從大豆工藝流中分離的純化的庫尼茲胰蛋白酶抑制劑蛋白的製作方法

2023-07-28 05:18:36

專利名稱：從大豆工藝流中分離的純化的庫尼茲胰蛋白酶抑制劑蛋白的製作方法
技術領域：
本公開提供了從大豆エ藝流中分離和回收並具有至少約95重量％的總KTI蛋白濃度的新型庫尼茲(Kunitz)胰蛋白酶抑制劑(KTI)亞型。發明背景
抑制蛋白分解酶類的蛋白經常以高濃度存在於很多種子和其它的植物貯藏器官中。抑制劑蛋白還存在於幾乎全部的動物組織和體液中。由於這些蛋白結合併抑制來自動物和微生物的蛋白分解酶類的能力，多年來它們已成為大量研究的對象。在醫學和生物學中，抑制劑已成為蛋白水解研究的有用工具。由於蛋白酶抑制劑在控制涉及一些疾病如膜腺炎、休克和肺氣腫的蛋白酶方面，以及作為用於調節哺乳動物受精作用的劑方面的治療潛力，它們是尤其受關注的。包含顯著量的蛋白酶抑制劑的大豆エ藝流。蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶以及可能抑制調控ー些關鍵代謝功能的多種其它關鍵跨膜蛋白酶。蛋白酶的局部給藥對於例如特應性皮炎的病症是有用的，特應性皮炎是皮膚炎症的ー種普通形式，其可以局限於少數區塊或者涉及身體的大部分。蛋白酶抑制劑的褪色活性和它們防止紫外線導致的色素沉著的能力在體外和體內均已被證明(參見，例如，Paine等人，J. Invest. Dermatol.，116 :587-595[2001])。蛋白酶抑制劑還被報導有利於創傷癒合。例如，分泌性白細胞蛋白酶抑制劑被證明當被局部施用時逆轉了組織的破壞並加速了創傷癒合過程。此外，絲氨酸蛋白酶抑制劑還能夠有助於在紅斑狼瘡病人中降低疼痛(參見，例如，美國專利6，537,968)。天然存在的蛋白酶抑制劑可見於多種食物中，例如糧穀類(燕麥、大麥和玉米)、芽甘藍、洋蔥、甜菜根、小麥、龍爪稷和花生。所關注的ー個來源是大豆。從大豆和其它豆類中已鑑定了兩大類的蛋白酶抑制劑超家族，每ー類具有多種同エ抑制劑。庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)是第一類的重要成員，第一類的成員具有大約170-200個胺基酸、介於20-25kDa之間的分子量，並且主要針對胰蛋白酶。庫尼茲胰蛋白酶抑制劑通常是具有以兩個ニ硫鍵連接的4個半胱氨酸、並且具有一個位於由ニ硫鍵限定的環中的反應性位點的單鏈多肽。第二類的抑制劑包含60-85個胺基酸，具有6-10kDa範圍的分子量，相對地熱穩定，並且在獨立的結合位點抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。Bowman-Birk抑制劑(BBI)是這ー類的ー個實例。大豆中存在的蛋白酶抑制劑的平均水平，對於KTI和BBI最重要的蛋白酶抑制劑而言分別是約I. 4%和0. 6%。要注意的是，這些低水平使得分離天然的蛋白酶抑制劑用於臨床用途是不現實的。現有技術尚未描述從大豆蛋白來源獲得的、不使用酸或醇萃取或者丙酮沉澱的、具有高純度水平的KTI產品。本領域公開的用於分離KTI產品的方法已被描述於下列的特定參考文獻中，但沒有導致高純度KTI產品的分離。J.Agric.Food Chem. 39 (5)862-866(1991) ；Protein Expression and Purification 30 167-170(2003) ；J. Agric.Food Chem. 57(15) :7022-7029(2009) ；FEBS Letters 294(1,2) :141-143(1991) Journalof Food Science,54(3) :606-617(1989) ;Journal of Agriculture and Food Chemistry,49(3) 1069-1086 (2001) ；Journal of Agriculture and Food Chemistry,35 (2)205-209(1987) ；Yamamoto,M.和 Ikenaka,T. , Studies on Soybean Trypsin Inhibitors.I. Purification and Characterization of Two Soybean Trypsin Inhibitors.J.Biochem. (Tokyo),62(2),141-149(1967) ；Birk, Y. , The Bowman-Birk inhibitor trypsin-and chymotrypsin-inhibitor from soybeans, Int. J. Peptide Protein Res.,25(2). 113-131 (1985) ；Hwang, D. , Davis Lin, K. T. , Yang, ff. , Foard, D. , Purification,Partial Characterization, and Immunological Relationships of Multiple Low
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圖3描述對富集的KTI餾分的SDS-PAGE分析。圖4描述對HiTrap DEAE FF離子交換餾分的SDS-PAGE分析。圖5描述提交給LC-MS/MS分析的KTI條帶。圖6描述對Mimo6HE餾分的SDS-PAGE分析。優選方面的詳述本文描述了從大豆エ藝流中分離的新型KTI亞型，該亞型被發現表現出所期望的特性，包括此前未達到的水平的純度。本文進ー步描述了用於從在大豆蛋白分離物的製造中產生的多種豆科植物エ藝流(包括大豆乳清流和大豆糖漿流)回收所述新型KTI亞型和其它產品的新型方法。例如，本公開的方法包括一種或多種被選擇或設計用於提供所述KTI蛋白的回收的分離技術或方法(即，層析分離或膜分離)。KTI蛋白和大豆乳清流的ー種或多種其它組分(例如，多種糖類，包括低聚糖)的分離可以利用多種分離技術(例如，膜、層 析、沉澱、離心、或過濾)。具體的分離技術將取決於有待通過將其與所述エ藝流的其它組分分離而被回收的所期望的組分。例如，純化的KTI餾分通常通過下列步驟製備首先移除一種或多種雜質(例如，微生物或礦物)，然後移除包括ー種或多種大豆貯藏蛋白(即，大豆球蛋白和￠-伴球蛋白)的附加的雜質，然後移除ー種或多種大豆乳清蛋白(包括，例如，BBI和其它非KTI的蛋白或鈦)，和/或然後從大豆乳清中移除包括糖類的ー種或多種附加的雜質。通過稀釋除去使純度降低的所述乳清流的其它主要組分(例如，貯藏蛋白、礦物和糖類)，同時同樣地通過純化蛋白餾分提高純度，改進了高純度形式的KTI蛋白的回收，其中所述純化蛋白餾分通過除去作為所述蛋白的拮抗物和/或具有有害效應的組分(例如，內毒素)進行。大豆乳清的多種組分的移除通常包括在所述大豆乳清的組分的移除之前和/或過程中對所述大豆乳清的純化。本文所公開的方法還將降低從大量含水廢物的處理產生的汙染。貯藏蛋白、糖類、礦物和其它雜誌的移除產生富集了所期望的KTI蛋白，並且不含可能是拮抗劑或毒素或者可能在其它方面具有有毒效應的雜質的餾分。例如，大豆貯藏蛋白富集的餾分通常可以與富集了ー種或多種大豆乳清蛋白的餾分一起被回收。富集了ー種或多種糖類(例如，低聚糖和/或多糖)的餾分也通常被製備。因此，本方法提供適合作為用於回收KTI蛋白的基料的餾分，並且還提供能夠被用於從含水的大豆乳清中回收其它有用產品的其它餾分。例如，糖類和/或礦物從大豆乳清流中的移除產生了有用的餾分，糖類能夠從其中被進ー步分離，從而產生附加的有用的餾分濃縮的糖和礦物餾分(可以包括檸檬酸)，以及可以最低限度的處理(如果存在的話)被處置或作為エ藝用水被回收的相對純的含水餾分。如此產生的エ藝用水在本方法的實施中可以是尤其有用的。因此，本方法的進ー步的優點可以是與常規的分離製備方法相比降低的エ藝用水需求。本公開的方法以至少兩種方式提供了高於製造大豆蛋白分離物和濃縮物的常規方法的優點。如所指出的，製造大豆蛋白材料的常規方法通常處理大豆乳清流(例如，含水的大豆乳清或大豆糖漿)。因此，通過本公開的方法回收的產品代表了附加的產品和目前在與常規的大豆蛋白分離物和大豆蛋白濃縮物製造的關聯中未實現的收益來源。此外，對大豆乳清流或大豆糖漿進行的用於回收可出售的產品的處理，可取地降低了與對大豆乳清流或大豆糖漿的處理或處置相關的成本。例如，如本文中其它地方所詳述的，本發明的多種方法提供了相對純的エ藝流，所述エ藝流可以在多種其它方法中被容易地利用或者以最低限度的處理(如果存在的話)被處置，從而降低所述方法對環境的影響。某些成本與本公開的方法相關聯地存在，但所分離的附加的產品和廢物處理的最小化的益處據信彌補了任何增加的成本。A.酸可溶的蛋白大豆蛋白分離物通常在大豆貯藏蛋白的等電點(例如，約4.5的pH)從脫脂大豆柏或大豆粉的水提物中沉澱。因此，大豆蛋白分離物一般包括在酸性液體介質中不可溶的蛋白。類似地，大豆蛋白濃縮物(第二精純的大豆蛋白材料)的蛋白同樣在酸性液體介質中是不可溶的。然而，通過本公開的方法回收的大豆乳清蛋白一般是酸可溶的，意味著它們在酸性液體介質中是可溶的。例如，本公開提供了來源於含水大豆乳清，並且在環境條件(例如，約25°C的溫度)下表現出跨越相對寬範圍PH的含水(通常為酸性的)介質(例如，具有約2至約10、約2至約7、或約2至約6的pH的含水介質)中的優越溶解度的大豆蛋白組合物。通常所 述大豆蛋白組合物的溶解度為至少約10克每升(g/L)，更典型至少約15g/L，以及更典型至少約20g/L。應當了解，提及跨越pH範圍的溶解度時(包括在所附權利要求中)是指所指定的溶解度是在落在所指定的PH範圍內的任何和全部的pH值達到的。例如，提及在約2至約10的pH範圍至少約10g/L的溶解度表示所指定的溶解度是在3、4、5、6等pH達到的。通過本公開的方法回收的酸可溶的大豆蛋白代表著本領域中的顯著改進。如本文所指出的，所述酸可溶的蛋白是從通常被丟棄的大豆乳清流中回收的。B.庫尼茲胰蛋白酶抑制劑如本文所論及的，大豆エ藝流(包括，例如，大豆乳清流和大豆糖漿流)包含庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)蛋白。這種蛋白酶抑制劑已知至少抑制胰蛋白酶，並且可能抑制調節ー些關鍵代謝功能的多種其它關鍵蛋白酶。根據本發明的實施方案分離的KTI蛋白可以包含多肽，所述多肽具有與SEQ IDNO 1 至少 50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同的胺基酸序列。在一個實施方案中，所述KTI蛋白可以包含與SEQ ID NO: I至少70%相同、更優選與SEQ ID NO :I至少80%相同、甚至更優選與SEQ ID NO :I至少90%相同、最優選與SEQ ID NO 1至少95%相同的胺基酸序列。在本實施方案的另一方面，所述胺基酸序列與SEQ ID N0:1至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、或甚至 100%相同。在本發明的某些方面，兩種胺基酸序列之間的序列同一性通過比較所述胺基酸序列確定。在本發明的其它方面，序列同一性能夠通過比較胺基酸序列與其保守的胺基酸取代物而確定。在本發明的某些方面，本發明的蛋白能夠具有ー個或多個保守取代。在本發明的其它方面，本發明的蛋白能夠具有ー個或多個非保守取代。天然存在的胺基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬醯胺(N)、天冬氨酸
(D)、半胱氨酸(C)、穀氨酸(E)、穀氨醯胺(Q)、甘氨酸(G)、組氨酸(H)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和纈氨酸(V)。保守的和非保守的胺基酸取代是本領域的普通技術人員已知的，例如，酸性胺基酸對另ー種酸性胺基酸的取代可以被認為是保守取代而鹼性胺基酸對酸性胺基酸的取代可以被認為是非保守取代；類似地，極性胺基酸對另ー種極性胺基酸的取代可以被認為是保守取代而非極性胺基酸對極性胺基酸的取代可以被認為是非保守取代。胺基酸一般被分為下列類別(這能夠被用作指導，用於確定取代是保守的還是非保守的)(1)極性的/親水性的:N、Q、S、T、K、R、H、D、E、C 和 Y ; (2)非極性的 / 疏水性的G、A、L、V、I、P、F、W 和 M ;
(3)酸性的D、E和C ; (4)鹼性的K、R和H ; (5)芳香族的F、W、Y和H ;和(6)脂族的G、A、L、V、I 和 Po在本發明的某些方面，其中一種或多種胺基酸序列與SEQ ID NO :1不相同，這樣的一種或多種胺基酸序列也具有KTI蛋白的功能，KTI蛋白已知抑制胰蛋白酶活性。用於確定這些功能的方法描述於本文中，並且是本領域的普通技術人員已知的。在本發明的其它方面，其中組合物包含與SEQ ID NO :1不相同的一種或多種胺基酸序列，這樣的一種或多種胺基酸序列也具有KTI蛋白的功能，KTI蛋白已知抑制胰蛋白酶。用於確定這些功能的方法描述於本文中，並且是本領域的普通技術人員已知的。 KTI蛋白由170個至200個胺基酸殘基和大約兩個ニ硫鍵組成。KTI蛋白的ー級結構自 1973 年起即是已知的(參見 Koide,T.和 Ikenaka, T. ,Studies on Soybean TrypsinInhibitors.3. Amino-Acid Sequence of the CarboxyI-Terminal Region and theComplete Amino-Acid Sequence of Soybean Trypsin Inhibitor, Eur. J. Biochem. 32,417,1973)。本公開的KTI產品的純度代表著與其它KTI產品相比此前尚未達到的純度水平。KTI餾分的純度是總KTI蛋白濃度、比活性(如以胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白測量的)和具有KTI拮抗劑功能的組分、毒素、或在單純的對每單位數量的KTI的功效的稀釋之外還具有有毒效應的其它組分的不存在的函數。一般而言，本公開的KTI產品的總KTI蛋白濃度是至少約70重量％，或至少約80重量％。通常，本公開的KTI產品的總KTI蛋白濃度是至少約90重量％，優選至少約95重量％，更優選至少約99重量％。「純的」單體蛋白在單向或雙向SDS-PAGE凝膠上電泳之後將產生單一條帶，將作為單獨的對稱吸收峰從凝膠過濾、高效液相色譜(HPLC)、或離子交換柱上洗脫，將產生単獨的一組質譜、核磁共振(NMR)、或W吸收光譜信號，並且在適當的情況下將沒有對酶活性的汙染。由於絕對的純度不能被確定，簡單的純度標準被常規地使用，即，在SDS-PAGE之後不能檢測到多於一個的蛋白條帶。(參見Mohan, Determination of purity and yield.Methods in Molecular Biology, 11, 307-323 (1992))。圖 3 描述了單向凝膠電泳之後的本發明的KTI蛋白。如圖3所示，本發明的KTI蛋白顯示為對應於21kDa分子量標準的単一條帶並且具有不同的等電點。KTI餾分的純度是總KTI蛋白濃度、比活性(如以胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白測量的)和具有KTI拮抗劑功能的組分、毒素、或在單純的對每單位數量的KTI的功效的稀釋之外還具有有毒效應的其它組分的不存在的函數。一般而言，本公開的KTI產品的總KTI蛋白濃度是至少約70重量％，或至少約80重量％。通常，本公開的KTI產品的總KTI蛋白濃度是至少約90重量％，優選至少約95重量％，更優選至少約99重量％。除KTI純度之外，本公開的KTI產品的總蛋白含量也是有利的和/或代表了本領域的改進。本公開的產品的KTI蛋白含量可以通過本領域已知的常規方法測定，包括，例如，描述於 Ohnisni, S. T.和 Barr,J.K.,A simplified method of quantitating proteinsusing the biuret and phenol reagents. Anal. Biochem. ,86,193(1978)中的 Lowry 方法。一般而言，本公開的KTI產品的總蛋白含量為至少約60重量％ (基於乾重)、至少約70重量％，至少約80重量％,或至少約85重量％。通常，本公開的KTI產品的總蛋白含量是至少約95重量％，優選至少約98重量％，更優選至少約99重量％。KTI蛋白已知僅抑制胰蛋白酶，而包含蛋白的組合物的其它組分(例如BBI蛋白)已知既抑制胰蛋白酶又抑制胰凝乳蛋白酶。因此，在本公開的抑制胰蛋白酶的準備中，胰凝乳蛋白酶抑制劑活性的不存在指示了 KTI蛋白的存在。類似地，本公開的KTI產品的胰蛋白酶抑制劑活性(按照胰蛋白酶抑制劑單位/克蛋白，或TIU/克蛋白表達)可以通過本領域已知的常規方法測定，包括，例如，在其中一個TIU被定義為能夠抑制Img的胰蛋白酶的底物的量，而ー個胰蛋白酶單位等於在pH 8. 2和37°C以N-苯甲醯-DL-精氨酸對硝基苯胺(BAPA硝基苯胺)作為底物每10分鐘0. 019的AA410。一般而言，本公開的KTI產品的胰蛋白酶抑制劑活性為至少約300TIU/克蛋白，典型為至少約500TIU/克蛋白，更典型為至少約950TIU/克蛋白，甚至更典型為至少約 1500TIU/克蛋白。KTI產品目前據信適合的多種應用要求相對低的內毒素含量。例如，多種治療應用要求KTI產品滿足藥品等級材料適用的規章。因此，在多個優選的方面，所述KTI產品的總內毒素含量為優選不超過約I. 5EU/克蛋白，更優選不超過約IEU/克蛋白，更優選不超過約0. 5EU/克蛋白，以及甚至更優選不超過約0. 25EU/克蛋白。例如，根據多個此類方面，所述KTI產品的總內毒素含量典型為約0. IEU/克蛋白至約1.5EU/克蛋白，更典型為約0. IEU/克蛋白至約I. OEU/克蛋白，和更典型為約0. IEU/克蛋白至約0. 5EU/克蛋白(例如，約0. IEU/克蛋白至約0. 25EU/克蛋白)。附加地或者作為另外一種選擇，本公開的KTI產品的總內毒素含量為不超過約5. 0內毒素單位姆克蛋白(EU/克蛋白)，或不超過約2. 5EU/克蛋白。例如，在多個方面，總內毒素含量為約0. IEU/克蛋白至約5. OEU/克蛋白，或約0. IEU/克蛋白至約2. 5EU/克蛋白。應當了解，本公開的KTI產品可以表現出以上指定的特徵中的ー種、組合、或全部。例如，本公開的KTI產品可以表現出所指定的KTI純度和總蛋白含量。KTI產品也可以表現出所指定的KTI純度、胰蛋白酶抑制劑活性和本文所公開的序列。以另ー個實例的方式，所述KTI產品可以表現出所指定的KTI蛋白濃度和總內毒素含量。在這些以及另外的方面，本公開的KTI產品可以表現出所指定的總大豆蛋白濃度和胰蛋白酶抑制劑活性。以另ー個實例的方式，本公開的KTI產品可以表現出所指定的總大豆蛋白濃度和總內毒素含量。所述KTI產品的特性的這些組合是示例性的，並且這一列舉並不g在是詳盡的。也就是說，根據本公開，KTI產品可以任何以上所指定範圍內的任何以上所指定的值，表現出以上提及的特性的任何組合。本發明的KTI產品能夠從任何來源或者允許從天然的基於植物的基質離析、分離、或純化KTI的任何方法獲得。以非限制性實例的方式，天然的基於植物的基質能夠來源於豆科(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、緑豆、赤豆、豇豆、麻風樹、緑藻、以及它們的組合。在本發明的特定方面，KTI是在多種エ藝流中從大豆獲得的。多種大豆エ藝流包括，例如，含水的大豆提取物流(其是大豆流的蛋白組分在其中為可溶性形式的任何流。例如來自脫脂大豆材料)、含水的豆漿提取物流(其是大豆流的蛋白組分在其中為可溶性形式的來自全部或部分脫脂的大豆材料的任何流)、含水的大豆乳清流(其是由貯藏蛋白的沉澱或鹽析得到的任何乳清流；沉澱方法能夠包括高溫以及化學方法)、含水的大豆糖漿流(其是通過從含水的大豆乳清流中移除水產生的任何流)、含水的大豆蛋白濃縮物大豆糖漿流(其是來自對來自大豆蛋白濃縮方法的可溶性糖的醇提取物的任何流)、含水的大豆透過流(其是由不同分子量的蛋白餾分的分離得到的任何流，所述分離中較小分子量的蛋白通過膜)和含水的豆腐乳清流(其包括來源於豆腐凝結過程的任何乳清流。通過本發明的方法分離的KTI產品的量可以是低至克級(實驗室規模的分離)或可以是若干公噸(エ業或大規模分離)。C.含水的乳清流
含水的乳清流和糖漿流是大豆エ藝流的類型，它們是從精煉完整豆類或油料種子的方法產生的。完整的豆類或油料種子可以來源於多種適合的植物。以非限制性實例的方式，適合的植物包括豆科植物(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、緑豆、赤豆、豇豆、麻風樹、緑藻、以及它們的組合。在一個實施方案中，所述豆科植物是大豆，並且從精煉大豆的方法產生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。在大豆蛋白分離物的製造中產生的含水的大豆乳清流一般是相對被稀釋的並且通常作為廢物被丟棄。更具體地講，所述含水的大豆乳清流具有典型小於約10重量％，典型小於約7. 5重量％，以及更典型小於約5重量％的總固體含量。例如，在多個方面，所述含水的大豆乳清流的固體含量為約0. 5重量％至約10重量％，約I重量％至約4重量％，或約I重量％至約3重量％ (例如，約2重量％)。因此，在商業化的大豆蛋白分離物生產過程中，產生了必須被處理或處置的顯著體積的廢水。大豆乳清流通常包含大部分起始大豆材料的初始大豆蛋白含量。如本文所用，術語「大豆蛋白」一般是指來源於大豆的任何和全部的蛋白。天然存在的大豆蛋白一般是具有被親水外殼圍繞的疏水核心的球狀蛋白。大量的大豆蛋白已被鑑定，包括，例如，貯藏蛋白如大豆球蛋白和￠-伴球蛋白。大豆蛋白同樣包括蛋白酶抑制劑，如以上提及的KTI蛋白。大豆蛋白也包括血球凝集素如凝集素、脂氧合酶、￠-澱粉酶和露那辛。值得注意的是，大豆植物可以被轉化，以產生通常不被大豆植物表達的其它蛋白。應當了解，本文提及「大豆蛋白」時同樣設想了如此產生的蛋白。基於乾重，大豆蛋白佔大豆乳清流的至少約10重量％，至少約15重量％，或至少約20重量％ (基於乾重)。通常，大豆蛋白佔大豆乳清流的約10重量％至約40重量％，或約20重量％至約30重量％ (基於乾重)。大豆蛋白分離物通常包含大部分大豆的貯藏蛋白。然而，在分離物沉澱之後剰餘的大豆乳清流同樣包含ー種或多種大豆貯藏蛋白。除多種大豆蛋白之外，含水的大豆乳清流還同樣包含一種或多種碳水化合物(即糖類)。一般而言，糖類按大豆乳清流的重量計(基於乾重)佔至少約25%，至少約35%，或至少約45%。通常，糖類按大豆乳清流的重量計(基於乾重)佔約25%至約75%，更典型佔約35%至約65%，更典型佔約40%至約60%。大豆乳清流的糖類一般包括一種或多種單糖、和/或一種或多種低聚糖或多糖。例如，在多個方面，所述大豆乳清流包含選自葡萄糖、果糖、以及它們的組合的單糖。通常，單糖佔大豆乳清流的約0. 5%至約10重量％，更典型約1%至約5重量％ (基於乾重)。進一步根據這些以及多個其它方面，所述大豆乳清流包含選自蔗糖、棉子糖、水蘇糖、以及它們的組合的低聚糖。通常，低聚糖按大豆乳清流的重量計(基於乾重)佔約30%至約60%，更典型約40%至約50%。含水的大豆乳清流還通常包含包括多種組分的灰分，所述組分包括，例如，多種礦物、植酸、檸檬酸和維生素。通常存在於大豆乳清流中的礦物包括鈉、鉀、鈣、磷、鎂、氯、鐵、錳、鋅、銅、以及它們的組合。存在於大豆乳清流中的維生素包括，例如，硫胺素和核黃素。無
論其確切的組成如何，灰分按重量計典型佔大豆乳清流(基於乾重)的約5%至約30%，更典型約10%至約25%。含水的大豆乳清流還通常包含脂肪部分，脂肪部分按重量計一般佔大豆乳清流(基於乾重)的約0. 1%至約5%。在本發明的某些方面，脂肪含量通過酸水解測量，並且按大豆乳清流的重量計(基於乾重)為約3%。除上述組分之外，含水的大豆乳清流通常還包含一種或多種微生物，包括，例如，多種細菌、黴菌和酵母。這些組分的比例通常為約100至約IXlO9菌落形成單位數(CFU)每毫升不等。如本文中其它地方所詳述的，在多個方面，在蛋白回收和/或分離之前，含水的大豆乳清流被處理，以移除這些組分。如所指出的，大豆蛋白分離物的常規的生產通常包括處理大豆蛋白分離物的分離之後剩餘的含水的大豆乳清流。根據本公開，一種或多種蛋白和多種其它組分(例如，糖類和礦物)的回收導致相對純的含水的大豆乳清流。蛋白和一種或多種組分未被移除的常規的大豆乳清流一般要求在處置和/或再利用之前進行處理。根據本公開的多個方面，所述含水的乳清流可以最低限度的(如果存在的話)處理被處置或作為工藝用水被利用。例如，所述含水的乳清流可以在本公開的一個或多個過濾(例如，滲濾)操作中被使用。除了從大豆蛋白分離物的製造中產生的含水的大豆乳清流回收KTI蛋白之外，應當了解，本文所述的方法還同樣適合用於回收大豆蛋白分離物的製造中產生的大豆糖漿流的一種或多種組分，因為大豆糖漿流是附加類型的大豆工藝流。D. KTI蛋白的回收本文所述的方式涉及純化的KTI蛋白的回收和分離，所述KTI蛋白存在於產生自完整的豆類或油料種子的精煉方法的含水的乳清流中。如上文所論及，所述完整的豆類或油料種子可以來源於多種適合的植物。以非限制性實例的方式，適合的植物包括豆科植物(包括如大豆)、玉米、豌豆、卡諾拉、向日葵、高粱、稻、莧屬植物、馬鈴薯、木薯、竹芋、美人蕉、羽扇豆、油菜、小麥、燕麥、裸麥、大麥、花生、洋刀豆、薏苡、豌豆家族豆類、巴魯、鵲豆、矛豆莢(例如，雨豆樹種子)、苜蓿、蝸牛苜蓿種子、利馬豆、牛油豆、芸豆、矮菜豆、甘蔗、小米、成材木、菠菜、chapule、纖毛蟲、甜點香蕉、兵豆、麩、蠶豆或胡豆、綠豆、赤豆、豇豆、麻風樹、綠藻、以及它們的組合。在一個實施方案中，所述豆科植物是大豆，並且從精煉大豆的方法產生的含水的乳清流是含水的大豆乳清流。
在多個方面，本公開提供了用於回收和分離KTI蛋白的方法，所述KTI蛋白存在於大豆蛋白分離物的生產過程中產生的含水的大豆乳清流中。應當指出的是，本發明的方法不限於大豆乳清或大豆糖漿流，並且可以被用於從很多種豆科植物工藝流中回收蛋白和多種其它組分。在多個方面，包含高比例的KTI蛋白的餾分被從大豆乳清流中回收。通過本公開的方法處理的大豆乳清流一般是相對稀釋的。為了有利於KTI蛋白的回收和/或分離，所述乳清流優選在所述方法的初始步驟中被濃縮。大豆乳清流的濃縮有助於從所述乳清流中回收和分離KTI蛋白。例如，在本公開的一個優選的實施方案中，在回收KTI蛋白之前，通過使含水的大豆乳清或其部分與分離膜接觸，以形成包含含水的大豆乳清的保留物和包含水的透過物，從所述含水的大豆乳清中移除水。在本公開的其它實施方案中，水可以通過本領域已知的任何方法從所述大豆乳清中移除，例如通過蒸發。
隨著KTI蛋白的回收，本公開的方法通常將蛋白自存在於大豆乳清流中的糖類分離。任選地，本公開的方法可以被配置和控制，以將大豆乳清流中的糖分離至一種或多種餾分(例如，單糖富集的餾分和/或低聚糖富集的餾分)。這可以在多個步驟中完成，以將不同的糖類從蛋白分離。因此，糖類從大豆乳清流中的回收提供了進一步的產品流。如所指出的，糖類的移除通常產生糖類能夠被從其分離的餾分，所述分離產生濃縮的糖類餾分和可以最低限度的(如果存在的話)處理被處置或作為工藝用水被回收利用的相對純的含水餾分。在處理所述保留物以移除糖類之後，所述保留物被進一步處理以移除附加的組分。如所指出的，可以通過本公開被處理的多種大豆乳清流包括一種或多種礦物(例如，磷和鈣)。已經被注意到，一種或多種礦物的存在，可以通過，例如，膜的汙染和從所期望回收的組分(即，KTI蛋白)分離方面的困難，對下遊的處理造成挑戰。除了普遍地回收這些所期望的組分之外，從大豆乳清中移除礦物目前據信還有助於回收具有較高純度的KTI產品。如本文中其它地方所詳述的，從大豆乳清中移除礦物一般可以根據本領域中已知的方法進行，所述方法包括，例如，沉澱和離心。由於植酸通常存在於通過本發明的方法處理的含水的大豆乳清流中，礦物如鈣和鎂通常以植酸鈣和植酸鎂的形式被回收。其它被移除的礦物還可以包括，例如，鈉、鉀、鋅、鐵、錳和銅。本公開包括多種適用於從在大豆蛋白分離物的生產中產生的含水的大豆乳清流回收KTI蛋白的方法。一般而言，本公開的方法包括一個或多個操作，所述操作被設計和配置為分離出含水的大豆乳清流的特定組分，從而濃縮所述乳清流並使得能夠從其回收純化的KTI蛋白。一般而言，根據本公開，任何本領域中熟知的多種分離和純化技術可以被用於移除存在於含水的大豆乳清中的多種幹擾組分和從其分離純化的KTI蛋白，所述技術包括，例如膜分離技術(例如，過濾，如超濾、微量過濾、納濾、和/或反向滲透)、層析分離技術(例如，離子交換層析、膜層析、吸附層析、尺寸排阻層析、反相層析、凝膠過濾、親和層析，其包括，例如，陰離子或陽離子交換層析、模擬移動床層析、膨脹床吸附層析、凝膠過濾、反相層析、和/或混合床離子交換)、電泳、透析、微粒過濾、沉澱、離心、結晶、以及它們的組合。上述多種組分的分離的主要原理是分子大小，儘管在過濾應用中，過濾介質的滲透性能夠被樣品的化學、分子或靜電特性影響。如本文中其它地方所詳述的(例如，下文提及

圖1A、IBUC和ID時)，本公開的方法通常利用多於一種的取決於待移除的乳清流的特定組分的分離膜。例如，所述方法的一個步驟可以利用超濾分離膜，然後的一個或多個步驟利用納濾分離膜。在關於不溶性固體的移除的某些方面，微粒過濾、沉澱、離心、結晶、以及它們的組合可以被使用。通過這些方法移除的不溶性固體通常大於20i!m。微粒過濾是通過使用微粒過濾膜將固體顆粒從流體分離的方法。適合的微量過濾膜由本領域已知的適當材料構成，所述材料包括，例如，聚碸、改性聚碸、陶瓷和不鏽鋼。微量過濾膜通常具有約0. I微米(ym)至約20 範圍的孔徑。在某些方面，微量過濾膜具有約0. 2 u m至約2 u m範圍的孔徑。 超濾與微量過濾類似，但在分離膜的孔徑方面不同。超濾膜通常被用於從具有較低分子量的分子分離具有較高分子量的分子(包括，例如，蛋白)。適合的超濾膜通常由本領域已知的適當材料構成，所述材料例如聚碸(PS)、聚醚碸(PES)、聚丙烯(PP)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、再生纖維素(RC)、陶瓷、不鏽鋼、或薄膜複合材料。超濾膜通常具有約I千道爾頓(kDa)至約300kDa或約5kDa至約50kDa的阻隔分子量。附加地或者作為另外一種選擇，適合的超濾膜可以具有約0. 002 u m至約0. 5 ii m的孔徑。納濾被用於流體移除小分子。適合的納濾膜通常由本領域已知的適當材料構成(例如聚醚碸、聚碸、陶瓷和聚酯上的聚醯胺型薄膜複合材料)並且通常具有約0. IkDa至約5kDa或約IkDa至約4kDa的MWC0。附加地或者作為另外一種選擇，適合的納濾膜可以具有約0. 0009 u m至約0. 009 u m的孔徑。反向滲透(或超過濾)通常被用於糖類的濃縮。適合的反向滲透膜包括本領域一般已知的那些(例如，具有小於0. 5nm的孔徑的膜)。本發明的過濾步驟中利用的分離膜可以單獨地或以組合方式根據本領域已知的一種或多種配置方式被布置。例如，膜可以平板的形式、或者以多層膜在其中被組合到一起(連同分離器篩網的任選的層)的盒模塊的形式被配置。含水的大豆乳清通常在膜堆的一端被引入交替通道，而流體通過膜進入一個或多個濾液或透過物通道。分離膜也可以被布置在螺旋狀的模塊中，在其中交替的膜的層圍繞著中空的中心核。含水的大豆乳清被引入所述模塊的一個末端，而流體通過所述交替的膜的層，流向並進入所述模塊的核心。以另一個實例的方式，分離膜可以被布置在中空纖維模塊中，所述模塊包括一束相對窄的膜管。含水的大豆乳清被引入所述模塊中，而流體沿通過所述模塊的大豆乳清的流的橫向通過膜管束。適合的膜的布置描述於，例如，美國專利6，946，075中，其全文以引用方式併入本文。本發明的過濾步驟可以採用直接(常規流)過濾或切向(錯流)過濾。在直接或常規流過濾中，流體(即，含水的大豆乳清)被直接向著分離膜運送。作為另外一種選擇，在切向或錯流過濾中，流體(即，含水的大豆乳清)可以沿分離膜表面的切向被運送。切向或錯流過濾的一個優點是，含水的大豆乳清的流切向施加在膜上的摩擦或掃刮力通常有助於維持流量。相應地，在多個方面，本公開的方法中的一個或多個步驟以及它們的組合按照錯流過濾操作。適合的錯流過濾器包括本領域中一般已知的那些，包括美國專利6，946，075中描述的那些。應當了解，流體的通過可以根據常規的和/或切向的(即，交錯的)流適當地進行。還應當了解，流體穿越其它膜分離單元的通過可以根據這些機制中的一種或全部兩種進行，所述其它膜分離單元詳述於本文中與圖1A、1B、1C和ID中描述的實施方案以及其它方面相關的其它地方。
本發明所描述的方法涉及選擇適當的分離操作或操作的組合，以從大豆乳清流中順序移除多種組分和回收或分離KTI產品，所述KTI產品包含本領域此前尚未達到的水平的純度。一般而言，並且如本文中其它地方所詳述的，用於回收KTI蛋白的方法利用膜分離和層析分離(例如，離子交換)操作的組合。如本文中其它地方所指出的，通過本公開的方法處理的含水的大豆乳清流一般是相對稀釋的。在多個方面，在回收作為靶標的個別的蛋白之前，含水的大豆乳清通過，例如，水的移除，以至少約2 (例如，約3或約6)的濃縮係數被濃縮。與用於回收KTI蛋白的其它方法相比，至少部分地由於其處理含水的大豆乳清的多個樣品的能力，通過模擬移動床(SMB)層析回收KTI蛋白一般也可以提供低成本、通量、和/或靈活性的優勢。
已經被注意到，大豆乳清流的一種或多種組分可以幹擾KTI蛋白的回收。例如，在大豆蛋白分離物製造過程中，矽化合物(通常為矽氧烷)經常作為消泡劑被引入，通常是以包含娃的化合物的形式，例如可從Hydrite Chemical或Emerald Performance Materials商購獲得的那些。無論確切的來源如何，有機矽化合物通常以按矽含量計至高約15份每一百萬份(ppm)、至高約lOppm、或至高約5ppm的濃度存在於大豆乳清流中。有機娃化合物的存在一般是非期望的，因為它可以幹擾大豆乳清流的KTI蛋白的回收。相應地，在多個方面，在用於回收和分離KTI蛋白的操作之前，矽氧烷和/或其它有機矽化合物被從大豆乳清流中移除，如本文中其它地方所詳述的。優選地，矽化合物被移除至使得大豆乳清包含不超過痕量級有機矽的程度，如本文中其它地方所詳述的。附加地或者作為另外一種選擇，含水的大豆乳清可以包含一種或多種微生物，所述微生物可以幹擾所述含水的大豆乳清的所期望的組分的回收，和/或在所述方法的最終的回收的產品中是非期望的。為了移除這些幹擾組分，可以使用選擇性保留矽消泡劑和/或一種或多種微生物的分離膜過濾所述大豆乳清流，以產生包含矽和/或一種或多種微生物的保留物和包含含水的大豆乳清的透過物。這一初始純化中使用的特定的膜(包括，例如，微量過濾)是根據待移除的組分選擇的。無論所選擇的膜的類型和從大豆乳清流中移除的組分如何，優選所期望的KTI蛋白的至少主要部分，並且優選所期望的KTI蛋白的基本上全部存在於保留物中。此外，就這一點而言，應當注意的是，提及包含含水的大豆乳清的透過物時表示用於移除一種或多種雜質的對乳清流的處理對所述大豆乳清流的其它組分具有很小的(如果存在的話)影響。在多個供選擇的替代方面，所述乳清流中包含的細菌可以在蛋白的回收之前通過加熱被殺死。加熱大豆乳清流以殺滅細菌的方式是不嚴格的，並且一般可以根據本領域已知的常規方法進行。分離技術領域的技術人員知道，由於分離不會是100%，在每一流中能夠存在殘餘的組分。此外，本領域的技術人員了解，分離技術能夠依賴於起始的原材料而變化。步驟0(參見圖IA)-乳清蛋白預處理能夠從包括但不限於大豆分離蛋白(ISP)糖漿、ISP乳清、大豆蛋白濃縮物(SPC)糖漿、SPC乳清、功能性大豆蛋白濃縮物(FSPC)乳清、以及它們的組合的進料流開始。能夠用於乳清蛋白預處理步驟中的加工助劑包括但不限於酸、鹼、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、水、蒸汽、以及它們的組合。在調節PH之後，步驟0的pH能夠是介於約3. O和約6. O之間、或介於3. 5和5. 5之間或約5. 3。溫度能夠是介於約70°C和約95°C之間或約85°C。溫度保持時間能夠在約O分鐘至約20分鐘之間或約10分鐘變化。在保留時間之後，所述流通過一個離心分離步驟(通常在間歇放電圓盤式淨化離心機中)，以從所述乳清流中分離沉澱。來自乳清蛋白預處理的產物包括但不限於流Oa中的乳清流(預處理的大豆乳清)的水相中的可溶性組分(分子量等於或小於約50千道爾頓(kDa))和流Ob中的不溶性大分子量蛋白(介於約300kDa和約50kDa之間)，例如預處理的大豆乳清、貯藏蛋白、以及它們的組合。步驟I (參見圖IA)-微生物的降低能夠以上述乳清蛋白預處理步驟的產物開始，包括但不限於預處理的大豆乳清。本步驟涉及預處理的大豆乳清的微量過濾。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於離心、死端過濾、加熱滅菌、紫外滅菌、微量過濾、錯流膜過濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟I的PH能夠是介於約2.0和約12. 0之間、或介於約3. 5和約5. 5之間或約5. 3。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、或介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自步驟I的產物包括但不限於流Ia中的貯藏蛋白、微生物、矽、以及它們的組合和流Ib中的純化的預處理的大豆乳清。 步驟2 (參見圖1A)-水和礦物的移除能夠以來自流Ib或4a的純化的預處理的大豆乳清、或來自流Ob的預處理的大豆乳清開始。其包括用於水的移除和部分礦物的移除的納濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於錯流膜過濾、反向滲透、蒸發、納濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟2的pH能夠是介於約2. 0和約12. 0之間、或介於約3. 5和約5. 5之間或約5. 3。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、或介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自這一水移除步驟的產物包括但不限於流2a中的純化的預處理的大豆乳清和流2b中的水、一些礦物、一價陽離子、以及它們的組合。步驟3 (參見圖IA)-礦物沉澱步驟能夠以來自流2a的純化的預處理的大豆乳清或來自流Oa或Ib的預處理的大豆乳清開始。其包括通過pH和/或溫度變化沉澱的步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於攪拌的或再循環的反應槽。能夠用於礦物沉澱步驟中的加工助劑包括但不限於酸、鹼、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、氯化鈉、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟3的pH能夠是介於約2. 0和約12. 0之間、或介於約6. 0和約9. 0之間或約8. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、或介於約25°C和75°C之間或約50°C。pH保持時間能夠介於約0分鐘至約60分鐘之間、或介於約5分鐘和約20分鐘之間或約10分鐘變化。流3的產物是純化的預處理的大豆乳清和沉澱的礦物的懸液。步驟4(參見圖IA)-礦物移除步驟能夠以來自流3的純化的預處理的大豆乳清和沉澱的礦物的懸液開始。其包括離心步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於離心、過濾、死端過濾、錯流膜過濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。來自礦物移除步驟的產物包括但不限於流4a中的去礦物化的預處理的乳清和流4b中的不溶性礦物與一些蛋白礦物複合物。步驟5 (參見圖IB)-蛋白分離和濃縮步驟能夠以來自流4a的純化的預處理的乳清或來自流Oa、lb、或2a的乳清開始。其包括超濾步驟。能夠用於超濾步驟中的加工助劑包括但不限於酸、鹼、氫氧化鈣、氫氧化鈉、鹽酸、以及它們的組合。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於錯流膜過濾、超濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟5的pH能夠是介於約2. O和約12. O之間、或介於約6. O和約9. O之間或約8. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、或介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自流5a的產物包括但不限於大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合。來自流5b的產物包括但不限於鈦、大豆低聚糖、礦物、以及它們的組合。步驟6 (參見圖IB)-蛋白洗滌和純化步驟能夠以來自流4a或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白或純化的預處理的乳清、或來自流0a、lb、或2a的乳清開始。其包括滲濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於再漿化、錯流膜過濾、超濾、水滲濾、緩衝液滲濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。能夠用於蛋白洗滌和純化步驟中的加工助劑包括但不限於水、流、以及它們的組合。步驟6的pH能夠是介 於約2. 0和約12. 0之間、或介於約6. 0和約9. 0之間或約7. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自流6a的產物包括但不限於大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合。來自流6b的產物包括但不限於鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。步驟7 (參見圖IC)-水移除步驟能夠以來自流5b和/或流6b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括納濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於反向滲透、蒸發、納濾、水滲濾、緩衝液滲濾、以及它們的組合。步驟7的pH能夠是介於約2. 0和約12. 0之間、或介於約6. 0和約9. 0之間或約7. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自流7a的產物包括但不限於鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。來自流7b的產物包括但不限於水、礦物、以及它們的組合。步驟8(參見圖IC)-礦物移除步驟能夠以來自流5b、6b、7a、和/或12b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括電滲析膜步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於離子交換柱、層析、以及它們的組合。能夠用於這一礦物移除步驟中的加工助劑包括但不限於水、酶、以及它們的組合。酶包括但不限於蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟8的pH能夠是介於約2. 0和約12. 0之間、或介於約6. 0和約9. 0之間或約7. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、介於約25°C和50°C之間或約40°C。來自流8a的產物包括但不限於具有介於約10毫西門子/釐米(mS/cm)和約0. 5mS/cm之間或約2mS/cm的電導率的去礦物化的大豆低聚糖。來自流8b的產物包括但不限於水、礦物、以及它們的組合。步驟9 (參見圖IC)-顏色移除步驟能夠以來自流8&、513、613、1213、和/或7&的去礦物化的大豆低聚糖開始。其利用活性炭床。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於離子交換。能夠用於這一顏色移除步驟中的加工助劑包括但不限於活性炭、離子交換樹脂、以及它們的組合。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間或約40°C。來自流9a的產物包括但不限於顏色化合物。流9b為脫色的溶液。來自流9b的產物包括但不限於大豆低聚糖、以及它們的組合。步驟10 (參見圖10-大豆低聚糖分餾步驟能夠以來自流％、513、613、7&、和/或8&的大豆低聚糖、以及它們的組合開始。其包括層析步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於層析、納濾、以及它們的組合。能夠用於這一大豆低聚糖分餾步驟中的加工助劑包括但不限於酸或鹼，以如本領域的技術人員所知地基於所使用的樹脂調節pH。來自流IOa的產物包括但不限於大豆低聚糖。來自流IOb的產物包括但不限於大豆低聚糖。步驟11 (參見圖IC)-水移除步驟能夠以來自流9b、5b、6b、7a、8a和/或IOb的大豆低聚糖開始。其包括蒸發步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於反向滲透、蒸發、納濾、以及它們的組合。能夠用於這一水移除步驟中的加工助劑包括但不限於消泡劑、流、真空、以及它們的組合。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間或約60°C。來自流Ila的產物包括但不限於水。來自流Ilb的產物包括但不限於大豆低聚糖。
步驟12 (參見圖IC)-附加的從大豆低聚糖分離蛋白的步驟能夠以來自流7a、5b、和/或6b的鈦、大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合開始。其包括超濾步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於錯流膜過濾、孔徑介於約50kDa和約IkDa之間的超濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。能夠用於這一從糖類分離蛋白的步驟的加工助劑包括但不限於酸、鹼、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、以及它們的組合。步驟12的pH能夠是介於約2. 0和約12. 0之間、約7. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自流12b的產物包括但不限於大豆低聚糖、水、礦物、以及它們的組合。來自流12a的產物包括但不限於肽、其它蛋白、以及它們的組合。步驟13 (參見圖IC)-水移除步驟能夠以來自流12a的肽和其它蛋白開始。其包括蒸發步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於反向滲透、納濾、噴霧乾燥、以及它們的組合。來自流13a的產物包括但不限於水。來自流13b的產物包括但不限於肽、其它蛋白、以及它們的組合。步驟14 (參見圖1B)-蛋白分餾步驟可以通過以來自流6a和/或5a的大豆乳清蛋白、BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合開始進行。其包括超濾(具有300kDa至IOkDa的孔徑)步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於錯流膜過濾、超濾、納濾、以及它們的組合。錯流膜過濾包括但不限於螺旋式、板框式、中空纖維、陶瓷、動態或旋轉盤、納米纖維、以及它們的組合。步驟14的pH能夠是介於約2. 0和約12. 0之間、或介於約6. 0和約9. 0之間或約7. O。溫度能夠是介於約5°C和約90°C之間、介於約25°C和75°C之間或約50°C。來自流14a的產物包括但不限於貯藏蛋白。來自流14b的產物包括但不限於大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它們的組合。步驟15 (參見圖IB)-水移除步驟能夠以來自流6a、5a、和/或14b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括蒸發步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於蒸發、納濾、R0、以及它們的組合。來自流15a的產物包括但不限於水。流15b產物包括但不限於大豆乳清蛋白、BBI、KTI、其它蛋白、以及它們的組合。步驟16(參見圖IB)-熱處理步驟和瞬間冷卻步驟能夠以來自流6a、5a、14b、和/或15b的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括超高溫步驟。在這一步驟中，方法的變量和供選擇的替代方案包括但不限於加熱滅菌、蒸發、以及它們的組合。能夠用於這一熱處理和瞬間冷卻步驟中的加工助劑包括但不限於水、流、以及它們的組合。所述加熱步驟的溫度能夠是介於約129°C和約160°C之間或約152°C。溫度保持時間能夠是介於約8秒和約15秒之間或約9秒。瞬間冷卻後，溫度能夠是介於約50°C和約95°C之間或約82°C。來自流16的產物包括但不限於大豆乳清蛋白。步驟17 (參見圖18)-乾燥步驟能夠以來自流6&、5&、1413、1513、和/或16的大豆乳清蛋白、BBI、KTI和其它蛋白開始。其包括乾燥步驟。液體進料溫度能夠是介於約50°C和約95°C之間或約82°C。入口溫度能夠是介於約175°C和約370°C之間或約290°C。排氣溫度能夠是介於約65°C和約98°C之間或約88°C。來自流17a的產物包括但不限於水。來自流17b的產物包括但不限於大豆乳清蛋白，其包括BBI、KTI、貯藏蛋白、其它蛋白、以及它們的組合。圖ID描述了用於從在大豆蛋白分離物的生成中產生的大豆乳清流中回收一直或多種單獨的蛋白的本公開的方法的實施方案。儘管未描述於圖ID中，乳清蛋白預處理能夠從處理包括但不限於大豆分離蛋白(ISP)糖漿、ISP乳清、大豆蛋白濃縮物(SPC)糖漿、SPC乳清、功能性大豆蛋白濃縮物(FSPC)乳清、以及它們的組合的進料流開始。能夠用於乳清蛋白預處理步驟中的加工助劑包括但不限於酸、鹼、氫氧化鈉、氫氧化鈣、鹽酸、水、蒸汽、以及它們的組合。所述預處理步驟的PH能夠是介於約3. 0和約6. 0之間，並且優選4. 5。溫度能夠是介於約70°C和約95°C之間，並且優選約85°C。溫度保持時間能夠介於約0分鐘至約20分鐘之間、並且優選約10分鐘變化。來自乳清蛋白的預處理的產物包括但不限於保留物中的乳清流(預處理的大豆乳清)的水相中的可溶性組分(分子量等於或小於約50千道爾頓(kDa))和透過物中的不溶性大分子量蛋白(介於約300kDa和約50kDa之間)，例如預處理的大豆乳清、貯藏蛋白、以及它們的組合。如圖ID中所示，含水的大豆乳清I被引入包含第一過濾進料區域6的膜分離單元5中，所述第一過濾進料區域6以比分離膜7另一側的第一透過區域8中的壓力更高的壓力與所述膜的一側接觸。優選地，膜分離單元5包含至少一種微量過濾膜。跨越膜分離單元5中的分離膜7的跨膜壓力一般是至少約lpsi、至少約5psi、至少約lOpsi、至少約20psi、至少約30psi、至少約40psi、至少約50psi、或至少約75psi。流體通常以至少約I升流體/小時/每平方米、或約I升流體/小時/每平方米至約400升流體/小時/每平方米橫截面膜區域(橫向於流動方向)的體積流量或流量通過所述膜。流量可以被，例如，過濾的類型、膜的汙染等影響。大豆乳清典型以約0°C至約100°C，更典型以約25°C至約75°C的溫度被引入所述膜分離單元的過濾進料區域。通常，含水的大豆乳清I由於保留物的原因體積減少約5%。流體穿越分離膜的通過導致第一保留物9和第一透過區域8中的第一透過物13。所述第一保留物9將主要包含一種或多種微生物和不溶性材料，更具體地講，所述第一保留物9通常相對於所述第一透過物13富集了微生物。優選地，所述第一保留物9包含所述含水的大豆乳清的微生物含量的主要部分(如果不是基本上全部)。甚至更優選地，所述第一保留物9還包含消泡劑(例如，存在於所述含水的大豆乳清中的有機矽的矽或包含脂質的化合物)的主要部分，更具體地講，基於消泡劑含量，所述第一保留物9包含至少約70重量％，更優選至少約80重量％，甚至更優選至少約90重量％的所述含水的大豆乳清的消泡劑含量。所述第一透過物13將主要包含所述含水的大豆乳清流的全部的多種剩餘組分，例如可溶性大豆貯藏蛋白、大豆乳清蛋白、多種糖類、水、礦物、異黃酮素和維生素。再次就圖ID而言，所述第一透過物13被引入包含第二過濾進料區域18的膜分離單元17中，所述第二過濾進料區域18以比第二透過區域20中的壓力更高的壓力與分離膜19的一側接觸。膜分離單元17優選包含至少一種超濾膜作為分離膜19。跨越膜分離單元17中的分離膜19的跨膜壓力一般是至少約5psi、至少約lOpsi、至少約25psi、至少約50psi、至少約lOOpsi、或至少約150psi。流體通常以至少約I升流體/小時/每平方米、或約I升流體/小時/每平方米至約150升流體/小時/每平方米橫截面膜區域(橫向於流動方向)的體積流量或流量通過所述膜。大豆 乳清典型以約0°C至約100°C，更典型以約25°C至約75°C的溫度被引入所述膜分離單元的過濾進料區域。通常，含水的大豆乳清I以至少約5、或約5至約75 (例如，約25)的濃縮係數被濃縮。超濾步驟可以任選地包括滲濾。滲濾體積通常為約I直到約10份滲濾體積每份保留物範圍。流體穿越所述分離膜的通過導致第二保留物21和第二透過物25。所述第二保留物21包含所述含水的大豆乳清的蛋白含量的顯著部分，並因此被進一步處理，以回收KTI蛋白。優選地，所述第二保留物21包含存在於被引入所述第一過濾進料區域6的含水的大豆乳清中的多種大豆乳清蛋白的至少約25重量％至至少約90重量％ (例如，至少約50重量％)(基於乾重)。再次就圖ID而言，所述第二透過物25 —般包含沒有被回收至第二保留物21中的任何蛋白和所述大豆乳清流的多種其它組分(例如，多種糖類、水、礦物、維生素和異黃酮素)。儘管未圖示於圖ID中，所述第二透過物25的組分可以按照適當的分離操作被進一步處理，以分離和/或移除來自所述含水的乳清流的單獨的組分。在附加的分離步驟之後，將優選地形成相對純的水流，其在被處置或使用之前需要最低限度的處理(如果存在的話)。因此，本文所述的發明還通過，例如，改善環境品質處理了環境有益效果。將所述第二保留物21與載流23混合以形成進料24，通向包含至少一種離子交換樹脂30的離子交換柱或單元29。所述載流的確切位置不被嚴格要求。通常，所述載流的PH是約I至約7，更典型是約2至約6，更典型是約2至約5，甚至更典型是約3至約4。在KTI蛋白的回收的多個方面，所述載流包括非揮發性的緩衝液，包括如檸檬酸鈉，或揮發性的緩衝液，包括如甲酸銨。例如，在多個方面，所述載流包括在含水混合物中以約10毫摩爾每升至約30毫摩爾每升(例如，20mM)包含反離子的緩衝液。所述第二保留物21和/或進料流24的pH影響大豆蛋白的溶解度，而沉澱的蛋白可以導致離子交換柱的汙染。因此，可能期望將流向離子交換柱的進料的PH控制在某些範圍內(例如，通過緩衝作用)。如果必要，可以通過，例如，稀釋所述第二保留物、載流和/或通過所述保留物和載流的混合提供的進料，將所述進料的PH維持在所述範圍內。稀釋劑的組成沒有嚴格要求，通常為可以由本領域的技術人員容易地選擇的含水介質(例如，去離子水)。除了影響所述進料的PH外，稀釋還通常降低所述進料的內在離子強度，這促進了蛋白與離子交換樹脂的結合。附加地或者作為另外一種選擇，所述進料的PH可以通過載流的選擇來控制。離子交換樹脂被選擇為適用於第二保留物21和進料24中存在的一種或多種蛋白的選擇性保留和回收。在多個方面，所述離子交換樹脂被選擇用於KTI蛋白的選擇性保留或非KTI蛋白的保留，使得KTI蛋白與非KTI蛋白分離。以下的討論聚焦在從含水的大豆乳清(例如，第二保留物21)中回收和分離KTI蛋白上。然而，應當了解，下列的流程能夠容易地適應其它靶蛋白(例如BBI蛋白)的回收以及含水的之外的其它類型的輸入流(例如，從噴霧乾燥的復原的)。無論離子交換單元的確切配置如何，適用於KTI蛋白的回收的離子交換樹脂包括多種陽離子和陰離子交換樹脂。依賴於進入離子交換柱的進料，儘管陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂均適用於回收KTI蛋白，所述離子交換樹脂在多個方面包括陽離子交換樹月旨。例如，暴露於低於其等電點(Pl)的PH中的蛋白更可能具有帶正電荷的區域，並因此更牢固地與陽離子交換樹脂結合。所述進料流中的大多數蛋白(例如，大豆貯藏蛋白)具有比KIT的pi和所述進料通常的pH更高的pi。因此，這些蛋白通常更牢固地與所述樹脂結合。包含KTI蛋白的餾分可以通過使樹脂與適當的洗脫劑接觸而被容易地從離子交換柱上洗脫。作為另外一種選擇，所述進料的pH可以被控制為低於KTI蛋白的pl，以通過離子 交換樹脂提供KTI蛋白的保留。其它蛋白(例如BBI蛋白)也與所述樹脂結合。然而，所期望的餾分的回收可以通過使離子交換樹脂與用於蛋白餾分的差別洗脫的適當的洗脫機接觸進行。適當的陽離子交換樹脂包括本領域所熟知的多種樹脂。在至少一個實施方案中，所述離子交換樹脂包括Poros 20HS-由Applied Biosystems製造的交聯的多聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基質，其表面塗覆了用磺基丙基(例如，丙烷磺酸，(OH)2S(O)-(CH2)3-)官能化的多羥基聚合物。再次就圖ID而言，在進料24通過了離子交換柱30之後，回收洗脫了 KTI蛋白流33。為了進一步純化KTI蛋白流33並達到95%或更高的純度，可以通過使用親和層析(未描述於圖ID中)分離所述KTI蛋白流33。親和層析是通常在單個步驟中提供>95%純度的純化技術。它利用靶分子的天然的或添加的特異性性質來將其與樣品中的全部雜質分離。為了純化KTI蛋白流33，在之前的步驟中尚未被除去的剩餘的雜質(主要是大豆凝集素)，能夠容易地通過親和層析被除去。任何預製的應用特異性樹脂(即，具有連接至其表面的特異性針對待分離化合物的配體的樹脂)能夠被使用和平衡，例如，N-乙醯-D-半乳糖胺樹脂(目錄號A2787, Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO)。使用本領域已知的方法，將KTI蛋白流33調節至與所述樹脂相同的緩衝液組成，並施加至親和柱，雜質從而粘附至樹脂，而穿流被收集作為純化的KTI餾分。圖2示出了對如圖ID所示的本發明的方法過程中分離的多種保留物和透過物的SDS-PAGE純度分析，包括KTI蛋白流33。泳道I描述了分離之前的大豆乳清的組成並且顯示了多重組分的存在。與此相對，泳道5描述了在圖ID中所示的多個分離操作之後富集的KTI餾分(即，KTI蛋白流33)。兩個條帶的存在表明，在圖ID的分離過程之後，KTI蛋白和一種其它雜質(基於所述KTI餾分的分子量推測其為大豆凝集素)已從大豆乳清中分離。剩餘的雜質(即，大豆凝集素)的移除能夠如實施例中所示通過親和層析完成，以獲得幾乎不含附加的組分並具有高水平的純度(> 95% )的KTI產品。圖1A、1B、1C和ID中所描述的方法設計不限於原料或以上所示的大豆乳清組分的分離和回收的順序，並且可被用於製備與上文所論及的那些不同的工藝流，包括，例如，如所附權利要求中所示的。E.製備KTI的方法在某些實施方案中，本發明的KTI蛋白通過，例如，重組方法或合成產生。本發明的蛋白的重組製備使用本領域的普通技術人員已知的標準技術進行。此類方法包括，例如，製備一種或多種編碼核酸序列，這能夠通過基於聚合酶鏈反應(PCR)的方法用全長cDNA序列作為模板進行。在製備了所期望的核酸序列之後，該序列被插入表達載體(包括，例如，大腸桿菌(Escherichia coli)pCAL_n表達質粒)中,然後將其轉入微生物；然後，使用選擇標記(包括，例如，抗生素抗性選擇標記或突光選擇標記)，進行對包含含有所期望序列的質粒的克隆的選擇；然後大量製備包含含有所期望序列的質粒的克隆；並從所期望的克隆純化肽(參加，例如，Gorlatov等人所述的方法，Biochemistry (2002)41,4107-4116 ;美國專利4，980，456)。作為另外一種選擇，本發明的肽能夠通過合成方法或半合成方法(例如，重組製備和合成方法的組合)製備。
合成製備能夠通過，例如，應用根據Carpino L. A.和Han. G Y, J. (Amer. Chem.Soc. 1981 ；37 ；3404-3409)的芴甲氧羰基保護基團策略或叔-丁氧羰基(t-Boc)-保護基團策略進行。肽使用多重肽合成儀合成，例如，通過根據Merrifield R. B. (J. Amer. Chem.Soc. 1963 ;85，2149-2154)的固相肽合成方法。然後對粗製肽進行純化。用於本發明的蛋白的合成製備的示例性方法描述於下文中。IOOmgTentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以0. 24mmol/g的載量被轉入可商購獲得的肽合成設備(PSMM (Shimadzu))中，其中肽序列根據碳二亞胺/HOBt方法被逐步構建。FMOC-胺基酸衍生物通過加入5倍克分子數相等的過量二異丙基碳二亞胺(DIC)、二異丙基乙胺(DIPEA)和羥基苯並三唑(HOBt)，然後轉入反應容器，與樹脂載體混合30分鐘而被預激活。洗滌步驟通過，例如，添加DMF並徹底混合I分鐘進行。裂解步驟通過，例如，在DMF中添加哌啶並徹底混合4分鐘進行。單個反應的移除和洗滌溶液通過迫使溶液通過反應容器的底部玻璃料實現。使用了胺基酸衍生物 FM0C-Ala、FM0C-Arg (Pbf),FMOC-Asp,FMOC-Gly,FMOC-His (Trt)、FMOC-Ile, FMOC-Leu, FMOC-Lys (BOC)、FMOC-Pro, FMOC-Ser (tBu)和 FMOC-Tyr (tBu)(Orpegen)。當合成完成時，乾燥肽樹脂。隨後通過在室溫用三氟乙酸/TIS/EDT/水(體積比95 : 2 : 2 : I)處理2小時裂解肽醯胺。通過過濾、濃縮所述溶液和通過加入冰冷的乙醚沉澱，獲得固體形式的粗產物。在0. 1% TFA中以5-60%梯度乙腈在40分鐘內以12ml/min的流量通過RP-HPLC純化肽，並通過UV檢測器方法在215nm評估洗脫液。通過分析型RP-HPLC和質譜測定了單個餾分的純度。F.使用方法在本發明的多個方面，本發明的KTI蛋白能夠被用於促進皮膚健康。促進皮膚健康的實例包括皮膚變色或色素沉著的減少、炎症的減少、皺紋的最小化、皺紋的除去、脫色、著色、皮膚軟化、皮膚平滑化、脫毛和清潔。與此相關的皮膚健康的其它實例和實驗方法可見於美國專利申請公布 20100093028、20100092409、20090111160、20080249029、美國專利6,555，143 (亦參見 Chen 等人，Photochemistry and Photobiology, 2008,84 :1551-1559 和Paine 等人，J. Invest. Dermatol. 200IApr ；116 (4) :587-95)。^JL
為了更好的理解本發明，下文定義了幾個術語。如本文所用，術語「酸可溶的」是指物質在具有約2至約7的pH的含水介質中以10克每升(g/L)的濃度具有至少約80%的溶解度。如本文所用，術語「大豆分離蛋白」或「分離大豆蛋白」是指按無水計具有至少約90%的大ii蛋白的蛋白含量的大ii材料。如本文所用，術語「對象」是指需要對病理狀態進行處理的哺乳動物(優選人類)、鳥、魚、爬行動物、兩棲動物，所述病理狀態包括但不限於與肌肉相關的疾病、非受控的細胞生長、自體免疫疾病和癌症。如本文所用，術語「工藝流」是指來源於精煉完整的豆類或油料種子的方法的次級或附帶的產物，包括含水的或溶劑流，其包括，例如，含水的大豆提取物流、含水的豆漿提取物流、含水的大豆乳清流、含水的大豆糖漿流、含水的大豆蛋白濃縮物大豆糖漿流、含水的大豆透過物流和含水的豆腐乳清流，並且附加地包括例如液體和乾粉形式的大豆乳清蛋白，其能夠根據本文所公開的方法被回收作為中間產物。如本文所用，術語「大豆乳清蛋白」是指在大豆貯藏蛋白通常不溶解的pH可溶的蛋白，包括但不限於BBI、KTI、露那辛、脂氧合酶、脫水蛋白、凝集素、肽、以及它們的組合，並且進一步涵蓋貯藏蛋白。本專利申請中各處提及的其它蛋白被定義為包括但不限於露那辛、凝集素、脫水蛋白、脂氧合酶、以及它們的組合。大豆低聚糖被定義為包括但不限於糖。糖被定義為包括但不限於蔗糖、棉子糖、水蘇糖、毛蕊花糖、單糖、以及它們的組合。當介紹本發明或其優選實施方案的要素時，冠詞「一個」和「所述」旨在表示有一個或多個要素。術語「包含」、「包括」和「具有」旨在表示包容性並且表示除列出要素外還可以有其它要素。在不脫離本發明範圍的條件下，可對以上化合物、產品和方法進行各種更改，這意味著可將上文描述和下文實施例中包含的所有內容理解為例證性的而非限定性的。
實施例實施例I :從大豆乳清蛋白中回收KTI蛋白具有大約3. 7重量％的總固體含量和22. 5重量％ (基於乾重)的總蛋白含量的含水的大豆乳清(1451)被引入包含BTS-25或MMM 0. 45微米微量過濾膜的0PTISEP 7000過濾模塊中。含水的大豆乳清穿越膜的通過形成了包含含水的大豆乳清的透過物(1321，具有3. 2重量％的固體含量)以及包含大於99%的大豆乳清初始細菌含量和大於90%的大豆乳清矽消泡劑含量的保留物。表I :實驗中所使用的膜的描述
權利要求
1.庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)產品，所述產品具有至少約95重量％的總KTI蛋白濃度。
2.權利要求I的KTI產品，其中所述KTI蛋白還包含與SEQID NO :1至少85%相同的胺基酸序列。
3.權利要求I的KTI產品，其中所述KTI蛋白還包含與SEQID NO :1至少90%相同的胺基酸序列。
4.權利要求I的KTI產品，其中所述KTI蛋白還包含與SEQID NO :1至少95%相同的胺基酸序列。
5.權利要求I的KTI產品，其中基於乾重，所述KTI產品還包含至少約95%的總蛋白含量。
6.權利要求I的KTI產品，其中所述產品還表現出至少約1500胰蛋白酶抑制單位/克蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性。
7.權利要求I的KTI產品，其中所述產品還包含不超過約0.5內毒素單位/克蛋白的總內毒素含量。
8.庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)產品，其中所述KTI蛋白包含至少一種與SEQID NO:I至少80%相同的胺基酸序列。
9.權利要求11的KTI產品，其中所述KTI蛋白包含與SEQID NO :1至少85%相同的胺基酸序列。
10.權利要求11的KTI產品，其中所述KTI蛋白包含與SEQID NO :1至少90%相同的胺基酸序列。
11.權利要求11的KTI產品，其中所述KTI蛋白包含與SEQID NO :1至少95%相同的胺基酸序列。
12.庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)產品，所述產品具有至少約70重量％的總KTI蛋白濃度，並且其中所述KTI蛋白包含與SEQ ID NO: I至少80%相同的胺基酸序列。
13.庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)產品，所述產品具有至少約95%的基於乾重的總蛋白含量，至少約1500胰蛋白酶抑制單位/克蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性。
14.權利要求16的KTI產品，還包含不超過約0.5內毒素單位/克蛋白的總內毒素含量。
15.庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)產品，所述產品具有至少約95重量％KTI蛋白的總KTI蛋白濃度，其中所述KTI蛋白包含與SEQ ID NO :I至少80%相同的胺基酸序列，並且進一步地，其中所述KTI產品表現出下列特性中的一種或多種 (i)基於乾重，至少約95%的總蛋白含量； (ii)至少約1500胰蛋白酶抑制單位/克蛋白的胰蛋白酶抑制劑活性；和/或 (iii)不超過約0.5內毒素單位/克蛋白的總內毒素含量。
全文摘要
本發明公開了從工藝流中回收並具有至少約95重量％的總KTI蛋白濃度的新型庫尼茲胰蛋白酶抑制劑(KTI)亞型，以及從工藝流中回收和分離純化的KTI亞型的方法。
文檔編號A61K36/00GK102770147SQ201080064229
公開日2012年11月7日 申請日期2010年12月30日 優先權日2009年12月30日
發明者B.塔爾克, C.S.沙斯蒂恩, D.馬什, J.吳, K.克勒, M.梅克爾 申請人:索萊有限責任公司