一種短頸劍線蟲的分子鑑定方法
2023-08-01 02:14:31
專利名稱：一種短頸劍線蟲的分子鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種檢疫方法，特別涉及一種短頸劍線蟲的分子鑑定方法。
背景技術：
2008年10月-2010年2月，對廣東省的園林植物進行寄生線蟲病害調查，共採集了 512份樣品進行線蟲分離。根據形態特徵、形態測量值及結合分子數據，共鑑定出潛在傳毒線蟲4屬12個種總計在33份樣品中發現美洲劍線蟲組(ZZMiz^ffl3 americanum group)內群體，在20份樣品中發現標明劍線蟲(Ζ i/^i卵￠0群體，在27份樣品中發現巴西劍線蟲(Ζ brasiliense),分別佔檢測到傳毒類線蟲群體總數的31. 9%、19. 1%和 12.8%。其中中國新記錄種1個腔室劍線蟲(Z da 力ers)；中國大陸新記錄種1個 克魯克劍線蟲(Z Ar^"/) ;2種傳毒線蟲胼胝擬毛刺線蟲和短頸劍線蟲 (Z brevicollum)；其它重要的病原線蟲2種標明劍線蟲(Z iasi卵e)、雪松毛刺線 ^kCTrichodorus cedarus)；本研究所鑑定的12個種中，克魯克劍線蟲和荔枝長針線蟲 Uongidorus litchii) ^^XCroton iiWi腫)上的新記錄；腎形擬毛刺線蟲和胼胝擬毛刺線蟲是灰木蓮glanca)上的新記錄；短頸劍線蟲O brevicollum) 是灰木蓮、紅背 {Excoecaria cochinchinensis)> 石 Ilf iPhotinia serrulata、、秋楓(Mischofia javanica )和羊蹄甲QBauhinia bIakearm )上的新記錄；巴西劍線蟲 (Z brasiliense )是梅葉冬青(//ez asprella )、杜英 iMlaeocarpus syl ves tris )禾口火力楠(Mchelia macclurei )上的新記錄；標明劍線蟲(Z insigne )是黃葛榕、Ficus Fii-e/75·)、木棉{Bombax malabaricumMM 口十楽積才{Koelreuteria bipinnata )禾口散尾奏 (Chrysalidocarpus Iu tescens )上的新記錄。胼胝擬毛刺線蟲寄主範圍廣泛，多達100多種。主要危害的農作物和經濟作物包括疲菜(Spinacia oleracea )、古月蘿蔔(Daucus caro )、大豆(Glycine max )、豆 MXPisum sa ti vum ) > 51 ii (vigna sinensis ) > # ^jp (.Lycopersicon esculentum)、畏官 (.Lactuca sa i>a ) > ΞΕ(Zea mays ) > ^ ipyrus pyrifolia ) > ^^ (Prunus ^ersica )、香舊 iMusa spp.)、葡萄(K/ tis Vinifera )、柑橘(CY trus spp.)、梓檬(CY trus linion )、無花果 QFicus carica)、油橄欖(0/ea)等(Decraemer，1995)。在日本，此線蟲還可寄生5 種針葉樹和26種闊葉樹，其中包括日本厚樸(ife卵o/ia obvataXMamiya, 1967 ；Shishida, 1979)。此樹隸屬於木蘭科(Magnoliaceae)，木蘭屬Ofe卵o/ia Linn\而灰木蓮也屬於木蘭科，應提高對此蟲的重視程度。據報導，此線蟲能夠嚴重破壞山茶花的根部，在人工控制條件下還能夠危害玉米和高粱(5br功腫nil gar e\ Ayala等(1968)報導了在人工控制條件，胼胝擬毛刺線蟲能夠在取食被病毒侵染的菸草後傳播菸草脆裂病毒的加利福尼亞分離物。Weischer等(2000)也報導了在北美此線蟲是菸草脆裂病毒的傳毒介體。腎形擬毛刺線蟲U3, renifer)是Siddiqi在馬鈴薯、Solanum tuberosum)根部發現的。它的次異名有..Paratrichodorus (Mnidorus)renifer Siddiqi，1Θ74 禾口 renifer Siddiqi，1974。這種線蟲在印度、西澳大利亞州、喀麥隆、美國、英國、加拿大、斯洛伐克共和國、巴基斯坦、中國等地分布，可以寄生馬鈴薯、葡萄、茶(snensis )、狗牙 {Cynodon dactylon )>￠1 {Rhododendron japonicum)>Μ (Semen Trigonellae)> ^1 ilachca sativa)、姜取 ijiedychium coronariums)(Siddiqi, 1974 ； Jana et
al, 1984 ；Cotton et al, 1991 ；Nasira et al, 1994 ；Ye, 1995 ；Kazi et al, 1996 ；謝輝等， 1996 ；Forge et al, 2009)，能夠對多種作物造成嚴重損失，應重視對它的檢測防治。雪松毛刺線蟲(7cedarus )是 Yookoo (1964 )在日本的柳杉(Cryp tomeria japonica )根部發現的。它的次異名有-.Trichodorus Longistylus, Yokoo，1964 和 Trichodorus kurumeensis, Xokoo, 。這種線蟲分布的國家不多，僅在中國、日本、韓國和美國的佛羅裡達州報導過。(Yookoo, 1964 ；Mamiya, Y. 1967 ；Baek et al, 1995 ；Xu et al, 1995).該種線蟲可以寄生多種植物。在日本，雪松毛刺線蟲廣泛分布，成為日本森林苗圃中最重要的植物寄生線蟲之一。據報導，它可以危害柳杉、日本厚樸、日本落葉松 {Iari χ 1 epto 1印i s)、矯餓We 11 i s sifleasis)等30多種喬木植物。此蟲還可以危害大豆、結球甘藍(^ra1S1Sica oleracea)與大轟(Jtordeum vuIgare )等農作物。在中國，它可以寄生梨、桃、蘋果、柿樹(歷仍/？斤仍kaki、、奄餓QPrunus armeniaca)等果樹和福州杉 (Cunninghamia lanceolata ) (Shishida, 1979 ；Lee, 1976 ；Xu et al, 1995)。 Yokoo (1964) 認為雪松毛刺線蟲是引起黑松GdZzw1S thunbergii)和雪松ifeoi/ara)短粗根病的病原物。它還可以寄生多種果樹，因此對該線蟲，生產上需予以高度重視，以便防患於未然。其他各種傳毒線蟲同樣對林業、農業有著不良的影響，同樣需要高度重視，以便防患於未然。傳統的植物寄生線蟲的分類鑑定是以線蟲形態學特徵，結合形態測量值為主要依據的，對於生理小種或致病型等種下群體的鑑定，則基於對鑑別寄主或寄主植物不同品種的反應型的生物測定法來確定。對於長針科線蟲和毛刺科線蟲的傳統鑑定，主要依據形態學特徵結合形態測量值來進行分類。目前，劍線蟲屬的形態學鑑定主要依據Loof等(1990) 的多歧檢索表及其增補(Loof et W，1993，1996)。該多歧檢索表根據劍線蟲形態特徵設置 A-L共12個代碼，每個代碼對應的形態特徵都被分為至少2個選項，研究者按順序確定全部或者大多數代碼對應的選項後即可查到與需鑑定線蟲的代碼相同或相近的種類，進而進行進一步比較鑑別。關於劍屬線蟲中的美洲組劍線蟲的鑑定，由於存在長期的學術爭議而導致狀態比較混亂，較具代表性的是Luc等(1998)和Lamberti等(2000)對美洲劍線蟲組的定義。這也反映了對於美洲劍線蟲的鑑定至今沒有令人滿意的檢索表或者鑑定手段可用， 只能在各個種中尋找與之最相近的原始形態學記錄中來鑑定，由此往往引致對鑑定結果的懷疑(武揚，2007)。長針屬線蟲的形態鑑定主要依據Chen等(1997)的多歧檢索表及其增補(Loof et W，1999)來進行初步確認，再結合具體文獻材料進一步確認。毛刺科線蟲的形態鑑定主要依據Decraemer (1998)的多歧檢索表來進行一步步確認定種。這些依據形態學特徵所進行的多歧分類和數值分類法，提高了線蟲類群鑑定的準確性，但以形態學為基礎的分類不能揭示不同類植物寄生線蟲在進化過程中的親緣關係(Blok et a7,1997)0近二十年來，生物技術的迅速發展彌補了傳統形態分類技術在線蟲分類上存在的局限和不足。同工酶電泳技術、核型分析技術、DNA雜交技術、DNA限制性內切酶圖譜、PCR 及其相關技術已逐漸滲透到線蟲研究的各個領域，對線蟲的系統分類學起了非常重要的作用，為植物線蟲的分類鑑定提供了新的、強有力的工具和手段。應用分子生物學技術進行線蟲分類的直接目的就是使得鑑別種類容易、準確和快速；鑑定線蟲種類分子標記的使用增加了在樣品中的鑑定的敏感性，加快了鑑定的速度；這種基於「多聚酶鏈式反應(PCR)」的分子診斷技術克服了傳統的形態學鑑定存在的局限性，縮短了檢測時間，提高了檢測靈敏度和準確度，漏診和誤診率明顯減少，對於保護我國農林業生產安全、維護生態平衡、保證公共衛生安全以及在解決貿易糾紛、促進對外貿易等方面都具有重要的意義。限制性片段長度多態性(RFLP，restriction fragment length polymorphism) 是最早發展起來的分子標記技術之一。其原理是對特定的DNA片段的限制性內切酶產物進行分析，根據片段的大小不同以及標記片段種類和數量的不同，從而分析在同源序列上產生的DNA片段長度多態性差異。此技術及其從中發展起來的一些變型均包括以下基本步驟DNA的提取、用限制性內切酶酶切DNA、用凝膠電泳分開DNA片段、把DNA片段轉移到濾膜上、利用放射性標記的探針顯示特定的DNA片段(通過Southern雜交)和分析結果。 二十世紀八九十年代，該方法在植物線蟲學中應用較多。如1986年Curran首先用該技術成功區分了 Trichinella和根結線蟲(Meloidogyne )；Burrows和Boffey用該技術區分了馬鈴薯金線蟲(67ο力ο /era rostochiensis)及馬鈴薯白線蟲(G. pallida ) ；Bolla等應用RFLP 方法區分了松材線蟲(Mursaphelenchus xylophilus )與擬松材線蟲(Λ mucrona tus )； Webster等構建了松材線蟲的基因文庫，從中篩選了來自rDNA的內切酶片段，並正確區分了不同來源的松材線蟲與日本和歐洲的擬松材線蟲。RFLP標記具有重複性好、穩定性高和共顯性遺傳等特點。但是，RFLP分析操作過程中涉及了 DNA的提取、酶切、電泳分離、探針的製備和Southern雜交等一系列分子生物學技術，步驟繁雜，工作量大，而且對DNA的需求量很大，檢測多態性頻率較低，特別是放射性同位素及核酸雜交技術，既不安全又不易自動化。因此很大程度上限制了該項技術的應用，逐漸被其他新型標記所替代。RAPD技術是由Williams等(1990)發明的一種新的分子標記技術，基本原理是利用一系列不同的鹼基隨機排列的寡聚核苷酸單鏈作為引物對所研究的基因組DNA進行PCR 擴增，擴增產物通過聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠電泳分離，EB顯色或放射性自顯影來檢測擴增DNA片段的多態性，這些擴增的DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。 RAPD反應引物是隨機排列的，無須專門設計，引物較短，可以在對物種沒有任何分子生物學研究的情況下，構建基因組的指紋圖譜，通過統計分析為物種進化和分類提供DNA水平上的理論依據，對於種、亞種、變種的鑑別與演化關係的研究具有重要意義。Irdani 等(1995)、Braasch 和 BurgermeisteK 1995)、鄭經武等(1998)、汪來發等 (2001)用RAPD技術成功的區分了松材線蟲與擬松材線蟲。此外張路平等(2002)對松材線蟲與擬松材線蟲的線粒體DNA進行了 RAPD分析，將松材線蟲的群體分成日本株系與北美洲株系。Amiri等(2003)應用RAPD技術構建了區分甜菜胞囊線蟲Ofeteroifera schachtii)M H. betae的圖譜；Carneiro等(2004)利用RAPD技術對來自巴西、美國咖啡上的根結線蟲進行遺傳學變異分析；Lax等(2004)首次對來自阿根廷的大豆胞囊線蟲0 ^/j^i/ ^)進行了 RAPD分析，指出兩群體間存在明顯的遺傳學差異，並分析可能是由於基因漂移或不同管理措施所造成的結果。此外，RAPD標記成功應用於鱗球莖線蟲iDi tylenchus dipsaci )、 馬鈴薯金線蟲與白線蟲等。RAPD技術是一種優於RFLP技術的DNA分子標記方法，具有效率高、樣品用量少、靈敏度高、成本較低和檢測容易等優點。但是RAPD技術也存在一些不足，實驗的穩定性和重複性差。首先是顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對複雜，在基因定位、 作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降；其次，RAPD 對反應條件相當敏感，無論是模板質量和濃度，單一短引物序列，非特異性擴增，基因組DNA 的複雜性，技術設備等都是導致RAPD技術重複性差的原因。Paran和Micrhlmore (1993)首次提出SCAR標記，該標記是在RAPD標記的基礎上發展的。基本步驟先做RAPD分析，然後將RAPD標記片段從凝膠上回收並進行克降和測序，根據RAPD片段的兩末端序列設計一對特異引物(一般18-24bps左右)，對基因組DNA 進行PCR擴增，篩選鑑定對應RAPD片段的單一位點。該標記由於所用引物較長及引物序列和模板DNA完全互補，因此可在嚴格條件下擴增，結果穩定性好，可重複性強，比較屬內種間差異能力更強，在基因定位和做圖在的應用前景廣泛。Zijlstra等利用SCAR標記成功鑑定了南方根結線蟲(傲iflco^Hiia)、爪哇根結線蟲和花生根結線(#. armaria)蟲，而且結果顯示所獲得的標記能特異性鑑定根結線蟲生活史各齡期。擴增片段長度多態性(AFLP)是基於RAPD和RFLP相結合的一種DNA指紋技術。 其原理是利用限制性內切酶消化基因組DNA產生不同大小的DNA片段再進行選擇性擴增，使用雙鏈人工接頭與基因組DNA的酶切片段相連接作為擴增反應的模板DNA，用含有選擇性鹼基的引物對模板DNA基因選擇性擴增，獲得的DNA擴增片段通過變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離檢測。既具有RFLP標記的專一性、可靠性，又具有RAPD標記的隨機性、方便性。由於該標記是通過選用不同的內切酶達到選擇性擴增的目的，因此又被稱作選擇性限制片段擴增標記(Selective restriction fragment amplification, SRFA)，AFLP 是目前在種群遺傳多樣性研究中應用較廣的分子標記技術。Folkertsma等(1996)用AFLP方法對2種馬鈴薯胞囊線蟲的M個群體的遺傳多樣性進行了分析，可明顯將馬鈴薯金線蟲分為 3個不同的致病型。Samblat等對3種根結線蟲的15個群體的遺傳多樣性進行了 AFLP研究，結果表明種間遺傳差異顯著，種內遺傳變異不同，花生根結線蟲的遺傳多態性最豐富。 Kaplan等(1999)利用AFLP標記能探測到甜菜胞囊線蟲種內群體基因的變異。Marche 等(2001)對來自美國和墨西哥的菸草胞囊線蟲0 tabacum^進行了 AFLP分析，明確指出兩者屬於菸草胞囊線蟲的不同亞組。AFLP技術與其它的DNA指紋技術相比具有效率高、重複性好、多態性強解析度高以及不受基因組遺傳背景信息局限等優點。其缺點主要是AFLP是一項專利技術，受專利權保護，實驗成分和造價費用昂貴；對基因組的複雜性認知程度有限，內切酶的選擇具有盲目性；對DNA純度和內切酶的質量要求較高，操作技術難度大等方面。但隨著AFLP操作步驟的簡單化、規範化和自動化，其分析效率會進一步提高，應用範圍會不斷擴大。SSR也稱微衛星(Microsatellite)，是一種由2_5個核苷酸為重複單位串聯組成的長達幾十個核苷酸的序列，其廣泛分布於整個真核生物基因組的不同座位上，具有重複性好、多態性高、實驗程序簡單和對模板DNA的要求低。SSR是目前較好的遺傳標記之一，具有重複性好、多態性高、實驗程序簡單和對模板DNA的要求低等特點，但獲得SSR標記一般需要建立、篩選基因組文庫，克隆測序，引物設計等一系列實驗，特別是依賴測序設計引物， 成本較高。而且，SSR標記中所用引物不同，實驗結果差異較大。但隨著微衛星研究的深入，新的序列大量湧入GeneBank中，SSR標記必定會在DNA多態性領域發揮更重要的作用。Thiery和Mugniery (2000)首次將微衛星分離技術應用到植物寄生線蟲上，對馬鈴薯白線蟲的基因庫進行了分析，獲得含有效微衛星重複子的克隆，並以此設計特異性引物，對不同的馬鈴薯白線蟲群體及球形胞囊線蟲屬的部分線蟲進行了檢測。分子標記技術作為一種新型的分子生物學技術，已經廣泛的應用於植物寄生線蟲基因定位、疾病診斷、遺傳變異、品種鑑定以及親緣進化關係等相關領域。分子標記技術由於不受線蟲發育階段、環境條件以及蟲量的限制，只用單條線蟲就可以將其鑑定到種或種以下的水平，解決形態學上不能解決的分類鑑定中的難題，特別是以其快速、準確、微量、靈敏度高、程序簡單等優點廣泛應用於植物檢疫檢測中，是目前線蟲學中發展較快的一種鑑定手段。然而DNA分子標記技術運用於植物病原線蟲學中的研究僅有10餘年的時間，從實驗研究技術到數據處理分析都有著很多不完善的地方。如何把傳統的形態標記、細胞標記和生化標記研究方法與現代分子標記技術有機的結合起來是一個關鍵的問題；如何從病原線蟲複雜的基因組中選擇有效的、具有豐富遺傳信息的並能夠真實反映遺傳關係的分子標記，也是一個很大的難題；如何建立廣泛認可的分子標記研究技術是研究者們所面臨的難題。雖然有關植物線蟲的分子分類和鑑定有了較大的突破，但是目前為止所有的線蟲分類仍是以傳統的形態學分類為堅實基礎的，離開了這個基礎，分子分類鑑定是難以進行的。這些分類技術現在往往被綜合利用起來去分析某一群體的分類地位。
發明內容
本發明的目的在於提供一種快速、準確的傳毒線蟲鑑定方法。本發明所採取的技術方案是
一種短頸劍線蟲實時螢光PCR檢測方法，包括以下步驟
(1)取待檢樣品，提取基因組DNA，製備模板DNA；
(2)建立PCR反應體系
取正向引物XB-F、反向引物XB-R、弓丨物探針XB-P、10XPCR緩衝液、MgCl2、dNTP混合物、 Taq DNA聚合酶和ddH20，加入待檢模板DNA，配成PCR反應體系；
其中所述正向引物CC-F6、反向引物CC-R8和探針CC-TZ-6的核苷酸序列分別為 正向引物XB-F 5，-CGTAACCAGCTCGTTCGGTAGA-3，(SEQ ID NO 1)， 反向引物XB-R 5，-TCGATGCACACATATAGATCCG -3，(SEQ ID NO 2)， 探針序列:XB-P 5' -FAM-GAACCTGCGAGCAGGTACCGA-TAMRA-3' FAM為螢光報告基團，TAMRA為螢光淬滅基團；
(3)進行PCR擴增；
(4)螢光PCR儀讀取Ct值判斷檢測的結果。優選的，待測線蟲DNA的提取方法為配製提取液提取液中含有2. 5 mmol/L的 DTT, 1. 125%的吐溫20，0. 025%的明膠，2. 5倍的PCR緩衝液，餘量為水，PCR緩衝液含有 125 mmol/L KCl，25 mmol/L 的 pH =8.3 的 Tris-HCl，3. 75 mmol/L MgCl2，餘量為水；
將配製好的提取液預冷至4°C，並滴加至載玻片上，取待測線蟲置於提取液中； 將線蟲切成段，吸取段狀線蟲懸浮液8 PL至含有10 PL無菌水的Eppendorf管中，再向管中加入2 μ 預冷的ang/mL蛋白酶K，使總體積為20 μ ,迅速放入_70°C冰箱冷凍10min以上；
將冷凍處理的Eppendorf管置於65°C恆溫60 min，95°C恆溫10 min, 12000 g離心0.5 min，得到線蟲DNA懸浮液。優選的，實時PCR的反應體系的總體積為20 μ ，含有2 μ 1的10XPCR緩衝液、2 μ 1的MgCl2 (25 mmol/mL)、l. 6 μ 1的dNTP混合物，其濃度均為10 mmol/mL，上反向引物 XB-F/XB-R 各 0. 5μ 1，其濃度均為 10 μ mol/mL、XB_P 探針 0. 25 μ 1，其濃度均為 10 μ mol/ mL)、Taq DNA 聚合酶0. 5 U,模板 DNA 2 μ 1 ；
PCR反應條件是94°C預變性，1 min ；95°C變性15s，60°C退火延伸1 min,45個循環。本發明的鑑定方法，檢測限低，特異性好，可以快速、準確地鑑定出線蟲的種類。
圖1是本發明方法對不同樣本進行實時螢光PCR的結果圖。圖2是本發明方法實時螢光PCR的靈敏度檢測結果圖。
具體實施例方式下面結合實施例，進一步說明本發明。配製提取液提取液中含有2. 5 mmol/L的DTT，1. 125%的吐溫20，0. 025%的明膠， 2. 5倍的PCR緩衝液，餘量為水，PCR緩衝液含有125 mmol/L KCl, 25 mmol/L的pH =8.3 的 Tris-HCl, 3. 75 mmol/L MgCl2，餘量為水；
將配製好的提取液預冷至4°C，並滴加至載玻片上，取待測線蟲置於提取液中； 將線蟲切成段，吸取段狀線蟲懸浮液8 PL至含有10 PL無菌水的Eppendorf管中，再向管中加入2 μ 預冷的ang/mL蛋白酶K，使總體積為20 μ ,迅速放入_70°C冰箱冷凍10 min以上；
將冷凍處理的Eppendorf管置於65°C恆溫60 min，95°C恆溫10 min, 12000 g離心0.5 min，得到線蟲DNA懸浮液。實時PCR的反應體系的總體積為20 μ 1，含有2 μ 1的10 X PCR緩衝液、2 μ 1的 MgCl2 (25 mmol/mL)、1.6 μ 1的dNTP混合物，其濃度均為10 mmol/mL，上反向引物XB-F/ XB-R 各 0. 5 μ 1，其濃度均為 10 口11101/1^、乂8- 探針0.25 4 1，其濃度均為10 ymol/mL)、 Taq DNA 聚合酶0. 5 U,模板 DNA 2 μ 1 ；
PCR反應條件是94°C預變性，1 min ；95°C變性15s，60°C退火延伸1 min, 45個循環； 其中，PCR 中使用的正向引物為 XB-F 5，-CGTAACCAGCTCGTTCGGTAGA-3，(SEQ ID NO 1)，反向引物為 XB-R :5，-TCGATGCACACATATAGATCCG -3，(SEQ ID NO 2)，探針序列為 XB-P 5，-GAACCTGCGAGCAGGTACCGA-3，(SEQ ID NO 3)。所有供試樣本均經華南農業大學廖金鈴教授的形態學鑑定，以確定其分類。對所有供試樣本進行實時螢光PCR反應，以檢測XB-F/ XB-R/ XB-P的特異性。PCR結果如圖1反示，短頸劍線蟲不同種群的3個樣本都出現了螢光信號，Ct值在22左右，而標明劍線蟲、巴西劍線蟲、移去劍線蟲、腔室劍線蟲、克魯克劍線蟲、湖南劍線蟲、胼胝擬毛刺線蟲、荔枝長針線蟲和雪松毛刺線蟲等樣本都沒有螢光信號，表明該方法能夠對短頸劍線蟲進行特異性的擴增。
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使用不同濃度的模板進行PCR，模板濃度為100ng、10ng、lng、0. lng、0. Olng時，擴增的Ct值分別為18. 1，21.5，24.2，27.9和31. 1。在0. Olng的濃度下螢光PCR擴增曲線明顯，兩個平行樣間的Ct值分別為31. 1和31.2，體現了良好重複性，表明該方法的檢測限度在0.01 ng以下。PCR擴增產物進行測序，測序結果與短頸劍線蟲重組質粒的DNA序列完全吻合，進一步證明上述檢測方法是對短頸劍線蟲的特異性擴增。
權利要求
1. 一種短頸劍線蟲實時螢光PCR檢測方法，包括以下步驟(1)取待檢樣品，提取基因組DNA，製備模板DNA；(2)建立PCR反應體系取正向引物XB-F、反向引物XB-R、弓丨物探針XB-P、IOXPCR緩衝液、MgCl2、dNTP混合物、 Taq DNA聚合酶和ddH20，加入待檢模板DNA，配成PCR反應體系；其中所述正向引物CC-F6、反向引物CC-R8和探針CC-TZ-6的核苷酸序列分別為正向引物XB-F 5，-CGTAACCAGCTCGTTCGGTAGA-3，(SEQ ID NO 1)，反向引物XB-R 5，-TCGATGCACACATATAGATCCG -3，(SEQ ID NO 2)，探針序列:XB-P 5' -FAM-GAACCTGCGAGCAGGTACCGA-TAMRA-3'FAM為螢光報告基團，TAMRA為螢光淬滅基團；(3)進行PCR擴增；(4)螢光PCR儀讀取Ct值判斷檢測的結果。
2.根據權利要求1所述的短頸劍線蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於待測線蟲 DNA的提取方法如下1)配製提取液提取液中含有2.5 mmol/L的DTT，1. 125%的吐溫20，0. 025%的明膠， 2. 5倍的PCR緩衝液，餘量為水，PCR緩衝液含有125 mmol/L KCl, 25 mmol/L的pH =8.3 的 Tris-HCl，3. 75 mmol/L MgCl2，餘量為水；2)將配製好的提取液預冷至4°C，並滴加至載玻片上，取待測線蟲置於提取液中切成多段，吸取段狀線蟲懸浮液8 PL至含有10 PL無菌水的Eppendorf管中，再向管中加入2 μ 預冷的2mg/mL蛋白酶K，使總體積為20 μ ，迅速放入_70°C冰箱冷凍10 min以上；3)將冷凍處理的Eppendorf管置於65°C恆溫60min，95°C恆溫10 min, 12000 g離心 1 min，得到線蟲DNA懸浮液。
3.根據權利要求1所述的短頸劍線蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於實時PCR的反應體系的總體積為20 μ 1，含有2 μ 1的10XPCR緩衝液、2 μ 1的MgCl2(25 mmol/mL)、 1.6 μ 1 的 dNTP 混合物(10 mmol/mL)、0. 5μ 1 的正向引物 XB-F(10 μ mol/mL)、0. 5 μ 1 的反向引物 XB-R (10 口11101/11^)、0.25口1的探針父8- (10 ymol/mL)、0. 5 U 的 Taq DNA 聚合酶、模板DNA 2 μ 1。
4.根據權利要求1所述的短頸劍線蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應條件是:94°C預變性，1 min ；95°C變性15s，60°C退火延伸1 min，45個循環。
5.根據權利要求1所述的短頸劍線蟲實時螢光PCR檢測方法，其特徵在於所述模板 DNA的檢測限度在O.Olng。
全文摘要
本發明公開了短頸劍線蟲的鑑定方法，包括以下步驟提取待測線蟲的DNA；使用正向引物、反向引物、探針序列進行實時PCR；根據Ct值的不同，判斷線蟲是否為短頸劍線蟲。本發明方法可快速、準確、穩定的鑑別線蟲是否為短頸劍線蟲。
文檔編號C12Q1/68GK102154499SQ20111008410
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月6日 優先權日2011年4月6日
發明者廖力, 張衛東, 徐淼鋒, 遲遠麗 申請人:中華人民共和國珠海出入境檢驗檢疫局