一種利用實時螢光定量pcr檢測h7n9禽流感病毒的試劑盒的製作方法
2023-08-05 10:34:31
專利名稱：一種利用實時螢光定量pcr檢測h7n9禽流感病毒的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種用於檢測H7N9禽流感病毒的試劑盒。
背景技術：
流感病毒屬於正粘病毒科(orthomyxoviridae),有包膜、分節段基因組的單負鏈RNA病毒。根據核蛋白和包膜內側面的Ml蛋白的抗原性將流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。甲型流感病毒再根據包膜表面血凝素(hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(neuraminidase, NA)兩種刺突的抗原性分若干亞型，目前包括Hl H16亞型，NA包括NI N9亞型。所有人類的流感病毒都可以引起禽類流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人類流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以傳染給人，其中H5為高致病性。H3為人犬共患，依據 流感病毒特徵可分為HxNx共135種亞型，H7N9亞型禽流感病毒是其中的一種。這個病毒的生物學特點、致病力、傳播力，還沒有依據進行分析判斷。H7N9亞型禽流感病毒是甲型流感中的一種，既往僅在禽間發現，未發現過人的感染情況。但我國人感染H7N9禽流感於2013年3月底在上海和安徽兩地率先發現。H7N9型禽流感是全球首次發現的新亞型流感病毒，尚未納入我國法定報告傳染病監測報告系統，並且至2013年4月初尚未有疫苗推出。中國國家衛生和計劃生育委員會2013年3月3日印發人感染H7N9禽流感診療方案、防控方案及醫院感染預防與控制技術指南。根據人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第I版)，人感染H7N9禽流感傳染源目前尚不明確，根據以往經驗及本次病例流行病學調查，推測可能為攜帶H7N9禽流感病毒的禽類及其分泌物或排洩物。傳播途徑為經呼吸道傳播，也可通過密切接觸感染的禽類分泌物或排洩物等被感染，直接接觸病毒也可被感染。現尚無人與人之間傳播的確切證據。現階段高危人群主要是從事禽類養殖、銷售、宰殺、加工業者，以及在發病前I周內接觸過禽類者。診療方案指出，人感染H7N9禽流感潛伏期一般為7天以內。患者一般表現為流感樣症狀，如發熱，咳嗽，少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重症患者病情發展迅速，表現為重症肺炎，體溫大多持續在39°C以上，出現呼吸困難，可伴有咯血痰；可快速進展出現急性呼吸窘迫症候群、縱隔氣腫、膿毒症、休克、意識障礙及急性腎損傷等。根據流行病學接觸史、臨床表現及實驗室檢查結果，可作出人感染H7N9禽流感的診斷。在流行病學史不詳的情況下，根據臨床表現、輔助檢查和實驗室檢測結果，特別是從患者呼吸道分泌物標本中分離出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸檢測陽性，可以診斷。
發明內容
鑑於核酸檢測是直接檢測病原體核酸，具有高敏感，高特異和短檢測窗口期等優點，為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。本發明提供了一種實時螢光定量PCR檢測H7N9禽流感病毒的試劑盒，用於檢測H7N9禽流感病毒核酸。一種利用實時螢光定量PCR檢測H7N9禽流感病毒的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括:
(1)RNA提取試劑、逆轉錄試劑、實時螢光定量PCR擴增反應試劑；
(2)用於擴增樣本cDNA的引物及探針，包括:
檢測H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探針:
H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA檢測H7N9禽流感病毒神經氨酸酶N9的引物及探針:
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
進一步地,所述RNA提取試劑包括QIAamp Viral RNA mini Kit ;所述逆轉錄試劑包括 5 X RT-Buffer, IOOuM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace 逆轉錄酶和 DEPC 水；所述實時螢光定量PCR擴增反應試劑包括qPCR Mix，50 X R0X，擴增引物及探針和滅菌水。更進一步地，所述試劑盒的使用方法包括以下步驟:
(1)用RNA提取試劑提取呼吸道標本的RNA；
(2)用逆轉錄試劑將步驟(I)中得到的RNA進行反轉錄為cDNA;
(3)使用弓I物H7-F、H7-R和N9_F、N9_R及相應探針H7-probe、N9_probe在單管PCR反應體系中對步驟(2)得到的cDNA進行實時螢光定量PCR檢測。其中，實時螢光定量PCR反應程序:95°C IOmin預變性；95°C 15sec，58°C35sec，39個循環。步驟(I)的具體抽取步驟如下:
I)吸取560ul準備好的buffer AVL (含有carrier RNA)到1.5ml離心管中。(根據樣品的實際量按比例調整buffer AVL-carrier RNA)。2)將140ul血漿，血清，尿液，培養細胞上清液或是無細胞體液加入到裝有bufferAVL-carrier RNA的離心管中。斡旋15秒，混勻。(為保證裂解效率，一定要徹底混勻，形成均一溶液。只溶解過一次的樣品也仍然可用)。3)室溫放置lOmin。( 10分鐘足夠，延長時間不會增加產物質量。Buffer AVL可以使潛在的汙染和Rnase失活)。4)瞬時離心,將蓋子上的液滴甩回管底。5)樣品中加入560ul無水乙醇(96% 100% ),斡旋15s充分混勻。然後瞬時離心，將蓋子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇，因為其他酒精會降低產量和純度。不能使用變性酒精，因為其中含有其他物質。如果樣品量大於140ul，按比例增加乙醇的量。該步驟要充分混勻，形成均一溶液，以保證產量)。6)吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已裝入到2ml離心管中)中，注意不要碰到柱子的邊緣。蓋上蓋子，6000Xg (8000rpm)離心lmin。將column放入新的2ml離心管中，棄去舊的收集管。(每一個column都要蓋上，以防交叉汙染。SOOOrpm的速度是為了限制噪音，全速離心也是可以的，不會影響產物。如果溶液沒有完全透過膜，可以更高的速度再次離心，直到溶液完全透過)。7)小心的打開column的蓋子，重複第6步。(如果樣品量超過了 140ul，那麼重複此步驟，直到所有的裂解液都上柱)。8)小心的打開column蓋子，加入500ul buffer Affl0蓋上蓋子，8000rpm離心，lmin。將column放入新的2ml收集管(Kit提供)中，棄去舊的收集管。(即使樣品量大於140ul，也無需增加buffer Affl的量)。9)小心的打開column蓋子，加入500ul buffer AW2。蓋上蓋子，全速離心(14000rpm), 3min0接著進行第11步，或者先進行第10步，以避免buffer AW2殘留,然後再進行第11步。(buffer AW2殘留會影響下遊實驗。有些離心機在減速時會發生振動，導致回流，使得buffer AW2接觸到column。將column和收集管從離心機裡拿出來時也可能會導致該現象產生，因此，最好先進行第10步)。10)推薦:將column放入新的2ml收集管(Kit中未提供)中，棄去舊的收集管，全速離心lmin。11)將column放在1.5ml離心管(kit中未提供)中。棄去舊的收集管。小心的打開column,加入60ul室溫的buffer AVE。蓋上蓋子,室溫放置lmin。8000rpm離心lmin。步驟(2)的逆轉錄具體步驟如下:向IOul RNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,將混合液至於65°C，5min後，冰浴2min ；向上述混合液加入4ul 5 X RT-Buffer, 4ul DEPC水，Iul 100U/ul ReverTra Ace 逆轉錄酶，混勻，37°C 60min,95°C 5min，獲得 cDNA -20°C備用。步驟(3)實時螢光定量PCR檢測`方法中，通過不同螢光標記(FAM、HEX)的兩條探針，完成一例樣本在一管PCR反應體系中同時檢測甲型禽流感病毒包膜表面血凝素(HA)基因及神經氨酸酶(NA)基因，既可以同時檢測出H7N9禽流感病毒的H7亞型和N9亞型。根據實時螢光定量PCR檢測結果，可以對檢測樣本是否感染H7N9禽流感病毒進行鑑定。具體方法為:在H7陽性質控和N9的陽性質控都有擴增曲線，且Ct值彡38的前提下，I)檢測樣本的一管PCR反應體系中，如果FAM標記的探針和HEX標記的探針都產生擴增曲線，且Ct值< 38，則判定樣本是H7N9病毒陽性；2)如果檢測樣本的一管PCR反應體系中，FAM標記的探針和HEX標記的探針都無明顯擴增曲線，或者只有其中一條探針有擴增曲線，則判定樣本是H7N9陰性。有益效果:本發明的用於檢測H7N9禽流感病毒核酸的試劑盒，通過對病毒RNA抽提，逆轉錄和實時螢光定量PCR，可以鑑定H7N9禽流感病毒。該試劑盒所得的結果具有高準確性，高敏感性，高特異性和短檢測窗口期等優點，為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。
圖1是樣本A實時螢光定量PCR檢測結果。由圖可知，該樣本H7和N9都產生擴增曲線，因此樣本A為H7N9禽流感病毒陽性。圖2是樣本B實時螢光定量PCR檢測結果。該樣本只有H7產生擴增曲線，因此樣本B為H7N9禽流感病毒陰性。
圖3是樣本C實時螢光定量PCR檢測結果。該樣本只有N9產生擴增曲線，因此樣本C為H7N9禽流感病毒陰性。圖4是樣本D實時螢光定量PCR檢測結果。該樣本H7和N9都無擴增曲線，因此樣本D為H7N9禽流感病毒陰性。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照製造廠商所建議的步驟和條件。實施例1
用於檢測H7N9禽流感病毒核酸的試劑盒，包括:
(i)RNA 提取試劑:QIAamp Viral RNA mini Kit ；
(ii)逆轉錄試劑:5XRT-Buffer,IOOuM Primer Mix, lOOU/ul ReverTra Ace 逆轉錄酶，DEPC水；
(iii)實時螢光定量PCR試劑:qPCR1^1，50父1 ( ，用於擴增樣本00嫩的2對引物及相應的探針，滅菌水，其中:
檢測H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探針:
H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC
H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA檢測H7N9禽流感病毒神經氨酸酶N9的引物及探針:
N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA
N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA所述試劑盒的使用方法包括以下步驟:
(1)用QIAamp Viral RNA mini Kit 提取血清待檢樣本 RNA ；
(2)用逆轉錄試劑將步驟(I)中得到的RNA進行反轉錄為cDNA;
(3)使用2對引物及相應探針在單管PCR反應體系中對步驟⑵得到的cDNA進行實時螢光定量PCR檢測；PCR檢測體系為25ul，其中包括12.5ul qPCR Mix, 10 uM探針各0.4ul(探針分別為H7-probe、N9-probe);10uM正向引物各0.8ul (正向引物分別為H7-F、N9_F);IOuM 反向引物各 0.8ul (反向引物分別為 H7-R、N9-R) ;50XR0X 0.5ul, cDNA 2ul, ddH206ul ;實時螢光定量PCR反應程序:95°C IOmin預變性；95°C 15sec，58°C 35sec，39個循環。根據實時螢光定量PCR檢測結果，可以對檢測樣本是否感染H7N9禽流感病毒進行鑑定。具體方法為:在H7陽性質控和N9的陽性質控都有擴增曲線，且Ct值彡38的前提下，
I)檢測樣本的一管PCR反應體系中， 如果FAM標記的探針和HEX標記的探針都產生擴增曲線，且Ct值< 38，則判定樣本是H7N9病毒陽性；2)如果檢測樣本的一管PCR反應體系中，FAM標記的探針和HEX標記的探針都無明顯擴增曲線，或者只有其中一條探針有擴增曲線，則判定樣本是H7N9陰性。
實施例2:檢測方法
1.待檢測樣本的RNA的抽取
I)吸取560ul準備好的buffer AVL (含有carrier RNA)到1.5ml離心管中。(根據樣品的實際量按比例調整buffer AVL-carrier RNA)。2)將140ul血漿，血清，尿液，培養細胞上清液或是無細胞體液加入到裝有bufferAVL-carrier RNA的離心管中。斡旋15秒，混勻。(為保證裂解效率，一定要徹底混勻，形成均一溶液。只溶解過一次的樣品也仍然可用)。3)室溫放置lOmin。( 10分鐘足夠，延長時間不會增加產物質量。Buffer AVL可以使潛在的汙染和Rnase失活)。4)瞬時尚心,將蓋子上的液滴甩回管底。5)樣品中加入560ul無水乙醇(96% 100%)，斡旋15s充分混勻。然後瞬時離心，將蓋子上的液滴甩回管底。(只可以用乙醇，因為其他酒精會降低產量和純度。不要用變性酒精，因為其中含有其他物質。如果樣品量大於140ul，按比例增加乙醇的量。該步驟要充分混勻，形成均一溶液，以保證產量)。6)吸取630ul上步中的溶液小心的加入column(已裝入到2ml離心管中)中，注意不要碰到柱子的邊緣。蓋上蓋子，6000Xg (8000rpm)離心lmin。將column放入新的2ml離心管中，棄去舊的收集管。(每一個column都要蓋上，以防交叉汙染。SOOOrpm的速度是為了限制噪音，全速離心也是可以的，不會影響產物。如果溶液沒有完全透過膜，可以更高的速度再次離心，直到溶液完全透過)。7)小心的打開column的蓋子，重複第6步。(如果樣品量超過了 140ul，那麼重複此步驟，直到所有的裂 解液都上柱)。8)小心的打開column蓋子，加入500ul buffer Affl0蓋上蓋子，8000rpm離心，lmin。將column放入新的2ml收集管(Kit提供)中，棄去舊的收集管。(即使樣品量大於140ul，也無需增加buffer Affl的量)。9)小心的打開column蓋子，加入500ul buffer AW2。蓋上蓋子，全速離心(14000rpm), 3min0接著進行第11步，或者先進行第10步，以避免buffer AW2殘留,然後再進行第11步。(buffer AW2殘留會影響下遊實驗。有些離心機在減速時會發生振動，導致回流，使得buffer AW2接觸到column。將column和收集管從離心機裡拿出來時也可能會導致該現象產生，因此，最好先進行第10步)。10)推薦:將column放入新的2ml收集管(Kit中未提供)中，棄去舊的收集管，全速離心lmin。11)將column放在1.5ml離心管(kit中未提供)中。棄去舊的收集管。小心的打開column,加入60ul室溫的buffer AVE。蓋上蓋子,室溫放置lmin。8000rpm離心lmin。2.將步驟I中的所得RNA用隨機弓I物逆轉錄為cDNA，再使用2對引物及探針對得到的cDNA進行實時螢光定量PCR檢測。其中逆轉錄的具體方法:向IOul RNA中加入Iul IOOuM Primer Mix,將混合液至於 65°C，5min 後，冰浴 2min。向上述混合液加入 4ul 5*RT_Buffer，4ul DEPC 水，Iul 100U/ul ReverTra Ace 逆轉錄酶，混勻，37°C 60min,95°C 5min，獲得 cDNA -20°C備用。其中實時螢光定量PCR檢測的具體方法:使用2對引物及相應探針在單管PCR反應體系中對步驟(2)得到的cDNA進行實時螢光定量PCR檢測(每批次檢測中，需進行H7和N9陽性質控的檢測);PCR檢測體系為25ul，其中包括12.5ul qPCR Mix, 10 uM探針各0.4ul(探針分別為H7-probe、N9-probe);10uM正向引物各0.8ul (正向引物分別為H7-F、N9_F);IOuM 反向引物各 0.8ul (反向引物分別為 H7-R、N9-R) ;50XR0X 0.5ul, cDNA 2ul, ddH206ul。實時螢光定量PCR反應程序:95°C IOmin預變性；95°C 15sec，58°C 35sec，39個循環。3.結果分析，具體方法為:在H7陽性質控和N9的陽性質控都有擴增曲線，且Ct值< 38的前提下，I)檢測樣本的一管PCR反應體系中，如果FAM標記的探針和HEX標記的探針都產生擴增曲線，且Ct值< 38，則判定樣本是H7N9病毒陽性；2)如果檢測樣本的一管PCR反應體系中，FAM標記的探針和HEX標記的探針都無明顯擴增曲線，或者只有其中一條探針有擴增曲線，則判定樣本是H7N9陰性
圖1是樣本A實時螢光定量PCR檢測結果。由圖可知，該樣本H7和N9都產生擴增曲線，因此樣本A為H7N9禽流感病毒陽性。圖2是樣本B實時螢光定量PCR檢測結果。該樣本只有H7產生擴增曲線，因此樣本B為H7N9禽流感病毒陰性。圖3是樣本C實時螢光定量PCR檢測結果。該樣本只有N9產生擴增曲線，因此樣本C為H7N9禽流感病毒陰性。圖4是樣本D實時螢光定量PCR檢測結果。該樣本H7和N9都無擴增曲線，因此樣本D為H7N9禽流感病毒陰性 。
權利要求
1.一種利用實時螢光定量PCR檢測H7N9禽流感病毒的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括: (1)RNA提取試劑、逆轉錄試劑、實時螢光定量PCR擴增反應試劑； (2)用於擴增樣本cDNA的引物及探針，包括: 檢測H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探針:H7-F: GGGffTTCACMTACAGYGGAATAAGH7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGCH7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGffTCTTC-TAMARA檢測H7N9禽流感病毒神經氨酸酶N9的引物及探針:N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCAN9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGAN9-Probe: HEX-CTCAAACGGA ACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述RNA提取試劑包括QIAampViral RNAmini Kit ;所述逆轉錄試劑包括5 X RT-Buffer, IOOuM Primer Mix, 100U/ul ReverTra Ace逆轉錄酶和DEPC水；所述實時螢光定量PCR擴增反應試劑包括qPCR Mix，50 X R0X，擴增引物及探針和滅菌水。
3.用權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒的使用方法包括以下步驟: (1)用RNA提取試劑提取呼吸道標本的RNA； (2)用逆轉錄試劑將步驟(I)中得到的RNA進行反轉錄為cDNA; (3)使用引物H7-F、H7-R和N9_F、N9_R及相應探針H7-probe、N9_probe在單管PCR反應體系中對步驟(2)得到的cDNA進行實時螢光定量PCR檢測。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，實時螢光定量PCR反應程序:95°CIOmin預變性；95°C 15sec，58°C 35sec，39 個循環。
全文摘要
本發明公開了利用實時螢光定量PCR檢測H7N9禽流感病毒的試劑盒，其特徵在於包括(1)RNA提取試劑、逆轉錄試劑、實時螢光定量PCR擴增反應試劑；(2)用於擴增樣本cDNA的兩對引物H7-F、H7-R和N9-F、N9-R，及相應的探針H7-probe、N9-probe。本發明的用於檢測H7N9禽流感病毒核酸的試劑盒，通過對病毒RNA抽提，逆轉錄和實時螢光定量PCR，可檢測H7N9禽流感病毒，該試劑盒所得的結果具有高準確性，高敏感性，高特異性和短檢測窗口期等優點，為疫病早診斷、早治療、降低病死率以及控制疫情爭取時間。
文檔編號C12Q1/68GK103233082SQ20131012930
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月12日 優先權日2013年4月12日
發明者陳奕磊, 李文靜, 王淑一, 黎颯, 徐建成 申請人:杭州艾迪康醫學檢驗中心有限公司