凝固檢查用試劑及其試劑的生產方法

2023-07-28 03:35:01

專利名稱：：凝固檢查用試劑及其試劑的生產方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於外源性血液凝固檢査的凝固檢查用試劑及其生產方法。
背景技術：
：凝血致活酶是一種被稱為組織因子的蛋白質和磷脂的複合物。凝血致活酶參與血液凝固。因此，凝血致活酶被應用於各種凝固檢査。比如，綜合性檢測血中第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的凝固功能的凝血檢查用試劑中含有牛腦組織凝血致活酶、纖維蛋白原、第V因子、鈣和磷脂。凝血檢査用試劑的主要成份之一牛腦組織凝血致活酶是磷脂結合到被稱為組織因子的蛋白質中生成的複合物。組織因子正如高模裕子(音譯)等人所著文獻("cDNAandaminoacidsequencesofbovinetissuefactor",BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,Vol.181,1991，pages1145-1150)的圖3所示，全部胺基酸數為257個的蛋白質。組織因子由從N末端到第213位的細胞外區(可溶性細胞區)、從第214到第236位的跨膜區和從237到257位的細胞內區組成。有此種結構的凝血致活酶歷來以牛大腦為原料通過用丙酮粉或生理鹽水提取凝血致活酶的方法生產。作為原料使用的牛大腦是狂牛症(BSE)的高感染部位之一。因此，近年來，生產現場發出了不使用牛大腦作原料的呼聲。有報告稱可以利用遺傳工程學技術生產作為檢測試劑成份之一的具有活性的重組組織因子基因。例如WO93/07492、WO98/48283，CheiylLBrucatol等所著文獻("ExpressionofrecombinantrabbittissuefactorinPichiapstoris,anditsapplicationinaprothrombintimereagent",ProteinExpressionandpurification,Vol.26,2002，pages386-393)。具體而言，根據WO93/07492，先在大腸菌中表達重組人組織因子遺傳基因，再運用固定針對人組織因子的單克隆抗體的親和色譜法，純化重組人組織因子。並將純化的重組人組織因子應用到凝血致活酶試劑。根據CherylLBrucatol等所著文獻，在酵母中表達重組兔組織因子(rTF)，然後利用組氨酸標記純化rTF，將所得rTF應用到凝血酶原時間測定試劑。此文獻報告稱，所表達的兔組織因子是由細胞內區、跨膜區和細胞外區組成的全長因子。同樣，WO98/48283也是在酵母中表達由細胞外區、脂質結合區、細胞內區構成的全長重組兔組織因子，然後利用有選擇性地放大重組組織因子的組氨酸標記，純化重組兔組織因子。將純化的兔組織因子應用於凝血酶原時間測定試劑。如上所述，上述任何一種形式都使用經色譜法等純化的重組組織因子來防止來源於宿主細胞的不純物混入試劑所造成的試劑凝固活性降低和測定精度降低等問題。然而，要純化重組組織因子，必須構築有效分離、去除來源於宿主細胞的不純物的體系。當大量生產重組組織因子時，這種純化工作費時、費力、費成本，給重組組織因子的生產效率帶來問題。比如使用特異性抗體的親和色譜法在大量純化、生產時，特異性抗體的使用是造成高成本的原因。使用組氨酸標記的親和色譜法作為適於大量生產的純化方法在重組兔組織因子中已經實用化。然而，根據宿主的種類和組織因子的種類不同，有些種類中組氨酸標記與重組組織因子的結合會影響凝固活性。因此，這種純化方法一般在純化後切斷組氨酸標記。追加這種標記切斷步驟，是生產成本增加的原因。有些種類的組織因子由於其立體結構，即使使用組氨酸標記的色譜法也不能很好地純化。由於上述原因，在使用遺傳工程學技術的組織因子生產中，有必要構築一個既不影響凝固活性、又能滿足成本和產量等生產率的生產體系。而且，人們希望有一種凝固檢查試劑能夠應用所構築的生產體系生產的組織因子。
發明內容本發明的範圍只由後附權利要求書所規定，在任何程度上都不受這一節
發明內容的陳述所限。本發明的第一方面提供一種凝固檢查用試劑，包含磷脂與以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主所獲得的重組組織因子的複合物；以及來源於所述昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。所述重組組織因子為具有可溶性區域和跨膜區的重組牛組織因子。所述重組組織因子有序列號1所示的胺基酸序列、或由所述胺基酸序列中的1個或數個胺基酸被缺失、附加或取代而獲得的胺基酸序列。所述重組組織因子所具有的胺基酸序列與序列號1所示的胺基酸序列有至少95%的相同性。所述昆蟲為鱗翅目昆蟲，所述鱗翅目昆蟲是家蠶。所述來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份包含來源於所述昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性蛋白質。所述凝固檢查用試劑是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑、肝促凝血活酶試驗用試劑或凝血致活酶時間用試劑。所述試劑，還包含選自於由第I因子、第V因子、硫酸鋇吸附血漿和鈣離子構成的組群中的至少一種成份。本發明的第二方面提供一種凝固檢查用試劑的生產方法，包括以下步驟將組織因子的cDNA插入杆狀病毒(BacuLovirus)DNA中獲得重組杆狀病毒，讓昆蟲或昆蟲培養細胞感染此重組杆狀病毒；在上述昆蟲或昆蟲培養細胞中表達用上述cDNA編碼的重組組織因子；破碎表達上述重組組織因子的昆蟲或昆蟲培養細胞，從含所得破碎物的溶液中去除不溶性成份，獲得含上述重組組織因子的可溶性組份；以及混合上述可溶性組份和磷脂，生成上述重組組織因子和磷脂的複合物。所述cDNA對牛組織因子的可溶性區域和跨膜區編碼。所述cDNA對具有序列號2所示的胺基酸序列、或由所述胺基酸序列中的1個或數個胺基酸被缺失、附加或取代而獲得的胺基酸序列的重組組織因子進行編碼。所述cDNA所編碼的重組組織因子有與序列號2所示胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。所述方法，在獲得所述可溶性組份的步驟中，含破碎物的溶液含有表面活性劑圖1為顯示含有重組組織因子的溶液SW的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果的照片。圖2為顯示含有重組組織因子的溶液SF的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳結果的照片。圖3為對照試劑1的活性值與試劑SW的活性值的關係圖。圖4為對照試劑1的活性值與試劑SF的活性值的關係圖。圖5為在使用實施例中製備的PIVKA感受性試驗用試劑的測定中血漿的稀釋倍率和凝固時間的關係圖。具體實施例方式作為本發明一實施方式的凝固檢査用試劑包括:磷脂與以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主獲得的重組組織因子的複合物以及來源於上述毘蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。此凝固檢査用試劑含有用遺傳工程學技術製造的重組組織因子，還含有宿主為昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。但是，它顯示出能夠與含有天然凝血致活酶的傳統凝固檢查用試劑相匹敵的凝固活性和敏感度。因此，此凝固檢査用試劑由於使用重組組織因子取代天然凝血致活酶，所以在生產現場可以不使用造成狂牛症等原因的大腦，非常安全。而且，此凝固檢査用試劑在其生產方法中可以簡化重組組織因子的純化工序，故具有優越的生產效率並可期望降低生產成本。重組組織因子和該組織因子的磷脂複合物首先，就用於凝固檢査用試劑的重組組織因子和該重組組織因子與磷脂的複合物(以後也稱重組組織因子一磷脂複合物)進行說明。重組組織因子由以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主、通過遺傳工程學方法生成的。作為重組組織因子有如通過遺傳工程學方法生成的重組牛組織因子、重組兔組織因子和重組人組織因子等。天然組織因子通過與磷脂複合，激活來源於人血的第VII因子。因此，作為重組組織因子至少應該有天然組織因子的可溶性區域和跨膜區。重組組織因子的可溶性區域是與第VII因子相互作用所需的區域，跨膜區則是合成與磷脂的複合物所必需的區域。更理想的重組組織因子應該是在不破壞其與磷脂合成複合物、激活第vn因子的能力的範圍內具有可溶性區域、跨膜區和細胞內區。如以重組牛組織因子為例，序列號i所示胺基酸序列中的數個胺基酸被取代、附加或缺失，但可與磷脂合成複合物，激活第vn因子。具體而言，重組組織因子以其序列至少95%與序列號i所示胺基酸序列相同為宜，重組組織因子其序列至少97%與序列號1所示胺基酸序列相同更好，重組組織因子的序列最好至少99%與序列號1所示胺基酸序列相同。在此，序列號1為上述高稷裕子(音譯)等人所著文獻的圖3所示正常牛組織因子的胺基酸序列。即，在序列號1中，從第1位胺基酸到第213位胺基酸為可溶性區域(細胞外區)，從第214位胺基酸到第236位為跨膜區，從第237位到第257位為細胞內區。上述重組組織因子通過以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主的遺傳工程學方法生成。詳待後述。重組組織因子一磷脂複合物是磷脂結合到上述重組組織因子的跨膜區的產物，而且具有與天然凝血致活酶(磷脂複合物型的天然組織因子)同等程度的凝血活性。這種複合物用眾所周知的方法通過重組組織因子與磷脂混合即可製備。比如，可以用WO93/07492、WO98/48283和上述CherylLBrucatol等人的文獻所記載的方法製造。用於合成複合物的磷脂以含有一般碳原子數為12~22的脂肪酸的磷脂為宜。脂肪酸可以是飽和脂肪酸也可以是不飽和脂肪酸。具體而言，理想的磷脂有磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油和磷脂醯絲氨酸等。這些磷脂也可以是天然物或合成品之一。這些磷脂也可以有不同種類的脂肪酸。而且，這些磷脂根據所希望的性狀、特性等也可以將二種混合用於複合物的合成。凝固檢査用試劑作為本發明實施方式的凝固檢查用試劑含有上述重組組織因子一磷脂複合物或獲得重組組織因子時使用的來源於宿主昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。凝固檢査用試劑所含重組組織因子是用以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主的遺傳工程學方法獲得的基因。作為宿主使用的昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份是與重組組織因子一起從宿主中提取出來的，最終與重組組織因子一起含在凝固檢查用試劑中。作為宿主使用的昆蟲，對其種類沒有限定。作宿主用的昆蟲可以使用鱗翅目昆蟲。在鱗翅目昆蟲中尤以家蠶(學名^w^戸/won')更好。用作宿主的昆蟲如可以有Sf9、Sf21、HiFive等。其中，以使用Sf9更好。從宿主中提取重組組織因子時，首先要在水和緩衝液等適當溶液中破碎作為宿主的昆蟲或昆蟲培養細胞。然後通過過濾和離心分離等從含有破碎所得破碎物的溶液中除去不溶成份。來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份是通過過濾從含昆蟲或昆蟲培養細胞破碎物的溶液中除去不溶性成份所得濾液中可能含有的成份。或來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份是通過離心分離從含昆蟲或昆蟲培養細胞破碎物的溶液中除去不溶成份所得上清液中可能含有的成份。比如，溶在昆蟲體液中的成份、溶在昆蟲培養細胞的細胞質溶膠(細胞溶膠)中的成份等。具體而言，含有構成昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性蛋白質、水溶性糖鏈或昆蟲或昆蟲培養細胞產生的可溶性蛋白等。凝固檢查用試劑含有上述重組組織因子一磷脂複合物和上述昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。也可根據凝固檢査用試劑的種類(即要檢測的凝固因子的種類)適當地在試劑中添加凝固因子、鈣離子和磷脂等。比如，如果凝固檢査用試劑為第II、第VII、第IX、第x因子測定用試劑，則試劑含有重組牛組織因子一磷脂複合物、昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。作為其他成份，試劑最好還含有第I因子、第v因子和鈣離子。也可以用除去第n因子、第VII因子、第IX因子和X因子的血眾取代添加第I因子和第V因子。該血漿最好使用用硫酸鋇吸附血漿(以牛血漿為宜)所得的硫酸鋇吸附血漿。硫酸鋇吸附血漿可以在血漿(以牛血漿為宜)中添加硫酸鋇，混合後再除去硫酸鋇來製備。如果凝固檢查用試劑為綜合性檢測第n、第vn、第x因子的凝固功能的肝促凝血活酶試驗(HepaplastinTest、HPT)用試劑，則試劑含有重組兔組織因子-磷脂複合物、昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。作為其他成份，試劑最好還含有第I因子、第V因子和鈣離子。也可以用除去第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的血漿取代添加第I因子和第V因子。如果凝固檢查用試劑為凝血活酶時間用試劑，則試劑含有重組兔組織因子一磷脂複合物或重組人組織因子一磷脂複合物及昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。作為其他成份，試劑最好還含有鈣離子。上述鈣離子源一般從氯化鈣、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣等選擇。根據需要，也可以在試劑中添加選自HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycine等組群的緩衝液，使其PH值達59、最終濃度約為10100畫o有以上組份的凝固檢查用試劑雖然含有來源於獲取重組組織因子時使用的宿主昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份，但儘管如此，凝固檢查用試劑也具有可以與天然凝血致活酶試劑相匹敵的凝固活性。當凝固檢査用試劑為含有重組牛組織因子-磷脂複合物的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑時，在對維生素K缺乏或拮抗劑誘導的蛋白質(PIVKA:proteininducedinvitaminKabsenceorantagonists)的感受性上，凝固檢査用試劑也不亞於使用天然凝血致活酶的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑。因此，凝固檢査用試劑也可以作為用於監視華法林(Warfarin)等療效的試劑使用。所謂PIVKA是無正常凝血因子活性的前驅體的總稱。PIVKA在維生素K缺乏或維生素K拮抗物存在的情況下出現在血液中。比如，凝血因子中第II、第VII、第IX和第X因子都在肝臟合成。在其合成的最後階段需要維生素K。因此，當維生素K缺乏症、用華法林等維生素K抑制劑時，這些因子以無正常凝血因子活性的前驅體出現在血液中。Hemker等人的文獻("Kineticaspectsoftheinteractionofbloodclottingenzymes.III.DemonstrationofaninhibitorofprothrombinconversioninvitaminKdeficiency.",ThrombDiathHaemorrh,Vol.19，pages346-363,1968)禾卩Denson等人的文獻(DensonKW,ReedSV,HaddonME."ValidityoftheINRsystemforpatientswithliverimpairment.",ThrombHaemost,Vol.73，pases162，1995)報告稱，牛組織因子對PIVKA的感受性高，兔組織因子和人組織因子對PIVKA的感受性低。因此，現在檢測華法林等療效時多利用含牛組織因子的第II、第VII、第IX和第X因子測定用試劑。使用含牛組織因子的第II、第VII、第IX和第X因子測定用試劑進行的檢測也稱為凝血試驗(Thrombotest)。凝固檢査用試劑的生產方法凝固檢査用試劑的生產方法包括以下步驟將組織因子的cDNA插入杆狀病毒DNA獲得重組杆狀病毒，讓昆蟲或昆蟲培養細胞感染杆狀病毒；讓被上述cDNA編碼的重組組織因子在上述昆蟲或昆蟲培養細胞中表達；破碎表達上述重組組織因子的昆蟲或昆蟲培養細胞，從含有上述所得破碎物的溶液中除去不溶性成份，獲得含上述重組組織因子的可溶性成份；以及混合上述可溶性成份和磷脂，合成上述重組組織因子與磷脂的複合物。在生產方法中使用的組織因子的cDNA是用於目標凝固檢査用試劑的組織因子的cDNA。組織因子的cDNA至少有編碼可溶性區域的鹼基序列和編碼跨膜區的鹼基序列。組織因子的cDNA最好有能夠編碼組織因子的可溶性區域、跨膜區和細胞內區全部區域的鹼基序列。比如，以牛組織因子為例，最好使用能夠對序列號2所示胺基酸序列(AAB20755)的鹼基序列編碼或能夠對該胺基酸序列中一個或數個胺基酸取代、附加或缺失的胺基酸序列編碼的鹼基序列。具體而言，以能夠對與序列號2所示胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列編碼的鹼基序列為宜，能夠對至少97%相同的胺基酸序列編碼的鹼基序列更好，最好是能夠對至少99%相同的胺基酸序列編碼的鹼基序列。更具體地說，可以使用能夠從Clonetech公司和Stratagene公司的cDNA庫等得到的牛組織因子的cDNA。將這種cDNA插入杆狀病毒DNA中，製備重組杆狀病毒。杆狀病毒作為基因有雙鏈環狀DNA。杆狀病毒是昆蟲病原病毒。作為杆狀病毒如有核型多角體病毒(NPV:nucleopolyhedrovirus)、GN(geanulovirus)等。作為杆狀病毒以使用NPV為宜。NPV是一種在感染的細胞內大量合成被稱為多角體的蛋白質的病毒。對這種多角體蛋白質編碼的基因在杆狀病毒擴增中是不需要的。通過將目標組織因子的cDNA插入多角體基因的啟動子下遊取代多角體基因即可以在感染細胞內大量合成目標組織因子。作為杆狀病毒，最好使用人為地使半胱氨酸蛋白酶基因缺失的杆狀病毒，以避免病毒產生的半胱氨酸蛋白酶造成蛋白質分解的影響。導入了組織因子cDNA的重組杆狀病毒可以用眾所周知的重組技術製備。比如，將組織因子cDNA插入杆狀病毒轉移載體。將所得轉移載體和杆狀病毒DNA轉染到昆蟲細胞。在昆蟲細胞內生成相同的重組，以此即可構建組織因子cDNA被插入杆狀病毒DNA的重組杆狀病毒。當使用含杆狀病毒的大腸桿菌DH10Bac(GibcoBRL公司)時，通過將插入組織因子cDNA的轉移載體轉染到大腸桿菌DH10Bac，即可構建重組杆狀病毒。然後，讓作為宿主的昆蟲或昆蟲培養細胞感染構建的重組杆狀病毒。如果宿主是昆蟲，則對昆蟲種類沒有特別限定。用作宿主的昆蟲最好是鱗翅目昆蟲。鱗翅目昆蟲中尤以家蠶(學名^w6j^附on')更好。對蠶的種類無特別限定，最好使用裸蛹家蠶。裸蛹家蠶是結繭基因變異的一種。因此，裸蛹家蠶化蛹但不結繭。這種裸蛹家蠶已知有比如Nd、Ndb、Nd-s和Nd-t系統的家蠶。最好使用這種蠶的蛹。蛹存在於家蠶幼蟲的消化管中用於分解食物(桑)的絲氨酸蛋白酶活性比蠶蟲體低得多。可以利用這一點防止在蠶內表達的蛋白質分解。蠶蛹對杆狀病毒的感受性比幼蟲高。因此，病毒很容易在蠶蛹內增殖，可使大量組織因子表達。當宿主是昆蟲培養細胞時，可使用Sf9、Sf21、HiFive等培養的昆蟲培養細胞。其中尤以Sf9為宜。使用昆蟲培養細胞時，作為表達的生成蛋白的組織因子可以在細胞外分泌也可在細胞內積累。作為感染方法可以利用眾所周知的方法。比如，當宿主為昆蟲時，可以運用向昆蟲注射病毒液的注射法、將塗有微量病毒液的針給昆蟲接種的微量接種法。或者將重組杆狀病毒轉染到昆蟲培養細胞，將所得昆蟲培養細胞培養一定時間使重組杆狀病毒增殖，再將增殖的昆蟲培養細胞接種到昆蟲，這樣也可以讓昆蟲感染病毒。使用昆蟲培養細胞作為宿主時，可以通過在含有病毒的培養液中培養昆蟲培養細胞一定時間，讓昆蟲培養細胞感染病毒。當宿主為昆蟲時，飼養感染昆蟲510天。在飼養過程中，插入重組杆狀病毒的cDNA在宿主內表達，在昆蟲內生成目標組織因子。生成的組織因子在昆蟲內積蓄。在昆蟲內積蓄的組織因子可以認為其N端經翻譯後的處理已經被切斷。比如，以重組牛組織因子為例，在昆蟲內積蓄的重組牛組織因子為序列號1所示因子。飼養一定時間後，將生成的組織因子從宿主中提取出來。當宿主為昆蟲培養細胞時，將昆蟲培養細胞與病毒液一起培養27天。培養過程中，插入重組杆狀病毒的cDNA在宿主內表達，在昆蟲培養細胞內生成目標組織因子。生成的組織因子在培養細胞內積蓄或在培養基內分泌。與宿主為昆蟲的情況一樣，在昆蟲培養細胞內，可以認為其N端經翻譯後的處理已經被切斷。比如，以重組牛組織因子為例，在昆蟲培養細胞內積蓄的重組牛組織因子為序列號1所示因子。培養一定時間後，將生成的組織因子從培養細胞內或培養基內提取出來。如果以昆蟲為宿主，組織因子可以通過以下方法從昆蟲提取。先破碎有重組組織因子表達的昆蟲。從含所得破碎物的溶液中除去不溶性成份。這樣就可以獲得含有上述重組組織因子的可溶性成份。昆蟲可以用攪拌器、均質器、攪切器(blender)和超聲波等機械粉碎。機械處理還可以配合使用表面活性劑等非機械處理使用。昆蟲的破碎最好在水和緩衝液等適當溶液中進行。這種溶液以下稱"破碎處理液"。破碎處理液如有水、磷酸緩衝液和三羥甲基氨基甲垸緩衝液等緩衝液以及添加表面活性劑的緩衝液等。從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份可通過過濾、離心分離或這些方法適當組合使用。若以昆蟲培養細胞為宿主，則組織因子可以通過如下方法從昆蟲培養細胞和培養基抽取。首先破碎表達重組組織因子的培養細胞。從含有所得破碎物的溶液中除去不溶性成份。如此即可獲得含有上述重組組織因子的可溶性成份。培養細胞可用均質器和超聲波等機械破碎。培養細胞還可用表面活性劑等非機械破碎溶解。也可將機械處理與非機械處理配合使用。培養細胞的破碎與以昆蟲為宿主時一樣，最好在適當破碎處理液中進行。從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份可通過過濾、離心分離或這些方法適當組合使用。含破碎昆蟲或昆蟲培養細胞所得破碎物的溶液中含有含重組組織因子的可溶性組份。可溶性組份含有重組組織因子和來源於宿主昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。含破碎物的溶液中除含此可溶性組份外，還含有導入基因時使用的杆狀病毒。表面活性劑有抑制此病毒活性的作用，因此最好在抽取上述重組組織因子時使用表面活性劑。作為表面活性劑可用非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑任何一種。從殺菌性看，最好使用非離子型表面活性劑作為表面活性劑。而且添加非離子型表面活性劑還可促進重組組織因子的溶解。所謂破碎處理液，如上所述，是破碎宿主昆蟲和昆蟲培養細胞時使用的溶液。作為破碎處理液如有水、磷酸緩衝液和三羥甲基氨基甲烷緩衝液等緩衝液以及添加表面活性劑的緩衝液等。在破碎處理液中破碎昆蟲和昆蟲培養細胞，生成的重組組織因子和來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份會溶解在破碎處理液中。在此，所謂來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份指可溶於破碎處理液的成份，因此，即使在通過過濾和離心分離等方法從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份後，仍然可含在經過濾除去不溶性成份所得濾液和經離心分離除去不溶性成份所得上清中。昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份如有昆蟲體液或溶於昆蟲培養細胞的細胞質溶膠(胞質溶膠)的成份。具體而言，如有構成昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性蛋白質、水溶性糖鏈、昆蟲或昆蟲培養細胞產生的可溶性蛋白等。所謂不溶性成份指不溶於上述破碎處理液的成份。具體而言，如有破碎的角質層和細胞膜等固體成份、脂蛋白、脂質和不溶性蛋白質等。如此從含有破碎物的溶液中除去不溶性成份，獲得不溶性成份去除液。作為不溶性成份去除液，具體來說，有過濾含破碎物溶液所得濾液和離心分離含破碎物溶液所得上清等。而且這種不溶性成份去除液可作為含重組組織因子的溶液(以下稱"重組組織因子含有液")使用。還可以HEPES等緩衝液(pH6~7)等為外液透析除去不溶性成份後的不溶性成份去除液。也可將透析後所得不溶性成份去除液作為重組組織因子含有液使用。重組組織因子-磷脂複合物的合成可以按照常規方法進行(參照MethodsEnzymo1.,222，p173，1993等)。尤以在有鎳參與的條件下混合重組組織因子含有液和磷脂溶液，合成複合物為佳。重組組織因子一磷脂複合物的合成工序在過濾、離心分離等除去不溶性成份後進行即可。如果要透析不溶性成份去除液，則複合物合成工序既可在透析後，也可在透析前進行。鹽析也同樣，複合物合成工序既可在鹽析後，也可在鹽析前進行。上述磷脂溶液含有合成複合物所用的磷脂。作為磷脂最好使用有碳原子數為12-22的脂肪酸或不飽和脂肪酸的磷脂。具體而言，可使用上述重組組織因子-磷脂複合物例示的磷脂。重組組織因子含有液和磷脂液的克分子比率約為l:101:2xl7範圍為宜，1:30001:15000更好。作為鎳，可使用氯化鎳和硫酸鎳等鎳鹽水溶液或將鎳溶解在緩衝液中形成的溶液。將以上重組組織因子含有液、磷脂液和鎳鹽溶液混合攪拌，反應約1~2個小時，即可合成組織因子和磷脂的複合物。當要生產的凝固檢査用試劑含有鈣離子時，在生產過程中添加氯化朽、乳酸鈣和葡萄糖酸鈣等作為鈣離子源。當要生產的凝固檢査用試劑是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑時，在生產過程中，添加第i因子和第v因子。也可用除去第n因子、第vn因子、第ix因子和第x因子的血漿取代第i因子和第v因子。作為該血漿也可使用用硫酸鋇吸附血漿(最好是牛血漿)獲得的硫酸鋇吸附血漿。硫酸鋇吸附血漿的配製無特別限定，比如可以用Charles等所著文獻("One-stageProthrombinTimetechniques",ThrombosisandBleedingDisordersTheoryandMethod,1971，p92-97)中記述的Owren等方法配製。另夕卜，在生產過程中，根據需要，還可按pH5~9、最終濃度約10100mM添加選自HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycine等組群中的緩衝液。根據需要添加的第I因子和第V因子(或硫酸鋇吸附血漿等)、韓離子源、緩衝劑等既可以在牛組織因子-磷脂複合物合成前添加，也可以在複合物合成後添加。對第I因子和第V因子、鈣離子源、緩衝劑等的添加順序也沒有特別限定。如上製備的凝固檢查用試劑含有重組組織因子-磷脂複合物和作為凝固檢查用試劑不可缺少的成份。在此，作為凝固檢查用試劑不可缺少的成份，具體而言，如果是凝血酶原時間測定試劑，則有鈣離子。如果是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑或肝促凝血活酶試驗用試劑，則有鈣、第I因子和第V因子。也可以用硫酸鋇吸附血漿取代第I因子和第V因子。用上述配製方法製備的凝固檢查用試劑含有上述重組組織因子構建中使用的宿主的可溶性成份。本發明人發現宿主(昆蟲或昆蟲培養細胞)的可溶性成份不影響檢查中的凝血反應。基於這一發現，在抽取用遺傳工程學生產的重組組織因子的過程中，即使不使用色譜法等對重組組織因子進行高度純化，實際上也可以提供沒有問題的凝固檢查用試劑。因此，用上述凝固檢查用試劑的配製方法簡化了遺傳工程學方法生產重組組織因子的純化步驟，可望降低生產成本。實例以家蠶為宿主的重組組織因子的生成購買牛腦的cDNA庫(Clonetech公司)，根據非專利文獻1的方法用PCR擴增牛組織因子的基因，克隆對牛組織因子的可溶性區域和跨膜區編碼的全長牛組織因子編碼遺傳基因。用PCR法擴增時，作為上遊引物使用有BgIII片段的引物(5'-agatctatggcgacccccaacgggcc)，作為下遊引物使用有EcoRI片段的弓1物(5'-acttaagaatacgtcgcaactcgccgc)。用DNAsequencer(DNA測序儀(4200型、萊卡))對克隆基因的鹼基序列進行測序，確認是序列號2的蛋白質編碼的DNA。將克隆的cDNA插入半胱氨酸蛋白酶基因缺失病毒(片倉工業、pYNG)的克隆細胞，獲得重組杆狀病毒。以此構建杆狀病毒表達體系，使牛組織因子表達。讓蠶蛹感染重組杆狀病毒，5"C放置7天，使之充分感染。用均質器在緩衝液中破碎感染後的蠶蛹。通過過濾和離心分離等方法從所得破碎液中除去固形成份。在此，從牛組織因子cDNA插入杆狀病毒到除去固形成份的過程中均使用片倉工業株式會社的"Superworm"服務。從片倉工業株式會社購買除去固形成份的溶液，再對此溶液進行均質化(AS-1會社、轉數5000rpml0衝程)和離心分離(3000xG、8°C、10分)處理。回收上清，向8容量上清添加2容量的10%NP-40表面活性劑(Calbiochem公司)。所得混合液的NP—40表面活性劑最終濃度為2%。然後，3(TC培養混合液3小時，讓杆狀病毒失活，同時對重組組織因子增溶。杆狀病毒失活的確認是根據Reed-MuencH法(Reed，L丄andMuench,H.:Amer丄Hyg.,27，493(1938))用顯微鏡目測有無病毒感染來確認混合液的病毒價。離心分離(3000xG、8°C、30分鐘)混合液，得除去脂朊和脂質成份的上清。接下來將所得上清用20MMHEPES(150MM氯化鈉緩衝液(pH7.2))透析(透析用纖維素管、三光純藥株式會社)。透析後，抽取透析管內的溶液，以此作為重組牛組織因子含有液SW。此重組牛組織因子含有液SW含重組牛組織因子和來源於家蠶的可溶性成份。以Sf9為宿主的重組牛組織因子的生產購買牛腦的cDNA庫(Stratagene公司)，根據非專利文獻1的方法用PCR擴增牛組織因子的基因，克隆對牛組織因子的可溶性區域和跨膜區編碼的全長牛組織因子編碼遺傳基因。用PCR法擴增時，作為上遊引物使用有BamHI片段的引物(5'-ggatccatggcgacccccaacgggccccg)，作為下遊引物使用有Xhol片段的引物(5'-ctcgagttatgcagcgttgagcggcgtg)。用4000LDNAs叫uencer(LI-COR公司)對克隆基因的鹼基序列進行測序，確認是序列號2的蛋白質編碼的DNA。用BamHI和Xhol消化克隆的cDNA後，將其插入轉移載休pFastBac(GIBCOBRL公司)。將此pFastBac轉移到含有杆狀病毒基因組DNA的大腸桿菌DH10Bac。最終得到導入了牛組織因子的cDNA的杆狀病毒(牛組織因子重組杆狀病毒)。將重組杆狀病毒轉染到昆蟲培養細胞Sf9，培養72小時後得到P1病毒。然後讓Sf9感染Pl病毒，在含10。/。FBS的格雷斯介質(GraceMedium)(invitrogen公司)中培養4天得P2病毒。將所得P2病毒感染到其他Sf9，將感染的Sf9在Sf-900II無血清介質(SerumFreeMedium)(invi加gen公司)中培養。獲取培養後的Sf9。用三羥甲基氨基甲烷緩衝液(pH7.5、含1%CHAPS)從獲得的Sf9中抽取重組牛組織因子，製備重組牛組織因子含有液SF。此重組牛組織因子含有液SF含有重組牛組織因子和來源於Sf9細胞的可溶性成份。用重組牛組織因子含有液作SDS-PAGE用在以上配製方法過程中獲得的重組牛組織因子含有液SW和重組牛組織因子含有液SF進行SDS-PAGE(十二垸基硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳)。在10pL重組牛組織因子含有液SW中添加SDS上樣緩衝液pH7.5(含200MMTris、72MM甘氨酸、0.02%SDS)10pL。將所得混合液IOO'C沸騰5分鐘，製備SDS用試樣(SDS用試樣SW)。將所得SDS用試樣SW10pL注入5~10%聚丙烯醯胺梯度凝膠孔，用電泳槽(微型蛋白質II電泳裝置(日本伯樂生命醫學產品株式會社))加電50V泳動3小時。泳動後用銀色染色試劑盒(第一化學藥品株式會社)對聚丙烯醯胺凝膠染色。其結果如圖1所示。在圖1中，條帶1為分子量標記(標準品、日本伯樂生命醫學產品株式會社))，條帶2為SDS用試樣SW的泳動結果。重組牛組織因子的條帶出現的位置(約是分子量40kDa的位置)用箭頭表不o在IOmL重組牛組織因子含有液SF中添加2xSDS上樣緩衝液pH7.5(含200MMTris、72MM甘氨酸、0.02%SDS)10jxL。將所得混合液IOO'c沸騰5分鐘，製備SDS用試樣(SDS用試樣SF)。將所得sds用試樣SF10mL注入510%聚丙烯醯胺梯度凝膠孔，用電泳槽(微型蛋白質n電泳裝置(日本伯樂生命醫學產品株式會社))加電ioov泳動1小時。泳動後用ccb染色試劑盒(和光純藥工業株式會社)對聚丙烯醯胺凝膠染色。其結果如圖2所示。在圖2中，條帶1為分子量標記(標準品、日本伯樂生命醫學產品株式會社))，條帶2為SDS用試樣SF的泳動結果。重組牛組織因子的條帶出現的位置(約為分子量40kDa的位置)用箭頭表不。由圖1和圖2的結果可以看出，重組牛組織因子含有液SW中和重組牛組織因子含有液SF中除重組牛組織因子外還含有大量來源於宿主的蛋白質。由圖1的結果可以認為，重組牛組織因子在重組牛組織因子含有液SW中的純度約為5~10%左右。由圖2的結果可以認為，重組牛組織因子在重組牛組織因子含有液SF中的純度約為15%左右。重組牛組織因子-磷脂複合物的合成先將基礎大豆卵磷脂0.4g(日清制油株式會社)溶解到0.25%去氧膽酸鈉doc(20ML)中。用旋轉混合器在室溫下讓基礎大豆卵磷脂完全溶解，在該混合液中懸浮1,2-油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)O.lg禾口1,2畫二油稀基-sn畫甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(l,2-dioleyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)0.3g(均為Avantipolarlipid、Inc.產品)，配製磷脂溶液。在此磷脂溶液37.5ML中添加0.5M氯化鎳溶液5ML、10MMHEPES緩衝液(pH7.3)5.0ML和上述重組牛組織因子含有液(重組牛組織因子含有液SW或重組牛組織因子含有液SF)2.5ML。將所得混合液旋渦攪拌30秒。攪拌後用BRANSON#2210型超聲波裝置在37"下讓混合液反應15分鐘後，37。C放置1小時。將混合液移至透析膜(透析用纖維素管、三光純藥工業株式會社)，用10MMHEPES(含0.15M氯化鈉)pH7.3進行三次透析，得透析管內經透析後的溶液，將此作為牛組織因子-磷脂複合物含有液(重組牛組織因子-磷脂複合物含有液SW或重組牛組織因子-磷脂複合物含有液SF)使用。第II、第VII、第DC、第X因子檢査用試劑的製備(1)硫酸鋇吸附血漿的配製在添加了檸檬酸的牛血漿中加入牛血漿的30w/v。/。量的硫酸鋇和牛血漿的20v/v。/。量的生理鹽水，用旋轉混合器攪拌60分鐘。將此混合液以4°C5000rpm離心分離15分鐘後，回收上清。在此上清中逐滴添加該上清的30w/vW量的硫酸鋇。這樣，血漿中的第II、第VII、第IX、第X因子即吸附於硫酸鋇中。然後，再離心分離，回收上清。將該上清注入透析管(透析用纖維素管、三光純藥工業株式會社)，以生理鹽水為外液在28'C進行透析。用0.45pm的濾膜過濾透析管內經透析後的溶液。以所得濾液為硫酸鋇吸附血漿，用於以下試劑的製備。(2)第H、第VII、第IX、第X因子檢査用試劑的製備將上述配製的牛組織因子-磷脂複合物含有液和硫酸鋇吸附血漿以及40mMHEPES緩衝液(含pH7.3、4mM乳酸轉)以1:2:1的比率混合攪拌，製備第II、第VII、第IX、第X因子檢查用試劑。在此，以用重組牛組織因子-磷脂複合物含有液sw製備的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑為試劑SW，以用重組牛組織因子-磷脂複合物含有液SF製備的第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑為試劑SF。例1來源於蠶的可溶性成份對凝血活性的影響基於上述製備方法製備試劑SW3批(SW-1、SW-2和SW-3)。由未感染杆狀病毒的家蠶按上述製備方法製備第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑sw。以此為試劑sw(未感染)。試劑sw(未感染)中雖然含有來源於家蠶個體的可溶性成份，但是不含來源於重組牛組織因子和杆狀病毒的可溶性成份。再讓蠶蛹感染未插入牛組織因子cDNA的杆狀病毒，根據上述製備方法從感染的蠶蛹製備第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑SW。以此為試劑SW(不含cDNA)。試劑SW(不含cDNA)中雖然含有來源於蠶蛹個體及來源於杆狀病毒的可溶性成份，但是不含重組牛組織因子。用這五種試劑(SW-1、SW-2、SW-3、SW(未感染)和SW(不含cDNA))分別用全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津製作所(株))測定正常血漿的凝固時間(秒)。再將上述五種試劑以生理鹽水稀釋2倍、稀釋4倍、稀釋8倍製備稀釋試劑，用這些稀釋試劑同樣測定正常血漿的凝固時間(秒)。作為正常血漿，使用的是正常值質控血漿N(希森美康(株))。用各種試劑獲得的凝血時間(秒)的結果如表l所示。表ltableseeoriginaldocumentpage21在表1中，當使用試劑SW(未感染)和試劑SW(不含cDNA)時，沒有檢測出凝固時間。而當使用試劑SW-1、試劑SW-2、試劑SW-3時，檢測出凝固時間。由此得知，試劑中所含來源於蠶個體的可溶性成份和來源於杆狀病毒的可溶性成份不引起凝血反應。而且，試劑SW-1、試劑SW-2和試劑SW-3均隨著稀釋倍率的增高而凝固時間延長。試劑的稀釋倍率越高，試劑中的重組牛組織因子的濃度越低。由此可以確認，試劑中的重組牛組織因子的濃度變化與凝固時間之間存在相關關係。從上得知，試劑中所含來源於蠶個體的可溶性成份和來源於杆狀病毒的可溶性成份不對血液的凝固反應產生影響。因此，製備凝固檢查用試劑時不必純化重組組織因子、除去這些可溶性成份。進而可以認為，以Sf9等昆蟲培養細胞為宿主時，來源於宿主的可溶性成份也同樣不會影響血液的凝固反應。例2試劑SW和試劑SF的敏感度分別使用上述方法製備的試劑SW和試劑SF用全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津製作所(株))測定4種Ak-Calibrant(AK校準品)(AK-Aa、AK-Bb、AK-Cc和AK-Dd，均為Immuno公司制，奧地利)的凝固時間(秒)及國際標準敏感度指數(ISI值)。Ak-Calibrant(AK校準品)是具有在OQUASTA檢測中被預先確定INR顯示值的校準品。使用算出的已知ISI值的複合因子T"KOKUSAI"作為對照試劑1與上述同樣測定AK校準品的凝固時間(秒)和ISI值。複合因子T"KOKUSAI"是以牛組織因子-磷脂複合物為天然牛大腦凝血致活酶的市場銷售的凝血致活試驗(TT)試劑。另外，作為對照試劑2製備了含純化的重組牛組織因子的第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑。用此對照試劑2與上述同樣測定AK校準品的凝固時間(秒)及ISI值。對照試劑2除在製備試劑SW的工序中進行硫銨鹽析以使重組牛組織因子含有液SW中所含重組牛組織因子純度達約95%以上外，其他均與試劑SW—樣製備。且試劑SW、試劑SF和對照試劑2在測定正常值質控血漿N(希森美康(株))時，調製得可以得出與使用對照試劑1時相同的凝固時間。用各試劑測得的凝固時間(秒)和ISI值的結果如表2所示。表2tableseeoriginaldocumentpage22從表2結果可以確認，試劑SW和試劑SF對於校準品AK-AaAK-Dd顯示與對照試劑1和對照試劑2同等程度的凝固時間和敏感度。據此得知，試劑SW和試劑SF的任何一個均顯示出與使用天然牛腦凝血致活酶的傳統試劑和含純化重組牛組織因子的試劑同樣的凝固時間和敏感度。例3試劑SW或試劑SF與對照試劑的凝固活性的相關性使用與上述例2中所用同樣試劑(試劑SW、試劑SF、對照試劑1和對照試劑2)用全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津製作所(株))測定服用華法林(Warfarin)患者的血漿(N=20)的凝固活性(％)。繪製用於計算活性值(％)的標準曲線使用的是正常值質控血漿N(希森美康(株))。服用華法林患者的血漿使用的是Multi-CoumadinSet(GeorogeKingBiomedical公司)。使用各種試劑所得的活性值(％)結果如表3所示。表3tableseeoriginaldocumentpage23從表3的結果可以確認，對於各種血漿標本，試劑SW和試劑SF均顯示出與對照試劑1和對照試劑2同等程度的活性值。由此得知，試劑SW和試劑SF的任何一個均顯示出與使用天然牛腦凝血致活酶的傳統試劑和含純化重組牛組織因子的試劑同樣的活性值。針對各種血漿標本，使用對照試劑1時的活性值和使用試劑SW時的活性值的關係圖如圖3所示。使用對照試劑1時的活性值和使用試劑SF時的活性值的關係圖如圖4所示。圖3的橫軸表示用對照試劑1測定吋的活性值(%)，縱軸表示用試劑SW測定時的活性值(％)。圖4的橫軸表示用對照試劑l.測定時的活性值(％),縱軸表示用試劑SF測定時的活性值(％)。正如圖3和圖4所明示，試劑SW的活性值(％)和試劑SF的活性值(%)均與傳統的對照試劑1的活性值(％)之間存在很高的相關性。由此得知，本實施例的試劑SW和試劑SF的活性相當於使用天然牛腦凝血致活酶的傳統試劑。例4第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑對PIVKA的感受性用重組牛組織因子含有液SW測試PIVKA的感受性。具體而言，將第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑SW與20MM氯化鈣溶液等量混合。再將所得混合液與人吸附血漿混合，製備PIVKA感受性試驗用試劑。作為對照，再用含有從牛腦抽取的凝血致活酶的牛腦來源凝血致活酶溶液和含有從兔腦抽取的凝血致活酶的兔腦來源凝血致活酶溶液與上述同樣製備PIVKA感受性試驗用試劑。用製備的PIVKA感受性試驗用試劑通過全自動凝血分析儀Coagrex-800(島津製作所(株))測定正常血漿和3種華法林服用患者血漿的凝固時間。正常血漿使用的是正常值質控血漿N(希森美康(株))和用生理鹽水將其稀釋的溶液。正常值質控血漿N的稀釋倍率為稀釋3倍、稀釋5倍和稀釋7倍。華法林服用患者血漿使用Multi-CoumadinSet(GeorogeKingBiomedical公司)及其用生理鹽水稀釋的溶液。華法林服用患者血漿的稀釋倍率為稀釋2倍、稀釋3倍和稀釋5倍。所得結果如圖5所示。圖5的A為使用重組牛組織因子含有液SW時的結果。B為使用牛腦來源凝血致活酶溶液時的結果。C為使用兔腦來源凝血致活酶溶液時的結果。圖5的縱軸為凝固時間(秒)，橫軸為血漿的稀釋倍率。按照Hemker和Denson等方法探討對PIVKA的感受性。按照Hemker和Denson等方法比較正常血漿所示直線和華法林服用患者血漿所示直線。此時你會發現，使用牛腦來源凝血致活酶溶液時(圖5B)在華法林服用患者血漿有由PIVKA造成的抗凝(虛線)。另一方面，使用兔腦來源凝血致活酶溶液時(圖5C)沒有由PIVKA造成的抗凝(虛線)。因此可以說，天然的牛凝血致活酶對PIVKA有感受性，但天然的兔凝血致活酶對PIVKA感受性很低。這種結果與Hemker和Denson等的報告一致。使用第n、第vn、第ix、第x因子測定用試劑sw時(圖5A)所得結果與使用牛腦來源凝血致活酶溶液時(圖5B)—致。從這些結果可以確認，本實施例試劑中的重組牛組織因子和磷脂的複合物顯示出與天然牛凝血致活酶同樣的性質。還了解到，第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑SW中所含來源於蠶的可溶性成份不會對PIVKA感受性產生影響。從以上各實施例的結果得知，上述凝固檢査用試劑儘管含有來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份，但仍顯示出與傳統凝固檢查試劑同樣的敏感度和凝固活性。由此得知，上述凝固檢査用試劑可以替代傳統的凝固檢查用試劑使用。另外，用於上述凝固檢查用試劑的重組組織因子因為可以簡化純化工序，因此可望比傳統的用重組組織因子的凝固檢査方法生產率高，生產成本低。序列表<110〉<勝<210〉<211〉<213〉希森美康株式會社凝固檢査用試劑及其試劑的生產方法2Patentlnversion3.11257PRT黃牛1ThrAspValValVslAlaTyrAsnlieThrTrpLysSerThrAsnPhe151015LysThrlieLeuGluTrpGluProLysProlieAsnHisValTyrThr202530ValGinlieSerProArgLeuGlyAsnTrpLysAsnLysCysPheTyr35'40■45ThrThrAsnThrGluCysAspValThrAspGlulieValLysAsnVal505560ArgGluThrTyrLeuAI3ArgValLeuSerTyrProAlaAspThrSer65707580SerSerThrValGluProProPheThrAsnSerProGluPheThrPro859095TyrLeuGluThrAsnLeuGlyGinProThrlieGinSerPheGluGin100105110ValGlyThrLysUuAsnValThrValGinAspAlaArgThrLeuVal115120125ArgAlaAsnSerAlaPheLeuSerLeuArgAspValPheGlyLysAsp130135140LeuAsnTyrThrLeuTyrTyrTrpLysAlaSerSerThrGlyLysLys145150155t60LysAlaThrThrAsnThrAsnG1yPheLeulieAspValAspLysGly165170175GluAsnTyrCysPheHisValGinAlaVallieLeuSerArgArgVal180185190AsnGinLysSerProGluSerProlieLysCysThrSerHisGluLys195200205ValLeuSerThrGluLeuPhePhelielieGlyThrValMetLeuVal210215220lielieliePhelieValValLeuSerValSerUuHisLysCysArg225230235240LysValArgAlaGluArgSerGlyLysGluAsnThrProLeuAsnAla245250255Ala<210〉<211〉<212〉<213〉2292PRT黃牛2MetAlaThrProAsnGlyProArgValProCysProC'lnAlaAlaVal1510i>AlaArgAlaLeuLeuPheGlvLeuValLeulieGinGlyAlaGlyVal202530AlaGlyThrThrAspValValValAlaTyrAsnlieThrTrpLysSer354045ThrAsnPheLysThrlieUuGluTrpGluProLysProlieAsnHis505560ValTyrThrValGinlieSerProArgLeuGlyAsnTrpLysAsnLys65707580CysPheTyrThrThrAsnThrGluCysAspValThrAspGlulieVal859095LysAsnValArgGluThrTyrLeuAlaArgValLeuSerTyrProAla100105110AspThrSerSerSerThrValGluProProPheThrAsnSerProGlu115120125PheThrProTyrLeuGluThrAsnLeuGlyGinProThrlieGinSer130135140PheGluGinValGlyThrLysLeuAsnValThrVaCinAspAisArg145150155160ThrLeuValArgAlaAsnSerAlaPheLeuSerLeuArgAspValPhe165170175GlyLysAspLeuAsnTyrThrLeuTyrTyrTrpLysAlaSerSerThr18C185190GlyLysb/sLysMaThrThrAsnThrAsnGlyPheLeulieAspVal"5200205AspLysGlyGluAsnTyrCysPheHisValGinAlaVallieLeuSer210215220ArgArgValAsnGinLysSerProGluSerProlieLysCysThrSer225230235240HisGluLysValLeuSerThrGluLeuPhePhelielieGlyThrVal245.250255MetLeuVallielieliePhelieValValLeuSerValSerLeuHis260265270LysCysArgLysValArgAlaGluArgSerGlyLysGiuAsnThrPro275280285.LeuAsnAlaAla290權利要求1.一種凝固檢查用試劑，其含有磷脂與以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主所獲得的重組組織因子的複合物；以及來源於所述昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。2.權利要求1所述試劑，其特徵在於所述重組組織因子為具有可溶性區域和跨膜區的重組牛組織因子。3.權利要求l所述試劑，其特徵在於所述重組組織因子有序列號1所示的胺基酸序列、或由所述胺基酸序列中的1個或數個胺基酸被缺失、附加或取代而獲得的胺基酸序列。4.權利要求1所述試劑，其特徵在於所述重組組織因子所具有的胺基酸序列與序列號1所示的胺基酸序列有至少95%的相同性。5.權利要求l所述試劑，其特徵在於所述昆蟲為鱗翅目昆蟲。6.權利要求5所述試劑，其特徵在於所述鱗翅目昆蟲是家蠶。7.權利要求l所述試劑，其特徵在於所述來源於昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份包含來源於所述昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性蛋白質。8.權利要求l所述試劑，其特徵在於所述凝固檢査用試劑是第II、第VII、第IX、第X因子測定用試劑、肝促凝血活酶試驗用試劑或凝血致活酶時間用試劑。9.權利要求l所述試劑，其特徵在於其還包含選自於由第I因子、第V因子、硫酸鋇吸附血漿和鈣離子構成的組群中的至少一種成份。10.—種凝固檢査用試劑的生產方法，包括以下步驟將組織因子的cDNA插入杆狀病毒DNA中獲得重組杆狀病毒，讓昆蟲或昆蟲培養細胞感染此重組杆狀病毒；在所述昆蟲或昆蟲培養細胞中讓用所述cDNA編碼的重組組織因子進行表達；破碎表達所述重組組織因子的昆蟲或昆蟲培養細胞，從含所得破碎物的溶液中去除不溶性成份，獲得含所述重組組織因子的可溶性組份；以及混合所述可溶性組份和磷脂，合成所述重組組織因子和磷脂的複合物。11.權利要求10所述方法，其特徵在於所述cDNA對牛組織因子的可溶性區域和跨膜區編碼。12.權利要求10所述方法，其特徵在於所述cDNA對具有序列號2所示的胺基酸序列、或由所述胺基酸序列中的1個或數個胺基酸被缺失、附加或取代而獲得的胺基酸序列的重組組織因子進行編碼。13.權利要求10所述方法，其特徵在於所述cDNA所編碼的重組組織因子有與序列號2所示胺基酸序列至少95%相同的胺基酸序列。14.權利要求10所述方法，其特徵在於在獲得所述可溶性組份的步驟中，含破碎物的溶液含有表面活性劑。全文摘要本發明提供一種凝固檢查用試劑。此凝固檢查用試劑含有磷脂與以昆蟲或昆蟲培養細胞為宿主獲得的重組組織因子的複合物以及來源於所述昆蟲或昆蟲培養細胞的可溶性成份。本發明還提供一種生產這種凝固檢查用試劑的方法。文檔編號G01N33/86GK101183109SQ20071018781公開日2008年5月21日申請日期2007年11月13日優先權日2006年11月14日發明者奧田昌宏,結城雅之,谷口友邦申請人:希森美康株式會社