克 申請人:森林產品委員會, 英屬哥倫比亞大學, 西澳大學