中藥藿蜂酮免疫增強劑的製作方法

2023-07-05 18:16:06 1

專利名稱：中藥藿蜂酮免疫增強劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種中藥藿蜂酮免疫增強劑，由淫羊藿提取物和蜂膠黃酮製成，簡稱 為藿蜂酮增免劑，屬於畜禽免疫佐劑領域。
背景技術：
畜禽傳染病一直是危害畜牧業發展的首要問題，尤其是當前流行的重大病毒性傳 染病，迄今尚無有效的治療方法，疫苗預防仍是最主要的措施。由於種種原因，多數疫苗只 有與免疫增強劑或免疫佐劑配合應用才能發揮良好的防疫效果。但是，目前國內外廣泛使 用的油乳類、鋁膠類等化學性免疫佐劑常有副作用大、局部刺激強、致癌、製備和使用麻煩 或不能足夠提高弱抗原的免疫原性等弊端。因此，研製開發高效、安全的新型免疫增強劑 成為亟待解決的問題。研究表明，許多中藥具有免疫增強作用，具備高效、安全的優勢。但 是尚無名副其實的中藥免疫增強劑產品問市，而且一些具有增強免疫作用的方劑多處方復 雜、給藥不便等不足。本發明通過多年的努力，從組分藥篩選到方劑篩選和劑型篩選，結合 成本和方便應用等方面綜合比較，研製成功由淫羊藿提取物和蜂膠黃酮製成的藿蜂酮增免 劑。

發明內容
技術問題本發明針對當前動物疫病防控現有技術中急需高效、安全的免疫增強劑 或疫苗佐劑的問題，提供一種由淫羊藿提取物和蜂膠黃酮製成的新型中藥免疫增強劑。技術方案本發明一種新型中藥免疫增強劑，其特徵在於，每1000ml藥液由淫羊藿 15g、酒制蜂膠5g製成。藥液中的多糖、黃酮質量比含量均不低於0. 07%。生產每1000ml藥液的工藝流程為淫羊藿水煎2次，合併濾液，85°C減壓濃縮至 835ml，加丙三醇35ml混勻；酒制蜂膠加95%乙醇75ml使溶解，靜置，濾過，濾液回收乙醇 至65ml，加入聚乙二醇-400 65ml，混勻，緩慢加入到淫羊藿溶液中，混勻，分裝，滅菌，獲 得。淫羊藿多糖的提取工藝為加淫羊藿20倍質量水煎煮2次，第一次1. 5小時、第二 次1小時。有益效果本發明的基礎工作首先選擇有增強免疫作用的中藥成分，比較它們的增 強免疫作用，篩選出作用較好的淫羊藿多糖、蜂膠黃酮，按不同比例組成多個複方，通過系 列試驗比較，證明複方的效果強於單味藥，篩選出效果最好的組方配比。為簡化工藝、節約 成本和充分利用資源，以淫羊藿提取物(含同量淫羊藿多糖)替代方中的淫羊藿多糖，通過 臨床試驗比較證明，其增強免疫效果與原方的差異不顯著，確定了藿蜂酮增免劑的處方。通過正交試驗和反覆比較確定了淫羊藿提取物和蜂膠黃酮的提取條件，在儘量少 用有機溶劑用量的前提下確定了藿蜂酮增免劑的生產工藝。比較了藿蜂酮增免劑與2個製備藥有效成分方劑的免疫增強作用，證明藿蜂酮增 免劑在體外能顯著促進雞外周血淋巴細胞增殖，從而增強細胞免疫，效果優於2個對照方
3劑(表1、表2)；配合新城疫疫苗免疫雛雞，能顯著提高血清抗體效價、促進淋巴細胞增殖， 增強雛雞的細胞免疫和體液免疫，提高新城疫苗的免疫應答(表3、表4)。比較了藿蜂酮增免劑不同劑量對新城疫疫苗的免疫增強作用，證明藿蜂酮增免劑 在合適的劑量能顯著提高免疫雛雞的血清抗體效價，促進淋巴細胞增殖，增強雞的細胞免 疫和體液免疫，提高新城疫疫苗的免疫效果；o. 75mg為雛雞的最佳劑量(表5、表6)。與現有技術相比，本發明優點如下1.與化學佐劑相比，藿蜂酮增免劑效果可靠，而且來源於天然中藥，無毒副作用， 無藥殘隱患，保障動物源食品安全；生產對環境無汙染，符合綠色環保的要求。2.與傳統中藥方劑相比，藿蜂酮增免劑處方精練，成分明確，質量可控，劑型先進， 給藥方便。3.與同類中藥成分方劑相比，藿蜂酮增免劑功效提高，單用或配合新城疫疫苗免 疫雛雞，能顯著增強細胞免疫和體液免疫，提高疫苗的免疫應答。
具體實施例方式1.製備工藝(1)淫羊藿提取物的製備以淫羊藿提取物和淫羊藿多糖的得率為指標，對加水量、 煮沸時間和提取次數進行正交試驗，確定淫羊藿提取物的最佳提取工藝為加20倍水煎煮2 次，第一次1. 5h、第二次lh。稱取淫羊藿飲片15g，按以上工藝水煎，合併濾液，85°C減壓濃 縮至835ml，得到淫羊藿提取物溶液。(2)蜂膠黃酮的製備在反覆比較的基礎上，確定蜂膠黃酮的提取工藝。稱取酒制蜂 膠5g，加95%乙醇75ml使溶解，靜置，濾過，濾液回收乙醇至65ml，得到蜂膠黃酮溶液。(3)藥液製備通過反覆比較，確定藿蜂酮增免劑的生產工藝。取淫羊藿提取液，加 丙三醇35ml，混勻；取蜂膠黃酮溶液，加入聚乙二醇-400 65ml，混勻，緩慢加入到淫羊藿溶 液中，混勻，分裝，滅菌，獲得。分別用苯酚-硫酸法、用蘆丁法測定藥液中的多糖、黃酮含 量，兩者的含量不低於0. 07%。2.增強免疫效果比較(1)體外增強免疫效果方法在組分藥篩選、方劑反覆篩選的基礎上，確定藿蜂酮增免劑的處方，另製備 兩個製備藥的有效成分的方劑，對照方1由淫羊藿黃酮加蜂膠黃酮組成，對照方2由淫羊藿 黃酮加蜂膠粗提物組成。首先測定3個方劑對雞外周血淋巴細胞的安全濃度，然後將3個方 劑用細胞培養液(RPMI1640)分別稀釋成 15. 625,7. 813,3. 906、1. 953 和 0. 977 u g .mL-1 共 5種濃度，分別加入到培養的雞外周血淋巴細胞中，用MTT法測定淋巴細胞增殖(A5TO值)， 作為淋巴細胞增殖的指標；並計算刺激指數(stimulating index, SI, SI =試驗孔A57(1均值 /對照孔A5TO均值)，比較3個方劑的作用強弱。結果①淋巴細胞增殖的變化藿蜂酮增免劑在0. 977,7. 813和15. 625 u g mL—1 時的細胞A5TO值顯著大於細胞對照組(P < 0. 05)，而2個對照方在低濃度時的A570值大於 細胞對照組，但差異不顯著(表1)。表1各組淋巴細胞增殖的變化(A57Q值) 注同列數據標註不含相同字母者差異顯著(P < 0. 05)，以下表同。②刺激指數的比較藿蜂酮增免劑在15. 625、和0. 977 μ g · mL—1時的刺激指數顯 著大於2個對照方組(P < 0. 05)，在其餘3個濃度多稍大於2個對照方組(表2)。表23個方劑刺激雞淋巴細胞增殖效果的比較(Si) 以上結果表明，藿蜂酮增免劑在體外能顯著刺激雞外周血淋巴細胞增殖，從而增 強細胞免疫，效果優於2個對照方(2)體內增強免疫效果方法14日齡免疫健康羅曼蛋公雞250羽，隨機均分為5組，除空白組外均用新城 疫IV苗滴鼻、點眼免疫(3羽份/羽)，28日齡二免。在首次免疫的同時，藿蜂酮增免劑、對 照方1和對照方2組分別同時肌肉注射相應藥物，0. 5mL/羽，免疫對照組和空白對照組注 射等量生理鹽水，分別於免疫後第7 (D7)、14 (D14)、21 (D21)和28 (D28)天每組隨機抽取6羽採 血，用β -微量法測定血清ND-HI抗體效價，用MTT法測定外周血T淋巴細胞增殖。結果①抗體效價的變化藿蜂酮增免劑組在首次免疫後4個時間點的抗體效價 最高均為最高。在首次免疫後第7天(D7)顯著高於免疫對照和空白對照組(P < 0. 05)，分 別比2個對照方高0. 5個滴度；在其後3個時間點顯著高於其餘各組(P < 0. 05)；在D14，分 別比對照方1、對照方2高1. 5,1. 33個滴度；在D21，分別比對照方1、對照方2高1. 33、1. 0 個滴度；在D28，分別比對照方1、對照方2高0. 84,0. 67個滴度(表3)。表3各組血清抗體效價的變化(Log2) ②淋巴細胞增殖的變化藿蜂酮增免劑組在首次免疫後4個時間點的A5TO值均為 最高，在首次免疫後第7天(D7)顯著高於免疫對照和空白對照組(P < 0. 05)，稍高於2個 對照方組；再其後的3個時間點均顯著高於其餘各組(P < 0. 05)(表4)。表4各組淋巴細胞增殖的動態變化(A5TO值) 以上結果表明，藿蜂酮增免劑配合新城疫疫苗免疫雛雞，能顯著提高血清抗體效 價，促進淋巴細胞增殖，增強雛雞的細胞免疫和體液免疫，提高新城疫苗的免疫應答。5.藿蜂酮增免劑最佳劑量的篩選方法將藿蜂酮增免劑分別製成3. 0,2. 5,2. OU. 5,1. 0,0. 5和0. 25mg/ml 7種濃 度。取14日齡免疫健康羅曼蛋公雞270羽，隨機均分為9組，除空白組外均用新城疫IV 苗滴鼻、點眼免疫(2羽份/羽)，28日齡二免。在首次免疫的同時，藿蜂酮增免劑的7個 劑量組分別同時肌肉注射相應濃度的藥物0. 5mL,即分別每羽1. 5,1. 25,1. 0,0. 75,0. 5、 0. 25和0. 125mg,免疫對照組和空白對照組注射等量生理鹽水，分別於首次免疫後第7 (D7)、 14(D14)、21(D21)和28(D28)天採血，用微量法測定各組的血清ND-HI抗體效價，用MTT 法測定1. 25,0. 75,0. 25mg組的淋巴細胞增殖。結果(1)血清抗體效價的變化藿蜂酮增免劑各劑量組在各時間點的抗體效價 多明顯或顯著高於免疫對照組和空白對照組，0. 75mg組在各時間點的抗體效價均為最高； 在首次免疫後第7天(D7)，0. 75、1. 0和1. 5mg組高於免疫對照組和空白對照(P < 0. 05)； 在D14，0. 75mg組顯著高於其餘各組(P < 0. 05)；在D21，0. 75、1. 0、1. 25和1. 5mg組顯著高 於免疫對照組和空白對照(P < 0. 05)；在D28，0. 75mg組顯著高於免疫對照組和空白對照(P < 0. 05)(表 5)。表5各組血清抗體效價的變化(1呢2) (2)淋巴細胞增殖的變化藿蜂酮增免劑各劑量組在各時間點的A5TO值多明顯或 顯著高於免疫對照組和空白對照組。在首次免疫後第7天(D7)，藿蜂酮增免劑3個劑量組 的A5TO值均顯著大於免疫對照組(P < 0. 05)；在D14，0. 75,0. 25mg組顯著大於免疫對照組 (P < 0. 05)；在 D21，0. 75、1. 25mg 組的顯著大於其餘 3 組(P < 0. 05)；在 D28，0. 75mg 組顯著 大於其餘各組(P < 0. 05)(表6)。表6淋巴細胞增殖的變化 以上結果表明，藿蜂酮增免劑在合適的劑量能顯著提高新城疫疫苗免疫雛雞的血 清抗體效價，促進淋巴細胞增殖，增強雛雞的細胞免疫和體液免疫功能，提高新城疫疫苗的 免疫效果；雛雞每次肌肉注射0. 75mg為最佳劑量。
權利要求
一種中藥藿蜂酮免疫增強劑，由淫羊藿提取物和蜂膠黃酮製成，簡稱為藿蜂酮增免劑，其特徵在於，每1000ml藥液由淫羊藿15g和酒制蜂膠5g製成。
2.根據權利要求1所述的中藥藿蜂酮免疫增強劑，其特徵在於，藥液中的多糖、黃酮質 量比含量均不低於0. 07%。
3.權利要求1或2所述中藥藿蜂酮免疫增強劑的製備方法，其特徵在於，淫羊藿水煎2 次，合併濾液，85°C減壓濃縮至835ml，加丙三醇35ml混勻；酒制蜂膠加95%乙醇75ml使溶 解，靜置，濾過，濾液回收乙醇至65ml，加入聚乙二醇-40065ml，混勻，緩慢加入到淫羊藿溶 液中，混勻，分裝，滅菌，獲得。
4.根據權利要求3所述中藥藿蜂酮免疫增強劑的製備方法，其特徵在於，淫羊藿多糖 的提取工藝為加淫羊藿20倍質量水煎煮2次，第一次1. 5小時、第二次1小時。
全文摘要
本發明涉及一種中藥藿蜂酮免疫增強劑，簡稱為藿蜂酮增免劑，屬於畜禽免疫佐劑領域。每1000ml藥液由淫羊藿15g，酒制蜂膠5g製成。淫羊藿水煎2次，合併濾液，濃縮，製成870ml；酒制蜂膠加乙醇溶解，過濾，濃縮，製成130ml，與淫羊藿提取液混合，製得。通過免疫試驗證明，藿蜂酮增免劑在體外能顯著刺激雞淋巴細胞增殖，配合新城疫疫苗免疫雛雞，能顯著提高血清抗體效價，促進淋巴細胞增殖，增強雛細胞免疫和體液免疫，提高疫苗的免疫應答。
文檔編號A61P37/04GK101869590SQ201010211988
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者劉家國, 張寶康, 王德雲, 胡元亮, 範雲鵬 申請人:南京農業大學