維甲醯阿糖胞苷綴合物及其藥質體、其製備方法和應用的製作方法

2023-08-02 15:12:16 1

專利名稱：維甲醯阿糖胞苷綴合物及其藥質體、其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有抗腫瘤活性的化合物，尤其涉及具有抗腫瘤活性的維甲醯阿糖 胞苷綴合物以及由該維曱醯阿糖胞苷綴合物構建得到的藥質體，本方發明還公開了 它們的製備方法以及它們在抗肺瘤中的應用，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
許多藥物在體內需要多次穿越生物膜才能到達靶部位(器官、組織、細胞和細 胞器)。在影響藥物跨膜的諸多因素中，親水親油平衡性或油水分配係數是影響明 顯的理化因素。水溶性強的藥物和體液相容，不易穿過由脂質雙層構成的生物膜。 脂溶性強的藥物雖容易進入脂質雙層，但與體液不相容難以在體液中轉運，最終或 積存脂肪組織或被代謝為水溶性物質。目前的解決辦法是藉助藥物傳遞系統來改善 藥物吸收、分布及獲得草巴向性。所述藥物傳遞系統主要有脂質體、納米粒、微球和
微嚢。這些藥物傳遞系統存在一些共同問題①用藥量難以控制。②存在包封率低、 易滲漏，載藥量不穩定。③藥物在到達靶體之前一旦離開傳遞系統，傳遞系統將失 去作用。為解決這些問題，出現了藥質體。藥質體既不是單純的前藥，也不是單純 的藥物載體，而是前藥和載體的有機結合體。藥質體不存在包封率、滲漏和穩定性 問題。藥質體具有較好的水中擴散性和生物膜滲透性，對需要穿過生物膜(包括吸 收、分布、靶向等過程)發揮藥效的治療,如抗病毒治療、腫瘤治療和基因治療非常 有意義。
阿糖胞苷是臨床上常用的抗白血病藥物，分子量為243,臨床用藥量為40mg/Kg/ 天。它在體內能干擾DNA的合成從而抑制白血細胞的繁殖。阿糖胞苷在血液中易被 嘧咬核苷脫氨酶迅速脫氨而失效。為維持有效的血藥濃度，需多次和連續給藥，易 造成骨髓抑制和消瘦作用。
全反式維甲酸為一長鏈帶有六元脂肪環的不飽和酸，臨床上常用的抗白血病藥 物，其分子量為300,臨床用藥量為60mg/Kg/天。維甲酸受體是核內轉錄因子，可 調控多種基因的表達，全反式維曱酸通過與核內維甲酸受體結合，而發揮治療作用的。
阿糖胞香與全反式維甲酸，兩藥物用途一致，化合物極性互補，臨床用藥劑量 匹配。全反式維甲酸具有脂溶性強、水溶性差的特點，與^目反，阿糖胞苷的水溶 性強但是脂溶性較差，上述特性導致二者均不具有兩親性以致生物利用度低、不能 自組裝為藥質體等缺陷，有待改進。

發明內容
本發明目的之一是將阿糖胞苷的結構進行修飾，提供一種具有兩親性的維甲醯 阿糖胞苷綴合物。
本發明目的之二是提供一種由上述具有兩親性的維甲醯阿糖胞苷綴合物構建 而成的藥質體。
本發明目的之三是提供上述具有兩親性的維曱醯阿糖胞苷綴合物的製備方法。 本發明目的之四是提供上述藥質體的構建方法。
本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的 具有兩親性的維甲醯阿糖胞苷綴合物，其結構式為式I所示
在二環己基羰二亞胺(DCC)和l-雍基苯並三氮唑(HOBt)的存在下，將全 反式維甲酸與阿糖胞普的4，位氨基偶聯，即得到上述式I化合物。
全反式維曱酸為一長鏈帶有六元脂肪環的不飽和酸，具有豐支強的脂溶性；本發 明為提高阿糖胞苷的脂溶性，在阿糖胞苷的4，位氨基上引入親脂基團全反式維曱酸, 使其具有合適的油水分配係數。為延緩阿糖胞苷4-氨基的代謝，在4位氨基引入保護 基。這樣便構成了維甲醯阿糖胞苦綴合物。阿糖胞苷的羥基構成親水端，全反式維 曱酸的脂肪鏈構成親脂端。這樣，維曱醯阿糖胞苷綴合物便成為兩親性分子。按照 常規的藥物製劑手段，可將這種兩親性分子製成藥質體，提高藥物的跨膜能力。例如，將上述的維甲醯阿糖胞苷綴合物按照常規薄膜分散法構建得到具有靶向性、高 活性的抗腫瘤藥質體。優選的， 一種構建甲醯阿糖胞苦綴合物藥質體的方法，包括 將磷脂和甲醯阿糖胞苷綴合物用氯仿溶解，旋轉蒸發去除溶劑，加入PBS砩酸鹽緩衝液(0.01mol/L),超聲分散(優選為在30°C溫度下超聲分散20min),得到具 乳光的藥質體溶液；該藥質體的粒徑為150 250nrn, Zeta電位為-30 ~-70mV。本發明的再一目的是提供一種治療腫瘤的藥用組合物，該藥用組合物由治療 上有效劑量的本發明式I化合物或由其製備的藥質體與藥學上可接受的賦型劑或者 載體所組成,即將有效量的本發明式I化合物與藥學上可接受的載體或稀釋劑配合 後，按本領域常規的製劑方法將其製備成任意一種適宜的藥物組合物。通常該組合 物適合於口服給藥和注射給藥，也適合其他的給藥方法。根據不同的給藥方法，本 發明藥物組合物可以含有0.1%-99%重量，優選10-60%重量的本發明式I化合物。 本發明的上述藥用組合物可以製備成微乳、乳劑、脂質納米粒、脂質體等藥物劑型。本發明將全反式維曱酸與阿糖胞苷4'位氨基偶聯，獲得具有兩親性的維曱醯 阿糖胞苷綴合物，該綴合物具備自組裝為藥質體的功能，既可保護阿糖胞苷4，位氨 基失活，又可使該綴合物及所製備的藥質體具有腫瘤乾向性。本發明分別用人白血病細胞HL-60評價和S咖腹水癌小鼠評價了本發明式I 化合物及所製備的藥質體的體外和體內抗肺瘤活性，實驗結果表明，本發明式I化 合物及由其所製備的藥質體具有優秀的抗腫瘤活性。


圖l 本發明式I化合物的結構式。圖2 本發明式I化合物的合成路線圖；I ) DCC和HOBt，冰浴；II )避光； III) Ar氣保護。圖3 維甲醯阿糖胞苦藥質體的電鏡呈像圖。
具體實施方式
為了進一步闡述本發明，下面給出 一系列實施例。這些實施例完全是例證性的， 它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。實施例l、維甲醯阿糖胞苷綴合物的製備將0.6g ( 2mmo1) ATRA (全反式維曱酸)，0.454g (2.2mmol) DCC ( 二環己基 羰二亞胺)和0.270g ( 2mmo1) HOBT ( 1-羥基苯並三氮唑)溶解於適量無水吡咬溶 液中，在避光和Ar氣保護條件下，冰浴攪拌20分鐘後加入0.558g 2mmo1 )HCl.Ara-C (阿糖胞苷鹽酸鹽)，保持避光和Ar氣保護，室溫攪拌2天，TLC(氯仿/曱醇，10: 1 )顯示ATRA和Ara-C的點變淺，將反應液減壓旋幹，加入適量的氯仿溶解，濾 出DCU(二環己基脲)，濾液減壓旋幹，用過量的乙醚洗殘留物，減壓旋蒸除去乙 醚，以氯仿溶解殘留物，分別用0.01N鹽酸和飽和NaCl水洗，濃縮氯仿層，用無 水Na2S04乾燥，柱層析分離(展開劑二氯曱烷曱醇=25: 1)。得0.21g標題化 合物，為橙色固體。Mp.l39-142.6。C; [a]D252 =-35.6 (c = 1.0，乙醇)；油水分配系 數2.924; ESI陽MS(m/e)526.4[M+H]+, 548.2[M+Na]+, 1052.9[2M]+, 1075.1[2M+Na]+。實施例2維甲醯阿糖胞苦藥質體的製備稱取實施例1所製備的維曱醯阿糖胞苦綴合物於茄形瓶中，加入適量卵磷脂 用氯仿充分溶解，置於旋轉蒸發儀上，恆溫水浴35。C旋轉蒸發去除溶劑，至瓶壁上 出現一層凝膠薄膜，加入磷酸鹽緩衝液，然後用手或在旋渦混合器上振蕩，至全部 或部分膜脫落，於水浴超聲20min,藉助卵磷脂目標化合物均可以在磷酸鹽緩衝液 中形成均勻的分散體系，目測無粒子，有淡藍色散射光。光學顯^敖鏡下可見到一些 均勻的4艮小粒子遊動，初步判定得到泡嚢狀的藥質體。通過在雷射納米粒度儀的測 量，藥質體粒徑在150~250nm， Zeta電位在-30 -70mV。藥質體的電鏡呈像，結果 如圖3所示。實驗例1維曱醯阿糖胞苷綴合物對人白血病細胞HL-60增殖的抑制作用實驗 受試化合物實施例1所製備的維甲醯阿糖胞苷綴合物(ATRA-Ara-C);100u/ml,鏈黴素100ug/ml)定期傳代培養。藥物配製陽性對照是將全反式維甲酸(ATRA)、阿糖胞普(Ara-C )及全反 式維曱酸和阿糖胞苷的物理混合物(ATRA+Ara-C)溶於含1%。乙醇的PBS磷酸鹽 緩衝液中製成5xl(T6mol/L濃度的溶液，將受試化合物溶於1%。乙醇的PBS磷酸鹽 緩衝液中製成與陽性對照組等物質的量濃度的溶液。臨用前稀釋得8x1(tVo1/L、 4xl(T8mol/L、 2xl(T7mol/L、 lxl(T6mol/L、 5xl(T6mol/L五個濃度。陰性對照是含196。乙醇的PBS磷酸鹽緩衝液。實驗方法取對數生長期的HL-60細胞，製成5xl04/ml細胞懸液，接種於96 孔培養玲反內，每孔lOOpl。實驗設不含肺瘤細胞組、陰性對照組、陽性對照組及受 試化合物藥物試驗組，加入上述不同濃度的陽性對照藥及所合成的化合物共4個藥 物，每個濃度重複3孔，37°C, 5%C02培養48h,每孔加MTT5mg/ml25p1, 37。C培 養箱中孵育4小時。將96孔板1000r/min離心10min，棄去上液，每孔加二甲亞碸 lOOpl，振蕩器振搖10min,自動酶標儀測定光密度OD值(測量波長570nm，參比波 長630nm)。 HL-60細胞存活率=[(抗癌藥物組OD值-不含細胞組OD值)/(細胞陰性 對照組OD值-不含細胞組OD值)]x 100%並計算半數抑制濃度(IQo)。實驗結果見表 1。表1的數據表明受試化合物對HL-60細胞系的IQo與陽性對照Ara-C以及 ATRA與Ara-C的物理混合組相當，而陽性對照組ATRA沒有明顯的細胞毒作用， 對HL-60細胞的抑制率本實驗最大為20%,沒有得到IC5o值。該結果說明，受試化 合物與Ara-C以及ATRA與Ara-C的物理混合組相比，其抗HL-60細胞的作用相 當；受試化合物與ATRA相比，對細胞的生長抑制作用有較大的提高。表1.目標化合物對HL-60細胞才朱作用的IC50 化合物 IC5Q (mol/L)Ara-C 3.80E-07ATRA 3.46E-04ATRA+Ara-C 2.36E-07ATRA—Ara-C 1.41E-06實驗例2維甲醯那糖胞苷綴合物及其藥質體對S湖腹水小鼠的治療作用受試化合物實施例1所製備的維曱醯那糖胞苷綴合物(RAA);實施例2所 製備的維甲醯那糖胞苦綴合物的藥質體；建立模型取腹腔接種了 S則腹水瘤第8天的昆明種小鼠一隻，脫頸推處死， 浸泡於75%酒精內5分鐘後置於超淨臺內，用4聶子夾起腹部中線偏右的皮趺，用小 剪刀剪一小口至可見乳白色腹水流出，於開口處用吸管輕輕插入腹腔吸出腹水轉移 至15ml無菌離心管內，以生理鹽水適量稀釋，1000轉/分離心5分鐘，棄去上清液後，加9ml滅菌生理鹽水，用吸管輕輕吹打使瘤細胞均勻懸浮，1000轉/分離心5 分鐘,棄去上清液，加入滅菌生理鹽水15ml，用吸管輕輕吹打懸浮，1000轉/分離心 5分鐘，棄去上清液，加入10ml生理鹽水，再次用吸管輕輕吹打均勻，取100ul該 懸浮液加至9.9ml滅菌生理鹽水中，混勻，得100倍稀釋液，混勻，加蓋，放入冰 中待用。取100ul上述瘤細胞稀釋液置入Eppendoff小管中，加100ul臺盼蘭染液， 混勻，取少許該混勻液加至計數板的計數池內，於顯微鏡下計算4個大格中被染上 藍色的存活瘤細胞的個數，將原液中的存活瘤細胞稀釋成1.0xl(^個/ml，放置於冰 上以備用於接種。用碘伏和75 %酒精棉球將雄性昆明種小鼠(20士2g)右側腋下消毒， 用lml無菌注射器將0.2ml腹水瘤細胞接種液，接種於已消毒的小鼠右側腋下皮內， 按此方法給每批昆明種小鼠接種肺瘤懸液，完畢後隨機分組，》文入動物室伺養。 藥物配製本實騶，沒藥物混懸劑和藥質體兩種劑型；混懸劑治療組為實施例1所製備的維曱醯那糖胞苷綴合物的CMC-Na混懸液， 陽性對照為全反式維曱酸(ATRA)、阿糖胞苷阿糖胞苷(Ara-C)和維曱酸與阿糖 胞苷的物理混合物(ATRA+Ara-C)的CMC-Na溶液，陰性對照為CMC-Na溶液；藥質體治療組為各化合物的藥質體，分散體系為滅菌的PBS溶液，陽性對照是 全反式維甲酸、阿糖胞苷和維曱酸與阿糖胞香的物理混合物的脂質體，陰性對照為 空白脂質體；各組藥物以3.3xl(T5 mmol/g等摩爾配製，藥質體均用實施例2所述的 薄膜分散法製備，分散體系為滅菌的PBS溶液；藥物混懸液製備稱取藥物，研碎， 用0.5。/。CMC-Na製成混懸液。實驗方法將右側腋下接種有腹水瘤的小鼠隨機分組，每組10隻，共8組。 各組小鼠正常飼養，每天腹腔注射上述藥物，0.2ml/只。8天後將各組荷瘤小鼠處死， 取瘤稱重，按抑瘤率=[(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重]x100 %計算抑瘤率。所得的數據以(X士SD)表示，組間用雙樣本等方差的t檢驗。結 果見表2，表3表2. RAA的混懸劑對S則腹水小鼠的治療作用混懸劑 瘤重/體重 抑瘤率ATRA 0.049±0.033 # 34.2%Ara-C 0.034±0.022 * 58.4%RAA 0.030±0.024 * 63.5%ATRA+Ara誦C 0.031±0.024* 62.9%CMC隱Na 0.082±0.027n=10,#)與CMC-Na組瘤重比豐支，P0.05。 混懸組與藥質體組組間均P>0.05。
權利要求
1、維甲醯阿糖胞苷綴合物，其結構式為式I所示 top= "37" left = "46"/>式I。
2、 一種製備權利要求1所述甲醯阿糖胞苷綴合物的方法，包括將全反式維曱 酸與阿糖胞苷的4'位氨基偶聯，即得。
3、 按照權利要求2的方法，其特徵在於在DCC/EDC和HOBt存在下，將全 反式維曱酸與阿糖胞苦的4'位氨基進行偶聯。
4、 含有權利要求1所述曱醯阿糖胞苷綴合物的藥質體。
5、 按照權利要求4所述的藥質體，其特徵在於該藥質體的粒徑為150 250nrn, Zeta電位為-30 ~ -70mV。
6、 一種製備權利要求5所述藥質體的方法，包括將磷脂和權利要求l所述曱 醯阿糖胞苷綴合物用氯仿溶解，旋轉蒸發去除溶劑，加入磷酸鹽緩衝液，超聲分散， 即得。
7、 按照權利要求l所述維曱醯阿糖胞苷綴合物，其特徵在於按照藥物製劑常 規方法製備成微乳劑、乳劑、脂質納米粒或脂質體。
8、 一種治療腫瘤的藥用組合物，該藥用組合物由治療上有效量的權利要求l所 述的式I化合物或權利要求4所述的藥質體與藥學上可接受的賦型劑或者載體組成。
9、 權利要求1所述的甲醯阿糖胞普綴合物在製備抗腫瘤藥物中的用途。
10、 權利要求4所述的藥質體在製備抗腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開具有兩親性的維甲醯阿糖胞苷綴合物以及由該綴合物構建而得的藥質體，本發明還公開了它們的製備方法以及它們作為抗腫瘤劑的應用。本發明將全反式維甲酸與阿糖胞苷4』位氨基偶聯，獲得具有兩親性的維甲醯阿糖胞苷綴合物，該綴合物具備自組裝為藥質體的特性，既可保護阿糖胞苷4』位氨基失活，又可使該綴合物及所製備的藥質體具有腫瘤靶向性。本發明分別用人白血病細胞HL-60和S180腹水癌小鼠評價了本發明式I化合物及由該化合物所製備藥質體的體外和體內抗腫瘤活性，實驗結果表明，本發明式I化合物及其藥質體具有優秀的抗腫瘤活性。
文檔編號A61K31/7068GK101597312SQ200810114699
公開日2009年12月9日 申請日期2008年6月6日 優先權日2008年6月6日
發明者崔國輝, 崔純瑩, 張雲瑋 申請人:首都醫科大學