一種測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物雜質含量的方法
2023-08-05 16:20:26 1
專利名稱：一種測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物雜質含量的方法
技術領域：
本發明屬於藥物分析領域，具體涉及高效液相色譜法測定法羅培南鈉原料及其制 劑中法羅培南聚合物含量的方法。
背景技術：
法羅培南是一個非典型0 -內醯胺類抗生素，屬於青黴烯類的衍生物。碳青黴烯 類及青黴烯類兩大類化合物已吸引人們極大的興趣，青黴烯類更有獨特的優點，現有五個 青毒烯類衍生物在開發之中，法羅培南便是其中之一。除對抑制綠膿桿菌較弱外，其抗菌譜 廣、對厭氧菌特別有效，勝過碳青黴烯類抗生素。它對需氧和厭氧的革蘭陽性菌、革蘭陰性 菌顯示出廣譜的抗菌活性，特別是對耐藥的葡萄球菌、腸球菌等革蘭陽性菌和擬桿菌等厭 氧菌的活性都優於現有的口服抗菌藥。法羅培南與青黴素結合蛋白有很好的親合力及良好 的內醯胺酶穩定性，較少產生耐藥，主要用於敏感細菌所致的呼吸系統感染、泌尿系統 感染、生殖系統感染和膽道感染等。隨著抗生素廣泛應用，抗生素引起的不良反應越來越引起人們的重視。內醯 胺類抗生素引發的速髮型過敏反應是臨床最常見的不良反應，對患者的危害及大，研究表 明內醯胺類抗生素本身只是半抗原，而其中存在的各類高分子聚合雜質才是引發速發 型過敏反應的真正過敏原，因此控制其聚合物限量是極其重要的。法羅培南鈉與同類其他 藥物一樣，它們在臨床上常引發過敏性休克反應，嚴重威脅著患者的安全。研究證明，引發 3_內醯胺類抗生素速髮型過敏反應的過敏原是與其中存在的高分子聚合物含量有關，所 以對此類藥物中高分子聚合物的測定越來越弓丨起人們的重視。凝膠色譜技術，是六十年代初發展起來的一種快速而又簡單的分離分析技術，由 於設備簡單、操作方便，不需要有機溶劑，對高分子物質有很高的分離效果。利用凝膠色譜 的分子篩機制，讓藥物分子自由地進入凝膠顆粒內部，而讓高分子雜質被排阻；由於溶質分 子和凝膠介質間存在多種次級相互作用，溶質分子可被吸附於凝膠介質的表面；在凝膠顆 粒內部，凝膠顆粒有較大的比表面積和較小的自由空間，故溶質分子更易和凝膠介質接觸， 因而溶質分子在凝膠顆粒內部較凝膠顆粒外部更易被吸附，即色譜過程中除分子排阻作用 外，凝膠對藥物的吸附作用大於對高分子雜質的吸附作用。據此原理可使高分子雜質和藥 物分子間的分離度增加。目前已經有多種0 -內醯胺類抗生素的聚合物含量測定的報導，其中2005年片藥 典對頭孢他啶、頭孢曲松鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢拉定、頭孢唑林鈉、頭孢呋辛鈉、 青黴素鈉、青黴素鉀、青黴素V鉀、阿莫西林等11抗生素的聚合物測定方法進行了收錄，也 有文獻對頭孢地嗪鈉、頭孢噻肟鈉和頭孢替唑鈉聚合物的測定方法進行了研究，楊鵬飛等 在《以葡聚糖凝膠G-10系統考察8種注射用頭孢菌素中的聚合物》中對注射用頭孢尼西 鈉、注射用頭孢硫脒鈉、注射用頭孢西丁、注射用頭孢唑肟鈉、注射用頭孢唑蘭、注射用頭孢 地嗪鈉、注射用頭孢替坦鈉等8種注射用頭孢菌素中的聚合物進行了系統研究。目前並無
3對法羅培南聚合物的具體測定方法的報導，因此對於建立法羅培南聚合物測定的方法對於 進行碳青黴烯類抗生素的質量控制和安全用藥有重要的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的 方法。我們建立了一種對法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南鈉聚合物的含量進行測定的高 效液相凝膠色譜法。發明人通過對水溶液種類、離子強度、溶液濃度、溶液PH、流速、柱溫、色 譜柱及波長等條件進行摸索，使法羅培南聚合物的測定方法分離度好，柱效高，重複性好。本發明提供的測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物雜質含量的方法，該 方法為凝膠色譜法，使用高效液相色譜儀進行檢測，色譜條件為①凝膠色譜柱排阻分子量為600-800道爾頓；②流動相具有兩種流動相A 濃度為0. 01-0. 2mol/L之間的水相溶液，用pH調節 劑調節PH值為6. 5-8. 5 ；流動相B 水或0. 005-0. 02%之間的十二烷基硫酸鈉溶液或甘氨 酸溶液；③柱溫室溫；④流速0.5-1. Oml/min ；⑤檢測波長210-300nm。其中上述所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南鈉聚合物含量的方法，所述 的凝膠色譜柱選自葡聚糖凝膠G-10凝膠色譜柱。其中上述所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法，所述的 葡聚糖凝膠G-10凝膠色譜，內徑為5 20mm ；長度200 500mm ；粒度40 60um ；孔徑 50 70A ；柱床1. 5 3. 5mL/g。其中上述所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法，所述 的流動相 A 的水相溶液為 NaH2P04、NH4CL、Na2HP04、KH2P04、K2HP04、NH4H2P04、(NH4)2HP04 一 種或兩種以上的混合水溶液，優選NaH2P04和Na2HP04的混合水溶液，NaH2P04的濃度為 0. 01-0. 2mol/L, Na2HP04 的濃度為 0. 01-0. 2mol/L。其中上述所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法，所述的 流動相A的pH調節劑選自NaOH、磷酸、氨水和HCL等。波長選取的標準與待檢物質的光吸收性質有關，對頭孢類抗生素，其最大吸收波 長是固定的，通過紫外掃描，發現法羅培南鈉聚合物210 300nm處波長均有較強的紫外吸 收，均可作為檢測波長。其中上述所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法，其中所 述的方法為標準曲線法或外標法。1)所述的標準曲線包括如下步驟①作標準曲線取含量已知的法羅培南對照品為對照，梯度稀釋，以流動相B為流 動相，過凝膠色譜柱，在檢測波長下檢測，記錄色譜圖，獲取保留時間、峰高、峰面積等參數， 得到標準曲線；②標準曲線法測定法羅培南聚合物含量將待測原料或製劑用水作為溶劑配製成 一定濃度的溶液，以流動相A為流動相，過凝膠柱色譜柱，在檢測波長下檢測，記錄色譜圖，
4獲取峰高和峰面積等參數，並將法羅培南聚合物對應的相關參數代入標準曲線，計算得到 法羅培南聚合物的含量。2)所述的外標法包括如下步驟①標準曲線和線性範圍取含量已知的法羅培南對照品為對照，梯度稀釋，以流動 相B為流動相，過凝膠色譜柱，在檢測波長下檢測，記錄色譜圖，獲取峰高和峰面積等參數， 得到標準曲線和線性範圍；②外標法測定法羅培南聚合物含量在線性範圍內選擇合適的濃度，配製對照溶 液和樣品溶液，在選定的色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，按外標法以相關參數進行計 算，得到法羅培南聚合物的含量。本發明具備如下有益效果和顯著進步性①本發明的測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法，首次採用 高效液相凝膠色譜法對法羅培南鈉聚合物進行定量測定，本方法自動化程度高，利於操作， 為更好的控制羅培南鈉原料及製劑中聚合物的量提供了一種可靠的方法。②本發明的測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法，特異性 高，分離度好，柱效高、重複性好能夠正確的定量法羅培南鈉原料及其製劑中法羅培南聚合 物的雜質，確保了保證產品質量，提高了用藥的安全性。
圖1為法羅培南對照品在流動相B中的HPLC譜2為法羅培南鈉原料在流動相A中的HPLC譜圖
具體實施例實施例1 標準曲線法測定法羅培南鈉原料及其製劑中法羅培南聚合物含量一、色譜條件儀器美國Agilent 1100系列高效液相色譜儀；凝膠色譜柱:SephadexG-10，15. 0mm X 400mm ；流動相流動相A :NaH2P04l. 08g 和 Na2HP044. 38g 至 1000ml 水中，用 H3P04 調 pH 到 7. 0 ；流動相B 0. 01 %十二烷基硫酸鈉流速1.0ml/min柱溫室溫；波長254nm二、實驗步驟1、作標準曲線①法羅培南對照品62.5mg，置於50ml容量瓶中，用水將其稀釋成0. 05、0. 10、 0. 15,0. 20,0. 25,0. 30 和 0. 4mg/ml 的溶液，搖勻；②取各稀釋點對照品溶液各20ul依次通過凝膠柱，以流動相B為流動相，在254nm 波長下檢測，記錄色譜圖，HPLC色譜圖見圖1，獲取保留峰面積，以濃度(C)對峰面積(A)進 行線性回歸，得到標準曲線和線性方程，計算回歸係數；
③經計算得到回歸方程為C = 58253A-19. 734 R2 = 0. 99972、測定法羅培南鈉聚合物的含量取相當於法羅培南50mg的法羅培南鈉原料或的製劑置於100ml容量瓶中，加純化 水配製成待測溶液，過凝膠色譜柱，在254nm波長下檢測，記錄色譜圖，HPLC譜圖見圖2，獲 取聚合物峰面積，並將法羅培南鈉聚合物的峰面積代入線性方程，得到聚合物的含量值。三、結果如圖2所示，色譜圖上保留時間為24. 827分鐘的吸收峰為法羅培南聚合物的特徵 峰，直接將檢測出的峰面積值代入回歸方程，即可測得法羅培南聚合物的含量為0. 24%。重複檢測5次，結果見表法羅培南聚合物的峰面積的RSD值為0. 06%，說明本方法 有很好的重現性。實施例2 標準曲線法測定法羅培南鈉原料及其製劑中法羅培南聚合物含量一、色譜條件同實施例1二、實驗步驟1、作標準曲線①法羅培南對照品62.5mg，置於50ml容量瓶中，用水將其稀釋成0. 05、0. 10、 0. 15,0. 20,0. 25,0. 30 和 0. 4mg/ml 的溶液，搖勻；②取各稀釋點對照品溶液各20ul依次通過凝膠柱，以流動相B為流動相，在254nm 波長下檢測，記錄色譜圖，獲取保留峰面積，以濃度(C)對峰面積(A)進行線性回歸，得到標 準曲線和線性方程，計算回歸係數；③經計算得到回歸方程為C = 57203A+76. 287R2 = 0. 99993、測定法羅培南鈉聚合物的含量①對照溶液和供試溶液的配製取法羅培南鈉對照品31. 25mg至，加純化水配製 成對照品溶液；取相當於法羅培南50mg的法羅培南鈉原料或的製劑置於100ml容量瓶中， 加純化水配製成待測溶液。②對照溶液以流動相B為流動相，過凝膠色譜柱，在254nm波長下檢測，記錄色譜 圖，獲取對照品的峰面積；供試液以流動相A為流動相，過凝膠色譜柱，記錄色譜圖，獲取聚 合物峰面積。③按照外標法計算公式聚合物的含量值。三、結果按外標法計算得羅培南聚合物的含量0. 24%。RSD值為0. 05%。實施例3 標準曲線法測定法羅培南鈉原料及其製劑中法羅培南聚合物含量一、色譜條件儀器美國Agilent 1100系列高效液相色譜儀；凝膠色譜柱:SephadexG-10，15. 0mm X 400mm ；流動相流動相A 取NH4C1 0. 54g至1000ml水中，用NaOH調pH到7. 0流動相B 0. 01 %十二烷基硫酸鈉流速1.0ml/min柱溫室溫；
波長254nm二、實驗步驟同實施例1三、結果按標準曲線法計算得羅培南聚合物的含量0. 25%。RSD值為0. 06%。實施例4 外標法測定法羅培南鈉原料及其製劑中法羅培南聚合物含量一、色譜條件儀器美國Agilent 1100系列高效液相色譜儀；凝膠色譜柱:SephadexG-10，15. 0mm X 400mm ；流動相流動相A 取NH4H2P041. 15g至1000ml水中，用NaOH調pH到7. 0流動相B 0. 01 %十二烷基硫酸鈉流速1.0ml/min柱溫室溫；波長254nm二、實驗步驟同實施例2三、結果按外標法計算得羅培南聚合物的含量0. 27%。RSD值為0. 08%。
權利要求
一種測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物雜質含量的方法，其特徵在於該方法為凝膠色譜法，使用高效液相色譜儀進行檢測，色譜條件為①凝膠色譜柱排阻分子量為600-800道爾頓；②流動相具有兩種流動相A濃度為0.01-0.2mol/L之間的水相溶液，用pH調節劑調節pH值為6.5-8.5；流動相B水或0.005-0.02％之間的十二烷基硫酸鈉溶液或甘氨酸溶液；③柱溫室溫；④流速0.5-1.0ml/min；⑤檢測波長210-300nm。
2.根據權利要求書1所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南鈉聚合物含量的方 法，其特徵在於，所述的凝膠色譜柱選自葡聚糖凝膠G-IO凝膠色譜柱。
3.根據權利要求書2所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法， 其特徵在於，所述的葡聚糖凝膠G-IO凝膠色譜柱，內徑為5 20mm ；長度200 500mm ； 粒度40 60um ；孔徑50 70A ；柱床1. 5 3. 5mL/g。
4.根據權利要求書1所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法， 其特徵在於，所述的流動相A的水相溶液為NaH2PO4、NH4CL、Na2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、NH4H2PO4、 (NH4)2ΗΡ04 一種或兩種以上的混合水溶液。
5.根據權利要求書4所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法， 其特徵在於，所述的流動相A的水相溶液為NaH2PO4和Na2HPO4的混合水溶液，NaH2PO4的濃 度為 0. 01-0. 2mol/L, Na2HPO4 的濃度為 0. 01-0. 2mol/L。
6.根據權利要求書1所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量的方法， 其特徵在於，所述的流動相A的pH調節劑選自NaOH、磷酸、氨水或HCL。
7.根據權利要求書1-6任一所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量 的方法，其特徵在於，它是標準曲線法，包括如下步驟①作標準曲線取含量已知的法羅培南對照品為對照，梯度稀釋，以流動相B為流動 相，過凝膠色譜柱，在檢測波長下檢測，記錄色譜圖，獲取保留時間、峰高、峰面積等參數，得 到標準曲線；②標準曲線法測定法羅培南聚合物含量將待測原料或製劑用水作為溶劑配製成一定 濃度的溶液，以流動相A為流動相，過凝膠柱色譜柱，在檢測波長下檢測，記錄色譜圖，獲取 峰高和峰面積等參數，並將法羅培南聚合物對應的相關參數代入標準曲線，計算得到法羅 培南聚合物的含量。
8.根據權利要求書1-6任一所述測定法羅培南鈉原料及製劑中法羅培南聚合物含量 的方法，其特徵在於，它是外標法，包括如下步驟①標準曲線和線性範圍取含量已知的法羅培南對照品為對照，梯度稀釋，以流動相B 為流動相，過凝膠色譜柱，在檢測波長下檢測，記錄色譜圖，獲取峰高和峰面積等參數，得到 標準曲線和線性範圍；②外標法測定法羅培南聚合物含量在線性範圍內選擇合適的濃度，配製對照溶液和 樣品溶液，在選定的色譜條件下進行測定，記錄色譜圖，按外標法以相關參數進行計算，得 到法羅培南聚合物的含量。
全文摘要
本發明屬於藥物分析領域，具體涉及高效液相色譜法測定法羅培南鈉原料及其製劑中法羅培南聚合物含量的方法。本發明的測定方法為凝膠色譜法，使用高效液相色譜檢測，色譜條件為(1)凝膠色譜柱排阻分子量為600～800道爾頓；(2)流動相兩種流動相，流動相ApH值為5.5-8.5，濃度為0.01-0.2mol/L之間的水相溶液；流動相B水或0.005-0.02％之間的十二烷基硫酸鈉水溶液或甘氨酸溶液；(3)柱溫室溫(4)流速0.5-1.0ml/min；(5)檢測波長210-300nm。本發明的方法特異性強，重複性好，自動化程度高，可以對法羅培南鈉原料及製劑中的聚合物進行準確定量。
文檔編號C07D499/893GK101852782SQ200910132008
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月2日 優先權日2009年4月2日
發明者趙志全 申請人:魯南製藥集團股份有限公司