禽流感疫苗的製作方法

2023-08-01 06:47:46

專利名稱：：禽流感疫苗的製作方法禽流感疫苗相關申請本申請要求以下申請的權益2006年10月10日提交的美國臨時申請第601850,761號、2006年11月20日提交的美國臨時申請第601860,301號、2007年3月30日提交的美國臨時申請第601920,874號和2007年4月2日提交的美國臨時申請第601921,669號，全部文獻因而〉開地通過引用的方式完整併入。發明領域本發明涉及免疫原性組合物和用作抗禽流感病毒疫苗的方法。相關技術的描述流感病毒從動物適應於人的能力由幾種病毒基因產物決定(見Parrish,C.R.等2005微生物學年評《AnnuRevMicvobiol》中綜述)。它們當中，病毒血凝素(HA)尤其令人感興趣；它結合至呼吸道中影響傳播的特定唾液酸(SA)受體(Parrish,C.R.等2005微生物學年評《AnnuRevMicvobiol》59:553;Bean,W丄等1992病毒學雜誌(JVirol)66:1129;Vine、A.等1998病毒學雜誌(JVirol)72:7626)。與此同時，它影響作為免疫保護主要決定因素的中和抗體的敏感性(Subbarao，K.等200620免疫學《Immunity》24:5;B.R.Murphy和R.G.Webster,費氏病毒學《FieldsVirology》.D.M.Knipe等編輯(Lippincott，Philadelphia,第3版，1996)，第1403頁)。發明簡述提供了因突變而適應於人的H5血凝素(HA)多肽和相關多核苷酸、方法、組合物和疫苗，其中所述的突變改變H1血清型的受體特異性。本發明的實施方式涉及分離或重組的血凝素(HA)多肽，所述多肽選自由以下項所組成的組中(a)具有SEQIDNO:2的胺基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的胺基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的胺基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列編碼的多肽，其中所述的多核苷酸序列在高度嚴格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核芬S交序列的基本上全長雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續的至少約350個胺基酸、與至少約400個胺基酸、與至少約450個胺基酸或與至少約500個胺基酸基本上相同的胺基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含S137除S之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y或V,優選地是A，並任選包含T192除T之外的胺基酸的又一個突變，其中所述胺基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V,優選地是I。本發明的另一個實施方式涉及分離或重組的血凝素(HA)多肽，所述多肽選自由以下項所組成的組中(a)具有SEQIDNO:2的氨基S臾序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的胺基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的胺基酸序列的多肽；(d)由多核香酸序列編碼的多肽，其中所述的多核苦Si^列在高度嚴格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核苦酸序列的基本上全長雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續的至少約350個胺基酸、連續的至少約400個胺基酸、連續的至少約450個胺基酸或連續的至少約500個氨基S緣本上相同的胺基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含K/R除K或R之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸即是A、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y或V,優選地是S、A、T或N，並包含由以下項所組成的組中的至少一種突變S136除S之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V，優選地是T;E190除E之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V，優選是D、N,或G;L194除L之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V、優選是I或F;R216除R之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、優選是E;S221除S之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V、優選是P;K222除K之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y，或V、優選是W;G225除G之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V、優選是D或N;Q226除Q之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、優選是R或L;S227胺基酸除S之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V、優選是A、H、P、E，或N;以及G228除G之外的胺基酸的突變，其中所述的胺基酸是A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、優選是S。本發明的其它實施方式涉及包含與前述血凝素多肽具有至少95%序列同一性的序列的多肽、其免疫原性片段、其組合物、其免疫原性組合物、修飾其裂解位點、修飾替代跨膜結構域的前述血凝素多肽的外部三聚區的羧基末端、編碼前述血凝素多肽的多核苷酸序列、載體、產生方法、使用方法、對其特異的抗體和抗體9B11、IODIO、9E8及11H12。圖1.曱型流感病毒粒子的結構示意圖。圖2.流感病毒A血凝素蛋白的圖示。圖3.曱型流感病毒(A/泰國/l(KAN-l)/2004(H5N1))血凝素(HA);GenBank登錄號AY555150;野i型；多肽序列是SEQIDNO:2;並且多核苷酸序列是SEQIDNO:1。圖4.血凝素突變的結構和遺傳基礎。A)顯示可選性病毒血凝素的RBD。B)130主環和220主環和190螺旋內胺基酸序列的比較。圖5.HANA假型慢病毒載體的功能性活性野生型和突變H5血凝素的等效表達、具有a2,3和a2,6SA特異新凝集素的293A細胞的反應性、除神經氨酸酶之外還含有野生型或突變HA的假型病毒介導進入的能力。(A)使用流式細胞術，在轉染的293T細胞中顯示野生型或所述突變流感病毒H5MHA的表達(Paulson,J.C.和Roger、G.N.1987酶學方法《MethodsEnzymol》138:162);免疫前對照(灰色)或抗H5(黑色)。(B)293A細胞如所示與生物素化標記MAA或SNA—起孵育，由流式細胞術分析。(C)在如實施例1中所述製備除NA之外以所示HA野生型(WT)或突變型變體假型化的慢病毒載體後，利用螢光素酶測定法測量，分析了由H5(KAN-1)及其衍生物介導的進入的效率。對應於所述突變體的表達水平是對照，4.78x10、WT,3.16xlO8;Q226L,G228、3.79xlO8;E190D,1.55x107;K193、3.78xlO8;G225D,2.97xl08;E190D,K193、4.51x108;E190D，G225D,8.3x168;K193S,G225D,4.03x108;E190D,K193S，G225D，3.05x108。圖6.與隨同NA—起共表達的野生型KAN-201H5相比，三重突變體H5的變異特異性。在隨同NA共表達後純化的(A)野生型或(B)三重突變體HA的聚糖微陣列分析通過先前技術(Steven、J.等2006自然-微生物學綜述《NatRevMicrobiol》4:857)的改良(實施例1)進行，由CoreH,功能基因組協會，Emory大學實施。具有相關係的聚糖通過編號進行分組選擇糖蛋白(1-6),主要是2，3-唾液酸糖香(7-44),2,6-唾液酸糖苷(45-60),2,8配體(61-67)或其它(68-84)，如前所示(表8)。圖7.突變H5N1假病毒的變異中和敏感性。(A)對轉染的293T細胞中隨NA共表達的HA的結合由流式細胞術以所示mAb(黑色)或同種型對照IgG(灰色)測定。(B)中和敏感性用所示mAb評價。(C)顯示了所示野生型和突變HA對這些mAb(400ng/ml)的中和敏感性。(D)展示了野生型以及S137A、T1921突變體對mAb9E8和11H12的中和敏感性。圖8.H5(Kan畫l)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質序列(SEQIDNO:8)、DNA序列(SEQIDNO:26)。圖9.H5(Kan-l)(mut.A)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質序列(SEQIDNO:9)、DNA序列(SEQIDNO:27)。圖10.H5(Kan-l)(mut.A)(短)/Foldon(摺疊子)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質序列(SEQIDNO:10)、DNA序列(SEQIDNO:28)。圖11.H5印度尼西亞(E190D/K193S/G225D)。蛋白質序刮(SEQIDNO:11)、DNA序列(SEQIDNO:29)。圖12.H5印度尼西亞(mutA)(E190D/K193S/G225D)。蛋白質序列(SEQIDNO:12)、DNA序列(SEQIDNO:30)。圖13.H5(印度尼西亞)(mut.A)(短)/Foldon(E190D/K193S/G225D)。蛋白質序列(SEQIDNO:13)、DNA序列(SEQIDNO:31)。圖14.VRC9151(SEQIDNO:14)。圖15.VRC9152(SEQIDNO:15)。圖16.VRC9153(SEQIDNO:16)。圖17.H5(Kan-l)(S137A)。蛋白質序歹'J(SEQIDNO:17)、DNA序列(SEQIDNO:32)。圖18.H5(Kan曙l)(mut.A)(S137A)。蛋白質序列(SEQIDNO:18)、DNA序列(SEQIDNO:33)。圖19.H5(Kan-l)(mut.A)(短)/Foldon(S137A)。蛋白質序列(SEQIDNO:19)、DNA序列(SEQIDNO:34)。圖20.H5(Kan-l)(T1921)。蛋白質序列(SEQIDNO:20)、DNA序列(SEQIDNO:35)。圖21.H5(Kan-l)(mut.A)(T192I)。蛋白質序列(SEQIDNO:21)、DNA序列(SEQIDNO:36)。圖22.H5(Kan-l)(mut.A)01)/Foldon(T192I)。蛋白質序歹寸(SEQIDNO:22)、DNA序列(SEQIDNO:37)。圖23.H5(Kan-l)(S137A/T192I)。蛋白質序列(SEQIDNO:23)、DNA序列(SEQIDNO:38)。圖24.H5(Kan-l)(mut.A)(S137A/T192I)。蛋白質序列(SEQIDNO:24)、DNA序列(SEQIDNO:39)。圖25.H5(Kan-l)(mut,A)(短)IFoldon(S137A/T192I)。蛋白質序列(SEQIDNO:25)、DNA序列(SEQIDNO:40)。圖26.曱型流感病毒(A/印度尼西亞/5/05(H5Nl))血凝素(HA);GenBank登錄號ISDN125873;野生型；多肽序列是SEQIDNO:82;並且多核苷酸序列是SEQIDNO:81。圖27.曱型流感病毒(A/Anhui/1/2005(H5N1))血凝素(HA);GenBank登錄號ABD28180;野生型；多肽序列是SEQIDNO:84;並且多核苷#列是SEQIDNO:83。以下生物材料已經根據布達佩斯條約條款在所示日期保藏於維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心(ATCC):tableseeoriginaldocumentpage15生物材料10D10的保藏D10小鼠B細胞雜交瘤在2006年10月10日作為ATCC登錄號PTA-7916保藏於美國維吉尼亞州20110-2209,馬納薩斯，Blvd大學,10801,美國典型培養物保藏中心(ATCC)。所述保藏物根據國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(布達佩斯條約)的條款產生。這確保維持此保藏物有活力的培養物自保藏日期起持續30年。ATCC將根據布達佩斯條約的條款使該保藏物可獲得並且該保藏物遵循申請人與ATCC之間的合同，其中所述的合同確保在相關的美國專利發布時或在任何美國申請或外國申請對公眾公開時，無論誰在先，公眾可永久且不受限制地獲得該保藏物的培養物的子代，並且確保由美國專利商標局委員根據35USC§122和根據其的行政規章(Commissioner'srulespursuantthereto)(包括375CFR§1.14)決定對其授權的個人可獲得所述利法授予的權力相牴觸地許可實施本發明。生物材料9B11的保藏9B11小鼠B細胞雜交瘤在2007年4月2日作為ATCC登錄號PTA-8306保藏於美國維吉尼亞州20110-2209,馬納薩斯，Blvd大學，10801,美國典型培養物保藏中心(ATCC)。所述保藏物根據國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(布達佩斯條約)的條款產生。這確保維持此保藏物有活力的培養物自保藏日期起持續30年。ATCC將根據布達佩斯條約的條款使該保藏物可獲得並且該保藏物遵循申請人與ATCC之間的合同，其中所述的合同確保在相關的美國專利發布時或在任何美國申請或外國申請對公眾^Hf時，無論誰在先，公眾可永久且不受限制地獲得該保藏物的培養物的子代，並且確保由美國專利商標局委員根據35USC§122和根據其的行政規章(包括375CFR§1.14)決定對其授權的個人可獲得所述子代。所保藏的生物材^h的可獲得性不得解釋為與任何政府權利機關根據其專利法授予的權力相牴觸地許可實施本發明。含有CDR和FR區的9E8抗體序列I.人源化序列蛋白質序列人源化9E8重鏈V區FR1:VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG(SEQIDNO:41)FR2:WVRQAPGQGLEWMGW(SEQIDNO:42)FR3:TMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR(SEQIDNO:43)FR4:WGQGTMVTVSS(SEQIDNO:44)CDR1:YIFSEYIIN(SEQIDNO:45)CDR2:FYPGSGSVKYNEKFNDKA(SEQIDNO:46)CDR3:HERDGYYVY(SEQIDNO:47)人源化9E8K鏈V區FR1:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS(SEQIDNO:48)FR2:MHWYQQKPGQAPRLLIY(SEQIDNO:49)FR3:NLETGIPARFSGSGSGTDFTLTIDPLEAEDVATYYC(SEQIDNO:50)FR4:FGQGTKVEIK(SEQIDNO:51)CDRl:ESVDSFGNSF(SEQIDNO:52)CDR2:LAS(SEQIDNO:53)CDR3:QQNNEDPYT(SEQIDNO:54)人源化9E8重鏈(SEQIDNO:55)mdwtwrilflvaaatgahsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgyifseyiinwvrqa卿glewmgwfypgsgsvkynekfndkatmtadtsistaymelsrlrsddtavyycarherdgyyvywgqgtmvtvssastlcgpsv^lapsskstsggtaaigclvkdyQ>epvtvswnsgaHsgvhtfpavlqssg1yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsMkvdkkvepkscdkthtcppcpapelggpsvf!fppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq(lwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqi)i-q)qvytlpi)srdeltknqvsItclvI、'gfypsHave、vesngqpennykttpp、'kls(lgsfflyskltv他snvqqgm'ftcs、TiiheaHmiiytql"'Msi)gk人源化9E8輕鏈(SEQIDNO:56)me，qllfHllwipclrtgeivltqspatlskpgeraUscrasesvds%isfiiihwyqq.kpgqaprlUylasnletgiparfsgsgsgtdftltidp〗eaedvatyycqqnnedpytfgqgtkvdkrtva汰psvfifppsdeqHcsgtasvvdlimfypreakvqw]cvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsst!tlskadyekhkvyacevth(jglsspvtksfhrgecDNA序列人源化9E8重鏈(SEQIDNO:57)atggattggacatggagaatcctgt〖cctggtggctgctgctocag伊gctcatagccaggtgcagctggigcagagcggagctgaagtgaagaagcctggagctegcgtgaaggtgtcctgtaaggcctccggatacatcttcagcgagtacatcatcaactgggtgagacaggctcctggacagggactggaatggatgggatggttctoccctggaagcggaagcgtgaagtacaacgagaagttcaacgacaaggctacaatgacagctgacacaagcatctocacagcttacatggaactgtccagactgagaagcgatgatacagctgtgtactactgtgccagacacgaaagagacggatactacgtgtactggggacagggaacaatggtgaccgtgtcctccgcctcc線ceaagggcccatcggtettccccctggcaGCCtectccaag3gcacctot卿ggcac3gcggccctgggctgcctggtca鄉actacttccccg抑cc敏gaeggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccgg卿cctacagtcctcaggactctactcccte3gcagcgtggtgacc狗ccctceagcagcttgggcaccc3g3cctacatctgcaacgtgaatc3caagcccagc3acacc的ggtggacaagaaagttgagcccaaatettgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcUccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct'gaggtcaagtteaactggtacgtggacggcgtggaggtgca〖aatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacglaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctocaacaaagccctcccagcccccatcgag3aaaccatctccsia3gcca3agggcagccccgaga3ccac鄉tgtacaccctgcccccatcccgggatgagc〖gaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgcfcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgca伊，gcctctcccfgtctccgggt嫌言ga人源化9E8輕鏈(SEQIDNO:58)AtggaagcccctgctcagctcctgUtctgcl,gctgctgtggctgcctgatacaacaggagaaatcgtgctgacacagagccctgccacact鵬cclgagccctggagaaagagccacactgagctgcaga忌cctcc,agcgtggattccttcggaaacagcttcatgcactggtaccagcag餘gcctggacaggcceccagactgctgatctacctggcctecaacctggaaacaggaatccc〖gccagattttccgg抑gcggMgcgg幼cag池tcacactgac組cgaccctctggaagctgaagatgtggctacMactectgtcagcaga織acgaagatccttacacatttggacagggaacaaaggtggagatcaagagaacagtggccgccccttccgtgttcatcttccctccttecgacgaacagctgaaaagcggaacagccagcgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcgga朋oigccaggaaagcgtgacagagcaggattccaaggattcaicatecagcctgagcagcacadgacactgtc'omggccgactacgaga3gcaccmggt.gtacgcctgcgaagtgacacaccagggactgtcctcccctgtgaII.小鼠序列蛋白質序列小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VH(SEQIDNO:59):mgwswiflfllsvtagvhskvqqqsgaelvkpgasvklsckasgyifs巧iinwvkqksgcjg化wiawfypgsgsvkynekfndkatlsadtssrrtvymdirvtsedsavyjfcarherdgyyvywgqgttltvss小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VL(SEQJDNO:60):sgsgsrtdftltidpveaddvatyycqqnnedpytfgggtkleikDNA序列小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VH(SEQIDNO:61):atgggatggagctggatctttctcttcctcctgtcagtaactgcaggtgtccactccaaggtccagctgcaacagtctggagctgagct:ggtgaaaeccggggcttcagl'gaagctgtcctgcaaggcttctggctacatcttcagtgaatatattataaattgggtpaagcagaaatctggacagggtcttgagtggattgcgtggttttaecctggaagtggtagtgtaaagtacaatgagaaattcaacgacaaggccacattgagtgcggacacgtcctccaacacagtctatatggagcttattagagtgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagacacga3鄉gMggttactecgtetoctggggccii郷cacc3ctctcEic3gtctcctca小鼠抗H5(Kan-l)單克隆抗體，9E8VL(SEQIDNO:62):atggagacagacacactcctgctatgggtgetgctgclctgggttccaggt襲ccacaggtaacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctaggacagagggccaccatatcctgcagaaccagtgaaagtgttgatagttttggcaatagttttetgcactggtaccagcagaaaecaggacagccacccaaactcctcatctotctfgcatecaficctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagt卿tct鄉acagacttcaccctcaccattgatcctgtgg鄉ctgatgatgttgcaacctattactgtcagcaaaataatgaagatccgtacacgttcg賊鵬紹gace鄉etg:g細taaaa含有CDR和FR區的11H12抗體序列蛋白質序列鼠類11H12重鏈V區FRl:VQLQQSGAVLMKPGASVKISCKATG(SEQIDNO:63)FR2:WVKQRPGHGLEWIG(SEQIDNO:64)FR3:AFTADTSSNTANIQLTSLTSEDSAVYYCAR(SEQIDNO:65)FR4:WGAGTTVTVSS(SEQIDNO:66)CDR1:YTFSSYWIE(SEQIDNO:67)CDR2:EILPGSGSINYNEIFKDKA(SEQIDNO:68)CDR3:GGYGYDPLYWSFDV(SEQIDNO:69)鼠類11H12K《連V區FRl:DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRAS(SEQIDNO:70)FR2:IHWYQQRTNGSPRLLIQ(SEQIDNO:71)FR3:ESISGIPSRFSGSGSGTNFTLTINSVESEDIADYYC(SEQIDNO:72)FR4:FGGGTKLEIK(SEQIDNO:73),CDR1:QSIGTN(SEQIDNO:74)CDR2:SAS(SEQIDNO:75)CDR3:QLTNTWPMT(SEQIDNO:76)11H12重鏈(SEQIDNO:77):mgwswiflfUsvtagvhsqvqlqqsgavlmkpgasvkisckatgytfssywiewkqi'pghglewigeUpgsgsiiiyneifkfJkaaftadtssntaiiiqltsltsedsavyycarggygydplywsfdvwgagttvtvssalcttppsvypIapgsaaqtnsOTVtlgdvfc-epvtvtwiisgsksgvhtfpavlqsdiytlsssvtvpsstwpsetvtettvfihpasstkvdkfcivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltithpkvlcvw出skddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfhstfrsvsdpimhqdwbgkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkcqmakdkvsltanitdffpe(litvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyiVysklnvqksnweagntfksv!heglhnhhtekslshspgk11H12輕鏈(SEQIDNO:78):mesqsqvfvfllftvipasrgcMUtqspailsvsi3gervsfecrasqsigtoiliwycicir1iigspriliqsasesisgipsrfsgsgsgtn組tiiw敏edia柳c:qltatMpR詢ggtkleikradaaptvg;ifppaseqlts靜,flimfypldirw1wlddg鵬rqngvlnswtdqds]ccIstysinsst:lt!tkdeyCTlinsytceathktstspivksfmTiecDNA序列11H12重鏈(SEQIDNO:79):atgggatggagcl名galctttctcttcclcctgtcagtaactgctggtgtccactcccaggttcagctgcagCMtctggagdgtactgatgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaggctactggctacacattcagtagctac;tggatagaglgggtgaagcagaggcctggacatggccHgaglgga"ggagagat很acctggaagl.ggtagtattaattacaatgagatcttcaaggacaaggccgeattcactgc3g站織tcctcc職gcc咖3ta,ctc8ccagcctg職tctg鄉3ctctgccgtc敏flctgtgc船ggggaggctatggUacgacccactctactggfcctregatgtccagccaaaacgacacecccatctgtetet(xactggcecclggatcl'gctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgaectggaadct經gttccctgtecagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaat〖gtgcccagggattgtggttgt肌gccttgcat欲gtacagtcccagaagtetcatctgtctteatettecccccaaagccxaaggatgtgctcaca"tactdgactcefaaggto3cgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttc鄉t敏ttgtag8tg卿gg鄉tgcac織gctcagacgcaaccccgggagg紹cagttc油c鄉adttccgcteagtcagtgaacttoceatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggteaacagtgcagctttccctgcccccatcg3ga鄉ccatctecaaaaccggc曰gaccgaa卿tecacaggtgtacaccattccacctecc卿g3gcag購gcc8鄉ataaagtcagtdgaectgeatgataacagacttettcectgaagacattectgtggagtggcagtggaat紹gcagccagcggagaactacaagaaeactcageccatcatggacacagatggctcttocttcgtetacagcaagctcaatgtgcag腿gagcaadgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggaaatga11H12輕鏈(SEQIDNO:80):atggagtcacagtctcaggtctugtatmtgcmtctggattccagcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtuctcctgca鵬ccagtcagagcattggcacaaacatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcatacagtctgcttctgagtctatuctgggatcccgtccaggtttagtggcagtggatcagggacaaattttactctaaccatcaacaglgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacttactaatacctggccaatgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctc.agtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcetgaacagttggactgateaggac汰gcaaagaeagcacctecagcatgageagcacceteacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctalacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttgatga表l曱型病毒HA序列和質粒構建tableseeoriginaldocumentpage21tableseeoriginaldocumentpage22具體實施例方式流感病毒進入由其刺突蛋白-血凝素(HA)的受體結合結構域(RBD)介導。禽病毒對人的適應性與HA針對a2，6-連接而非a2，3-連接唾液酸(SA)受體的特異性有關。本文中，我們定義了曱型流感病毒亞型H5N1(禽)HA中的如此突變，其通過減少a2,3-或增加a2，6-SA識別作用而改變所述HA對SA的特異性。使用RBD突變體來開發疫苗和中和新變體的單克隆抗體。基於結構對HA特異性的修飾可以指導開發可在人適應性H5N1抹出現之前進行評價的優選疫苗和治療性單克隆抗體。定義除非另外定義，本文中所用的技術術語和科學術語具有如本發明所述領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。參見例如，SingletonP和SainsburyD.，微生物學與分子生物學詞典第三版(DictionarvofMicrobiology和MolecularBiology.3rded.),J.Wiley&Son、奇切斯特(Chichester)，紐約(NewYork)，2001和費氏病毒學第四版(TieldsVirology.4thEd.)編者KnipeD.M.和HowleyP.M.,LippincottWilliams&Wilkin、費城(Philadelphia),PA，2001。過渡態術語"包含"是與"包括"、"含有"或"特徵在於"同義的，是包含性或開放的，並且不排除額外的、未提及的要素或方法步驟。過渡態短語"由......組成"排除了未在權利要求中詳述的任意要素、步驟或組分，但是不排除與本發明不相關的額外組分或步驟，如通常與本發明相關的雜質。過渡態短語"基本上由……組成"將權利要求的範圍限於指定的材料或步驟和這樣的材料或步驟，其實際上不影響所要求專利的發明的基本和新穎性特徵。如本說明書及所附權利要求書中所用，單數形式"一個(a)"、"一種(an)"和"該(the)"包括複數指稱，除非上下文清楚地聲明。因此，例如對"一種病毒"的指稱包括多種病毒；對一種"宿主細胞"的指稱包括宿主細胞的混合物等。術語"核酸"、"多核苦酸"、"多核苷酸序列"和"核S交序列"，才艮據上下文，指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物、其嵌合物或類似物，或代表此類對象的字符串。如本文中所用，該術語任選地包括天然存在性核苷酸的類似物的聚合物，所述的聚合物具有天然核苷酸的本質特性，從而它們以類似於天然存在性核苦酸的方式與單鏈核酸雜交(例如聚醯胺核酸)。除非另外說明，本發明的具體核S吏序列除清楚說明的序列之外任選地包括互補序列。從任意的所述多核苷酸序列，可以確定給定的核酸或互補性多核苷S吏序列(例如互^M亥酉臾)。術語"核酸"或"多核苷酸"也包括單體單元的任意實體串列，所述的串列可以對應於一串核苦酸，包括核苷酸聚合物(例如常見的DNA或RNA聚合物)、PNA、修飾的寡核普酸(例如包含對於溶液中的生物RNA或DNA是不常見的鹼基的寡核苦酸，如2'-0-曱基化寡核苷酸)等。核酸例如可以是單t連或雙鏈的。"亞序列，，是全長的任意部分，脂質並且包括整個序列。通常，亞序列包含小於全長的序列。在兩種核酸或多肽(例如編碼HA分子的DNA或HA分子的胺基酸序列)的上下文中，短語"基本上相同"指兩個或更多個序列或亞序列，在為最大對應性進行比較和比對時，如使用序列比較算法或通過目視檢查測量，所述序列具有至少約90%、優選91%、最優選92°/。、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、599.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更大的核香酸殘基同一性或胺基酸殘基同一性。術語"變體"就多肽而言，指相對於參考序列氨因一個或多個胺基酸而改變的胺基酸序列。所述變體可以具有"保守性，，變化，其中置換的胺基酸具有相似的結構或化學屬性，例如用異亮氨酸替換亮氨酸。或者，變體可以"非保守性"變化，例如用色氨酸替換甘氨酸。類似的細微變異也可以包括胺基酸缺失或；插入或這兩種情況。使用i本領域眾所周知的電腦程式例如軟體DNASTAR,可以找到決定哪種胺基酸殘基可被置換、插入或缺失而不消除生物學活性或免疫學活性的原則。本文中也描述保守性置換的實例。術語"基因"廣泛地用來於生物學功能相關的任意核酸。因此，基因包括編碼序列和/或其表達所需要的調節序列。術語"基因"適用於特定基因組序列，以及適用於由該基因組序列編碼的cDNA或mRNA。基因也包括不表達的核酸節段，其例如形成其它蛋白質的識別序列。不表達的調節序列包括"啟動子"和"增強子"，其中調節蛋白如轉錄因子與所述啟動子和增強子結合，從而導致轉錄相鄰或附近的序列。"組織特異性"啟動子或增強子是調節特定組織類型或細胞類型中轉錄的那種啟動子或增強子。"基因的表達"或"核酸的表達"通常意指DNA轉錄成RNA(任選地包括修飾所述RNA，例如剪接)或RNA轉錄成mRNA、RNA翻譯成多肽(可能包括對所述多肽的後續修飾，例如翻譯後修飾)或意指轉錄和翻譯，如上下文所示。"開放閱讀框"或"ORF'是DNA或RNA(例如基因)中可能翻譯的開放閱讀框，所述的開放閱讀框能夠翻譯成多肽。也就是說，所述開放閱讀框不由終止密碼子截斷。然而，應當指出術語ORF不必表示所述多核香酸實際上被翻譯成多肽。術語"載體"指核酸可以藉此而增殖和/或在生物、細胞或細胞組分之間轉移的手段。載體包括自主複製或可以整合至宿主細胞染色體的質粒、病毒、噬菌體、前病毒、噬菌粒、轉座子、人工染色體等。載體也可以是無法自主複製的棵RNA多核苷酸、棵DNA多核苷酸、在同一條鏈中由DNA和RNA組成的多核苷酸、聚賴氨酸綴合的DNA或RNA、肽綴合的DNA或RNA、脂質體綴合的DNA或其它。在眾多但非全部的常見實施方式中，本發明的載體是質粒。"表達載體，，是能夠促進整合於其中的核酸表達以及複製的載體，如質粒。通常，待表達的核酸與啟動子和/或增強子"可操作地連接(operablylinked)",並且接受所述啟動子和/或增強子的轉錄性調節控制。"雙向表達載體"以兩個這樣的備選啟動子為特徵，其中所述兩個啟動子相對於在這兩個啟動子之間存在的核酸具有對立方向，從而表達可以在兩個方向上啟動，導致例如正鏈(+)或有義鏈RNA和負鏈(-)或反義鏈RNA的轉錄。根據上下文，"氨基S交序列"是胺基酸殘基的聚合物(蛋白質、多肽等。)或代表tt酸聚合物的字符串。"多肽"是包含兩個或更多個胺基酸殘基的聚合物(例如多肽或蛋白質)。所述聚合物可以任選地包含修飾，如糖基化或其它等。所述多肽的胺基酸殘基可以是天然或非天然的並且可以是非取代的、非修飾的、取代的或修飾的。在本發明的上下文中，術語"分離"指這樣的生物材衝牛，如病毒、核酸或蛋白質，所述生物材料基本上沒有在其天然存在環境中通常與之相伴或相互作用的組分。分離的生物材料任選地包含在其天然環境中找不到伴隨所述生物材料的額外材料，例如細胞或野生型病毒。例如，若所述材料處於其天然環境如細胞中，則該材料可以位於該細胞中的如此位置(例如基因組或遺傳元件)內，其中所述的位置對在此環境中存在的此材料而言不是天生的。例如，天然存在性核酸(例如編碼序列、啟動子、增強子等)變成分離的，若此核酸通過非天然存在性工具(例如載體，如質粒或病毒載體或擴增子)導入基因組中對於該核酸而言是非天生的基因座。此類核酸也稱作'異源性"核酸。分離的病毒例如處在並非是野生型病毒天然環境(例如感染個體的腸道或呼吸道)的環境中(例如細胞培養系統或從細胞培養中純化)。術語"重組"表示所述材料(例如核酸或蛋白質)已經因人工幹預而受到人工或合成(非天性)改變。所述改變可以對位於其天然環境或狀態下或從其中取出的材料進行。具體而言，例如當通過表達重組核酸產生流感病毒時，該流感病毒是重組的。例如，"重組核酸，，是通過(例如克隆期間)使核酸重組或其它方法，或通過化學誘變法或其它誘變法所產生的核酸；並且"重組多肽"或"重組蛋白，，是通過表達重組核酸而產生的多肽或蛋白質。當指異源性或分離的核酸時，術語"導入"指將核酸併入真核細胞或原核細胞，其中所述核酸可以併入該細胞的基因組(例如染色體、質粒或線粒體DNA)、轉化成自主複製子或瞬時表達(例如轉染的mRNA)。該術語包括此類方法如"轉染"、"轉化"和"轉導""。在本發明的上下文中，可以使用多種方法將核酸導入細胞，所述方法包括電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、脂質介導轉染法(lipofection)等。術語"宿主細胞"意指含有異源性核酸如載體或病毒並支持所述核酸複製和/或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌(E.coli)或真核細胞如酵母、昆蟲、兩棲動物、禽類或哺乳動物細胞，包括人細胞。示例性宿主細胞可以包括例如Vero(非洲綠猴腎細胞)細胞、BHK(乳倉鼠腎)細胞、原代雞腎(PCK)細胞、Madin畫Darby犬腎(MDCK)細胞、Madin畫Darby牛腎(MDBK)細胞、293細胞(例如293T細胞)和COS細胞(例如COSl、COS7細胞)等。流感病毒的"免疫學有效量"是足以增強個體(例如人)在暴露於流感病毒後自身免疫應答的量。誘導免疫的水平可以通過測量中和性分泌抗體和/或血清抗體的量，例如通過蝕斑中和測定法、補體結合測定法、酶聯免疫吸附測定法或微量中和測定法加以監測。抗流感病毒的"保護性免疫應答，，指個體(例如人)表現的如此免疫應答，該免疫應答在該個體隨後暴露於野生型流感病毒和/或受其感染時保護其不受疾病影響。在一些情況下，野生型(例如天然循環型)流感病毒可以仍造成感染，不過它不能造成嚴重感染。一般，所述保護性免疫應答產生可檢測水平的宿主產生的血清抗體和分泌型抗體，所述的抗體能夠在體外和體內中和相同抹和/或亞群的病毒(並也可能中和不同的非疫苗林和/或亞群)。如本文中所用，"抗體"是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段編碼一條或多條多肽的蛋白質。已識別的免疫球蛋白基因包括k、？ua、y、5、s和ji恆定區基因，以及繁多的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為K或X。重鏈分類為y、p、a、5或s，它們轉而分別定義免疫球蛋白類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。常見免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。每種四聚體由相同的兩對多肽鏈，每對多肽鏈具有一條"輕"鏈(約25kD)和一條"重，，鏈(約50-70kD)。每條鏈的氨基端定義主要負責抗原識別的含約IOO個至110個或更多個胺基酸的一個可變區。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)指分別這些輕鏈和重鏈。抗體作為完整免疫球蛋白或作為眾多充分表徵的片段存在，其中所述的片段用多種肽酶消化而產生。因此，例如胃蛋白酶消化鉸鏈區中二闢"建以下的抗體以產生作為Fab二聚體的F(ab)'2，其中所述的Fab本身是通過二硫鍵與VH-CH1連接的輕鏈。F(ab)'2可以在溫和環境下被還原以破壞鉸鏈區中的二硫鍵，因而將所述(Fab')2二聚體轉化成Fab'單體。所述Fab'單體基本上是具有部分鉸鏈區的Fab(對其它抗體片段的更詳細描述，見《基礎免疫學》(FundamentalImmunology)，W.E.Paul編輯，RavenPress,N.Y.(1999))。儘管就消化完整抗體而言定義了多種抗體片段，技術人員將理解此類Fab'片段可以按照化學方式或通過使用重組DNA方法學從頭合成。因此，術語"抗體"如本文中所用，包括抗體或通過修飾完整抗體而產生或使用重組DNA方法學從頭合成的片段。抗體包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、多鏈或單鏈抗體，所述單鏈抗體包括其中可變重鏈和可變輕鏈(直接或通過肽接頭)連接在一起以形成連續多肽的單鏈Fv(sFv或scFv)抗體和人源化或嵌合抗體。tableseeoriginaldocumentpage28流感病毒曱型流感病毒是感染類型廣泛的禽類和哺乳動物種的有包膜負股單鏈RNA病毒。曱型流感病毒分成血凝素(HA)和神經氨酸酶5(NA)主要表面糖蛋白的血清學定義抗原亞型(WHO備忘錄1980BullWHO58:585-591)。該命名法滿足了對可由全部國家使用的簡單系統的要求並且其從1980年以來一直有效。此命名法以源自包含血凝素和神經氨酸酶抗原的雙向免疫擴散(DID)反應的數據為基礎。雙向免疫擴散(DID)試驗如先前所述(Schild,GC等1980病毒學文獻(ArchVirol)63:171-184)進行。簡而言之，試驗在瓊脂糖凝膠上實施(HGT瓊脂糖、1%磷酸鹽緩衝鹽水、pH7.2,含有0.01%疊氮鈉)。含有每毫升5-15mg病毒蛋白(或雞紅細胞的HA滴度為每0.25ml1055-1065血凝素單位)的純化病毒顆粒的製品以5-10|il體積添加至凝膠的孔內。病毒顆粒在孔內通過添加1%終濃度的去垢劑十二烷基肌氨酸鈉NL97加以破壞。將沉澱反應照相而不染色，或將凝膠乾燥並用考馬斯亮蘭染色。當使用對一種或另一種所述抗原為特異的超高免血清開展DID試驗時，該試驗提供用於比較抗原關係的有價值方法。抗原之間的相似性檢測為共同沉澱素線，其中當使不同抗原^L射狀地對單種血清向內擴散時，抗原之間變異的存在由毛刺狀沉澱素揭示。基於對源自全部物種的甲型流感病毒的DID試驗的結果，H抗原可以分成如表2中所示的16個亞型。表2從人、低等哺乳動物和鳥類分離的甲型流感病毒的血凝素亞型tableseeoriginaldocumentpage29tableseeoriginaldocumentpage30顯示流感病毒參考株或來自該物種的首個分離株。b目前亞型命名。來自WHO備忘錄1980BullWHO58:585-591。曱型流感病毒基因組由8條單鏈負義RNA(single-strandnegative-senseRNA)分子組成(圖1)。三種膜整合蛋白-血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)和少量M2離子通道蛋白-插入貫穿病毒包膜的脂質雙層。認為病毒粒子基質蛋白Ml位於脂質雙層下面，還與螺旋狀核糖核蛋白(RNPs)相互作用。在包膜內存在以RNP形式包含的8節段單鏈基因組RNA(長度範圍從2341至890核苷酸)。與RNP結合的少量由PB1、PB2和PA蛋白質組成的轉錄酶複合體。所述8個RNA節段的編碼功能也在圖1中顯示。HA和NA由獨立的RNA分子編碼。HA參與病毒與宿主細胞糖蛋白上的末端唾液酸殘基和糖脂結合。在病毒進入細胞的酸性內吞體區室後，HA也參與同細胞膜的融合，這種融合導致病毒粒子內容物釋放至胞內。HA作為HAo前體合成，其中HAo前體形成病毒表面上非共價結合的同三聚體。所述HAo前體由宿主蛋白酶在保守的精胺酸殘基處切割以產生兩個由單個二碌L鍵連接的亞基HAi和HA2(圖2)。該切割事件是生產型感染所需要的。NA切割曱型流感病毒細胞受體的末端唾液酸殘基並參與成熟病毒粒子的釋放散播；它也可能對病毒初始進入有貢獻。抗原轉變和漂移曱型流感病毒基因組的節段化有利於毒抹之間在兩種或多種毒抹感染相同細胞時的重配。重配可以產生重大遺傳變化，稱作抗原轉變。相反，抗原漂移是具有細微遺傳性變化的病毒抹的累積，其中所述的細微遺傳性變化主要是HA和NA蛋白中的胺基酸置換。由病毒編碼的RNA依賴性RNA聚合酶複合體進行的曱型流感病毒核酸複製是相對易出錯的，並且RNA基因組中的這些點突變(每個複製循環-l/104)是漂變的主要遺傳性變異源。選擇作用有利於具有涉及HA和NA蛋白的抗原轉變和漂移的人曱型流感病毒毒林，因為這些毒林能夠逃避來自先前感染和接種的中和抗體。這種選擇作用造成辛亞型(轉變)或相同病毒亞型(漂移)的病毒性再感染。抗原轉變造成二十世紀三次主要曱型流感病毒大流行，包括1918H1N1(西班牙流感)、1957H2N2(亞洲流感)和1968H3N2(香港流感)暴發。抗原漂移是流感流行的年度特徵。這還解釋了基於中和抗體的曱型流感病毒接種效力降低對於特定亞型，若接種中所用的HA蛋白的胺基酸序列不匹配流行期間遭遇的HA蛋白的胺基酸序列，抗體中和作用可能是無效的。組織嗜性的決定子甲型流感病毒HA對宿主細胞表面上整合型糖蛋白或糖脂的結合特異性似乎是特定曱型流感病毒亞型是否可以感染人的關鍵決定因素。禽流感病毒，如H5N1亞型，偏好性地結合至細胞表面受體，其中所述的細胞表面受體由與糖蛋白或糖脂的倒數第二個半乳糖殘基以2-3連接(NeurAc(a2-3)Gal)的末端唾液酸組成。相反，人系病毒，包括從1918年、1957年和1968年大流行早期分離的人系病毒，結合至其中這些末端唾液酸-半乳糖殘基具有2-6連接(NeurAc(a2-6)Gal)的受體。鳥和人的呼吸道上皮分別主要表達具有唾液酸的2-3連接和2-6連接的曱型流感病毒受體。載體啟動子和表達系統本發明包括併入一個或多個在本文中所述核酸序列的重組構建體。此類構建體任選地包括其中已經以正方向或反方向插入例如包含禽H5框架或其亞序列等的本發明一個或多個多核苷酸序列的載體，例如質粒、粘粒、噬菌體、病毒、細菌人工染色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)等，其中所述的多核苷酸序列例如包含禽H5框架，所述的禽H5框架包含了改變如本文中所述受體特異性的至少一種突變。例如，插入的核酸可以包含病毒染色體序列或cDNA，所述的病毒染色體序列或cDNA包括本發明的至少一種多核苷酸序列的全部或部分。在一個實施方式中，所述構建體還包含與所述序列有效連接的調節序列，包括例如啟動子。種類眾多的合適載體和啟動子是本領域技術人員已知的並且是市售的。可以在適於產生有義或反義RNA和任選地產生多肽(或肽)表達產物(例如本發明的血凝素分子或其片段)的多種載體之任一者中包含本發明的多核苷酸。此類載體載體包括染色體、非染色體和合成性DNA序列，例如SV40的衍生物；細菌質粒；噬菌體DNA;杆狀病毒；酵母質粒；從質粒與噬菌體DNA的組合中衍生的載體、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒、腺病毒、腺聯病毒、逆轉錄病毒和眾多其它載體(例如pCMV/R)(Barouch等2005病毒學雜誌(JVirol)79:8828-8834)。可以使用能夠將遺傳材料導入細胞並且若需要複製則可在相關宿主內複製的任意載體。在表達載體中，目的HA多核苷酸序列以物理方式在距離和方向上與合適轉錄控制序列(例如啟動子和任選地一個或多個增強子,)排列以指導mRNA合成。也就是說，目的多核苷酸序列有效地與適宜的轉錄控制序列連接。此類啟動子的實例包括LTR或SV40啟動子、大腸桿菌lac或trp啟動子、噬菌體XPj^啟動子和已知可控制基因在原核或真核細或其病毒中表達的其它啟動子。多種啟動子適用於表達載體中以調節流感病毒基因組節,爻序列的轉錄。在某些實施方式中，使用細胞巨化病毒(CMV)DNA依賴性RNA聚合酶II(PolII)啟動子。根據需要，例如為調節條件表達，可以取代以在指定條件下或在指定組織或細胞中誘導RNA轉錄的其它啟動子。眾多病毒啟動子和哺乳動物啟動子例如人啟動子，是可獲得的或可以根據構思的具體應用加以分離。例如，從動物和人病毒的基因組中獲得的備選啟動子包括此類啟動子，如腺病毒(如腺病毒2)、乳頭瘤病毒、B型肝炎病毒、多瘤病毒和猴病毒40(SV40)以及多種逆轉錄病毒的啟動子。哺乳動物啟動子包括其中所屬的肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等。轉錄任選地通過包含增強子序列而增加。增強子一般是同啟動子協調發揮作用以增加轉錄的短的(例如10-500bp)、順式作用DNA元件。眾多增強子序列已經從哺乳動物基因(血紅蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰島素)和真核細胞,病毒中分離。增強子可以被剪接至載體內位於異源性編碼序列的5'或3'，但是通常插入啟動子的5'部位。通常，選擇啟動子和根據需要選擇額外的轉錄增強序列以優化在待導入所述異源性DNA的宿主細胞類型中的表達。任選地，所述擴增子也可以含有用於翻譯起始的核糖體結合位點或內部核糖體進入位點(IRES)。本發明的載體也有利地包含終止轉錄和為穩定mRNA所必需的序列，如聚腺苷酸化位點或終止子序列。此類序列通常可從真核或病毒DNA或cDNA的3'非翻譯區及偶爾5'非翻譯區獲得。在一個實施方式中，牛生長激素終止子可以提供聚腺苷酸化信號序列。此外，如上所述，所述表達載體任選地包含一個或多個選擇標記基因以提供用於選擇已轉化宿主細胞的表型性狀，除了先前所列的基因之外，標記如如二氫葉酸還原酶或卡那黴素抗性適用於真核細胞培養中的選擇。含有如上所述適宜核酸序列以及適宜啟動子或控制序列的載體可以用來轉化可允許所述蛋白質表達的宿主細胞。儘管本發明的載體可以在細菌細胞中複製，然而常常需要將它們導入哺乳動物細胞，例如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞，或用於表達目的的其它細胞等。額外表達元件最常見地，編碼流感病毒HA蛋白的基因組節段包括對其表達(包括翻譯成功能性病毒蛋白)必需的任意額外序列。在其它情況下，可以使用編碼病毒蛋白例如HA蛋白的微型基因或其它人工構建體。在如此情況下，再次地，常常需要包含輔助所述異源性編碼序列高效翻譯的特定起始信號。這些信號可以包括例如ATG起始密碼子及鄰近序列。為確保完整插入物的翻譯，將起始密碼子相對於病毒蛋白插在正確的開放閱讀框內。外源性轉錄性元件和起始密碼子可以具有多種來源，無論是天然的或合成的。表達效率可以通過包含適宜於所用細胞系統的增強子予以增強。根據需要，編碼額外表達的元件如信號序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序列可以併入載體，通常符合於目的多核苷酸的開放閱讀框，例如其目的是將多肽表達靶向所需的細胞區室或細胞器或指導多肽分泌至周質間隙或進入細胞培養基。此類序列是技術人員已知的，並且包括分泌前導肽、細胞器定向序列(例如核定位序列、ER停留信號、線粒體轉移序列)、膜定位/錨定序列(例如終止轉運序列、GPI錨定序列)等。在需要翻譯由本發明核酸序列編碼的多肽時，額外的特異性翻譯起始信號可以改善翻譯效率。這些信號可以包括例如ATG起始密碼子和鄰近序列、IRES區等。在一些情況下，例如，將包含編碼序列的全長cDNA分子或染色體節段、翻譯起始密碼子和相關序列元件插入同時具有目的多核苷酸序列的適宜表達載體，其中所述的編碼序列併入例如本發明的多核香酸序列(例如在本文的序列中)。在這類情況下，往往不需要額外的翻譯控制信號。然而在其中僅插入多肽編碼序列或其部分的情況下，經常提供例如包括ATG起始密碼子在內的外源性翻譯控制信號以表勤目關序列。所述起始密碼子置於正確的開放閱讀框中以確保目的多核苦酸序列的轉錄。外源性轉錄性元件和起始密碼子可以具有多種來源，無論是天然的或合成的。表達效率可以通過包含適宜於所用細胞系統的增強子予以增強。細胞培養和表達宿主本發明也涉及以本發明載體導入(轉導、轉化或轉染)的宿主細胞並涉及通過重組技術產生本發明的多肽。宿主細胞用載體如本發明的表達載體進行基因改造(即轉導、轉化或轉染)。如上所述，所述載體可以是質粒、病毒顆粒、噬菌體等形式。適宜表達宿主的實例包括細菌細胞，如大腸桿菌、鏈黴菌(Streptomyce)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium);真菌細胞如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴#々德、畢赤酵母(Pichiapastoris)和鏈孑包黴(Neurosporacrassa);或昆蟲糹田月包i口果蟲龜(Drosophila)和草i也貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。通常使用哺乳動物細胞來培養本發明的HA分子。用於複製本文中HA序列的合適宿主細胞包括例如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞和COS細胞、包括ing293T細胞、COS7細胞等。細胞一般在補充有血清(例如10%胎牛血清)的標準商業培養基如Dulbecco改良Eagle培養基或無血清培養基中，在適用於維持中性緩衝pH(在7.0-7.2之間的pH上)的受控溼度和C02濃度下培養，任選地，所述培養基含有防止細菌生長的抗生素(例如青黴素、鏈黴素等)和/或額外的營養物(如L-穀氨醯胺、丙酮酸鈉、非必需胺基酸)、促進有利的生長特徵的額外補充物，例如胰蛋白酶、P-巰基乙醇等。工程化的宿主細胞可以在常規營養培養基中培養，其中所述的常規營養培養基根據需要進行改良以激活啟動子、選擇轉化體或擴增所插入的多核苷S^f列。培養條件如溫度、pH等一般是先前隨所選用於表達的特定宿主細胞使用員而言和在本文中引用的參考文獻中是顯而易見的，所述的參考文獻Sambrook等，《分子克,隆實驗手冊第三版》(MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.))，第1-3巻，冷泉港實驗室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港(ColdSpringHarbor)，紐約(NewYork)，2001("Sambrook")和F.M.Ausubel等編輯《分子生物學最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),才各4木出片反十辦會公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)和約翰威利國際出版公司(JohnWiley&Sons,Inc.)間的合資公司CurrentProtocols("Ausubel")。此外，此類方法中適應於本發明的變體通過例行實驗可輕易確定並且是本領域技術人員所熟悉的。在哺乳動物宿主細胞中，可以使用眾多的表達系統如基於病毒的系統。在其中使用腺病毒作為表達載體的情況下，編碼序列任選地連接至由晚期啟動子和三聯體前導序列組成的腺病毒轉錄/翻譯複合體。在該病毒基因組的非必需性El或E3區內的插入將產生能夠在感染的宿主細胞中表達目的多肽的活病毒。此外，可以使用轉錄增強子如羅氏肉瘤病毒(RSV)增強子，來提高在哺乳動物宿主細胞中的表達。任選地因其調節插入序列的表達或以想要的方式加工所表達蛋白質的能力而選擇宿主細胞抹。對蛋白質的此類修飾包括，但不限於乙醯化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和醯化。將蛋白質的前體形式切割至成熟形式的翻譯後加工有時對於正確插入、摺疊和/或功能是重要的。此外，在宿主細胞中的正確定位(例如在細胞表面上)也是重要的。不同宿主細胞如COS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7等具有特定細胞裝置和特徵性機制用於此類後加工活性，並且可以進行選擇以確保當前導入的外來蛋白質的正確修飾和加工。任選地，使用穩定表達系統以長期高率地產生重組蛋白，其中所述的重組蛋白由本發明的多核苷酸編碼或具有由所述多核苦酸序列編碼的亞序列。例如，穩定表達本發明多肽的細胞系使用含有病毒複製起點或內源表達元件以及選擇標記基因的表達載體轉染。例如，在導入載體後，使細胞在豐富培養基中生長1-2日，隨後將它們轉移至選擇性培養基內。選擇性標記的目的是賦予選擇抗性，並且選擇標記的存在允許培育及回收成功表達所導入序列的細胞。因此，穩定轉化的細胞(例如從單一細胞類型衍生)的抗性團簇可以使用適於所述細胞類型的組織培養^t支術增殖。用編碼本發明多肽的核香酸序列轉化的宿主細胞任選地在適於表達並從細胞培養中回收所編碼蛋白質的條件下培養。可以分選、分離和/或純化表達所述蛋白質的細胞。由重組細胞產生的蛋白質或其片段可以是分泌的、膜結合的或在細胞內停留，這取決於所用的序列(例如取決於編碼膜停留信號或其它等的融合蛋白)和/或載體。對應於本發明核酸的表達產物也可以在非動物細胞如植物、酵母、真菌、細菌等中產生。參考上述的Sarnbrook和Ausubel。在細菌系統中，根據所表達產物的預期用途，可以選擇多種表達載體。例如，當需要大量多肽或其片段以產生抗體時，有利地使用指導可輕易純化的融合蛋白高水平表達的載體。此類載體包括，但不限於多功能大腸桿菌克隆及表達載體，如BLUESCRIPT(美國斯特瑞塔基因(Stmtagene));pIN載體；pET載體等，其中在所述BLUESCRIPT內的目的編碼序列(例如包含本文中找到的那些序列等的序列)可以連接至該載體內與用於氨基端翻譯的序列處於同一個開放閱讀框，其中所述的氨基端翻譯始自曱硫氨酸和P-半乳糖苷酶的後續7個殘基，從而產生具有催化活性的(3半乳糖苷酶融合蛋白。類似地，在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，含有組成型或誘導型啟動子如a因子、醇核酸雜交可以使用比較雜交法來鑑定本發明的核酸，包括本發明核酸的保守性變異。這種比較雜交法是區別本發明核酸的優選方法。此外，在高、超高和超超高嚴格性條件下與由序列代表的核酸雜交的靶核酸是本發明的特徵。此類核酸的實例包括與給定核酸序列相比具有一個或數個沉默性或保守性核酸置換的那些核酸。聲稱試驗輩巴核酸與探針核酸特異性雜交，此時所述靶核酸如雜交至完全匹配性互補靶那樣，以如此信噪比與所述探針充分雜交至少50%,其中所述的信噪比是所述探針在這樣的條件下與所述靶雜交時的信噪比的至少一半，其中在所述的條件下前述完全匹配性探針以這樣的信噪比與所述完全匹配性互補靶結合，該信噪比是對雜交至任意非匹配性靶核酸時所觀察到的信噪比的至少約5倍-10倍。核酸在其結合時通常在溶液中"雜交"。核酸因多種充分表徵的物理化學力如氫鍵結合作用、溶劑排斥作用、鹼基推疊作用等雜交。用於核酸雜交的多種方法是本領域眾所周知的。在上述的Sambrook和Ausubel中存在針對核酸雜交的一般指導。用於具有100個互補殘基的互補性核酸在DNA印跡法或RNA印跡法中的濾膜上雜交的嚴格雜交條件實例是在42。C於含有1mg肝素的50%福馬林內過夜實施雜交。嚴格洗滌條件的實例包括用0.2xSSC在65'C洗滌15分鐘。低嚴格性洗滌往往先於高嚴格性洗滌以出去背景探測信號。低嚴格性洗滌的實例是2xSSC在4(TC持續15分鐘。通常，在特定雜交測定法中比對於不相關探針所觀察到的信噪比高5倍(或更高)的信噪比表示^r測到特異性雜交。在雜交後，不雜交的核酸可以通過一系列洗液去除，所述洗液的嚴格性可以根據想要的結果進行調節。低嚴格性洗滌條件(例如使用更高的鹽濃度和更低的溫度)提高敏感性，但可以產生非特異性雜交信號和高背景信號。更高的嚴格性條件(例如使用更低的鹽濃度和與Tm更接近的更高溫度)降低所述背景信號，而一般主要留下特異性信號。"嚴格性雜交洗滌條件"在核酸雜交實驗如DNA印跡雜交和RNA印跡雜交的上下文中是序列依賴性的，並且在不同環境參數下是不同的。嚴格性雜交條件和洗滌條件可以對任意試驗核酸以實驗方式容易地確定。例如，在確定高度嚴格性雜交條件和洗滌條件中，逐步提高雜交條件和洗滌條件(例如在雜交或洗滌中通過提高溫度、降低鹽濃度、提高去垢劑濃度和/或提高有機溶劑(如福馬林)的濃度)，直至滿足所選的一組標準。例如，逐步提高雜交條件和洗滌條件直至探針以這樣的信噪比與完全匹配性互補靶結合，其中所述的信噪比是對前述探針雜交至非匹配性靶時所觀察到的信噪比的至少5倍。通常，在特定雜交測定法中比對於不相關探針所觀察到的信噪比高至少2倍(或更高，例如至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍)的信噪比表示檢測到特異性雜交。在本發明的上下文中檢測到兩個序列之間的至少嚴格性雜交表示與例如本發明核酸的相對強的結構相似性。選擇"極嚴格，，條件以等同於特定探針的解鏈溫度(Tm)。Tm是(在定義的離子強度和pH下)50%試驗序列與完全匹配性探針雜交的溫度。出於本發明的目的，通常，選擇"高度嚴格"雜交條件和洗滌條件以低於所述具體序列在定義的離子強度和pH上(如下文所述，高度嚴格性條件也可以以比較性術語提及)的Tm約5°C。可以在嚴格條件或高度嚴格性條件下鑑定與目的核苷酸序列(例如"探針")密切相關或相同的靶序列。更低嚴格性條件適用於互補性較低的序列。"超高嚴格性"雜交條件和洗滌條件是這樣的條件，其中提高雜交條件和雜交至任意非匹配性靶核酸時所觀察到M/信噪比的至少10倍。將此類條件下以這樣的信噪比與探針雜交的靶核酸稱作在超高嚴格性條件下與所述探針雜交，其中所迷的信噪比是完全匹配性互補靶核酸的信噪比的至少50%。在嚴格性或高度嚴格性雜交(或甚至更嚴格性雜交)條件和洗滌條件中，逐步提高雜交條件和洗滌條件(例如在雜交或洗滌中通過提高溫度、降低鹽濃度、提高去垢劑濃度和/或提高有機溶劑(如福馬林)的濃度)，直至滿足所選的一組標準。例如，根據需要，逐步提高雜交條件和洗滌條件，直至包含本發明的一個或多個多核苷酸序列(例如選自本文所給出那些多核苷酸序列的序列或亞序列和/或其互補性多核苷酸序列)的探針以這樣的信噪比與完全匹配性互補耙(再次，所述的耙是包含一種或多種核酸序列或選自本文所給出那些多核苷酸序列中的亞序列和/或其互補性多核苷酸序列)結合，其中所述的信噪比是對前述探針雜交至非匹配性靶(例如包含選自在提交時於公共資料庫如GenBank內存在的已知流感病毒序列當中的一個或多個序列或亞序列的多核苷酸序列，和/或其互補性多核苷酸序列)時所觀察到的信噪比的至少2倍(和任選5倍、10倍、100倍或更多倍)。類似地，甚至更高水平的嚴格性可以通過逐步提高相關性雜交測定法的雜交條件和/或洗滌條件而確定，例如這樣的雜交測定法，其中提高雜交條件和洗滌條件的嚴格性，直至揮:針與完全匹配性互補靶核酸結合的信噪是對雜交至任意非匹配性把核酸時所觀察到的信噪比的至少至少10倍、20倍、50倍、100倍，或500倍或更多倍。具體的信號將取決於相關性測定法中所用的標記物，例如螢光標記物、比色標記物、放射性標記物等。將此類條件下以這樣的信噪比與探針雜交的靶核酸稱作在超超高嚴格性條件下與所述探針雜交，其中所述的信噪比是完全匹配性互補靶核酸的信噪比的至少二分之一。目的生物分子的克隆、誘變和表達適用於本發明的分子生物學技術如克隆\突變\細胞培養等的通用教材描述包括上文的Sambrook和Ausubel。這些教材描述誘變、載體用途、啟動子和例如涉及產生HA分子等的眾多其它相關主題。在本發明中任選使用多種類型的誘變，例如旨在產生和/或分離例如新的或新分離的HA分子和/或旨在進一步修飾/突變本發明的多肽(例如HA分子)。所述誘變包括但不限於位點定向誘變、隨機點突變、使用含尿嗜啶的模板的誘變、寡核苷酸定向誘變、硫代磷酸酯修飾的修飾的DNA誘變、使用帶缺口的雙鏈體DNA的誘變等。其它合適的方法包括點錯配修復、使用修復缺陷型宿主菌抹的誘變、限制作用-選擇作用和限制作用-純化作用、缺失誘變、通過基因總合成的誘變、雙鏈斷裂修復等。在一個實施方式中，可以通過天然存在分子或改變或突變的天然存在分子的已知信息例如序列、序列比較結果、物理屬性、晶體結構等指導誘變。寡核苦酸，例如用於本發明誘變(例如致本發明HA分子突變或改變本發明HA分子的誘變)中的寡核苷酸,如Needham-VanDevanter等在1984《核酸研究》(NucleicAcidsRes)12:6159-6168中所述，一般根據Beaucage和Caruthers1981四面體快報(TetrahedronLetts)22:1859-1862描述的固相亞磷醯胺三酯方法，例如使用自動合成儀化學地合成。此外，基本上任意的核酸可以從任意的多種商業來源自行訂購或以標準方式訂購。本發明也涉及包含本發明的HA分子或其它多肽和/或核酸或在多種載體等當中的此類HA或其它序列的宿主細胞和生物。宿主細胞用本發明的載體進行基因改造(例如轉化、轉導或轉染)，所述載體例如可以是克隆載體或表達載體。所述載體可以例如處於質粒、細菌、病毒、棵多核苷酸或綴合的多核苷酸形式。載體通過標準方法導入細胞和/或微生物，所述標準方法包括電穿孔法、病毒載體感染法、在小珠或顆粒的基質內部或表面攜帶核酸的小顆粒高速射彈穿透法。上述的Sambrook和Ausubel提供了多種適宜的轉化方法。幾種將靶核酸導入細菌細胞的熟知方法是可獲得的，其中任意者可以在本發明中使用。這些方法包括受者細胞與含有DNA的細菌原生質體融合法、電穿孔法、拋射體轟擊法和病毒載體感染法等。細菌細胞可以用來放大含有本發明DNA構建體的質粒數目。所述細菌培育致對數期並且該細菌內的質粒可以通過本領域已知的多種方法(例如參見Sambrook)分。此外，用於從細菌中純化質粒的多種試劑盒是市售的。隨後進一步操作分離和純化的質粒以產生其它質粒，後者用來轉染細胞或引入相關載體以感染生物。常見載體含有轉錄及翻譯終止子、，轉錄和翻譯起始序列和用於調節特定靶核酸表達的啟動子。所述載體任選地包含類屬性表達盒，該表達盒含有至少一個獨立的終止子序列、允許該表達盒在真核生物或原核生物或者兩類生物中複製的序列(例如穿梭載體)和用於原核及真核系統的選擇標記。載體適用於在原核生物或真核生物或者優選這兩類生物中複製和整合。見，Sambrook和Ausubel(上文)。例如在網際網路網址ATCC.org處，提供用於克隆的細菌和噬菌體目錄。用於測序、克隆的其它基礎方法和分子生物學其它方面以及基礎性理論考慮也存在於Watson等(1992)重組D萌Re隱bi腿tDNA)第二版科學美國出版社(ScientificAmericanBooks),紐約(NY)。多肽的產生和回收在一些實施方式中，在轉導合適的宿主細胞系或菌抹並且將所述宿主細胞培育至適宜細胞密度後，所選擇的啟動子通過合適方法(例如溫度轉變或化學誘導)誘導並且將細胞培養額外一段時間。在一些實施方式中，隨後從培養基中回收分泌型多肽產物，例如作為分泌型融合蛋白形式的HA多肽等。或者，細胞可以通過離心法收穫、通過物理或化學方法破碎，並且留下所得的粗提物用於進一步純化。用於表達蛋白質的真核細胞或微生物細胞可以由任意的常規方法破碎，所述的常規方法凍融循環法、超聲波處理法、機械破碎法或使用細胞裂解劑或本領域技術人員熟知的其它方法。此外，表達本發明HA多肽產物的細胞可以在不從細胞中分離所述多肽的情況下使用。在這種情況下，本發明檢驗(例如因具有HA分子或其片段，例如包括融合蛋白或其它等)。此類細胞也是本發明的特徵。表達的多肽可以通過本領域眾所周知的眾多方法之任意者從重組細胞培養中回收和純化，所述方法包括硫S交銨或乙醇沉澱法、酸提取法、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析(例如使用本領域技術人員已知的任意標籤系統)、羥基磷灰石層析和凝集素層析。蛋白質再摺疊步驟可以根據需要在完成成熟蛋白質的構象中使用。高效液相色譜層析(HPLC)也可以在最終純化步驟中使用。或者，可以使用無細胞轉錄/翻譯系統來產生包含本發明胺基酸序列或亞序列的多肽。眾多合適的體外轉錄和翻譯系統是市售的。體外轉錄和翻譯方法的一般指南存在於Tymms(1995)分子生物學方法第37巻體外轉錄和翻譯操作(InvitroTranscriptionandTranslation'Protocols:MethodsinMolecularBiologyVolume37),花環出版社(GarlandPublishing),紐約(NY)。此外，多肽或其亞序列(例如包含抗原肽的亞序列)可以手工方式產生或通過使用自動化系統，使用固相合成技術通過直接肽合成法產生(見,MerrifieldJ1963美國化學協會雜誌(JAmChemSoc)85:2149-2154)。示例性自動化系統包括應用生物系統(AppliedBiosystems')431A肽合成儀(珀金埃爾默(PerkinElmer),福斯特市(FosterCity),加利福尼亞(CA))。根據需要，亞序列可以單獨修飾的胺基酸本發明表達的多肽可以含有一個或多個修飾的胺基酸。存在修飾的胺基酸可能是有利的，例如在於(a)增加多肽的血清半壽期、(b)降低/增加多肽的抗原性、(c)提高多肽的儲藏穩定性等。胺基酸在重組產生期間例如以共翻譯或翻譯後方式受到修飾(例如在哺乳動物細胞期間在N-X-S/T基序處的N-連接糖基化)或通過人工方法修飾(例如通過PEG化)。修飾的胺基酸的非限制性實例包括糖基化胺基酸、硫酸化胺基酸、異戊烯化(例如法尼基化、雜牛兒基維牛兒基化)胺基酸、乙醯化胺基酸、醯化胺基酸、PEG化胺基酸、生物素化胺基酸、羧化胺基酸、磷酸化胺基酸等，以及通過與例如脂質部分或其它有機衍生化劑綴合加以修飾的一元酸。足以指導修飾胺基酸的參考文獻見於諸多文獻。實例方法存在於Walker(1998)光碟版《蛋白質方法》(蛋白質ProtocolsonCD-ROM)人類出版社(HumanPress)，妥華達Towata,新澤西(NJ)。融合蛋白本發明也提供融合蛋白，其包含本發明(例如編碼HA多肽)的序列或其片段與例如免疫球蛋白(或其部分)、編碼例如GFP(綠色螢光蛋白)或其它類似標記的序列等的融合物。編碼此類融合蛋白的核苷^f列是本發明的另一個方面。本發明的融合蛋白任選用於例如與本發明的非融合蛋白相似的應用(包括如本文中所述的例如治療性、預防性、診斷性、實驗性等應用)。除了與免疫球蛋白序列和標記序列融合之外，本發明的蛋白質還任選地例如與將所述融合蛋白靶向特定細胞類型、區域等的序列融合。抗體本發明的多肽可以用來產生對本文中所給出多肽或由本發明的多核苷酸編碼的多肽具有特異性的抗體，如本文中所示的那些抗體，及其保守性變體。對上述多肽特異的抗體例如用於診斷性和治療性目的，例如涉及靶多肽的活性、分布和表達。例如，此類抗體可以任選地用來在與本文HA序列相同的毒抹中定義其它病毒。對本發明多肽特異的抗體可以通過本領域眾所周知的方法產生。此類抗體可以包括，但不限於多克隆、單克隆、嵌合、人源化、單鏈、Fab片段和由Fab表達文庫產生的片段。對於產生抗體而言多肽不需要具有生物學活性(例如不需要全長有功能的血凝素)。然而，多肽或寡肽必須是抗原肽。用來誘導特異性抗體的肽一般具有含至少約4個胺基酸且往往含至少5個或10個胺基酸的胺基酸序列。多肽短段可以與另一種蛋白質(如匙孔血藍蛋白)和針對所述嵌合分子產生的抗體融合。用於產生多克隆和單克隆抗體眾多多方法是本領域技術人員已知的，和可以加以調整以產生對本發明的和/或本發明多核苦酸序列編碼的多肽具有特異性的抗體。見，例如Harlow和Lane(1988)《抗體實'瞼手冊》(Antibodies:ALaboratoryManual)冷泉港出版社，紐約(ColdSpringHarborPress,NY);和Kohler及Milstein(1975)自然(Nature)256:495-497。用於抗體製備的其它適用技術包括選擇噬菌體或相似載體中的重組抗體文庫。見，Huse等1989科學(Science)246:1275-1281;和Ward,等1989自然(Nature)341:544-546。特異性單克隆和多克隆抗體以及抗血清通常將以例如至少約O，l|lM、至少約0.01fiM或更佳並且一般至少約0.001或更佳的KD結合。對於特定治療性應用，需要人源化抗體。用於製備嵌合(人源化)抗體的詳細方法可以在美國專利5,482,856中找到。關於人源化和其它抗體產生法的額外細節以及工程化技術可以在專利和科學文獻中找到。通過免疫反應性定義多肽因為本發明的多肽提供多種新多肽序列(例如包含HA分子，)，故所述多肽也產生可以識別、例如在免疫學測定中可識別的新結構特徵。產生特異性結合本發明多肽的抗血清和由此類抗血清結合的多肽是本發明的特徵。例如，本發明包括特異性地結合於或特異性地與抗體或抗血清發生免疫反應的多肽(例如HA分子)，所述的抗體或抗血清針對包含選自本文所給出一個或多個序列中的胺基酸序列等的免疫原產生。為消除與其它同系物的交叉反應性，以提交時在公共資料庫中存在的HA分子如"對照"多肽扣減所述抗體或抗血清。在其餘對照序列對應於核酸的情況下，產生由該核酸編碼的多肽並用於抗體/抗血清扣減目的。在一種常見形式下，所述免疫測定法使用了針對一種或多種多肽所產生的多克隆抗血清，其中所述的多肽包含與本文序列等相對應的一個或多個序列或其絕大部分亞序列(即所提供全長序列的至少約30。/。)。得自本發明序列的成套多種多肽免疫原在下文中整體地稱作"免疫原性多肽"。任選地選擇所得抗血清以與對照血凝素類似物具有低交叉反應性，並且任何此類交叉反應性在所述免疫測定法中使用多克隆抗血清之前例如通過免疫吸附加以消除。為了產生用於免疫測定法中的抗血清，如本文所述產生並純化一種或多種所述免疫原性多肽。例如，可以在重組細胞中產生重組蛋白。將小鼠近交系(在本測定法中使用，原因是結果由於小鼠的虛擬遺傳同一性而具有更多可重複性)免疫以與標準佐劑如弗氏佐劑聯合的免疫原性蛋白和小滑鼠準免疫程序(對於抗體產生、免疫測定模式和可以用來確定特異免疫反應性的條件的標準描述，見例如Harlow和Lane(1988)《抗體實驗手冊》(Antibodies:ALaboratoryManual)冷泉港出版社，紐約(ColdSpringHarborPress,NewYork))。其它參考文獻和對抗者，從本文公開的序列中衍生的一種或多種合成多肽或重組多肽與載體蛋白綴合併且用作免疫原。將多克隆血清收集並在免疫測定法(例如具有固定在固相支持物上的一種或多種所述免疫原性蛋白的固相免疫測定法)中針對所述免疫原性多肽進^f亍滴定。將具有106或更高滴度的多克隆抗血清選出、匯集並用對照血凝素多肽扣減以產生扣減的匯集滴定的多克隆抗血清。所述扣減的匯集滴定的多克隆抗血清在比較性免疫測定法中測試針對所述對照同系物的交叉反應性。在這種比較測定法中，對所述扣減滴定的多克隆抗血清確定區分性結合條件，所述的區分性結合條件產生與結合至所述對照同系物時的信噪比相比，至少約5-10倍更高的所述滴定多克隆抗血清與所述免疫原性多肽結合的信噪比。即，結合反應的嚴格性通過添加非特異性竟爭物如白蛋白或脫脂乳和/或通過調節鹽條件、溫度和/或其它因素等進行調節。這些結合條件在後續測定法中使用以確定試驗多肽(與所述免疫原性多肽和/或所述對照多肽比較的多肽)是否特異性地被所述匯集的扣減多克隆抗血清結合。尤其，與對照等相比，如此試驗多肽與所述免疫原性多肽共有明顯的結構相似性並且因此是本發明的多肽，其中所述的試驗多肽在區分性結合條件下顯示比對照同系物高至少2-5倍的信噪比，和與所述免疫原性多肽相比至少約1/2的信噪比。在另一個實例中，使用竟爭性結合模式下的免疫測定法以檢測試驗多肽。例如，如所述，將交叉反應性抗體用對照多肽通過免疫吸附作用從匯集的抗血清混合物中除去。所述免疫原性多肽隨後固定至固相支持物，所述固相支持物暴露於所述扣減匯集的抗血清。將試驗蛋白添加至測定法，以竟爭對所述扣減匯集的抗血清的結合作用。所述試驗蛋白與所述固定蛋白質相比而竟爭對所述扣減匯集抗血清結合的能力同添加至測定法中的免疫原性多肽竟爭結合作用的能力進行比較(所述免疫原性多肽有效地同固定的免疫原性多肽竟爭對匯集抗血清的結合作用)。使用標準計算法計算所述試驗蛋白的交叉反應性百分數。在平行測定法中，與所述免疫原性多肽竟爭對所述抗血清結合的能力相比較，任選地測定所述對照蛋白質竟爭對所述扣減匯集抗血清結合的能力。再次地，使用標準計算法計算所述對照多肽的交叉反應性百分數。在所述試驗多肽的交叉反應性百分數比對照多肽高至少5-10倍並且所述試驗多肽的結合作用大致處在所述免疫原性多肽的結合作用範圍內時，則稱所述試驗多肽與所述匯集扣減的抗血清特異性結合。通常，免疫吸附且匯集的抗血清可以在如本文中所述的竟爭性結合免疫測定法中使用以將任意試驗多肽與所述免疫原性多肽和/或對照多肽比較。為了開展這種比較，所述免疫原性多肽、試驗多肽和對照多肽分別在廣泛濃度範圍內進行分析，並且使用標準技術確定每種多肽的如此量，其是抑制所述扣減抗血清對例如固定的對照蛋白、試驗蛋白或免疫原性蛋白的50%結合作用所需要的。若該試驗多肽對於在所述竟爭性測定法中結合所需的量比所述免疫原性多肽所需的量少兩倍，則稱所述試驗多肽特異性地與針對所述免疫原性蛋白所產生的抗體結合，前提是所述的量比對照多肽的量高至少約5-10倍。作為特異性的額外測定，匯集的抗血清任選地用所述免疫原性多肽(而非所述對照多肽)充分地免疫吸附，直至很少檢測到或檢測不到所得的經免疫原性多肽扣減的匯集抗血清對免疫吸附中所用免疫原性多肽的結合作用。隨後用所述試驗多肽測試這種充分免疫吸附的抗血清的反應性。若觀察到很少反應性或觀察不到反應性(即對這種充分免疫吸附的抗血清與所述免疫原性多肽的結合作用觀察到不超過2倍的信噪比)，則所述試驗多肽被所述免疫原性蛋白激發的抗血清特異性結合。核酸和多肽序列變體如本文中所述，本發明為核酸提供多核香S吏序列並且對多肽提供胺基酸序列，例如血凝素序列，以及例如包含所述序列的組合物和方法。所述序列的實例在本文中披露。然而，本領域技術人員將理解本發明實際上不限於本文中披露的那些序列並且本發明也提供具有如本文中所述功能(例如編碼HA分子)的眾多相關和不相關序列。技術人員將理解眾本發明中包括所披露序列的多種變體。例如，發明中包括所披露序列的保守性變異，其中所述的保守性變異產生功能相同的序列。認為本發明中包括核酸多核苷酸序列的如此變體，其中所述變體與至少一種所披露序列雜交。本發明中也包括本文所披露序列的亞序列沉默變異因遺傳密碼子的筒並性，任選地產生任意的編碼本發明多肽的多種核酸序列，其中某些核酸序列可以對本文中的HA核酸序列和多肽序列具有更低水平的序列同一性。指示遺傳密碼子的密碼子表存在於多種生物學和生物化學教材中。此類密碼子表顯示多種胺基酸由多於一種密碼子編碼。例如，密碼子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均編碼精氨酸。因此，在本發明核酸中由密碼子指定精氨酸的每個位置內，該密碼子可以變更為任意的上文所述相應密碼子，而不改變所編碼的多肽。應當理解RNA序列中的U對應於DNA序列中的T。此類"沉默變異"是下文討論的"保守性修飾變異"的一個類型。技術人員知道核酸中的每種密碼子(通常僅作為甲硫氨酸的密碼子的ATG和通常僅作為色氨酸的密碼子的TTG例外)可以通過標準技術加以修飾，以編碼功能相同的多肽。因此，在任意所述序列中內在地包括編碼多肽的核酸的每種沉默變異。因而，本發明毫無疑問地提供編碼本發明多肽的核酸序列的每種和各種可能的變異，其中可以通過選擇基於密碼子可能選項(包括人偏好性密碼子)的組合而產生所述變異。這些組合根據如適用於編碼本發明血凝素多肽的核酸序列的標準三聯密碼子而產生。通過考慮與遺傳密碼子相結合的序列，具體地提供和描述本文每種核酸的全部此類變異。使用本文中的方法，技術人員完全能夠使用本文方法產生這些沉默型置換。保守性變異鑑於遺傳密碼子的簡併性，"沉默型置換"(即核酸序列中不導致所編碼多肽中變更的置換)是編碼胺基酸的本發明每種核酸序列的暗含特徵。類似地，在胺基酸序列中的一個或幾個胺基酸內，"保守性胺基酸置換"以具有高度相似屬性的不同胺基酸取代，也因極其相似於披露的構建體如本文中的那些構建體而輕易地得以鑑定。所披露的每種序列的此類保守性變異是本發明的特徵。特定核酸序列的"保守性變異"指編碼相同或基本上相同胺基酸序列的那些核酸，或在所述核酸不編碼胺基酸序列的情況下，指基本上相同的序列，見下表3。技術人員會知道變更、添加或缺失編碼序列中單個胺基酸或小百分比(通常小於5%，更通常小於4%、3%、2%或1%)胺基酸的各個置換、缺失或添加是"保守性修飾變異"，其中所述改變導致缺失胺基酸、以化學相似的胺基酸添加胺基酸或置換胺基酸。因此，本發明所列多肽序列的"保守性變異"包括以相同保守性置換組中保守性選擇的胺基酸置換多肽序列中小百分數的、通常小於5%，更通常小於4%、3%、2%或1%的胺基酸。最終，添加不改變核酸分子編碼活性的序列如添加非功能性序列，是所述基礎核酸的保守性變異。表3.保守性置換組tableseeoriginaldocumentpage47序列比較、同一性和同源性術語"相同"或"同一性"百分數，在兩個或更多個核酸序列或多肽序列的上下文中，指這樣的兩個或更多個序列或亞序列，它們在就最大對應性進行比較時是相同的或具有具有指定百分數的相同胺基酸殘基或核苷酸，所述的最大對應性如使用下文所述的序列比較算法之一(或術人員可獲得的其它算法)或通過目視檢查進行測量。短語"明顯相同"，在兩種核酸或多肽(例如編碼HA分子的DNA或HA分子的胺基酸序列)的上下文中，指這樣的兩個或更多個序列或亞序列，它們在就最大對應性進行比較時具有至少約90%、優選91%、最優選92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更大的核苷酸或胺基酸殘基同一化生，所述的最大對應性如使用序列比較算法或通過目視檢查進行測量。此類"基本上相同的"序列一般^L為"同源的"，而不涉及實際的祖先。優選地，"明顯同一性，，存在於長度至少約200個殘基的胺基酸序列區域內，更優選地存在于于長度至少約250個殘基的區域內，並且最優選地，所述序列在至少約300個殘基、350個殘基、400個殘基、425個殘基、450個殘基、475個殘基、480個殘基、490個殘基、495個殘基、499殘基或500殘基範圍內是明顯相同的，或當所述胺基酸是血凝素或血凝素片段時在兩個待比較的序列的全長範圍內是明顯相同的。對於序列比較和同源性確定，一個序列通常充當試驗序列與之比較的參考序列。當使用序列比較算法時，試驗序列和參考序列輸入計算機，根據需要指定名亞序列坐標，並且指定序列算法程序參數。所述序列比較算法隨後基於指定的程序參數而計算試驗序列相對於參考序列的序列同一性百分數。對於比較的序列最佳比對可以例如通過Sm他和Waterman應用數學進展(AdvApplMath)2:482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch，分子生物學雜誌(JMolBiol)48:443(1970)的同源性比對算法、通過Pearson和Lipman，美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)85:2444(1988)的相似性搜索方法，通過計算機執行算法如在維斯康辛遺傳軟體包-遺傳計算機群(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup),575科學(Science)Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA或通過目視力全查進行。適於確定序列同一性百分數和序列相似性的一個算法實例是BLAST算法，該算法在Altschul等，分子生物學雜誌(JMolBiol)215:403-410(1990)中描述。用於開展BLAST分析的軟體可通過網際網路上在ncbi.nlm.nih.gov處的美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公開地獲得。該算法包括首先通過鑑定查詢序列中長度為W的短字而確定高記分序滿足某些陽性e-值化閾值記分T。T稱作相鄰字記分閾值。這些初始相鄰字命中充當種子用於啟動搜索以找到含有它們的HSP。所述的字命中隨後沿每個序列的兩個方向擴展，只要可以提高累積比對記分。對於核苷酸序列而言，使用參數M(—對匹配殘基的獎勵分；總是X))和N(錯配殘基的罰分；總是<0)計算累積記分。對於氨基S吏序列而言，使用一種記分矩陣來計算所述累積記分。當所述累積比對記分從已實現的最大值跌落達量X;所述累積比對記分因積累一個或多個負向記分的殘基比對結果而至零或以下，或抵達任何一個序列的末尾時，所述字命中在每個方向上的擴展終止。BLAST算法參數W、T和X決定比對的敏感性和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用字長度(W)11、期望(E)10、截值IOO、M=5、N;4和兩條鏈的比較作為默認值。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用字長度(W)3、期望(E)11和BLOSUM62記分矩陣(見，Henikoff和Henikoff(1989)美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)89:10915)。除了計算序列同一性百分數之外，BLAST算法還開展兩個序列之間相似性的統計分析(見，例如Karlin和Altschul，美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)90:5873-5787(1993))。對BLAST算法產生的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N)),其提供兩個序列之間的匹配原本偶爾發生的概率說明。例如，若試驗核酸與所述參考核酸比較的最小總和概率小於約0.1、更優選小於約0.01並且最優選小於約0.001，則認為該核酸與參考序列相似。有用序列比對算法的另一個實例是PILEUP。PILEUP使用漸進配對比對法從一組相關序列中產生多重序列比對結果。它也可以繪製顯示聚類關係的樹狀圖，後者用來產生所述比對結果。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)分子進化雜誌(J.Mol.Evol.)35:351-360的漸進比對法的簡化形式。所用方法與Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153描述的方法相似。該程序可以比對例如至多達300個最大長度5000字母的序列。這種多重比對方法始於兩個最相似序列的配對比對，這產生兩個比對序列的簇。這種蔟隨後可以與下一個最相關的序列或比對序列的簇比較。所述序列的兩個蔟的可以通過配對比對各自兩個序列的簡單延伸加以比對。最終比對通過一系列漸進配對比對而實現。此程序也可以用來繪製聚類關係的樹狀圖或樹狀顯示圖。此程序通過指定特定序列和其相對於序列比較區域的胺基酸或核苷酸坐標而運行。適於多重DNA序列或胺基酸序列比對的額外算法實例是CLUSTALW程序(Thompson,J.D.等(1994)核酸研究(NuclAcidsRes)22:4673-4680)。CLUSTALW執行成組序列之間的多重配對比較並且基於同源性將它們裝配成多重比對結果。空位開口罰分和空位延伸罰分可以例如分別是10和0.05。對於胺基酸比對，可以使用BLOSUM算法作為蛋白質加權矩陣。見，例如Henikoff和Henikoff(1992)美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)89:10915-10919.用於預防性施用疫苗的方法和組合物通常，本發明的實施方式可以按照免疫學有效量並在適宜載體或賦形劑中預防性地施用，以刺激針對如HA序列所決定的一種或多種流感病毒毒抹為特異的免疫應答。通常，所述載體或賦形劑是藥學上可接受的載體或賦形劑，如無菌水、鹽水溶液、緩衝鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其組合。製備保證無菌、pH、等張性和穩定性的此類溶液根據本領域建立的方法進行。一般而言，選擇載體或賦形劑旨在使過敏效應和其它不良效應最小化，並且旨在適合特定施用途徑，例如皮下、肌內、鼻內等。本發明的相關方面提供用於刺激個體免疫系統產生針對流感病毒的保護性免疫應答的方法。在所述方法種，免疫學有效量的本發明實施方式例如本發明的HA分子)、免疫學有效量的本發明多肽和/或免疫學有效量的本發明核酸在生理可用的載體中施用至所述個體。通常，本發明的實施方式以這樣的量施用，所述的量足以刺激針對一種或多種流感病毒毒株(即針對本發明的HA毒抹)為特異的免疫應答。優選地，施用本發明的實施方式激發了針對此類毒抹的保護性免疫應答。用於激發針對一種或多種流感病毒毒株的保護性免疫應答的劑量和方法是本領域技術人員已知的。一般，所述劑量將基於例如年齡、身體條件、體重、性別、施用時間和其它臨床因素在一定範圍內調節。預防性疫苗製劑以全身方式施用，例如使用針頭和注射器或無針頭注射裝置通過皮下或肌內施用。或者，該疫苗製劑以鼻內方式通過滴劑、大顆粒氣霧劑(大於約IO微米)或噴霧劑施用至上呼吸道。儘管上述任意送遞途徑產生全身性保護免疫應答，然而鼻內施用在流感病毒進入部位賦予激發黏膜免疫的額外益處。儘管優選以單次給藥刺激保護性免疫應答，不過可以通過相同或不同突途徑施用額外的劑量以實現想要的預防效果。在新生兒和嬰兒，例如，可以需要多次施用以激發足夠水平的免疫。施用可以在整個兒童期根據需要間隔地不斷進行，旨在維持足夠水平的抗野生型流感感染的保護作用。類似地，特別容易遭受反覆或嚴重流感感染的成人，例如護工、日間護理員、幼童的家庭成員、老年人和心肺功能不足的個體，可能需要多次兔疫以建立和/或維持保護性免疫應答。誘導免疫水平可以例如通過測量中和性分泌抗體和血清抗體的量進行監測，並且根據需要調節劑量或反覆接種以激發和維持所需水平的保護作用。任選地，用於預防性施用本發明實施方式的製劑也含有一種或多種佐劑以增強針對流感病毒抗原的免疫應答。合適的佐劑包括弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化鋁,和表面活性物質如溶血磷脂、複合多元醇(pluronicpolyol)、聚陰離子、肽、油或烴乳液、卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(CorynebacteriumParvum)以及合成佐劑QS-21和MF59。根據需要，本發明實施方式的預防性疫苗施用可以與施用一種或多種免疫刺激分子一起進行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激活性、免疫沉澱活性和促炎活性的多種細胞因子、淋巴因子和趨化因子，如白細胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生長因子(例如粒細胞-巨噬細胞(GM)-集落刺激因子(CSF))和其它免疫刺激分子如巨噬細胞炎性因子、Flt3配體、B7.1;B7.2施用。可以施用蛋白質(例如本發明的HA多肽)或編碼所述蛋白質的表達載體以產生免疫刺激作用。上文所述的方法用於通過將本發明的載體以體外、離體或體內方式導入靶細胞群而治療性和/或預防性地治療疾病或病症，通常是流感，其中所述的載體包含編碼有治療或預防活性的HA多肽(或肽)或HARNA(例如反義RNA或核酶)的異源性多核苷酸。通常，編碼所述多肽(或肽)或RNA的目的多核苷酸有效地連接至適宜的調節序列，例如本文中所述的調節序列。任選地，多於一種異源性編碼序列併入單一載體或病毒。例如，除了編碼有治療或預防活性的HA多肽或RNA的多核香酸之外，所述載體也可以包括額外的治療性或預防性多肽，例如抗原、共刺激分子、細胞因子、抗體等和/或標記等。可以將禽H5HA轉換成人受體特異性的突變禽病毒結合至腸道中具有a2-3連接的唾液酸糖苷，而人適應性病毒對呼吸道中的a2-6連接呈特異性。從a2-3至a2-6受體特異性的轉變是禽病毒適應人宿主過程中的關鍵步驟並且似乎是絕大多數禽流感病毒(包括當前禽H5毒抹)在禽至人感染後不容易從人傳播至人的原因之一。受體結合結構域的結合位點包含三個結構性元件，即a-螺旋(190-螺旋、HA1第190至第197位)和兩個環(130-環，HA1第135-138位和220-環，HA1第221-228位)。眾多保守殘基參與受體結合，這些殘基包括第136、l卯、193、194、216、221、222、225、226、227和228位胺基酸。因此，產生如此問題，即現有H5病毒如何能夠使其HA適應結合至人受體。先前研究已經在Hl、H2和H3血清型中確定參與禽至人受體特異性轉變的眾多關鍵性受體結合結構域突變。例如，發現1918Hl可能僅通過兩個突變(D190E和D225G)而從a2-6受體特異性轉變成經典的禽a2-3特異性。反過來，具有a2-3特異性的禽Hl病毒通過E190D和G225D突變轉變成a2-6特異性(StevensJ等2006科學(Science)312:404-410)。然而，哪種突變有可能調節H5血清型中的受體特異性不是很清楚。在本研究中，我們通過在受體結合結構域中或其周圍產生一系列突變體以探究H5HA是否可能通過突變輕易地適應於人而4企驗了H5病毒的結合和進入條件，其中已知所述的突變在改變Hl血清型中的受體特異性。我們在HA分子中涉及受體特異性的位置處鑑定了胺基酸差異性。分析了Hl血清型和H5血清型之間的結構差異性和遺傳差異性，因為它們似乎比H3HA在結構上更密切地相關。我們的結論是在H1框架上造成禽型轉變至人型特異性的突變也可以在H5禽框架上造成特異性的轉變，從而導致進入人細胞。參考表4，本發明的實施方式是包含至少一種突變的H5禽流感框架，其中所述的突變選自由S136T、E190D、E190N、E190G、K/R193S、K/R193A、K/R193T、K/R193N、L194I、L194F、R216E、S221P、K222W、G225D、G225N、Q226R、Q226L、S227A、S227H、S227P、S227E、S227N和G228S所組成的組中。因此，此類突變提供了一種可能途徑，通過該途徑H5病毒能在人群體中贏得立足點。tableseeoriginaldocumentpage52aA/越南/CL01/2004例外，第190位置是D。bA/Dk/HN/303/2004例外，第193位置是S。三重突變體HA流感病毒進入由其刺突糖蛋白即病毒血凝素(HA)介導，血凝素也是由預防性疫苗激發的保護性中和抗體的靶。H5N1禽流感病毒在結合細胞受體-唾液酸(SA)後進入細胞，其中所述的唾液酸在禽宿主中表現與半乳糖的a-2，3連接。相反，人適應型病毒偏好地利用增加上呼吸道中細胞感染的具有a-2，6連接的SA，這促進人傳播。這裡，我們定義了禽H5N1HA中提高其對人受體的親和力的突變，並且證明這些變化改變了HA對中和抗體的敏感性。結構性和分子遺傳信息允許鑑定到受體結合結構域中增強人細胞進入作用超過IOO倍的位點，並且凝集素抑制法揭示了受體特異性的轉變。限於所述受體結合結構域內的3個點突變，偏好人的HA對抗H5中和抗體具有約10倍的更高抗性。這些突變使得所述HA對H5中和性單克隆抗體不敏感；然而，鑑定到另一種可以中和前述兩種HA的單克隆抗體。H5HA對利用人受體的適應因此改變抗體敏感性，同時它改變受體特異性。這些研究結果提示禽流感病毒的適應性突變可能使得現有疫苗效力更低。然而，這類修飾的HA為治療性抗體以及為新型預防性疫苗提供免疫原，其中所述的預防性疫苗預期在天然人適應型H5N1抹出現之前開發出來。由具有改變的受體結合特異性的禽H5流感病毒血凝素突變體進行免疫HA中的受體結合結構域(RBD)由位於病毒刺突蛋白頂端外表面上的少於300個胺基酸組成(Gamblin，S丄等2004科學(Science)303:1838;Skehel，JJ.和Wiley,D.C.2000生物化學年度評論(AnnuRevBiochem)69:531;Steven、J.等2004科學(Science)303:1866;Steven、J.等2006科學(Science)312:404;Wilson，LA.等1981自然(Nature)289:366)。SA結合作用由以兩條脊作為邊界的腔體(圖4A)介導，所述的腔體由環220(第221位至第228位胺基酸)、環130(第135位至第138位胺基酸)和在第190位至第197位胺基酸處的螺旋狀結構域(編號基於H3A/Aichi/2/68)(Wilson，I.A.等1981自然(Nature)289:366)組成。先前已經描述了Hl、H5和H3HA的結構(Gambling,S丄等2004科學(Science)303:1838;Shekel,J丄和Wiley，D.C.2000生物化學年度評論(AnnuRevBiochem)69:531;Steven、J.等2004科學(Science)303:1866;Steven、J.等2006科學(Science)312:404;Wilson,I.A.等1981自然(Nature)289:366),並且Hl和H5RBD彼此顯示的結構和遺傳相似性高於與H3的結構和遺傳相似性(圖4A)。為定義改變受體識別作用的突變，我們著眼於識別a2，6-SA連接的H5和Hl(A/南加利福尼亞/l/18)之間的差異，尤其第190、193和225位胺基酸(圖4B)。產生了創造假病毒的單個或組合突變，其中在特定位置上由胺基酸的單字母代碼描述的胺基酸被替換，如在位置190內的天冬氨酸被穀氨酸替換置換(E190D)。我們也使用先前提示增加a2，6識別的突變Q226L，G228S(Steven、J.等2006科學(Science)312:404)。這些HA的表面表達通過流式細胞術證實(圖5A),和假型慢病毒載體在神經氨酸酶(NA)共轉染後產生。用螢光素E190D、K193、G225D三重突變體病毒顯示類似於野生型HA的進入(圖5C),證實該突變體病毒的功能完整性；然而，受體特異性不可能通過這種方式定義。不同HA的SA特異性由改良聚糖微陣列法(Steven、J.等2006NatRevMicrobiol4:857)和再唾液酸化HA測定法(Paulson,J.C.和Roger、G.N.1987酶學方法《MethodsEnzymol》138:162)分析。對於聚糖陣列，HA隨NA共表達並加以純化(Steven、J.等2004科學(Science)303:1866)。與野生型蛋白相比，E190D、K193S、G225D突變取消了對絕大多數a2,3-連接的底物的識別(圖6,A與B)。再唾液酸化HA測定法證實所述三重突變體中a2,3-SA識別作用的喪失和ot2，6結合作用的缺乏(表5A),該情況也在Q226L、G228S中見到。對先前所述突變體的分析(Yamada，S.等2006自然(Nature)444:378)也顯示無a2,6-SA識別作用(表5B)。最後，我們鑑定到提高a2，6-SA識別作用的突變(表5C),尤其改變了130環和190螺旋的S137A/T192I變體。這種改變的特異性在聚糖微陣列中得到證實(表6)。這些突變代表HA可以藉此調節其底物識別作用的替代形式；在最後提到的例子中，所述突變提高2，6-SA結合作用至與人適應型流感病毒更相似(儘管不相同)的程度。具有改變的受體特異性的HA之間的免疫原性及抗原性差異通過用野生型或三重突變體HA接種小鼠並產生單克隆抗體(mAbs)進行分析。每種mAb以差異的特異性識別與NA共表達的突變HA或野生型HA(圖7A)。一抹有效的H5特異性mAb9E8中和野生型H5,但是顯出針對三重突變體假病毒的顯著降低活性(圖7B，左側)。與之相對，第二主這種單克隆10D10以最大抑制濃度同等地中和突變HA或野生型HA，儘管在中間濃度上觀察到較小差異(圖7B,中間)。在用三重突變體表達載體免疫後分離的第三mAb9Bll顯示相反的特異性，抑制所述三重突變體，但不影響野生型H5假病毒(圖7,B和C,右邊)。最終，儘管9E8中和野生型HA的效力比中和S137A/T192I變體的效力更高，另一種抗體11H12顯示對這兩者的可比較活性(圖7D)，從而證實該突變體的差異抗原性。對SA結合特異性的修飾因此改變中和敏感性並促進可激發有效中和性mAb的疫苗的產生。在本報告中，我們鑑定到禽H5血凝素中改變其SA受體特異性的突變並中和敏感性用先前證實可定義眾多病毒進入機制的慢病毒進入測定法確定，其中所述的眾多病毒包括HIV、嚴重急性呼吸綜合症(SARS)病毒、伊波拉和馬爾堡出血熱病毒和最近包括流感病毒(Li，W.等2003自然(Nature)426:450;Yang,Z.等1998科學(Science)279:1034;Yang,Z,Y.等2004病毒學雜誌(JVirol)78:5642)。抗體抑制作用決定中和敏感性(實施例1;Kong，W.-R等2006美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)並與血凝抑制作用(免疫保護作用的一種傳統標誌)(表7)(Kong,W.P.等2006美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)。用這種方法，無需為產生可複製性病毒所要求的分子適應過程，4企驗了所述HA的特異性，這可以鑑定到具有改變的SA特異性的幾種突變體。最近已經定義了惡其它突變體，它們的識別作用以特異性更低的測定法評價(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)，並且我們發現這些突變體在HA測定法中沒有獲得a2,6-SA識別作用(表5B;N186K,Q196R)。先前報導的Q226L，G228S突變體(Steven、J.等2006科學(Science)312:404)也不顯示a2,6-SA結合作用(表5A)。因此先前報導的HA突變體不太可能是人適應性的，儘管本文的S137A，T192I可以代表該途徑中的一個步驟。仍未知a2,6-SA特異性的獲得是否將增加H5Nl傳染性。最近，證實1918病毒中導致人SA識別的HA突變增強在雪貂中的傳染作用(Tumpey,T.M.等2007科學(Science)315:655)，這支持這種觀念並且提供了評價此類H5突變體的模型。合理設計人適應型H5特異性疫苗的方法促進了此類分析，以及促進開發先期對抗手段以對抗流感暴發。HA的五個主要抗原位點位於靠近RBD的可接近表面(Skehel,J丄和Wiley，D.C.2000生物化學年度評論(AnnuRevBiochem)69:531;Wiley，D.C.等1981自然(Nature)289:373;Kaverin,N.V.等2002普通病毒學雜誌(JGenVirol)83:2497)。儘管針對該區域的抗體可以影響RBD特異性和中和敏感性(Skehel，J丄和Wiley,D.C.2000生物化學年度評論(AnnuRevBiochem)69:531,Laeeq,S.等1997病毒學雜誌(JVirol)71:2600;Ilyushina，N.等2004病毒學月刊(Virology)329:33;Bizebarb，T.等1995自然(Nature)376:92;Fleury,D.等1999天然結構生物學(NatStructBiol)6:530)，不過僅在RBD中的變化還未證實可改變免疫原性。這裡，基於結構對RBD特異性的修飾促進mAb的產生，而不依賴於所述主要抗原位點。針對功能性約束結構域的這些抗體可以較不容易地發生抗性並且充當這樣的疫苗原型，其中所述疫苗原型擬在人適應興毒抹出現之前進行開發。單克隆抗體9B11、10D10、9E8和11H12在歷經長期有關多克隆抗體的科學研究後，1975年發展的單克隆抗體產生方法當然是巨大的技術躍進。單克隆抗體對於眾多任務而言是極有價值的，這些任務包括分析、表徵和純化其對應抗原。單克隆抗體對靶標的敏銳特異性使它們成為藥物用途的突出候選物。然而，雜交瘤必須在實驗動物而非人中產生的事實使得雜交瘤產生的單克隆抗體作為人治療物具有限用途。得自小鼠的抗體具有被人免疫系統識別為外來物的序列，並且因此在施用至人時產生強烈且潛在破壞性的免疫應答。對抗體結構的常年仔細研究導致這個方面的明顯進展。在1983,嵌合抗體的改變變成現實。在嵌合抗體中，使用重組DNA技術將小鼠單克隆抗體或其它非人類單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區("供體")連接至人抗體的重鏈恆定區和輕鏈恆定區。這極大地降低了抗體在人中的潛在免疫原性，同時保留其特異性。稍後幾年出現下一代技術突破一一"人源化"。在"人源化，，抗體中，僅3個CDR(互補決定區)和有時來自每個供體抗體可變區的幾個仔細選擇的"框架區"殘基(可變區的非CDR部分)重組地黏附至人抗體序列的對應框架區和恆定區。最近，該領域已經發展多種方法來產生"完全人"抗體例如通過產生來自經遺傳修飾僅具有人員抗體基因的小鼠的雜交瘤或通過從人衍生抗體基因的噬菌體展示文庫中選擇而產生。然而，另一種變體結構時單《連Fv或"scFv，，，其中單克隆抗體的輕鏈可變區通過接頭序列重組地融合於抗體重鏈可變區。如本文中所用，"特異性結合，，指單克隆抗體結合對應抗原的屬性，其中任意的單克隆抗體9B11、IODIO、9E8或11H12以如此親和力與所述對應抗原結合，所述的親和力比該克隆抗體對除所述對應抗原之外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)的親和力高至少2倍、50倍、100倍、1000倍或更高倍。如本文中所用，術語"抗體"指包含至少一種和優選兩種重(H)鏈可變區(本文中縮寫為VH)以及至少一種及優選兩種輕(L)鏈可變區(本文中縮寫為VL)的蛋白質。所述VH和VL區可以進一步再分成稱作"互補決定區"("CDR")的超變區，該超變區間插以稱作"框架區域"(FR)的更保守區域。所述框架區域和CDR的範圍已經精確定義(見Kabat,E.A.,等(1991)免疫學目的蛋白質的序列，第五版，美國衛生與福利署，NIH出版編號91-3242(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanService、NIHPublicationNo.91-3242)和Chothia，C等(1987)分子生物學雜誌(J.Mol.Biol.)196:901-917)。優選地，每個VH和VL由從氨基端至羧基端以如下順序排列的三個CDR和四個FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體的VH或VL鏈可以還包括全部或部分的重鏈或輕鏈恆定區。在一個實施方式，所述抗體是兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈由例如二硫鍵彼此連接。所述重鏈恆定區由三個結構域Cffl、CH2和CH3組成。所述輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。所述重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區一般介導該抗體對宿主組織或因子的結合，所述的宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統的第一成分(Clq)。術語"抗體"包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亞型)型完整免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的輕鏈可以是K或X型。如本文中所用，術語"免疫球蛋白，'指由基本上免疫球蛋白基因所編碼的一個或多個多肽組成的蛋白質。已識別的人免疫球蛋白基因包括K、la(IgAl和lgA2)、y(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、5、s和ii恆定區基因，以及繁多的免疫球蛋白可變區基因。全長免疫球蛋白"輕鏈"(約25Kd或214個胺基酸)在氨基端處由可變區基因編碼(約110個胺基酸)並且在氣基端處由K或人恆定區基因編碼。全長免疫球蛋白"重鏈"(約50Kd或446個胺基酸)類似地由一個可變區基因(約116個胺基酸)和前述其餘恆定區基因之一例如y(編碼約330個胺基酸)編碼。術語"免疫球蛋白"包括這樣的免疫球蛋白，其具有CDR,其來自非人類來源，例如來自非人類抗體，例如非人類抗體，例如小鼠免疫球蛋白或另一種非人類免疫球蛋白，來自共有序列或來自通過噬菌體展示法或產生多樣性的任何其它方法所產生的序列；並具有這樣的框架，其在人中比非人類框架區具有更少抗原性，例如在來自非人免疫球蛋白的CDR的情況下，比來自所述非人類CDR從中取得的非人類框架具有更少的抗原性。所述免疫球蛋白的框架可以是人、人源化非人類(例如小鼠)框架，其中將所述的框架修飾以減少在人中的抗原性，或合成性框架區，例如共有序列。這些抗體在本文中有時稱作修飾的免疫球蛋白。修飾的抗體或其抗原結合片段包括至少一條、兩條、三條或四條修飾的免疫球蛋白鏈，例如至少一條或兩條修飾的免疫球蛋白輕鏈和/或至少一條或兩條修飾的重鏈。在一個實施方式，所述修飾的抗體是兩條修飾的免疫球蛋白重鏈和兩條修飾的免疫球蛋白輕鏈的四聚體。如本文中所用、"同種型"指由重鏈恆定區基因編碼的抗體類別(例如IgM或IgGl)。術語抗體的"抗原結合片段"(或筒單稱作"抗體部分"或"片段")，如本文中所用、指特異性地與目的抗原結合的抗體部分，例如這樣的分子，其中一條個或多條免疫球蛋白鏈不是全長的，但是特異性地與目的抗原結合。在術語抗體的"抗原結合片段"中包含的結合片段實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在鉸鏈區由二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)Fv片段，其由抗體的單條臂的VL和VH結構域組成；(v)dAb片段(Ward等、(1989)自然(Nature)341:544-546)，其由VH結構域組成；以及(vi)分離的互補決定區(CDR),具有足夠框架以特異性結合例如可變區的抗原結合部分。輕鏈可變區的抗原結合部分和重鏈可變區的抗原結合部分，例如，Fv片段的兩個結構域VL和VH可以使用重組方法例如通過合成接頭加以聯接，其中所述的合成接頭能夠使所述兩個結構域作為單一蛋白鏈產生，其中VL區和VH配對以形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv);見，例如Bird等(1988)科學(Science)242:423-426;和Huston等(1988)美國科學院院報(ProcNatl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。術語抗體的"抗原結合片段，，意圖包食此類單鏈抗體。使用本領域技術人員抑制的常規技術獲得這些抗體片段，並且對所述片段如完整抗體那樣相同的方式篩選用途。術語"單特異性抗體"指對特定靶如表位顯示單一結合特異性和親和力的抗體。本術語包括"單克隆抗體"或"單克隆抗體組合物"，其如本文中所用，指單一分子組合物的抗體或其片段的製備物。術語"重組"抗體，如本文中所用，指通過重組方法製備、表達、產生或分離的抗體，如使用轉染至宿主細胞的重組表達載體表達的抗體，從重組組合抗體文庫中分離的抗體、從對人免疫球蛋白基因為轉基因的動物(例如小鼠)中分離的抗體或通過任何其它方法製備、表達、產生或分離的抗體，其中所述的任何其它方法涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列。此類重組抗體包括人源化、CDR接枝、嵌合、(例如通過噬菌體展示)體外產生的抗體，並且可以任選地包含源自人種系免疫球蛋白序列的恆定區。在優選的實施方式中，我們提供單特異性抗體(例如單克隆抗體)或其抗原結合片段。所述抗體(例如重組或修飾的抗體)可以是全長的(例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如IgAl、IgA2)、IgD和IgE,不過優選IgG)或可以僅包括抗原結合片段(例如Fab、F(ab')2或scFv片段、或一個或多個CDR)。抗體或其抗原結合片段可以包含兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈，或可以是單鏈抗體。所述抗體可以任選地包含選自的恆定區k、人、a、y、S、s或ii恆定區基因。優選的抗體包括基本上來自人抗體例如人IgGl恆定區或其部分的重鏈和輕鏈恆定區。在一些實施方式中，所述抗體是人抗體。抗體(或其片段)可以是鼠類或人抗體。可以使用的優選單克隆抗體的實例包括9B11、IODIO、9E8和11H12抗體。本發明的範圍也包括使用如此抗體或其抗原結合片段的方法和組合物，其中所述的抗體結合本文所披露抗體的重疊表位或竟爭性地抑制本文所披露抗體與對應抗原的結合，例如這樣的抗體，其結合單克隆抗體9B11、IODIO、9E8或11H12的重疊表位或竟爭性抑制所述單克隆抗體與對應抗原的結合。可以使用任意的抗體組合，例如結合至對應抗原不同區域的兩種或更多種抗體，例如結合至對應抗原的兩種不同表位的抗體。在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段結合至本文所述抗體例如9B11、IODIO、9E8和11H12的全部或部分表位。所述抗體可以抑制，例如竟爭性地抑制本文所述抗體例如9B11、IODIO、9E8和11H12抗體與對應抗原的結合。抗體可以結合至這樣的表位，例如空間表位或線性表位，其中所述表位在被結合時阻止本文所述的抗體如抗體9B11、IODIO、9E8和11H12的結合。所述表位可以在空間上非常接近於或在功能上相關於或在構象上非常接近於抗體9B11、IODIO、9E8和11H12識別的一個表位，例如線性序列中的重疊或相鄰表位。在其它實施方式中，抗體(或其片段)是重組或修飾的抗體，所述抗體選自例如嵌合、人源化、或體外產生的抗體。如本文中所討論，修飾的抗體可以是CDR接枝抗體、人源化抗體或更一般地是具有來自非人類抗體的CDR和如此框架的抗體，其中所述的框架因在人中較低的免疫原性而選擇，例如其免疫原性比其中天然存在鼠類CDR的鼠類框架更低。在一個實施方式中，修飾的抗體是抗體9B11、IODIO、9E8或11H12的人源化形式。在另一個方面，本發明以用於預防或治療流感病毒感染的組合物為特徵。所述組合物包含如本文中所述的抗體或其抗原結合片段。本發明的組合物還可以包含藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。如本文中所述的抗體或其抗原結合片段可以全身地施用至受試者(例如靜脈內、肌內、通過輸注(例如使用輸注裝置)、皮下、經皮或通過吸入)。在抗體或其抗原結合片段是小分子的那些實施方式中，可以口服地施用抗體。在其它實施方式，將抗體或其抗原結合片段局限地(例如局部)施用至受累區域，例^口p乎吸道。受試者可以是哺乳動物，例如靈長類，優選高級靈長類，例如人(例如患有流感病毒感染或有此風險的患者)。在另一方面，本發明以用於體外檢測樣品(例如生物樣品，如血漿、組織活抬r樣品)中對應抗原存在性的方法為特徵。所述組合物包含如本文中所述的抗體或其抗原結合片段。本發明的組合物還可以包含藥學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。所述主題方法可以用來評價例如流感病毒感染的診斷或階段。該方法包括(i)使所述樣品(和任選地，參考，例如對照樣品)與抗體或其觸；並且(ii)檢測複合物在所述抗體或其抗原結合片段與該樣品(和任選地，參考，例如對照樣品)之間的形成。所述複合物的形成表示存在對應抗原，和可以指示本文中所述治療的適用性和需要。例如，相對於對照樣品，樣品中所述複合物形成的統計顯著變化表示該樣品中存在所述對應抗原。在又一個方面，本發明提供用於體內檢測受試者對應抗原存在性的方法(例如受試者中體內成像)。所述主題方法可以用來評價受試者例如哺乳動物，例如靈長類例如人中流感病毒感染的診斷或階段。該方法包括(i)將抗體下施用至受試者(和任選地，參考，例如對照受試者)；並且(ii)檢測複合物在所述抗體或其抗原結合片段與對應抗原之間的形成。相對於所述參考例如對照受試者或受試者的基線，該受試者中所述複合物形成的統計顯著變化表示存在所述對應抗原。'優選地，抗體或其抗原結合片段直接或間接地用可檢測物質標記以促進檢測結合及未結合的物質。合適的可檢測物質包括多種有生物活性的酶、輔基、螢光材料、發黃材料、順磁性(例如核磁共振活性)材料和放射性材料。在一些實施方式中，抗體或其片段偶聯於放射性離子，例如銦(11In)、碘(1311或1251)、釔(90Y)、鑥(177Lu)、僻(225Ac)、鉍。2Bi或犯Bi)、硫(35S)、碳("C)、氚(3H)、銠(188Rh)、鎝("mTc)、鐠或磷(32P)。實施例1所用的Genbank登錄號是AY651364、AY555150、DQ868374和DQ868375。免疫原和質粒構建編碼H5N1(KAN-l)(Genbank登錄號AY555150)血凝素的質粒先前已經描述(W.-RKong等2006美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)l03:15987)並且使用人偏好性密碼子加以合成(GeneArt，德國雷根斯堡)。該序列已經提交至GenBank，登錄號DQ868374。使用如文中所述的快速變化(QuickChange)試劑盒(Stratagene,拉荷亞(LaJolla)，加利福尼亞(CA))通過位點定向誘變製備突變的HA。蛋白質表達通過蛋白質印跡分析法證實(W.P.Kong等2003病毒學雜誌(JVirol)77:12764)。DNA接種中所用的免疫原含有如前所述(W.-P.Kong等2006美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA):15987)(Genbank登錄號DQ868375)變成PQRETRG(SEQIDNO:4)的裂解位點突變(PQRERRRKKRG(SEQIDNO:3)。該修飾也稱作"mut.A"。表達分泌型三聚體形式HA和三重突變體HA(E190D/K193S/G225D)的質粒通過將含有如上所述述切割位點突變的HA的第1-518位胺基酸與如所述的IDNO:5)融合而產生(J.Stevens等2006科學(Science)312:404)。該修飾也稱作"短"和"摺疊子"，因為它不僅含有三聚化位點，並且此融合導入HA蛋白在跨膜結構域上遊羧基末端10個胺基酸的截短。質粒編碼Nl(KAN-l)(Genbank登錄號AY555150)也使用人偏好性密碼子合成(基因技術(GeneArt)，德國雷根斯堡)。接種6-8周齡雌性BALB/c小鼠(傑克森實驗室(JacksonLabs))如前述進行免疫(Z,Y.Yang等2004自然(Nature)428:561)。簡而言之，小鼠用100|ilPBS(pH7.4)中的15嗎質粒DNA以肌內方式在第0、3、6周免疫三次，僅用於DNA免疫或用於初免-加強接種以產生中和性單克隆抗體，隨後用表達相同抗原的101個重組腺病毒(rAd)顆粒在第8-10周進行額外加強免疫。血清在最後接種10日後收集。雪貂類似地進行免疫，除了使用200昭質粒DNA以外。細胞系、抗體、凝集素和唾液酸類似物-人胚腎細胞系293T、293A和293F從英傑(Invitrogen)(卡爾斯巴德(Carlsbad),CA)購買，分別作為病毒生產者和作為感染的靶細胞或用於蛋白質產生。它們先前已經得到描述(Z,Y.Yang等2004病毒學雜誌(JVirol)78:5642)。兔抗HA(H5N1)IgG,人免疫4支術(ImmuneTechnology)(紐約皇后區(Queens,NY))購買。兔抗p24(HIV-l)抗血清從ABI(Columbia,MD)獲得。山槐(Maackiaamurensis)凝集素II(MAA)、紫雲接骨木(Sambucusnigra)凝集素(SNA)、生物素化MAA或SNA以及FITC標記鏈黴抗生物素蛋白來自載體實驗室(VectorLaboratories)(伯4木蓋姆(Burlingame)，力口利一畐尼亞(CA))。抗H5小鼠單克隆抗體的產生雌性BALB/c小鼠用質粒DNA免疫三次，隨後用表達相同抗原的1010個顆粒加強免疫。加強免疫後3日，將脾臟從所述小鼠中收穫，勻漿成單個細胞混懸液，使用聚乙二醇與作為伴侶的骨髓瘤融合，並且在洛夫斯特瑞德實驗室(LofstrandLabs)(蓋塞斯堡(Ga他ersburg),馬裡蘭州(MD))於如前所述含HAT的培養基中選擇雜交瘤(G.Kohler和CMilstein1976歐洲免疫學雜誌(EurJImmunol)6:511;S.N.Iyer等1998高血壓(Hypertension)31:699)。產生目的抗體的雜交體用ELISA進行篩選，並且假型中和測定法如前所述進行(W.-P.Kong等2006美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)。分離到顯示強烈中和作用的三個克隆10D10、9E8和9B11,並且隨後使它們適應於烏髮血清培養基。具有中和活性的另一個克隆克隆11H12從後續融合中分離並且也用來表徵S137A,T1921突變體。使用HiTrap蛋白G親和柱(阿莫仙(Amersham)，皮斯卡塔韋(Piscataway),新澤西(NJ))從無血清細胞培養基純化小鼠單克隆抗體。三聚體HA蛋白的產生和純化使用含有或不含有1/10比例NA(KAN-1)表達載體(重量:重量)的293轉染試劑(fectin)(Invitrogen，Carlsbad,CA),將表達分泌型三聚體HA和HA(E190D/K193S/G225D)的質粒轉染至293F細胞。在轉染72-96小時後，將細胞培養上清液收集、通過離心澄清、過濾並使用Ni瓊脂糖(Sepharose)TM高效親和柱(通用電氣醫療集團(GEHealthcare),Piscataway,新澤西(NJ))純化，如前所述(J.Stevens等2006科學(Science)312:404)。將級分合併並進行離子交換層析(單-Q(mono-Q)HR10/10，通用電氣醫療集團(GEHealthcare),皮斯卡塔韋(Piscataway,NJ))和凝膠過濾層析(Hiload16/60Superdex200pg，GEHealthcare,Piscataway，NJ)。將含有三聚體的級分合併，並對PBS透析。HA和a2，3及a2，6唾液酸的表面染色使用脂質體轉染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以表達野生型和H5突變體的質粒共轉染293T細胞。轉染24小時後，將細胞使用含2mMEDTA的PBS取出、收集和並以PBS洗滌。細胞用小鼠抗HA[H5N1(KAN-1)]血清(圖5A;黑色線，1:200)或免疫前血清對照(圖5A,灰色線，1:200)染色。或者，以O.lw/w比的NA(KAN-l)共轉染的細胞與單克隆抗體(9E8、IODIO、9B11)(圖7A;黑色線，5pg/ml或同種型對照(圖7A，灰色線，5|ig/ml)在冰上孵育30分鐘、洗滌並且與AlexaFluor488-山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,Carlsbad,CA)(1:2000)在冰上孵育。將樣品洗滌並使用FACSCalibur流式細胞儀(FlowCytometer)(碧迪公司(BD)，弗蘭克林湖(FranklinLakes),NJ)進行分析。對於a2,3-和a2,6-SA的表面染色(圖5B),如上所述收集和分析293A細胞。與生物素化MAA(10|ig/ml)或生物素化SNA(10pg/ml)在冰上孵育30分鐘後，將細胞洗滌並與FITC標記鏈黴抗生物素蛋白(10嗎/ml)在水上孵育30分鐘。假型慢病毒載體的產生表達螢光素酶報導基因的重組慢病每載體如前所述產生(L.Naldini等1996美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)93:11382)。簡而言之，使用磷酸釣轉染試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA),將10cm培養皿中的293T細胞用400ng的H5HA或HA突變體、50ng的NANA(H5N1/KAN-1)表達載體、7ng的pCMVAR8.2和7嗎的pHR/CMV-Luc質粒共轉染過夜，隨後用新鮮培養基恢復。48小時後，將上清液收穫、經過濾0.45pm注射式濾器過濾，等份貯存並立即使用或凍存在-80。C。病毒輸入量通過所述病毒製備物中p24的量加以標準化。使用HIV-1p24抗原測定試劑盒(貝克曼庫爾特(BeckmanCoulter),富爾敦(Fullerton),CA)測量來自不同病毒原液的p24水平。在浮力密度離心後，使用蛋白質印跡分析法證實對這些製備物中HA表達的分析，並且水平變化不超過l-2倍。用假型慢病毒載體感染細胞將總計30,000個293A細胞在感染前一日鋪種在48孔培養皿的每孔內。細胞以三復孔lOOjxl病毒上清液/孔與HANA假型病毒聘育14-16小時病毒上清液在此時間結束時更換為新鮮培養基，並且使用"哺乳動物細胞裂解緩衝液"和"螢光素酶測定試劑"(普洛麥格(Promega)，麥迪遜市(Madison)，威斯康辛(WI))根據製造商方案，在48小時後如前所述測量螢光素酶活性(Z.-Y.Yang等2004病毒學雜誌(JVirol)78:5642)。通過小鼠抗血清和單克隆抗體抑制HANA假病毒進入首先通過連續稀釋法滴定編碼螢光素酶的HANA假型慢病毒載體。隨後將相似量的病毒(p246.25ng/ml)與所示量的小鼠抗血清或單克隆抗體在室溫孵育20分鐘並且添加至293A細胞(10,000個細胞/孔在96孔培^m)(50pl/孔，三復孔)。將平板洗滌並在6小時候更換為新鮮培養基。24小時候，測量荄光素酶活性。血凝素的聚糖陣列分析通過將15(ilHA和7figAlexaFluor488標記小鼠抗5xHis(凱傑(Qiagen),目錄號1019199)以2:1摩爾比在總體積50^1中混合而製備HA-抗體複合物，並將該混合物在水上孵育15分鐘。所述預複合物隨後用含有3%(w/v)牛血清白蛋白和0.05%吐溫(Tween)20的50微升PBS稀釋。等份的所述稀釋預複合物施加至蓋玻片下的微陣列(version3.0)並在黑暗、溼化室內在室溫孵育1小時。將蓋玻片柔和地取下並且此蓋玻片隨後在含0.05。/oTween-20的PBS、PBS和去離子水中連續淋洗。為除去過多的水，此蓋玻片在蓋玻片微型離心機中離心30秒，並且結合圖像在微陣列掃描儀(ProScanArray，珀金埃爾默(PerkinElmer))內讀取。使用Imaenev.6軟體(生物探索(BioDiscovery),埃爾塞貢多(ElSegundo),CA)開展圖像分析，並且結果文件以Excel格式生成，其中在消除最高值或最低值後，將源於每種聚糖(表8)6個重複的相對螢光(RFU)報導為n=4的平均數。數據上載至網際網路上網址fimctionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp處的功能'l"生外唐類協會組資料庫(ConsortiumforFunctionalGlycomicsDatabase)。H5N1和測量受體特異性的其它假病毒的血凝作用雞RBC(CRBC)和酶修飾CRBC的血清作用如前所述進行(L.Naldini等1996美國科學院院報(ProcNatlAcadSciUSA)93:11382;LGlaser等2005病毒學雜誌(JVirol)79:11533;T.GKsiazek等2003新英格蘭醫學雜誌(NEnglJMed)348:1953;J.CPaulson和G.N.Rogers1987酶學方法《MethodsEnzymol》138:162)。為產生SAa2,3Gal或a2，6Gal再唾液酸化的CRBC,將0.6ml的10%(v/v)新鮮製備的CRBC(創新研究(InnovativeResearch),南田(Southfield),密西根州(MI))用10mlPBS(pH7.4)洗滌三次並且用處理200mU霍亂弧菌(vibviocholerae)神經氨酸酶(羅氏(Roche),印第安納波利斯(Indianapolis),印第安納州(IN))在37。C處理1小時。用1mlPBS洗滌三次後，將細胞重懸於1mlPBS中，與20mU的a2,3(N)-唾液酸轉移酶(卡爾生物化學(Calbiochem),LaJolla，CA)在37。C孵育30分鐘；或在1.5mlPBS中與Dr.JamesPaulson博士(斯克瑞普斯研究機構(ScrippsResearchInstitute))友好提供的4.5mU的a2，6(N)-唾液酸轉移酶外加1.5mMCMP-SA(西格瑪(Sigma)，聖路易斯(St.Louis)，密蘇裡州(MO))在37。C將育45分鐘。再唾液酸化的CRBC在用PBS洗滌3次後以0.5%(v/v)重懸於PBS中。神經氨酸酶處理的CRBC也在再唾液酸化之前與假型病毒載體孵育並且均勻地顯示《1:2的滴度。為通過血凝作用測量假病毒的結合活性，將PBS中的5(^11:5稀釋的H5N1假病毒添加至96孔圓底平板，並且進行2倍連續稀釋。分別添加50pi10.5%CRBC、a2，3或a2,6再唾液酸化CRBC,並將它們與病毒混合。60分鐘後通過目視檢查法確定HA滴度。表5.野生型和突變體HA的聚糖識別作用的特異性和進入效率tableseeoriginaldocumentpage66tableseeoriginaldocumentpage67如實施例1中所述使用來自泰國的H5突變體KAN-1或來自越南的VN1203和VN1194。通過再唾液酸化血凝試-險(實施例1)對(A)喪失a2,3HA活性的KAN-1突變體和相關對照、(B)VN1203和先前描述的VN1194突變體(Yamada，S.等2006自然(Nature)444:378)和(C)a2，6-SA結合作用提高的KAN-1突變體測定所示HA結合a2,3-或a2，6-SA的能力。野生型和突變布支型慢病毒載體的病毒進入過程如所述進行測量(實施例1)。進入程度如下+，WT的75%。本文的H5(KAN-l)與所述GenBank序列相同，並且與源自Yamada和合作者(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)的序列在第186位胺基酸(N/K)處不同於，並且VN1194突變體根據替代性編號習慣與N182K和Q192R(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)相同。表6通過聚糖微陣列分析，與野生型相比S137A、T192I的聚糖結合作用差異的匯總表tableseeoriginaldocumentpage68tableseeoriginaldocumentpage69上表顯示如聚糖微陣列測定法確定的S137A，T192I相對於野生型(wt)的化學結構、連接和結合作用。聚糖陣列如圖6中所述進行，從而對於絕大多1^物觀察到在線性範圍內的結合作用(50%最大結合作用)。通過將S137A,T1921突變體的相對螢光單位(RFU)從對照的RFU中扣減而進行差異分析。所述差異除以對照並且乘以100以獲得代表相對於對照數據的陽性或陰性變化的百分比。針對三個群體呈現結果，包括含有Neu5Aca2-6GalNAc(31-4的9種不同結構，與對照相比，其中7種結構顯示因突變所致的結合作用明顯陽性增加；帶有與聚乳糖胺連接的巖藻糖的四種化合物，它們顯示明顯更高的S137A,T192I結合作用；並且6種a2-3和a2-6SA,其相對於S137A，T1921,顯示更高的野生型結合作用。總之，這些分析證實了與野生型H5KAN-1HA相比，S137A,T192I增強的a2-6識別作用和改變的受體結合結構域(RBD)特異性。表7:通過不同測定法測定的接種動物的中和性抗體應答KAN-1VN(1203)VN(1203)KAN-1慢病毒動物免疫原載體血凝抑制微量中和法抑制作用(IC80)雪貂1HA3xDNA+rAd40404202HA3xDNA+rAd160201557HA3xDNA+rAd>2560>2560198794HA3xDNA+rAd804012515HA3xDNA+rAd>2560>2560171866HA3xDNA+rAd160805627對照載體3xDNA+rAd101008對照載體3xDNA+rAd10100小鼠1HA蛋白質320NDl卯42HA蛋白質640ND13673HA蛋白質640ND3457tableseeoriginaldocumentpage71通過多種方法評1介源自個體雪貂或小鼠組的血清，其中所述的雪貂和小鼠用由單獨DNA編碼的H5KAN-IHA、DNA加rAd(重組腺病毒)或純化的KAN-IHA蛋白免疫。血凝抑制和微量中和試驗用如前所述的rgA/越南A203/2004xA/PR8/34重組4朱病毒VN(12(B)(J.J.Treanor等2006新英格蘭醫學雜誌(NEnglJMed)354:1343)(南方研究院，伯明罕，阿拉巴馬州(SouthernResearchInstitute,Birmingham,AL))進行。在上表中顯示終點稀釋度。使用A/泰國/KAN-112004HA慢病毒載體的慢病毒抑制試驗如實施例1中所述進行。顯示了具有IC80活性的血清的稀釋度。Mab指圖7中所述的小鼠單克隆抗體。所述單克隆抗體的IC80基於純化IgG的濃度進行計算。ND表示樣品沒有進行測定。200780041962.X轉溢齒被62/685x表8由微陣列分析的聚糖的化學結構和命名tableseeoriginaldocumentpage72tableseeoriginaldocumentpage73tableseeoriginaldocumentpage74tableseeoriginaldocumentpage75tableseeoriginaldocumentpage76tableseeoriginaldocumentpage77化學結構和連接、命名以及如前所述(J.Stevens等人.2006科學(5We"")312:404)表明的參考毒抹的結合得到顯示，為圖6中所示的野生型(wt)和三重突變HA提供了參考。符號象徵是白色圓形(Gal)、黑色圓形(Glc)、黑色三角形(Fuc)、白色方形(GalNAc)、黑色方形(GlcNAc)、黑色菱形(唾液酸)、灰色圓形(人)以及白色菱形(N-乙醇醯基唾液酸(N-glycolylsialicacid))。承**應當理解本文中所述的實施例和實施方式僅出於說明目的並且在其影響下作出的多種修改和改變將對本領域技術人員存在提示，並且應當包括在本申請的精神及範圍和所附帶任意權利要求的範圍內。本文中提及的全部圖、表和附錄以及出版物、專利和專利申請因而通過引用的方式併入用於全部目的。權利要求1.分離或重組的血凝素(HA)多肽、所述多肽選自由以下項所組成的組中(a)具有SEQIDNO2的胺基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO82的胺基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO84的胺基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列編碼的多肽，其中，所述的多核苷酸在高度嚴格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核苷酸序列的基本上全長雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續的至少約350個胺基酸、連續的至少約400個胺基酸、連續的至少約450個胺基酸或連續的至少約500個胺基酸基本上相同的胺基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含S137除S之外的胺基酸的突變，並任選包含T192除T之外的胺基酸的又一個突變。2.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對權利要求l中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98%序列同一性、對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98.5%序列同一性、對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99%序列同一性、對權利要求l中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.2%序列同一性、對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.4%序列同一性、對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.6%序列同一性、對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.8%序列同一性或對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.9%序列同一性。3.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對權利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少95%序列同一性。4.根據權利要求1所述的多肽，其中，所述的多肽具有免疫原性。5.組合物，其包含權利要求1的一種或多種多肽。6.多肽，其特異性地由針對至少一種抗原產生的多克隆抗血清結合，所述抗原包含權利要求1的至少一種胺基酸序列。7.對權利要求1的多肽特異的抗體。8.免疫原性組合物，其包含免疫學有效量的權利要求1的多肽。9.根據權利要求1所述的多肽，其還包含至SEQIDNO:4的裂解位點的修飾。10.根據權利要求1所述的多肽，其還包含替代跨膜結構域的SEQIDNO:5的外部三聚區的氛基末端的修飾。11.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苦酸序列，並且所述多核苷酸序列選自由以下項所組成的組中(a)編碼具有SEQIDNO:2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷酸序列；(b)編碼具有SEQIDNO:82的氨基S吏序列的多肽的多核香酸序列，或其互補多核苷S臾序列；(c)編碼具有SEQIDNO:84的胺基酸序列的多肽的多核香酸序列，或其互補多核苷酸序列；(d)多核苷酸序列，其在高度嚴格性條件下與多核苷酸序列(a)、(b)或(c)的基本上全長雜交；(e)編碼多肽序列的多核苷酸序列，所述多肽序列包含由(a)、(b)或(c)編碼的多肽的片段，所述多肽包含這樣的氨基,列，所述胺基酸序列與由(a)、(b)或(c)編碼的所述多肽中連續的至少約350個胺基酸、連續的至少約400個胺基酸、連續的至少約450個胺基酸或連續的至少約500個胺基酸基本上相同；和(f)編碼H5HA多肽的多核苷酸序列；其中所述多核苦酸序列編碼這樣的多肽，所述多肽包含S137除S之外的胺基酸的突變，並任選包含T192除T之外的胺基酸的又一個突變。12.根據權利要求11所述的核酸，其中，所述核酸是DNA。13.根據權利要求11所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。14.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序歹'J,並且所述多核苷I^f列對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98%同一性、對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98.5%同一性、對權利要求ll中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99%同一性、對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.2%同一性、對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.4%同一性、對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.6%同一性、對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核香酸具有至少99.8%同一性或對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.9%同一性。15.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，並且所述多核苷S^f列對權利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少95%同一性。16.根據權利要求11所述的核酸，其中，所述的多核香酸編碼免疫原性多肽。17.組合物，其包含權利要求11的一種或多種核酸。18.免疫原性組合物，其包含免疫學有效量的權利要求11的核酸。19.載體，其包含權利要求11中所述的一種或多種核酸。20.根據權利要求19所述的載體，其中，所述載體包括質粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。21.根據權利要求19所述的載體，其中，所述載體包括表達載體。22.細胞，其被權利要求19的載體所轉導。23.用於在細胞培養中產生血凝素(HA)多肽的方法，所述方法包括將權利要求19的載體導入宿主細胞；培養該宿主細胞；並且回收所述血凝素(HA)多肽。24.免疫原性組合物，其包含權利要求l的多肽。25.免疫原性組合物，其包含權利要求11的核酸。26.根據權利要求24或25所述的組合物，該組合物還包含賦形劑。27.根據權利要求26所述的組合物，其中，所述賦形劑是藥學上可接受的賦形劑。28.預防性或治療性治療受試者中流感感染的方法，所述方法包括以產生針對所述流感感染的免疫原性應答的有效量，施用包含權利要求1的多肽的免疫原性組合物或包含權利要求11的核酸的免疫原性組合物至所述受試者。29.根據權利要求28所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動物。30.根據權利要求28所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。31.根據權利要求28所述的方法，其中，所述組合物以有效預防性或治療性治療所述流感感染的量施用至該受試者。32.分離或重組的血凝素(HA)多肽，所述多肽選自由以下多肽所組成的組中(a)具有SEQIDNO:2的胺基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的胺基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的胺基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列編碼的多肽，其中所述的多核苷酸序列在高度嚴格性條件下與編碼(a)、(b)或(c)的多核香酸序列的基本上全長雜交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含與所述(a)、(b)或(c)中連續的至少約350個胺基酸、連續的至少約400個胺基酸、連續的至少約450個胺基酸、或連續的至少約500個胺基酸基本上相同的胺基酸序列；(f)H5HA多肽；其中，所述多肽包含K/R193除K或R之外的胺基酸的突變和選自由以下突變所組成的組中的至少一種突變S136除S之外的胺基酸的突變、El卯除E之外的胺基酸的突變、L194除L之外的胺基酸的突變、R216除R之外的胺基酸的突變、S221除S之外的胺基酸的突變、K222除K之外的氛基酸的突變、G225除G之外的胺基酸的突變、Q226除Q之外的胺基酸的突變、S227除S之外胺基酸的突變和G228除G之外的胺基酸的突變。33.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98%序列同一性、對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少98.5%序列同一性、對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99%序列同一性、對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.2%序列同一性、對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.4%序列同一性、對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.6%序列同一性、對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.8%序列同一性或對權利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多肽具有至少99.9%序列同一性。34.多肽，包含這樣的序列，所述的序列對權利要求32中所述的(a)、(b)或'(c)的至少一種多肽具有至少95%序列同一性。35.根據權利要求32所述的多肽，其中，所述的多肽具有免疫原性。36.組合物，其包含權利要求32的一種或多種多肽。37.多肽，其特異性地由針對至少一種抗原產生的多克隆抗血清結合，所述抗原包含權利要求32的至少一種胺基酸序列。38.對權利要求32的多肽特異的抗體。39.免疫原性組合物，其包含免疫學有效量的權利要求32的多肽。40.根據權利要求32所述的多肽，其還包含至SEQIDNO:4的裂解位點的修飾。41.根據權利要求32所述的多肽，其還包含替代跨膜結構域的SEQIDNO:5的外部三聚區的羧基末端的修飾。42.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，並且所述多核苷酸序列選自由以下項所組成的組中(a)編碼具有SEQIDNO:2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷S交序列；(b)編碼具有SEQIDNO:82的氨基S吏序列的多肽的多核苦酸序列，或其互補多核香酸序列；(c)編碼具有SEQIDNO:84的胺基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互補多核苷酸序列；(d)多核苷酸序列，其在高度嚴格性條件下與多核苦酸序列(a)、(b)或(c)的基本上全長雜交；(e)編碼多肽序列的多核香酸序列，所述多肽序列包含由(a)、(b)或(c)編碼的多肽的片段，所述多肽包含這樣的胺基酸序列，所述胺基酸序列與由(a)、(b)或(c)編碼的所述多肽中連續的至少約350個胺基酸、連續的至少約400個胺基酸、連續的至少約450個胺基酸或連續的至少約500個胺基酸基本上相同；和(f)編碼H5HA多肽的多核香酸序列；其中，所述多核苷酸序列編碼這樣的多肽，所述多肽包含K/R193除K或R之外的胺基酸的突變和選自由以下突變所組成的組中的至少一種突變S136除S之外的胺基酸的突變、E190除E之外的胺基酸的突變、L194除L之外的胺基酸的突變、R216除R之外的胺基酸的突變、S221除S之外的胺基酸的突變、K222除K之外的胺基酸的突變、G225除G之外的胺基酸的突變、Q226除Q之外的胺基酸的突變、S227除S之外胺基酸的突變和G228除G之外的胺基酸的突變。43.根據權利要求42所述的核酸，其中，所述核酸是DNA。44.根據權利要求42所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。45.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，並且所述多核苷S臾序列對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98%同一性、對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少98.5%同一性、對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99%同一性、對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.2%同一性、對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苦酸具有至少99.4%同一性、對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.6%同一性、對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.8%同一性或對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苷酸具有至少99.9%同一性。46.分離或重組的核酸，其包含編碼血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，並且所述多核苷酸序列對權利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一種多核苦酸具有至少95%同一性。47.根據權利要求42所述的多肽，其中，所述多核苦酸編碼免疫原性多肽。48.組合物，其包含權利要求42的一種或多種核酸。49.免疫原性組合物，其包含免疫學有效量的權利要求42的核酸。50.載體，其包含權利要求42的一種或多種核酸。51.根據權利要求50所述的載體，其中，所述載體包括質粒、粘粒、噬菌體、病毒或人工染色體。52.根據權利要求50所述的載體，其中，所述載體包括表達載體。53.細胞，其被權利要求50的載體所轉導。54.用於在細胞培養中產生血凝素(HA)多肽的方法，所述方法包括將權利要求50的載體導入宿主細胞；培養該宿主細胞；並且回收所述血凝素(HA)多肽。55.免疫原性組合物，其包含權利要求32的多肽。56.免疫原性組合物，其包含權利要求42的核酸。57.根據權利要求55或56所述的組合物，其還包含賦形劑。58.根據權利要求57所述的組合物，其中，所述賦形劑是藥學上可接受的賦形劑。59.預防性或治療性治療受試者中流感感染的方法，所述方法包括以產生針對所述流感感染的免疫原性應答的有效量，施用包含權利要求32的多肽的免疫原性組合物或包含權利要求42的核酸的免疫原性組合物至所述受試者。60.根據權利要求59所述的方法，其中，所述受試者是哺乳動物。61.根據權利要求59所述的方法，其中，所述哺乳動物是人。62.根據權利要求59所述的方法，其中，所述組合物以有效預防性或治療性治療所述流感感染的量施用至該受試者。63.抗體或其抗原結合片段，其竟爭性抑制選自由9B11、IODIO、9E8和11H12所組成的組中的單克隆抗體結合。64.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體.瘤細胞系產生。65.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體66.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體或其抗原結合片段包含這樣的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含選自由9E8的CDR的胺基酸序列所組成組中的至少一種CDR。67.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體或其抗原結合片段包含這樣的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包含選自由11H12的CDR的氨基S^列所組成組中的至少一種CDR。68.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體或其抗原結合片段包含這樣的重鏈可變區，所述重鏈可變區包含選自由9E8的CDR的胺基酸序列所組成組中的至少一種CDR。69.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體或其抗原結合片段包含這樣的重鏈可變區，所述重鏈可變區包含選自由11H12的CDR的胺基酸序列所組成組中的至少一種CDR。70.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體或其抗原結合片段包含來自9E8的全部6個CDR。71.根據權利要求63所述的抗體或其抗原結合片段，其中，所述的抗體或其抗原結合片段包含來自11H12的全部6個CDR。72.特異性地結合對應抗原的抗體或其抗原結合片段，所述的對應抗原特異性地由選自由9B11、IODIO、9E8和11H12所組成的組中的單克隆抗體結合。全文摘要本發明提供因突變而適應於人的H5血凝素(HA)多肽和相關多核苷酸、方法、組合物和疫苗，其中所述的突變改變H1血清型的受體特異性。文檔編號C07K14/11GK101627050SQ200780041962公開日2010年1月13日申請日期2007年10月10日優先權日2006年10月10日發明者加裡·J.·納貝爾,嵐吳,楊志勇,江永佩,魏智仁申請人:美國國有健康與人類服務部(馬裡蘭州)