一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法
2023-08-06 04:28:21
一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法
【專利摘要】本發明涉及一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，具體步驟如下：(1)不育材料的特徵、特性研究方法。(2)雜交方法的研究。(3)不育材料的遺傳分析研究方法。①不育材料F1代的育性調查；②不育材料F1分離出的可育株跟蹤調查；③不育材料不同生態條件下的育性狀況；(4)不育材料的不育度調查方法。(5)核不育材料在莜麥育種上的應用。①雜交；②選種；③育種。並採用「核不育單交單基因漸進累加法」、「核不育雙交雙基因漸進累加法」和「動態基因庫雜交育種法」育種程序，開展「輪迴選擇法」研究。本發明提高了莜麥的育種水平和選擇效率，有利於多出品種，快出品種，出好品種，社會效益大；提高了雜交效率，降低了成本，經濟效益好。
【專利說明】一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]莜麥(A.nuda大粒裸燕麥)是我國華北北部冀晉蒙三省區、西北的陝甘寧青四省區以及西南雲貴川大小涼山等高緯度、高海拔、高寒邊遠山區的主要糧食作物和飼料、飼草作物，在我省張、承兩市的壩上及壩下高寒山區種植面積佔糧播面積的30-50%。近年來國內外研究證實其籽實具有降低人體血脂和血糖的功效，被作為一種功能性保健食品得到開發利用。因此開展莜麥育種新技術的研究，做好莜麥新品種的選育，對推動我國莜麥的開發和產業化生產有著極其重要的意義。
[0003]莜麥起源於我國，由於長期生長繁衍於我國北方高寒乾旱區的單一生態環境條件下，形成了其耐旱不耐倒，耐瘠不高產的單一的品種資源類型，因此必須引進外源基因來改變這種局面。莜麥是自花授粉性很強的作物，天然雜交率極低，據楊才試驗，去雄不剪穎天然雜交率只有0.1-0.3%。而且由於莜麥穎殼長而軟，去雄授粉非常困難，一個熟練工，每天只能做150-200朵左右的花，且由於人工雜交的技術問題，品種間雜交結實率也只有5-8%，很難超過10%，因此說，莜麥雜交結實率低、費工、費時、成本高，故而影響了廣泛地配置組合和開展應用更深層次的雜交育種方法。若能採用顯性核不育育種方法，將有效地解決上述問題，起到事半功倍的效果。
[0004]顯性雄性核不育是受一對單基因控制的不育類型，其特點是:不育度高，Fl代分離可育株與不育株比例為1: 1，而分離出的可育株後代不會再分離出不育株，是一項很有效的育種方法。
[0005]從1972年由高忠麗發現，經鄧景揚鑑定出小麥太谷顯性雄性核不育以來，相繼在棉花、馬鈴薯、萵苣、紅胡麻草、穀子、亞麻、水稻、油菜、大白菜等10多種作物上發現過14例顯性核不育材料。並在這些作物育種上得到了廣泛的應用，收到了非常好的效果。利用小麥顯性太谷核不育在「六五一八五」10多年的時間裡就有14個品種通過了審定，覆蓋面積達180萬公頃。作為雜交工具利用顯性核不育育性穩定，雄性敗育徹底，可以省卻人工去雄、授粉工序；利用顯性核不育便於開展輪迴選擇；利用顯性核不育可打破不利的連鎖使其變為有利的基因連鎖；利用顯性核不育抑制或篩選最佳遺傳背景以優化組合等。通過基因充分交流而組裝起來的材料，經過天然淘汰與人工選擇，就有可能從中獲得突破性品種，如在小麥上解決了耐乾旱、耐鹽鹼、抗赤黴病、抗小麥吸漿蟲等多種國際上尚未突破的難題。可見顯性核不育在作物育種上，特別是自交性強的自花授粉作物上，育種應用效果明顯，效益大，價值高。而在莜麥上還沒有發現和研究利用顯性雄性不育材料的報導。本項研究是對楊才1996年發現的不育材料進行研究和應用的。實踐證明，顯性雄性核不育在莜麥育種上應用，效果很好，對推動世界莜麥乃至燕麥的科學進步，帶動莜、燕麥產業化發展有很高的學術價值和重要的生產意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，以便能夠更好地針對上述材料進行研究。
[0007]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。
[0008]一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，具體步驟如下:
[0009](I)不育材料的特徵、特性研究方法。直觀性狀，主要採取不育材料與母體的對比調查法，進行特徵的區別描述；花粉育性是，用碘化鉀或醋酸洋紅液染色壓片法，對不育材料和母本進行對比檢測。
[0010](2)雜交方法的研究。種植不同比例的母、父本對結實率的影響。
[0011](3)不育材料的遺傳分析研究方法。①不育材料F1代的育性調查:採取不育材料與母本和不同類型的品種進行測交，對其F1代分離出的可育株和不育株的分離比列進行調查；②不育材料F1分離出的可育株跟蹤調查:調查代數為2~10代；③不育材料不同生態條件下的育性狀況:設壩下、壩上和壩下溫室三種生態條件，調查可育株與不育株的分離比例。
[0012](4)不育材料的不育度調查方法。根據可育株與不育株的特徵，在莜麥抽穗時授粉前將不育株穗子套袋，成熟前摘下袋子，調查結實情況，計算不育度。
[0013](5)核不育材料在莜麥育種上的應用。①雜交:雜交的類型有單交、雙交、三交、復交、多交、聚合雜交及輪迴選擇幾種。雜交的方法是種I行母本、種兩行父本，抽穗開花時拔除可育株，保留不育株與父本雜交，並進行人工輔助授粉。②選種:採用系統選擇法，從匕代分離出的可育株中選擇優 良單穗(株)，進穗行圃，穗行圃穩定且性狀優良的晉升；穗行圃仍有性狀分離，且不整齊的繼續選單穗，直至穩定一致後進入常規育種試驗場圃，進行產量和性狀的鑑定。後期程序同常規育種。③育種方法。研究並採用了兩種育種方案，一種是優良基因漸進累加法；一種是動態基因庫育種法，優良基因漸進累加法又分核不育單交單基因漸進累加法和核不育雙交雙基因漸進累加法。
[0014]核不育動態基因庫育種法。選符合育種目標的多個品種為父本，等量混合後再與核不育母本材料隔行種植，抽穗時拔除可育株，自由授粉。下年繼續如上述方法操作，以後類推。
[0015]並採用「核不育單交單基因漸進累加法」、「核不育雙交雙基因漸進累加法」和「動態基因庫雜交育種法」育種程序，開展了「輪迴選擇法」的研究工作。應用上述方法選出各類高代品系20多份，其中進入品系鑑定11份，參加品比的4份，參加區試的3份，完成區試，生產鑑定等中試試驗，進入大面積示範，已鑑定的品種3個，(參加品比以上的品種(系)材料見表6)。建立了以遠雜資源後代為主的「優質高蛋白種群動態基因庫」和以生產種植推廣的優良品種資源為主的「抗旱豐產種群動態基因庫」。現將三種方法的應用程式及效果評述如下:
[0016]上述技術中，「核不育單交單基因漸進累加法」、「核不育雙交雙基因漸進累加法」和「動態基因庫雜交育種法」育種程序分別如下:
[0017](I)核不育單交單基因漸進累加法育種程序，具體步驟如下:
[0018]I)確定育種目標，制定新品種模板:根據生產需要，確定新品種的選育目標，制定新品種的模板。[0019]2)選擇目的基因:從各種各類資源中選擇符合育種目標和新品種模板的多個目的基因。如制定的新品種模板是:抗燕麥堅黑穗、高蛋白、抗旱耐瘠性好的品種。則選擇上述三個目的基因，也就是具有上述三個特點的資源品種。
[0020]3)雜交:採用成對雜交、三交和多交的方法逐漸加入目的基因，即每年(或者每一次雜交)加入一個目的基因，連續雜交I~3次以上。
[0021]4)選擇:加入全部目的基因後，從最後一次加入目的基因的F1代可育株中，選擇符合育種目標的單穗(株)，也可以在加入一定量的目的基因的中期，雜交和選擇同時時行。
[0022]5)性狀鑑定:同常規育種。
[0023](2)核不育雙交雙基因漸進累加法育種程序具體如下:
[0024]I)確定育種目標，制定新品種模板:根據生產需要，確定新品種的選育目標，制定新品種的模板。
[0025]2)選擇目的基因:同單交單基因法，但可選擇更多的目的基因。
[0026]3)雜交:採用雙交、復交的方法，即在一個年度(一個周期)內分別配置兩個組合，第二年進行複合雜交，也可以是三交。
[0027]4)選擇:加入全部目的基因後，從F1代可育株中，選擇符合育種目標的單穗(株)。
[0028]5)性狀鑑定:同常規育種。
[0029](3)核不育目標動態基因庫種群雜交法育種程序，具體如下:
[0030]I)確定育種目標:根據生產需要確定育種目標，制定新品種的模板。
[0031]2)選擇目的基因:從資源材料和高代品系中，選符合育種目標的多個目的基因。
[0032]3)建立目標動態基因庫(雜交):以入選的多個目的基因為父本群，等量混合後與核不育材料隔行種植進行雜交，抽穗時拔除可育株，自由授粉。根據需要下年可以再加入一些新的目的基因。
[0033]4)選種:按照育種目標和新品種模板的要求，從目標基因庫中連續不斷地選擇可育單穗(株)。
[0034]5)後代鑑定:按常規育種程序。
[0035]該發明的有益效果在於:
[0036](I)該發明技術在國內外首先發現獲得了莜麥顯性雄性不育材料，為開展莜麥核不育育種提供了關鍵性材料。顯性雄性核不育作為一種橋梁材料已在一些作物上得到應用，但在莜麥上至今還沒有開展這一研究和應用這項技術。影響開展這項工作研究的關鍵是沒發現和找到可利用的莜麥顯性核不育材料。1996年由該項目主持人楊才研究員在莜麥田發現了莜麥顯性雄性核不育材料，為顯性雄性核不育育種在莜麥上的應用提供了關鍵的核不育材料，在世界莜麥育種上屬首次。為推動莜麥育種技術的進步，提高莜麥育種水平，提供了關鍵性材料。
[0037](2)對核不育材料開展了深入細緻，全面而系統的研究，明確了核不育材料的類型，特徵、特性、育性及後代遺傳分離規律等問題，為莜麥顯性雄性核不育，在育種上的應用打下了堅實的基礎，提供了技術依據和保證。研究得出核不育植株的特點是:外穎有剛毛，開花時穎殼張裂，柱頭外露，花葯小；花粉粒形狀不規則，不著色，易粘連；自交不結實，花粉完全敗育；不育株與 可育株雜交，或與其它任何一個品種雜交，Fl代分離出的不育株與可育株始終保持近似於1:1的比例；而分離的可育株遺傳性狀穩定，不再分離不育株，表現為雄性不育受一對顯性核不育基因控制。為應用方便，定名為莜麥顯性雄性核不育ZY基因。
[0038](3)創立了 「核不育單交單基因漸進累加法」，「核不育雙交雙基因漸進累加法」和「核不育目標動態基因庫雜交法」育種程序和方法，並開展了莜麥輪迴選擇方法的研究。採用基礎研究與應用研究相結合的方法，經多年的研究和實踐應用，創立了上述三種莜麥顯性核不育育種程序和方法，為莜麥顯性雄性核不育ZY基因在莜麥育種上的應用提供了具體的應用方法，積累了經驗。
[0039](4)在研究動態基因庫育種法的同時，創建了「優質高蛋白種群」、「抗旱豐產種群」兩個目標動態基因庫種群。從而育成了符合育種目標的品系3個，還選出了矮杆資源15個，高蛋白資源3個，超早熟資源8個。
[0040](5)利用核不育育種法育成了莜、燕麥新品種3個，新品系20多個，穩定的後代材料1500份。應用核不育材料暨優良基因漸進累加法和動態基因庫育種法選出了穩定的後代材料1500份，進入品系鑑定的品系20個，其中參加品比的4個，區試的3個，已鑑定的品種3個，為莜麥育種開創了一條新途徑。
[0041]上述雜交育種是莜麥育種的一種主要的方法,但是莜麥的穎殼長而軟，花器小，去雄授粉非常困難，人工徒手做雜交結實率低，效果不高。一般一個熟練的技工每天只做200-250朵花，而結實率只有3-10%，可得種子10幾粒。雜交育種投資大，成本高，影響了廣泛地配置雜交組合，開展高水平多基因的聚合雜交及輪迴選擇。而莜麥顯性雄性核不育的發現和應用，可解決上述問題，開展廣泛的雜交，提高莜麥育種水平，為莜麥育種開創了一條新的雜交育種新途徑，推動莜麥育種領域的進步和水平的提高，應用前景好，效率高。
[0042]應用該技術，提聞了蔽麥的育種水平和選擇效率，有利於多出品種，快出品種，出好品種，社會效益大；提高了雜交效率，降低了成本，經濟效益好。已育成的三個品種共獲得經濟效益29.91萬元，若在生產大面積應用推廣後，年可增加產值1.8億元。`【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]圖1、本發明實施例中的核不育單交單基因漸進累加法技術路線圖。
[0044]圖2、本發明實施例中核不育雙交雙基因漸進累加法技術路線圖。
[0045]圖3、本發明實施例中核不育動態基因庫育種法示意圖。
[0046]圖4、本發明實施例中不育株花粉粒電鏡圖。
[0047]圖5、本發明實施例中可育株花粉粒電鏡圖。
【具體實施方式】
[0048]下面結合附圖和實施例對本發明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發明。
[0049]實施例
[0050]本發明實施例所採用的材料分兩類，一是:母本核不育材料，二是:用於測配的父本材料。
[0051 ]1、母本核不育材料的獲得。1996年在原張家口市壩上農科所莜麥試驗田發現並獲得。其過程是:1994年從中國科學院植物所引入兩種轉基因物質(PUC18、GUS)，當時作為兩種抗鹽鹼基因轉接到莜麥品種「品五號」中。做法是:將授粉4小時的莜麥胚，用鋒利的刀片切去柱頭，滴DNA5y 1，每個處理做500朵花，共2個處理，即P5P、P5G.。秋天收穫種子分別為95粒、115粒。95年種於大田繁殖種子，經調查觀察沒有發現任何異常現象。1996年將一代繁殖的種子繼續種植於大田，抽穗後在P5G處理的後代中發現六株雄性不育株。當時對已抽穗的進行掛牌標記，與母本自由交配，對未抽穗的分櫱穗進行幼穗培養，生產克隆苗，繁殖種子和配置組合。經研究定名為莜麥顯性雄性核不育ZY基因。
[0052]2、父本材料:應用的父本材料近100多個。用於前期調查研究的材料50多個。大體用了三個種四個類型。三個種是:莜麥(A.nuda)、普通栽培燕麥(A.satiav)和大燕麥(A.magna);四個類型來源是:①通過雜交培育的新品種，如578、「品字號」系列，「花育號」系列，「壩莜I號」等；②創新資源與高代品系，如S013、S20、S109等農家優良品種，如「三分三」、李家場等國外引進資源，如中引系列，白雪、76-5等。
[0053]上述針對莜麥顯性雄性核不育材料的研究方法與技術路線如下:
[0054](I)不育材料的特徵、特性研究方法。直觀性狀，主要採取不育材料與母體的對比調查法，進行特徵的區別描述；花粉育性是，用碘化鉀或醋酸洋紅液染色壓片法，對不育材料和母本進行對比檢測。
[0055](2)雜交方法的研究。種植不同比例的母、父本對結實率的影響。
[0056](3)不育材料的遺傳分析研究方法。①不育材料F1代的育性調查:採取不育材料與母本和不同類型的品種進行測交，對其F1代分離出的可育株和不育株的分離比列進行調查；②不育材料F1分離出的可育株跟蹤調查:調查代數為2-10代；③不育材料不同生態條件下的育性狀況:設壩下、壩上和壩下溫室三種生態條件，調查可育株與不育株的分離比例。
`[0057](4)不育材料的不育度調查方法。根據可育株與不育株的特徵，在莜麥抽穗時授粉前將不育株穗子套袋，成熟前摘下袋子，調查結實情況，計算不育度。
[0058](5)核不育材料在莜麥育種上的應用。①雜交:雜交的類型有單交、雙交、三交、復交、多交、聚合雜交及輪迴選擇幾種。雜交的方法是種I行母本、種兩行父本，抽穗開花時拔除可育株，保留不育株與父本雜交，並進行人工輔助授粉。②選種:採用系統選擇法，從匕代分離出的可育株中選擇優良單穗(株)，進穗行圃，穗行圃穩定且性狀優良的晉升；穗行圃仍有性狀分離，且不整齊的繼續選單穗，直至穩定一致後進入常規育種試驗場圃，進行產量和性狀的鑑定。後期程序同常規育種。③育種方法。研究並採用了兩種育種方案，一種是優良基因漸進累加法；一種是動態基因庫育種法，優良基因漸進累加法又分核不育單交單基因漸進累加法和核不育雙交雙基因漸進累加法。其技術路線見圖1、圖2、圖3。
[0059]核不育動態基因庫育種法。選符合育種目標的多個品種為父本，等量混合後再與核不育母本材料隔行種植，抽穗時拔除可育株，自由授粉。下年繼續如上述方法操作，以後類推。
[0060]具體過程及結果如下:
[0061](I)不育株特徵、特性的研究:
[0062](Ia)直觀性狀:經觀察核不育材料與母體「品五號」的特徵、特性大致相同，但也有差別，從外觀上看，可育株與不育株的區別是:可育株為短串鈴，不育株為燕尾鈴；可育株小穗上多數無剛毛，不育株小穗上有1-2條剛毛；抽穗開花後，可育株穎殼關閉不張開，不育株穎殼張裂，柱頭外露；可育株花葯大，不育株花葯小。
[0063](Ib)電鏡檢驗花粉粒:用碘化鉀或醋酸洋紅液染色壓片，電鏡檢驗結果是:可育株花粉粒大而圓、表面光滑、可染色，花粉粒分散均勻，無粘連現象；不育株的花粉粒小、形狀為不規則形、表面皺縮、不著色、粒與粒之間有粘連現象，難以分離(見圖4和圖5。
[0064](2)雜交方法的研究:主要研究了母、父本種植行比例對結實率的影響。設計方案是:母、父本種植的行比為1: 1、1: 2、1: 3三個處理，組合為不育材料X578。結果是:母父本行比例為1:1的結實率為23.6%;行比為1: 2的結實率為31.5%;行比為1: 3的結實率為34.3%。綜合評價行比以1: 2為好。
[0065](3)不育株不育度調查分析:1998-2002四年間，對核不育材料在抽穗開花前進行套袋，收穫時調查結實情況，結果見表1。
[0066]表1不育材料結實情況調查
[0067]
【權利要求】
1.一種莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，其特徵在於:具體步驟如下: (1)不育材料的特徵、特性研究方法；直觀性狀，採取不育材料與母體的對比調查法，進行特徵的區別描述；花粉育性是，用碘化鉀或醋酸洋紅液染色壓片法，對不育材料和母本進行對比檢測； (2)雜交方法的研究:種植不同比例的母、父本對結實率的影響； (3)不育材料的遺傳分析研究方法:①不育材料F1代的育性調查:採取不育材料與母本和不同類型的品種進行測交，對其F1代分離出的可育株和不育株的分離比列進行調查；②不育材料F1分離出的可育株跟蹤調查:調查代數為2-10代；③不育材料不同生態條件下的育性狀況:設壩下、壩上和壩下溫室三種生態條件，調查可育株與不育株的分離比例； (4)不育材料的不育度調查方法:根據可育株與不育株的特徵，在莜麥抽穗時授粉前將不育株穗子套袋，成熟前摘下袋子，調查結實情況，計算不育度； (5)核不育材料在莜麥育種上的應用:①雜交:雜交的類型有單交、雙交、三交、復交、多交、聚合雜交及輪迴選擇幾種；雜交的方法是種I行母本、種兩行父本，抽穗開花時拔除可育株，保留不育株與父本雜交，並進行人工輔助授粉；②選種:採用系統選擇法，從F1代分離出的可育株中選擇優良單穗(株)，進穗行圃，穗行圃穩定且性狀優良的晉升；穗行圃仍有性狀分離，且不整齊的繼續選單穗，直至穩定一致後進入常規育種試驗場圃，進行產量和性狀的鑑定；後期程序同常規育種；③育種方法:研究並採用了兩種育種方案，一種是優良基因漸進累加法；一種是動態基因庫育種法，優良基因漸進累加法又分核不育單交單基因漸進累加法和核不育雙交雙基因漸進累加法，並採用「核不育單交單基因漸進累加法」、「核不育雙交雙基因漸進累加法」和「動態基因庫雜交育種法」育種程序，開展「輪迴選擇法」的研究工作。
2.根據權利要求1所述的莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，其特徵在於:所述核不育單交單基因漸進累加法育種程序，具體步驟如下: 1)確定育種目標，制定新品種模板:根據生產需要，確定新品種的選育目標，制定新品種的模板； 2)選擇目的基因:從各種各類資源中選擇符合育種目標和新品種模板的目的基因；所制定的新品種模板是:抗燕麥堅黑穗、高蛋白、抗旱耐瘠性好的品種；則選擇上述三個目的基因，也就是具有上述三個特點的資源品種； 3)雜交:採用成對雜交、三交和多交的方法逐漸加入目的基因，即每年(或者每一次雜交)加入一個目的基因，連續雜交I~3次以上； 4)選擇:加入全部目的基因後，從最後一次加入目的基因的F1代可育株中，選擇符合育種目標的單穗(株)，或者在加入目的基因的中期，雜交和選擇同時進行； 5)性狀鑑定:同常規育種。
3.根據權利要求1所述的莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，其特徵在於:所述核不育雙交雙基因漸進累加法育種程序具體如下: 1)確定育種目標，制定新品種模板:根據生產需要，確定新品種的選育目標，制定新品種的模板； 2)選擇目的基因:同單交單基因法，選擇更多的目的基因； 3)雜交:採用雙交、復交的方法，即在一個年度(一個周期)內分別配置兩個組合，第二年進行複合雜交，或者三交； 4)選擇:加入全部目的基因後，從F1代可育株中，選擇符合育種目標的單穗(株)； 5)性狀鑑定:同常規育種。
4.根據權利要求1所述的莜麥顯性雄性核不育材料研究方法，其特徵在於:所述核不育目標動態基因庫種群雜交法育種程序，具體如下: 1)確定育種目標:根據生產需要確定育種目標，制定新品種的模板； 2)選擇目的基因:從資源材料和聞代品系中，選符合育種目標的目的基因； 3)建立目標動態基因庫(雜交):以入選的目的基因為父本群，等量混合後與核不育材料隔行種植進行雜交，抽穗時拔除可育株，自由授粉；根據需要下年再加入新的目的基因； 4)選種:按照育種目標和新品種模板的要求，從目標基因庫中連續不斷地選擇可育單穗(株)； 5)後代鑑定:按常規育種程`序。
【文檔編號】A01H1/02GK103858749SQ201410091348
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月7日 優先權日:2014年3月7日
【發明者】楊才, 周海濤, 楊曉虹, 張新軍, 李天亮, 劉文婷, 王英 申請人:河北省農林科學院