治療劑的製作方法

2023-08-02 16:39:01

專利名稱：治療劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及源於水生生物的生理活性物質作為藥物、食品、飲料或飼料的用途。
作為巖藻依聚糖的生理作用，已知癌增殖抑制活性、癌轉移抑制活性、抗凝血活性、抗病毒活性等，期待開發作為藥品的用途。
如果概括地描述本發明，本發明的第1項發明涉及需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的治療劑或預防劑，其特徵在於，含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。
本發明的第2項發明涉及調節細胞因子生成用食品、飲料或飼料、誘導一氧化氮產生用食品、飲料或飼料或者抗變態反應用食品、飲料或飼料，其特徵在於，含有巖藻依聚糖和/或其分解產物。
另外，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病中的用途；巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的治療劑或預防劑中的用途；或者使用巖藻依聚糖和/或其分解產物治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的方法。
而且，作為本發明的一種方式，涉及含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的細胞因子生成調節劑、一氧化氮產生誘導劑、抗變態反應劑或IgE產生抑制劑。
而且，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備細胞因子生成調節劑、一氧化氮產生誘導劑、抗變態反應劑或IgE產生抑制劑中的用途。
而且，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備調節細胞因子生成用食品、飲料或飼料、誘導一氧化氮產生用食品、飲料或飼料或者抗變態反應用食品、飲料或飼料中的用途。
而且，作為本發明的一種方式，涉及使用巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的細胞因子生成調節方法、一氧化氮產生誘導方法、變態反應抑制方法或IgE產生抑制方法。
而且，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在調節細胞因子生成、誘導一氧化氮產生、抑制變態反應或抑制IgE產生中的用途。
作為本發明更優選的方式，巖藻依聚糖和/或其分解產物對於調節抗原致敏時，例如抗原呈遞細胞和T細胞之間的抗原呈遞時的細胞因子生成具有顯著效果。另外，巖藻依聚糖和/或其分解產物對於治療抗原致敏後的變應性疾病，特別是抑制抗原致敏後的抗原特異性IgE產生具有顯著效果。另外，本發明中，細胞因子生成調節劑包括通過增強、促進細胞因子類的生成等，調節細胞因子的產量。
因此，作為本發明的一種方式，涉及抗原致敏時需要調節細胞因子生成的疾病或抗原致敏後的變應性疾病的治療劑或預防劑，其特徵在於含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。
另外，本發明的一種方式涉及抗原致敏時調節細胞因子產生用食品，飲料或飼料，或抗原致敏後的抗變態反應用食品、飲料或飼料，其特徵在於含有巖藻依聚糖和/或其分解產物。
另外，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在治療或預防抗原致敏時需要調節細胞因子生成的疾病或抗原致敏後的變應性疾病中的用途；巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備抗原致敏時需要調節細胞因子生成的疾病或抗原致敏後的變應性疾病的治療劑或預防劑中的用途；或者使用巖藻依聚糖和/或其分解產物治療或預防抗原致敏時需要調節細胞因子生成的疾病或抗原致敏後的變應性疾病的方法。
而且，作為本發明的一種方式，涉及含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的抗原致敏時的細胞因子生成調節劑、抗原致敏後的抗變態反應劑或IgE產生抑制劑。
而且，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備抗原致敏時的細胞因子生成調節劑、抗原致敏後的抗變態反應劑或抗原致敏後的IgE產生抑制劑中的用途。
而且，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備調節抗原致敏時的細胞因子生成用食品、飲料或飼料、或者抗原致敏後的抗變態反應用食品、飲料或飼料中的用途。
而且，作為本發明的一種方式，涉及使用巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的抗原致敏時的細胞因子生成調節方法、抗原致敏後的變態反應抑制方法或抗原致敏後的IgE產生抑制方法。
而且，作為本發明的一種方式，涉及巖藻依聚糖和/或其分解產物在調節抗原致敏時的細胞因子生成、抑制抗原致敏後的變態反應或抑制抗原致敏後的IgE產生中的用途。
本發明中使用的巖藻依聚糖沒有特別的限定，優選例如源於藻類的巖藻依聚糖或源於棘皮動物的巖藻依聚糖。
另外，作為巖藻依聚糖的分解物，可使用例如巖藻依聚糖的酸分解物，巖藻依聚糖的酶分解物。
作為本發明中使用的巖藻依聚糖、巖藻依聚糖的分解產物，例如巖藻依聚糖的酸分解產物、巖藻依聚糖的酶分解產物，只要是顯示細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、或抗變態反應作用，例如IgE產生抑制作用等，沒有特別的限定，能夠以上述作用等作為指標適當配製。
另外，本說明書中所說的細胞因子特別是指巖藻依聚糖或其分解產物能夠顯示生成調節作用的細胞因子，例如白介素類(如白介素-12)、幹擾素類(如幹擾素-γ)。
而且，抗變態反應作用是指巖藻依聚糖或其分解產物能夠顯示的變態反應抑制作用，例如IgE產生抑制作用。


圖1是表示源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脫曲線的圖。
圖2是表示添加7-12SFd-F培養時培養基中的NO2-濃度的圖。
圖3是表示添加級分I培養時培養基中的NO2-濃度的圖。
圖4是表示添加級分II培養時培養基中的NO2-濃度的圖。
圖5是表示添加級分III培養時培養基中的NO2-濃度的圖。
圖6是表示添加陽性對照的LPS培養時培養基中的NO2-濃度的圖。
圖7是表示巖藻依聚糖及其分解產物的IFN-γ產生誘導作用的圖。
圖8是表示巖藻依聚糖及其分解產物的IL-12產生誘導作用的圖。
圖9是表示源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖對小鼠脾臟淋巴細胞的細胞毒性免疫增強作用的圖。
圖10是表示G-巖藻依聚糖的IFN-γ產生誘導作用的圖。
圖11是表示G-巖藻依聚糖的IL-12產生誘導作用的圖。
圖12表示各種抗體對巖藻依聚糖的IFN-γ或IL-12產生誘導作用的作用。
圖13是表示各種巖藻依聚糖的IFN-γ產生誘導作用的圖。
發明的最佳實施方式本發明使用的巖藻依聚糖是含有硫酸化巖藻糖作為構成成分的多糖，只要具有細胞因子類生成調節作用，例如抗原呈遞細胞(APC)和T細胞之間的抗原呈遞反應時的幹擾素-γ產生調節作用、白介素-12產生調節作用；一氧化氮產生誘導作用；或抗變態反應作用，例如IgE產生抑制作用，並沒有特別的限定。例如，藻類中的Kjellmaniella crassifolia、Kjellmaniella gyrata、墨角藻屬(Fucus)、衝繩海蘊(Cladosiphon okamuranus)、裙帶菜屬(Undaria)、昆布(Ecklonia kurome)、茶色海藻(Eiseniabicyclis)、褐藻(Ecklonia cava)、巨藻(Giant kelp)、黑巨藻(Lessonia nigrescence)、泡葉藻(Ascophyllum nodosum)等海帶目(Laminariales)、索藻目(Chordariales)、巖藻目(Fucales)海藻富含適用於本發明的巖藻依聚糖，適合作為原料。另外，也可以使用源於棘皮動物，例如海參、海膽、海星等的巖藻依聚糖。
這些巖藻依聚糖的製備可以分別按照公知的方法製備，在本發明中可以使用純化品或含有該巖藻依聚糖的物質等。
例如由Kjellmaniella crassifolia製備巖藻依聚糖，該巖藻依聚糖可以進一步分離成含有葡萄糖醛酸的巖藻依聚糖(稱為U-巖藻依聚糖)和不含葡萄糖醛酸的巖藻依聚糖(稱為F-巖藻依聚糖)。這些巖藻依聚糖可以用作本發明的治療劑或預防劑等的有效成分。另外，也可以由Kjellmaniella crassifolia製備硫酸化巖藻半乳聚糖(稱為G-巖藻依聚糖)使用。
U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖在由Kjellmaniellacrassifolia製備巖藻依聚糖後，用陰離子交換樹脂、表面活性劑等分離。源於Kjellmaniella crassifolia的U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖的存在比按重量比約為1∶2，U-巖藻依聚糖含有巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等，硫酸含量為約20重量％，F-巖藻依聚糖含有巖藻糖和半乳糖，硫酸含量為約50重量％，兩種物質的分子量均以約20萬為中心分布(第18次糖質討論會要旨集，第159頁，1996年)。
例如將由Kjellmaniella crassifolia製備的巖藻依聚糖溶液施於DEAE-Cellulofine A-800柱上後，用含有NaCl的緩衝液按濃度梯度法進行洗脫，可以分離U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖。圖1表示其中的一個實例。也就是說，圖1是表示U-巖藻依聚糖和F-巖藻依聚糖的分離的圖，圖中前峰為U-巖藻依聚糖，後峰為F-巖藻依聚糖。
另外，通過將源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖用交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)產生的F-巖藻依聚糖特異分解酶以及黃桿菌屬(Flavobacteriumsp.)SA-0082(FERM BP-5402)產生的U-巖藻依聚糖特異分解酶分解，除去分解產物，可以純化上述G-巖藻依聚糖。
另外，源於墨角藻屬的巖藻依聚糖、源於Cladosiphonokamuranus的巖藻依聚糖、源於裙帶菜屬的巖藻依聚糖、源於裙帶菜(Undaria pinnatifida)的巖藻依聚糖也可以按照公知的方法製備，用於本發明。
本發明中適用的源於棘皮動物的巖藻依聚糖，例如特開平4-91027號公報中記載的海參中含有的巖藻依聚糖，可以按照該公報中記載的方法由海參製備該巖藻依聚糖。
另外，本發明中使用的具有細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用的巖藻依聚糖分解產物可以按照酶學方法、化學方法、物理方法等公知的方法，選擇具有所需的細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用的分解產物後使用。
作為所述巖藻依聚糖的分解產物的製備方法，例如有酸分解法，可以通過對該巖藻依聚糖進行酸分解，製備具有細胞因子生成調節作用、免疫激活作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用的分解產物。
上述酸分解法的酸分解條件只要是生成具有細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用的分解產物(以下稱為本發明的分解產物)的條件即可，沒有特別的限定。
例如通過將巖藻依聚糖溶解或懸濁於酸中，使之反應，生成本發明的分解產物。另外，通過在反應時進行加熱，可以縮短生成本發明的分解產物所必需的時間。
溶解或懸濁巖藻依聚糖的酸的種類沒有特別的限定，可以使用鹽酸、硫酸、硝酸等無機酸，枸櫞酸、甲酸、醋酸、乳酸、抗壞血酸等有機酸，以及陽離子交換樹脂、陽離子交換纖維、陽離子交換膜等固體酸。
酸的濃度沒有特別的限定，優選以0.0001～5N，更優選以0.01～1N的濃度使用。另外，反應溫度也沒有特別的限定，優選設定為0～200℃，更優選20～130℃。
另外，反應時間也沒有特別的限定，優選設定為數秒～數日。酸的種類和濃度、反應溫度和反應時間最好根據本發明分解產物的產量、分解產物的聚合度適當選擇。另外，製備本發明的分解產物時，優選使用枸櫞酸、乳酸、蘋果酸等有機酸，酸的濃度在10mM～數M的範圍內選擇，加熱溫度在50～110℃，更優選在70～95℃的範圍內選擇，加熱時間在數分鐘～24小時的範圍內選擇，可以製備本發明的分解產物。作為巖藻依聚糖的酸分解產物，例如源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的酸分解產物，該分解產物可以作為具有細胞因子生成調節作用，特別是APC和T細胞之間的抗原呈遞反應時的幹擾素-γ產生調節作用，一氧化氮產生誘導作用以及抗變態反應作用的強效新生理功能的食物纖維使用。
本發明的分解產物能夠以細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用為指標進行分級，例如可以按照凝膠過濾法、採用分子量分級膜的分級法等對酸分解產物進一步進行分子量分級。
作為凝膠過濾法的實例，使用Cellulofine GCL-300，可以製備例如分子量大於25000、分子量25000～大於10000、分子量10000～大於5000、分子量5000以下等任意的分子量級分，使用CellulofineGCL-25，可以將分子量為5000以下的級分製備成分子量5000～大於3000、分子量3000～大於2000、分子量2000～大於1000、分子量1000～大於500、分子量500以下等任意的分子量級分。
另外，也可以使用超濾膜進行工業分子量分級，例如可以通過使用DAICEL公司生產的FE10-FUS0382製備分子量30000以下的級分，或者通過使用DAICEL公司生產的FE-FUS-T653製備分子量6000以下的級分。也可以進一步使用納米濾膜得到分子量500以下的級分，可以通過將這些凝膠過濾法、分子量分級法組合，製備任意的分子量級分。
作為本發明中能夠使用的具有細胞因子生產調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用的巖藻依聚糖分解產物，例如下述式(I)～式(IV)表示的化合物，這些化合物可以按照國際公開第97/26896號說明書、國際申請號PCT/JP99/00606號說明書、國際申請號PCT/JP00/00965號說明書中記載的方法製備。另外，作為本發明的巖藻依聚糖分解產物，也包括國際公開第97/26896號、國際申請號PCT/JP99/00606號說明書、國際申請號PCT/JP00/00965號說明書中記載的巖藻依聚糖分解產物。另外，具有式(I)所示化合物的重複結構的巖藻依聚糖以及低聚糖也可以適用於本發明。 (式中，R為OH或OSO3H。) (式中，R為OH或OSO3H。) (式中，R為OH或OSO3H。) (式中，R為OH或OSO3H。)另外，作為式(I)所示化合物的實例，例如下述式(V)表示的化合物。
式(I)表示的化合物例如可以通過用交替單胞菌屬SN-1009(FERM BP-5747)產生的內切型硫酸化多糖分解酶(F-巖藻依聚糖特異分解酶)處理上述F-巖藻依聚糖，由其分解產物純化得到。關於該化合物中硫酸酯基的含量、部位，可以由其分解產物中純化得到任意的物質。另外，該分解產物中也含有式(I)所示化合物的聚合物，可以根據目的進行分離、純化。
式(II)表示的化合物和式(III)表示的化合物分別可以通過例如用黃桿菌屬SA-0082(FERM BP-5402)產生的內切型硫酸化多糖分解酶(U-巖藻依聚糖特異分解酶)處理上述U-巖藻依聚糖，由其分解產物純化得到。針對該化合物中硫酸酯基的含量、部位，可以由其分解產物中純化得到任意的物質。另外，該分解產物中也含有以式(II)所示化合物中沒有雙鍵的化合物作為基本骨架的聚合物，可以根據目的進行分離、純化。
式(IV)表示的化合物例如可以通過使從黃桿菌屬SA-0082(FERMBP-5402)得到的特異地分解G-巖藻依聚糖的內切型硫酸化多糖分解酶(G-巖藻依聚糖特異分解酶)作用於G-巖藻依聚糖，製備該G-巖藻依聚糖的分解產物，由該分解產物純化得到。針對該化合物中硫酸酯基的含量、部位，可以由其分解產物中純化得到任意的物質。另外，該分解產物中也含有以式(IV)所示化合物為基本骨架的聚合物，可以根據目的進行分離、純化。
另外，巖藻依聚糖或其分解產物的細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用或抗變態反應作用按照例如後述實施例1、2、7和8記載的方法檢定。作為被測對象的巖藻依聚糖或其分解產物顯示所述作用時，以其作為指標選擇本發明中可以使用的巖藻依聚糖或其分解產物。
在本發明中，能夠通過巖藻依聚糖或其分解產物調節生成的細胞因子沒有特別的限定，例如白介素(IL)-1～18、幹擾素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、淋巴毒素、腫瘤壞死因子(TNF)、幹細胞因子(SCF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)等。
這些細胞因子包括以延遲型過敏反應或靶細胞障礙為主與各種細胞性免疫反應的表達或調節有關的細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α、TNF-β等)、在抗體產生機理中與其調節功能有關的細胞因子(IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等)、對腫瘤細胞直接顯示增殖抑制作用或破壞作用的細胞因子(TNF-α、TNF-β、IFN等)、促進骨髓中的造血幹細胞或前體細胞增殖、分化的細胞因子(IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等)、與炎症反應有關的細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TNF-β、IFN等)、與變態反應有關的細胞因子(IL-3、IL-4、IL-5等)、增強NK細胞活性的細胞因子(IL-12)等。另外，本發明中使用的巖藻依聚糖和/或其分解產物具有的細胞因子生成調節作用是指僅僅在存在病毒感染或癌等體內應排除的抗原，必須增強細胞性免疫時，能夠選擇性產生的細胞因子生成調節作用，例如IFN-γ、IL-12的產生誘導作用或者其產生增強作用或產生促進作用。因此，該巖藻依聚糖和/或其分解產物不會導致不必要狀態下的免疫系統活化或增強，因而不會引起變態反應症狀、自身免疫疾病等疾病，是非常安全而且有效的成分。另外，該巖藻依聚糖和/或其分解產物也可以增強細胞毒性免疫，例如增強淋巴細胞的細胞毒性。
因此，使用巖藻依聚糖和/或其分解產物，通過調節這些細胞因子的生成，能夠治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病，例如癌等需要表達或調節細胞性免疫反應的疾病，自身免疫疾病等需要調節抗體產生的疾病，貧血、糖尿病等需要細胞分化的疾病，敗血症性休克、炎症性腸疾病、慢性關節風溼、多發性硬化、葡萄膜炎等需要抑制炎症的疾病。
本發明中使用的巖藻依聚糖及其分解產物具有細胞因子生成調節作用，能夠以這些化合物作為有效成分製備需要調節細胞因子生成的上述疾病的治療劑或預防劑。
另外，本發明中使用的巖藻依聚糖及其分解產物具有一氧化氮產生誘導作用，使用這些化合物作為有效成分，能夠治療或預防需要產生一氧化氮的疾病，例如需要鬆弛血管平滑肌、抑制血小板、粒細胞和單核細胞向血管壁粘附、阻止分泌性平滑肌細胞增殖等的動脈硬化。另外，該巖藻依聚糖及其分解產物也可以通過上述作用發揮免疫激活效果。另外，一氧化氮產生誘導作用也包括誘導增強作用或誘導促進作用。
而且，本發明中使用的巖藻依聚糖及其分解產物具有抗變態反應作用，例如IgE產生抑制作用，使用這些化合物作為有效成分，能夠治療或預防變應性疾病，例如由於產生IgE介導的或惡化的症狀，例如IgE引起的變應性疾病，如支氣管哮喘、變應性鼻炎、特應性皮炎、變應性結膜炎、蕁麻疹、過敏性休克等。
另外，上述巖藻依聚糖的特定級分，特別是F-巖藻依聚糖、U-巖藻依聚糖、G-巖藻依聚糖，是基本結構初次確定的巖藻依聚糖級分，在這一點上，使用特異地作用於各級分的酶製備的各種分解產物，特別是其分解產物的級分，例如式(I)～(IV)等化合物是分子量較巖藻依聚糖低的分子；而且與巖藻依聚糖具有同等的生理活性，在這一點上，與結構、組成、物性不明確的簡單分離得到的巖藻依聚糖或含有巖藻依聚糖的物質相比顯著優良。
在本發明中，提供一種需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的治療劑或預防劑，其中含有上述巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。
特別是作為本發明的需要調節細胞因子生成的疾病的治療劑或預防劑，從有效性的觀點來看，優選需要調節白介素類或幹擾素類生成的疾病的治療劑或預防劑，更優選需要調節幹擾素-γ或白介素-12生成的疾病的治療劑或預防劑。另外，本發明的變應性疾病的治療劑或預防劑具有抗原致敏後的IgE產生抑制作用，且通過口服給藥具有抗原致敏後的IgE產生抑制作用，在這一點上，是非常有用的抗變態反應劑。而且，本發明的變應性疾病的治療劑或預防劑能夠通過口服給藥抑制特別是在花粉病樣由抗原致敏產生的症狀中的抗原特異性IgE產生，在這一點上顯著優良。因此，作為變應性疾病的治療劑或預防劑，優選需要抑制IgE產生的疾病的治療劑或預防劑。
本發明的治療劑或預防劑以巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分，通過將其與公知的藥用載體組合製成製劑得到。該製劑的製備一般通過將巖藻依聚糖和/或其分解產物與藥學上允許的液狀或固體狀的載體配合，並根據需要加入溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、穩定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等，製成片劑、顆粒劑、散劑、粉末劑、膠囊劑等固體製劑、溶液劑、懸濁劑、乳劑等液體製劑進行。另外，也可以製成能夠在使用之前添加適當的載體形成液狀的乾燥品。
藥用載體可以根據本發明的治療劑或預防劑的給藥方式和劑型適當選擇。
口服劑的場合，可以利用例如澱粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米澱粉、無機鹽等。另外，配製口服劑時，也可以進一步配合粘結劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、助流劑、矯味劑、著色劑、香料等。
另一方面，非口服劑的場合，可以按照常規方法使本發明的有效成分巖藻依聚糖和/或其分解產物溶解或懸濁於作為稀釋劑的注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根據需要加入殺菌劑、穩定劑、等滲劑、止痛劑等進行配製。
本發明的治療劑或預防劑可以根據製劑形態採用適當的給藥途徑給藥。另外，給藥方法也沒有特別的限定，可以內用、外用和注射。注射劑可以在靜脈內、肌肉內、皮下、真皮內等給藥，外用劑也包括栓劑等。另外，所述治療劑或預防劑從其有效性的觀點來看，優選口服用治療劑或口服用預防劑。
本發明的治療劑或預防劑的給藥量並不是一定的，可以根據其製劑形態、給藥方法、使用目的及其適用的患者年齡、體重、症狀適當設定，一般製劑中含有的巖藻依聚糖和/或其分解產物的量優選成人每天0.1～2000mg/kg。因此，本發明的治療劑或預防劑中巖藻依聚糖和/或其分解產物的含量最好適當決定，使得通過給予該治療劑或預防劑至少能夠在上述範圍內給予巖藻依聚糖和/或其分解產物。另外，給藥量根據種種條件變化，因此有時採用低於上述給藥量的量就足夠，或者有時必須超過上述範圍。本發明的治療劑或預防劑可以直接口服給藥，也可以添加到任意的飲食品中使之日常攝取。另外，也可以使用巖藻依聚糖和/或其分解產物作為調節細胞因子生成用飲食品或飼料、誘導一氧化氮產生用飲食品或飼料、抗變態反應用飲食品或飼料的原料。
另外，作為本發明的一種方式，提供一種巖藻依聚糖和/或其分解產物在治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病中的用途；或者使用巖藻依聚糖和/或其分解產物治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的方法。
為了治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病，最好按上述例舉的範圍給予巖藻依聚糖和/或其分解產物，例如適當給予本發明的治療劑或預防劑。
而且，作為本發明的一種方式，提供含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的細胞因子生成調節劑，例如IFN-γ生成調節劑、IL-12生成調節劑；一氧化氮產生誘導劑；或抗變態反應劑，例如IgE產生抑制劑。這些藥物可以按照上述治療劑或預防劑製備。例如細胞因子生成調節劑對研究細胞因子的功能、篩選與細胞因子有關的疾病用藥物是有用的。這些藥物的劑型、用量等只要可以相應於各種用途得到該藥物發揮的所需效果即可，沒有特別的限定。另外，對於上述例舉的疾病等也可以適用。
而且，作為本發明的一種方式，提供巖藻依聚糖和/或其分解產物在調節細胞因子生成、誘導一氧化氮產生、抑制變態反應或抑制IgE產生中的用途；或使用巖藻依聚糖和/或其分解產物的細胞因子生成調節方法、一氧化氮產生誘導方法、變態反應抑制方法或IgE產生抑制方法。
為了調節細胞因子生成、誘導一氧化氮產生、抑制變態反應或抑制IgE產生，可以使用上述細胞因子生成調節劑、一氧化氮產生誘導劑等以根據各種用途獲得所需的效果。
以下說明本發明使用的巖藻依聚糖或其分解產物的推定藥理作用。
關於從淋巴細胞誘導產生IFN-γ，已知ConA等促細胞分裂劑對T細胞直接刺激產生的誘導以及抗原致敏時抗原呈遞細胞(APC)和T細胞的細胞間相互作用產生的誘導。前者是促細胞分裂劑對T細胞受體直接結合產生的誘導，後者是APC與T細胞各受體的刺激以及通過該刺激由APC產生的IL-12引起的誘導。作為與IL-12產生誘導有關的受體反應，除T細胞受體(TCR)/主要組織相容複合體(MHC)以外，作為副刺激，已知T細胞側的CD40L和APC側的CD40、以及T細胞側的CD28和APC側的B7的各種反應。
以前，有報導稱源於海帶(Laminaria japonika)的巖藻依聚糖誘導源於正常小鼠的脾臟淋巴細胞產生IFN-γ，增強NK細胞的活化(中國海洋藥物雜誌，1995第3期，9～13)，但這是對處於靜止期的原初T細胞直接刺激產生的誘導。
另一方面，關於這次本發明人等確認的源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖及其級分的IFN-γ產生誘導作用，如實施例所示，確認沒有直接刺激淋巴細胞或刺激同種異源抗原時的誘導作用，僅在致敏淋巴細胞的抗原刺激下促進IFN-γ產生。而且，確認這時誘導IL-12產生。這種抗原呈遞反應時的IFN-γ產生誘導作用在由抗IL-12抗體中和產生的IL-12時抑制約50％，在通過抗CD40抗體和抗CD28抗體抑制這些受體反應時則完全抑制。因此，關於來源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖及其級分的IFN-γ產生誘導作用機理，推測可能是由於在抗原呈遞反應時對APC作用促進IL-12產生引起的，以及對由於APC細胞和T細胞的相互作用處於活化狀態的T細胞作用誘導的。
發現對靜止期T細胞的直接誘導作用的上述報導中記載的巖藻依聚糖和本發明中使用的源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖不同，其結果顯示完全不同的作用。
另外，在使用抗原呈遞細胞之一的巨噬細胞株的系統中，巖藻依聚糖及其分解產物誘導一氧化氮產生，並基於這種誘導顯示免疫激活效果，但是即使在這種系統中，也未見巖藻依聚糖及其分解產物誘導IFN-γ產生，認為本發明中使用的巖藻依聚糖及其分解產物沒有直接誘導IFN-γ產生的活性，促進一氧化氮產生與促進IL-12產生平行，因此可以推測本發明的巖藻依聚糖及其分解產物引起的IFN-γ產生增強不是由於靜止期T細胞的直接刺激引起的誘導，而是抗原呈遞反應時對APC作用促進IL-12產生引起的，以及對由於APC與T細胞的相互作用處於活化狀態的T細胞作用誘導的。基於這一點，本發明中使用的巖藻依聚糖及其分解產物顯示與發現直接誘導作用的上述報導完全不同的作用。
另外，IFN-γ在T細胞(Th1)的T細胞受體被抗原呈遞細胞(APC)等刺激時產生，並通過APC產生的IL-12促進產生。IFN-γ在病毒、真菌感染以及癌疾病等中具有使NK細胞、巨噬細胞等細胞性免疫活化，發揮增強生物防禦能力的作用。
另一方面，已知IFN-γ能抑制作為以哮喘、花粉病、特異性皮炎等為代表的變態反應疾病的發生原因的Th2細胞活化。Th2細胞誘導免疫球蛋白E抗體(IgE)產生。產生的IgE與肥大細胞的細胞膜上的受體結合，引起肥大細胞釋放化學介質。以這種炎症性介質為出現變態反應症狀的直接原因。
本發明的抗變態反應劑在抗原致敏後的口服給藥中，抑制IgE產生，對於改善發病後的以哮喘、花粉病、特異性皮炎等為代表的變應性疾病的症狀非常有用。
而且，本發明提供含有巖藻依聚糖和/或其分解產物的調節細胞因子生成用食品或飲料、誘導一氧化氮產生用食品或飲料或者抗變態反應用食品或飲料。
特別是作為本發明的調節細胞因子生成用食品或飲料，從有效性的觀點來看，優選調節白介素類或幹擾素類生成用食品或飲料，更優選調節幹擾素-γ或白介素-12生成用食品或飲料。
另外，本發明的抗變態反應用食品或飲料具有抗原致敏後的IgE產生抑制作用，通過攝取發揮抗原致敏後的IgE產生抑制作用，在這一點上，是非常有用的食品或飲料。因此，作為抗變態反應用食品或飲料，優選抑制IgE產生用食品或飲料。
另外，關於後述的飼料，基於同樣的觀點也優選具有這些作用的飼料。
所述食品或飲料基於其細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用，對於改善、預防對巖藻依聚糖或其分解產物顯示敏感性的需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病、變應性疾病的症狀是非常有用的。
另外，本發明的食品、飲料或飼料、後述化妝品中所謂「含有」這一用語包括含有、添加、稀釋的含義，含有是指食品、飲料等中含有本發明使用的有效成分這種狀態，添加是指在食品、飲料等的原料中添加本發明使用的有效成分這種狀態，稀釋是指在本發明使用的有效成分中添加食品、飲料等的原料這種狀態。
本發明的食品或飲料的製備方法可以按照公知的方法進行，沒有特別的限定。作為所述的製備方法，可以列舉烹調、加工以及一般採用的食品或飲料的製備方法，只要製得的食品或飲料中含有具有細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用和抗變態反應作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分即可。
本發明的食品或飲料沒有特別的限定，例如含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的穀類加工品(小麥粉加工品、澱粉加工品、預混合加工品、面類、通心粉類、麵包類、餡類、蕎麥麵類、麩子、米粉、粉條、包裝餅等)，油脂加工品(可塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黃醬類、調味汁等)，大豆加工品(豆腐類、豆醬、納豆等)，肉類加工品(火腿、燻豬肉、壓縮火腿、香腸等)，水產品(冷凍碎魚肉、魚糕、魚卷、魚肉山芋蒸餅、油炸魚丸子、汆魚丸子、飯卷、魚肉火腿、香腸、幹狐鰹、魚子加工品、水產品罐頭、煮的魚貝等)，乳製品(原料乳、乳酪、酸乳、奶油、乾酪、煉乳、乳粉、冰淇淋等)，蔬菜·果實加工品(餡類、果醬類、醃菜類、果類飲料、蔬菜飲料、混合飲料等)，糖果類(巧克力、餅乾類、甜點類、蛋糕、年糕、米糕類等)，酒精飲料(日本酒、中國酒、葡萄酒、威士忌酒、日本蒸餾酒、伏特加酒、白蘭地、杜松子酒、糖蜜酒、啤酒、清涼醇飲料、果酒、利口酒等)，嗜好飲料(綠茶、紅茶、烏龍茶、咖啡、清涼飲料、乳酸飲料等)，調料(醬油、辣醬油、醋、料酒等)，罐裝、瓶裝、袋裝食品(牛肉蓋飯、小鍋什錦飯、紅小豆飯、咖哩飯、其它各種烹調好的食品)，半乾燥或濃縮食品(肝醬、其它塗抹果醬的食品、蕎麥·麵條的汁、濃縮的湯類)，乾燥食品(速食麵類、速食咖哩飯、速溶咖啡、果汁粉、湯粉、速食醬類、烹調好的食品、烹調好的飲料、烹調好的湯等)，冷凍食品(素燒、蒸雞蛋羹、烤鰻魚串、漢堡包、燒麥、餃子、各種麵條、雞尾酒等)，固態食品、液態食品(湯等)，香料類等農產·林產加工品、畜牧加工品、水產加工品等。
作為本發明的食品或飲料，含有具有選自細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用等生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物，只要含有用於表達其生理作用的必要量即可，對其形狀沒有特別的限定，也包括片狀、顆粒狀、膠囊狀等能夠口服攝取的形狀。
巖藻依聚糖和/或其分解產物在食品或飲料中的含量可以根據其功能和生理活性適當選擇，例如每100重量份食品為10-9重量份以上，優選10-7～2重量份，例如每100重量份飲料為10-9重量份以上，優選10-7～2重量份。另外，例如成人每天最好攝取巖藻依聚糖和/或其分解產物達到0.01～2000mg/kg。
另外，具有選自細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用等生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物作為同時具有該生理作用和食物纖維功能的健康食品材料、作為食品或飲料的製造材料是非常有用的。
而且，按照本發明，還提供一種含有具有選自細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用等生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的生物用飼料。
另外，作為本發明的一種方式，提供將具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物給予生物的生物飼養方法。
另外，作為本發明的一種方式，提供含有具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物的生物飼養用劑。
在這些發明中，生物是指例如養殖動物、寵物等，作為養殖動物，例如家畜、試驗動物、家禽、魚類、甲殼類或貝類。
作為飼料，例如基於巖藻依聚糖和/或其分解產物的生理作用的身體狀況改善用飼料。
作為飼養用劑，例如浸漬用劑、飼料添加劑、飲料用添加劑。
這些發明中，具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物具有提高生物的飼養效率，例如存活率、養肥率、產卵率、產仔率、斷奶率等的效果。
在將巖藻依聚糖和/或其分解產物給予生物的生物飼養方法中，通常每1kg對象生物的體重、每天優選給予具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物0.01～2000mg/kg。給藥可以通過例如將巖藻依聚糖和/或其分解產物添加、混合到人工配合飼料的原料中，或與人工配合飼料的粉末原料混合後，添加、混合到其它原料中進行。另外，也可以給予本發明的飼料，使之能夠達到所述巖藻依聚糖和/或其分解產物的給藥量。
具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物在飼料中的含量沒有特別的限定，可以根據目的使用，優選0.001～15重量％的比例。
作為人工配合飼料例如以魚粉、酪蛋白、烏賊粉等動物性原料，大豆粕、小麥粉、澱粉、飼料用酵母等植物性原料，鱈魚肝油、烏賊肝油等動物性油脂，大豆油、菜籽油等植物性油脂，維生素類、礦物類、胺基酸、抗氧化劑等為原料的人工配合飼料。另外，還例如魚肉絞碎物等魚類用飼料。
另外，也可以使用如低聚果糖、低聚異麥芽糖等功能性低聚糖，如聚葡萄糖、難消化性糊精、β-1，3-葡聚糖等食物纖維，蜂膠，如麥芽糖醇、palanitit、赤蘚糖醇等糖醇，EPA，γ-亞麻酸，亞鐵血紅素，小球藻、螺旋藻屬、白漿果提取物，如多元酚等止齲材料等功能性食品材料作為本發明飼料的原料。另外，在本發明中作為飼料，也包括飼料添加劑、飼料用營養輔助食品。
本發明飼料的製備方法沒有特別的限定，只要製得的飼料中含有具有選自細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用等生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物的有效量即可。
另外，也可以通過將具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物直接添加到池塘、水槽、貯水池或飼養區域的水、海水等中，浸漬對象生物給藥。這種浸漬方法在對象生物的飼料攝取量低下時特別有效。
水或海水中巖藻依聚糖和/或其分解產物的濃度沒有特別的限定，可以根據目的使用，優選0.00001～1重量％的比例。
另外，也可以使對象生物攝取含有具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物的飲料作為飼養用飲料。
飲料中具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物的濃度沒有特別的限定，可以根據目的使用，優選0.0001～1重量％的比例。
以具有所述生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的生物飼養用劑，例如浸漬用劑、飼料添加劑、飲料用添加劑可以按照其本身公知的方法製備。
本發明可以適用的生物沒有限定，作為養殖動物，例如馬、牛、豬、羊、山羊、駱駝、駝羊等家畜，小鼠、大鼠、土撥鼠、兔等實驗動物，雞、鴨、火雞、鴕鳥等家禽，真鯛、石鯛、比目魚、鰈魚、師魚、黃尾笛鯛、黃條師、金槍魚、大甲參、香魚、鮭類、河豚、鰻鱺、泥鰍、鯰魚等魚類，對蝦、黑虎蝦、青蟹等甲殼類等，鮑、蠑螺、扇貝、牡蠣等貝類，作為寵物，例如狗、貓等，可以廣泛適用於陸上、水中動物。
通過攝取含有具有選自細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用等生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物的飼料，或者將對象生物浸漬在含有該巖藻依聚糖和/或其分解產物的液體中，能夠顯著改善家畜、實驗動物、家禽、魚類、甲殼類、貝類、寵物等的身體狀況、健康、生物體的體內平衡、新陳代謝等，本發明對於防止生物老化是非常有用的。
而且，具有選自細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用等生理作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物作為化妝品的有效成分是有用的，作為本發明的一種方式，提供以巖藻依聚糖和/或其分解產物為有效成分的調節細胞因子生成用化妝品、誘導一氧化氮產生用化妝品、抗變態反應用化妝品等。
這些化妝品等中含有的巖藻依聚糖和/或其分解產物的含量通常優選為0.0001～20重量％，更優選0.001～5重量％。
本發明的化妝品對透皮、口服使用有效，按照本發明可以提供通過透皮給藥、口服給藥有效的化妝品。特別是抗變態反應用化妝品是基於其抗變態反應作用對治療、預防特應性皮炎有用的化妝品。另外，其給藥量或適用量可以適當調節以得到所需的效果。
本發明的化妝品可以按照常規方法製備，作為調節細胞因子生成用化妝品、誘導一氧化氮產生用化妝品、抗變態反應用化妝品，可以製備例如洗劑、乳液、面霜、面膜劑、浴用劑、洗面劑、浴用洗劑、毛髮滋養劑、生髮劑或洗髮劑。
本發明所使用的具有細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用、抗變態反應作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物在給大鼠口服時，確認即使一次口服給藥1g/kg，也沒有死亡例。
將氯化鈣二水合物(日本曹達社制)7.3kg溶解於自來水900升中，其次混合Kjellmaniella crassifolia粉碎物20kg。通入水蒸氣使之由液體溫度12℃升溫40分鐘達到液體溫度90℃，接著攪拌條件下在90～95℃保溫1小時，接著冷卻，得到冷卻物1100升。
接著，使用固液分離裝置(West Farrier Separator公司制CNA型)，對冷卻物進行固液分離，製備約900升的固液分離上清液。
使用DAICEL公司制FE10-FC-FUS0382(級分分子量3萬)，將固液分離上清液360升濃縮至20升。接著，加入自來水20升，再濃縮至20升，這種操作進行5次，進行脫鹽處理，配製源於Kjellmaniella crassifolia的萃取液25升。
冷凍乾燥該溶液1升，得到源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖乾燥物13g。(2)將參考例1-(1)記載的巖藻依聚糖乾燥物7g溶解於含有50mM氯化鈉和10％乙醇的20mM的咪唑緩衝液(pH8.0)700ml中，通過離心分離除去不溶物。用同樣的緩衝液將DEAE-Cellulofine A-800柱(φ11.4cm×48cm)平衡化，供給離心分離上清液後，用同樣的緩衝液洗滌，按照氯化鈉50mM至1.95M的濃度梯度進行洗脫(1級分250ml)。用酚硫酸法以及咔唑硫酸法求出總糖量和糖醛酸含量，按洗脫順序得到級分43～49、級分50～55、級分56～67。接著，通過電透析將這些級分脫鹽後進行冷凍乾燥，分別由級分43～49製得I級分(340mg)，由級分50～55製得II級分(870mg)，由級分56～67製得III級分(2.64g)。
圖1表示源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的DEAE-Cellulofine A-800柱洗脫曲線。圖1中縱軸表示按咔唑硫酸法得到的530nm處的吸光度(圖中黑圓圈)、按酚硫酸法得到的480nm處的吸光度(圖中白圓圈)以及電導率(mS/cm圖中白方塊)，橫軸表示級分序號。參考例2(1)在分別注入了含有葡萄糖0.25％、蛋白腖1.0％、酵母提取物0.05％的人工海水(Jamarin Laboratory公司制)pH8.2構成的培養基600ml並滅菌(120℃，20分鐘)後的2升錐形瓶中接種交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)，在25℃下培養26小時，得到種培養液。將含有蛋白腖1.0％、酵母提取物0.02％、下述參考例2-(2)記載的硫酸化多糖0.2％以及消泡劑(信越化學工業社制KM70)0.01％的人工海水pH8.0構成的培養基20升裝入30升容量的發酵罐中，在120℃下殺菌20分鐘。冷卻後，接種上述種培養液600ml，在每分鐘10升的通氣量和每分鐘250轉的攪拌速度的條件下，在24℃培養24小時。培養結束後，離心分離培養液，得到菌體和培養上清液。用裝有排除分子量1萬的全纖維的超濾器濃縮得到的培養上清液，之後用85％飽和硫酸銨鹽析，通過離心分離收集生成的沉澱，對含有十分之一濃度人工海水的20mM Tris-鹽酸緩衝液(pH8.2)充分透析，配製600ml選擇性作用於硫酸化多糖的內切型硫酸化多糖分解酶(F-巖藻依聚糖特異分解酶)液。(2)用裝有直徑1mm的篩網的切磨機(增幸產業社制)將乾燥後的Kjellmaniella crassifolia 2Kg粉碎，將得到的海帶碎片懸濁於20升的80％乙醇中，在25℃下攪拌3小時，用濾紙過濾後，充分洗滌殘渣。將得到的殘渣懸濁於加熱至95℃的40升含有50mM氯化鈉的20mM磷酸鈉緩衝液pH6.5中，不斷攪拌的同時在95℃下處理2小時，提取硫酸化多糖。
過濾提取液中的懸濁物，製得濾液後，用3.5升100mM氯化鈉洗滌過濾殘渣，再得到濾液。
將兩次的濾液合併後，將溫度降低至30℃，添加3000U的海藻酸裂合酶K(Nagase生化學工業社制)後，加入乙醇4升，在25℃下攪拌24小時。其次，進行離心分離，用具備排除分子量10萬的全纖維的超濾器將得到的上清液濃縮至4升，再用含有10％乙醇的100mM氯化鈉繼續超濾，直到著色性物質不再過濾。
通過離心分離除去非濾液中生成的沉澱，將該上清液的溫度降低至5℃，用0.5N鹽酸調節pH至2.0後，通過離心分離除去生成的蛋白質等沉澱，迅速用1N氫氧化鈉將得到的上清液的pH調節至8.0。
其次，用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器進行超濾，用20mM氯化鈉pH8.0完全取代溶劑後，再調節pH至8.0，離心分離後，進行冷凍乾燥，製得約95g的硫酸化多糖。(3)用裝有直徑1mm篩網的切磨機粉碎乾燥的Kjellmaniellacrassifolia 2Kg，將得到的海帶碎片懸濁於20升的80％乙醇中，在25℃下攪拌3小時，用濾紙過濾後，充分洗滌殘渣。將得到的殘渣懸濁於含有30ml上述參考例2-(1)製得的內切型硫酸化多糖分解酶、10％乙醇、100mM氯化鈉、50mM氯化鈣以及50mM咪唑的20升緩衝液(pH8.2)中，在25℃下攪拌48小時。用網眼的直徑為32μm的不鏽鋼金屬網過濾該懸濁液，用含有50mM氯化鈣的10％乙醇洗滌殘渣。再將該殘渣懸濁於10升含有50mM氯化鈣的10％乙醇中，攪拌3小時後，用不鏽鋼金屬網過濾，洗滌。再將該殘渣在同樣的條件下懸濁後，攪拌16小時，用直徑32μm的不鏽鋼金屬網過濾，洗滌。
收集這樣得到的濾液和洗滌液，用裝有排除分子量3000的全纖維的超濾器進行超濾，分離成濾液和非濾液。
用旋轉式汽化器將該濾液濃縮至約3升後，離心分離得到上清液。用裝有排除分子量300的膜的電透析器將得到的上清液脫鹽後，向該溶液中添加醋酸鈣達到0.1M，離心分離除去生成的沉澱。將該上清液裝入預先用50mM醋酸鈣平衡後的DEAE-Cellulofine(樹脂量4升)，用50mM醋酸鈣和50mM氯化鈉充分洗滌後，按50mM～800mM氯化鈉的濃度梯度進行洗脫。這時的收集量按每1級分500ml進行。用醋酸纖維素膜電泳法〔Analytical Biochemistry，第37卷，第197～202頁(1970)〕分析收集的級分，用氯化鈉濃度為約0.4M洗脫的硫酸化糖(級分序號63附近)是均一的。
然後，首先將級分序號63的溶液濃縮至150ml後，添加氯化鈉使濃度達到4M，裝入預先用4M氯化鈉平衡後的Phenyl-Cellulofine(樹脂量200ml)，用4M氯化鈉充分洗滌。收集非吸附性的硫酸化糖級分，用裝有排除分子量300的膜的電透析器脫鹽，得到脫鹽液505ml。
將得到的脫鹽液中40ml裝入用含有10％乙醇的0.2M氯化鈉平衡後的Cellulofine GCL-90柱(4.1cm×87cm)中，進行凝膠過濾。收集按每1級分9.2ml進行。
按照酚硫酸法〔Analytical Chemistry，第28卷，第350頁(1956)〕對總級分進行總糖量的分析。
結果，由於硫酸化糖形成了1個峰，收集其峰的中央部分，即級分序號63～70，用裝有排除分子量300的膜的電透析器脫鹽後，冷凍乾燥，得到112mg下述式V表示的化合物的乾燥品。 參考例3(1)用裝有孔徑1mm篩網的切磨機(增幸產業社制)粉碎乾燥Kjellmaniella crassifolia 2Kg，在20升的80％乙醇中25℃下攪拌3小時後過濾，洗滌。將得到的殘渣懸濁於含有50mM氯化鈣、100mM氯化鈉、10％乙醇以及參考例2-(1)製得的交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)SN-1009(FERM BP-5747)內切型硫酸化多糖分解酶(F-巖藻依聚糖特異分解酶)1U的20升30mM咪唑緩衝液(pH8.2)中，在25℃下攪拌2天，其次用孔徑32μm的不鏽鋼金屬網過濾，洗滌。將得到的殘渣懸濁於含有100mM氯化鈉、10％乙醇以及4g海藻酸裂合酶(Nagase生化學工業制)的40升磷酸鈉緩衝液(pH6.6)，在25℃攪拌4天後，離心分離得到上清液。為了除去所得上清液中含有的海藻酸的低分子化物，用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器濃縮至2升後，用含有10％乙醇的100mM氯化鈉進行溶液更換。向該溶液中添加等量的400mM醋酸鈣攪拌後，離心分離，將得到的上清液用冰冷卻，同時用1N鹽酸調節至pH2。通過離心分離除去生成的沉澱，用1N氫氧化鈉將得到的上清液調節至pH8.0。通過超濾將該溶液濃縮至1升後，用100mM的氯化鈉進行溶液交換。通過離心分離除去這時產生的沉澱。為了除去得到的上清液中的疏水性物質，向上清液中加入氯化鈉達到1M，裝入用1M氯化鈉平衡後的3升Phenyl-Cellulofine柱(生化學工業制)，收集流出的級分。通過超濾器將該級分濃縮後，用20mM的氯化鈉進行溶液交換，冷凍乾燥。冷凍乾燥物的重量為29.3g。(2)將上述冷凍乾燥物15g溶解於含有400mM氯化鈉以及培養國際公開第97/26896號說明書記載的黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)SA-0082(FERM BP-5402)與參考例2-(1)同樣由該培養物得到的內切型硫酸化多糖分解酶(U-巖藻依聚糖特異分解酶)9U的1.5升50mM Tris-鹽酸緩衝液，在25℃下反應6天後，用蒸發器濃縮至約300ml。將濃縮液加入到排除分子量3500的透析管中徹底透析，將殘留在透析管內的液體裝入用50mM氯化鈉平衡後的4升DEAE-Cellulofine A-800中，用50mM氯化鈉充分洗滌後，按照50～650mM氯化鈉的濃度梯度進行洗脫。再用650mM的氯化鈉充分洗脫同一柱。收集洗脫級分中用650mM氯化鈉洗脫出的級分作為硫酸化巖藻半乳聚糖級分，用排除分子量10萬的超濾器濃縮後，用10mM的氯化鈉更換溶液，冷凍乾燥得到硫酸化巖藻半乳聚糖的冷凍乾燥物0.85g。得到的硫酸化巖藻半乳聚糖(G-巖藻依聚糖)含有半乳糖和巖藻糖作為構成糖，其摩爾比為約2∶1。參考例4用裝有孔徑1mm篩網的切磨機粉碎市售的裙帶菜(Undariapinnatifida)乾燥物1Kg後，懸濁於10升的80％乙醇中，攪拌3小時後，用濾紙過濾，得到殘渣。將殘渣懸濁於含有50mM氯化鈉的40mM磷酸緩衝液(pH6.5)20升中，在95℃下處理2小時。將處理液冷卻至37℃後，添加乙醇達到10％，添加市售的海藻酸裂合酶K(Nagase生化學工業社制)12000U後，在室溫下攪拌24小時。離心分離得到的處理液，用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器將該上清液濃縮至2升後，通過離心分離除去生成的沉澱。將得到的上清液冷卻至5℃後，添加0.5N鹽酸調節pH至2.0後，攪拌30分鐘，通過離心分離除去生成的沉澱。用0.5N氫氧化鈉將上清液的pH調節至8.0，通過超濾將溶液更換為20mM的氯化鈉。將溶液的pH調節至8.0後，將離心分離得到的上清液冷凍乾燥，得到90.5g源於裙帶菜的巖藻依聚糖。參考例5參考例5將粉碎的墨角藻(Fucus vesiculosus)乾燥物1Kg懸濁於10升的80％乙醇中，攪拌3小時後，用濾紙過濾，得到殘渣。將殘渣懸濁於含有100mM氯化鈉的30mM磷酸緩衝液(pH6.0)30升中，在95℃下處理2小時。將處理液冷卻至37℃後，添加100g活性炭，攪拌30分鐘。添加市售的海藻酸裂合酶K3000U後，添加乙醇至10％，在室溫下攪拌24小時。離心分離得到的處理液，用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器將該上清液濃縮至2升後，通過離心分離除去生成的沉澱。向該上清液中加入提取液，同時進行超濾，除去色素。將得到的非濾液冷卻至5℃後，添加0.5N鹽酸調節pH至2.0後，攪拌30分鐘，通過離心分離除去生成的沉澱。用0.5N氫氧化鈉將上清液的pH調節至8.0，通過超濾將溶液更換為20mM氯化鈉。將溶液的pH調節至8.0後，將離心分離得到的上清液冷凍乾燥，得到71g源於墨角藻的巖藻依聚糖。參考例6將按照參考例1-(1)記載的方法製得的源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖2g溶解於100ml水中，用枸櫞酸將其pH調節至pH3後，在100℃下處理3小時，製得該巖藻依聚糖的酸分解產物。通過採用Cellulofine GCL-300或Cellulofine GCL-25的凝膠過濾對該酸分解產物進行分子量分級，分級得到分子量大於25000(A級分)、25000～大於10000(B級分)、10000～大於5000(C級分)、5000～大於2000(D級分)、2000～大於500(E級分)、500以下(F級分)。然後，分別將這些級分和酸分解產物脫鹽後進行冷凍乾燥，製得酸分解產物的各級分和酸分解產物。參考例7將刺參5kg解剖，除去內臟，收集體壁。每200g體壁溼重量加入500ml丙酮，用勻漿機處理後過濾，用丙酮洗滌殘渣直到沒有更多的著色物質。將該殘渣抽濾乾燥，得到140g乾燥物。向該乾燥物中加入0.4M食鹽水2.8升，在100℃下處理1小時後，過濾。用0.4M食鹽水充分洗滌殘渣，得到提取液3.7升。向該提取液中加入5％氯化十六烷基吡啶鎓直到沒有沉澱生成，通過離心分離收集生成的沉澱。將該沉澱懸濁於0.4M食鹽水後再次離心分離，向得到的沉澱中添加1升4M食鹽水，用勻漿機處理後，攪拌的同時添加4升乙醇，攪拌1小時後，過濾，得到沉澱。對於該沉澱，反覆進行懸濁於80％乙醇中然後過濾的操作，直到上清液在260nm處的吸光度達到0為止。將得到的沉澱殘渣與2升2M食鹽水中，通過離心分離除去不溶物。用裝有排除分子量3萬的膜的超濾裝置對上清液進行超濾，完全脫鹽後，冷凍乾燥，得到3.7g源於刺參的巖藻依聚糖。參考例8將市售的鹽醃衝繩海蘊(Cladosiphon okamuranus)625g懸濁於4375ml的30mM磷酸鈉緩衝液(pH6.0)中，用勻漿機以8000轉/分鐘處理5分鐘後，在95℃下處理1小時，離心分離得到上清液。向得到的上清液中加入10g活性炭後，攪拌30分鐘，離心分離得到上清液。用裝有排除分子量10萬的全纖維的超濾器將得到的上清液濃縮至2升後，用20mM氯化鈉更換溶液，冷凍乾燥，得到10.9g源於衝繩海蘊的巖藻依聚糖級分的乾燥物。
上述培養後，向100μl培養基中加入100μl的4％格裡斯試劑(Sigma公司制，G4410)，室溫下放置15分鐘後，測定540nm處的吸光度。根據由預先按照已知濃度溶解於上述培養基中的NaNO2製作的標準曲線計算出培養基中的NO2-濃度。測定均進行3次。
結果得知7-12SFd-F、源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分和III級分均促進誘導產生NO，具有免疫激活作用。其結果如圖2～圖5所示。也就是說，圖2是表示添加7-12SFd-F培養時培養基中NO2-濃度的圖，圖3是表示添加I級分培養時培養基中NO2-濃度的圖，圖4是表示添加II級分培養時培養基中NO2-濃度的圖，圖5是表示添加III級分培養時培養基中NO2-濃度的圖。另外，圖6是表示添加陽性對照的LPS培養時培養基中NO2-濃度的圖。在圖2～圖6中，橫軸表示培養條件，縱軸表示NO2-濃度(μM)。
根據這些結果，得知源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分以及7-12SFd-F具有NO產生誘導作用以及基於該作用的免疫激活效果。
另外，各參考例記載的其它巖藻依聚糖及其分解產物也顯示同樣的NO產生誘導作用。
另外，使用ELISA試劑盒(Genzyme公司)對與測定NO2-濃度的培養液相同的培養液中的IFN-γ量進行測定。但是，在該系統中源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分、7-12SFd-F以及其它各參考例記載的巖藻依聚糖及其分解產物均未見誘導IFN-γ產生。
由日本SLC購入ICR小鼠(雌性，7周齡，體重約25g)，預飼養1周後，用於實驗。由小鼠摘出脾臟，細粉碎後，懸濁於含有10％胎牛血清(Hiclone公司)的RPMI-1640培養基(Gibco公司)中，得到單細胞液。使粘連性細胞粘附在塑料陪替氏培養皿上除去，以非粘連性細胞作為脾臟淋巴細胞使用。將脾臟淋巴細胞懸濁於含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中，調節至2×106細胞/ml，按180μl/孔接種在96孔微板上。將各試樣溶解於蒸餾水，調節至100mg/ml的濃度，用培養基稀釋至顯示量的10倍濃度。對照組添加與試樣等量的培養基，向對照組以外的各孔中添加各種濃度(10～50μg/ml)的參考例記載的各種巖藻依聚糖、Kjellmaniellacrassifolia巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分、7-12SFd-F或100μg/ml的刀豆球蛋白A(Con A，Nakalaitesque公司)溶液20μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培養器中培養2天或4天。培養後，回收培養上清液，使用ELISA試劑盒(Genzyme公司)測定IFN-γ量。
結果，參考例記載的各種巖藻依聚糖、源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分、7-12SFd-F確認採用500μg/ml以下的用量時沒有來自非刺激淋巴細胞的IFN-γ產生誘導作用。另一方面，添加Con A的細胞確認有較強的IFN-γ產生誘導。(2)同種異源抗原刺激下的IFN-γ產生誘導作用由日本SLC購入BALB/c小鼠(雌性，6周齡，體重約20g)、C57BL/6小鼠(雌性，6周齡，體重約20g)，預飼養1周後，用於實驗。由H-2單元型不同的小鼠(BALB/cH-2d、C57BL/6H-2b)摘出脾臟，通過上述方法得到脾臟淋巴細胞。將各細胞浮遊液的細胞濃度調節至2×106細胞/ml，分別在96孔微板上接種100μl。在該對照組以外的各孔中與實施例2-(1)同樣添加各種濃度(10～500μg/ml)的參考例記載的各種巖藻依聚糖、源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分、7-12SFd-F或10μg/ml的ConA。另外，對照組添加與試樣等量的培養基。將其在37℃、5％二氧化碳培養器中培養4天。培養後，回收培養上清液，使用ELISA試劑盒測定IFN-γ量。
結果，參考例記載的各種巖藻依聚糖、源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分、7-12SFd-F確認採用500μg/ml以下的用量時對同種異源抗原刺激狀態的淋巴細胞沒有IFN-γ產生誘導作用。另一方面，添加Con A的細胞確認有較強的IFN-γ產生誘導。(3)致敏淋巴細胞的抗原刺激下的IFN-γ產生誘導作用由日本SLC購入C57BL/6小鼠(雌性，6周齡，體重約20g)，預飼養1周後，用於實驗。將1×106細胞的Meth-A小鼠肉瘤細胞接種在小鼠的腹腔內，進行免疫。腫瘤接種14天後摘出脾臟，通過上述方法得到脾臟淋巴細胞。將細胞浮遊液的細胞濃度調節至2×106細胞/ml，分別在96孔微板上接種100μl。為了製備刺激細胞，向懸濁於RPMI-1640培養基中調節至2×106細胞/ml的Meth-A小鼠肉瘤細胞中以50μg/ml的濃度添加絲裂黴素C(協和發酵社制)，在37℃下處理30分鐘，洗滌2次後，懸濁於含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中，調節至2×106細胞/ml。將製得的刺激細胞續加到按100μl/孔加有脾臟淋巴細胞的板的各孔中，在37℃、5％二氧化碳培養器中培養4天。與實施例2-(1)同樣配製、添加使源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖達到1～100μg/ml，使源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的I級分、II級分、III級分、7-12SFd-F分別達到10～500μg/ml，另外陽性對照使ConA達到10μg/ml，同樣進行培養。另外，對照組添加與試樣等量的培養基。培養後，回收培養上清液，用ELISA試劑盒測定IFN-γ量。對於同一培養上清液，使用ELISA試劑盒(ENDOGEN公司)測定IL-12量。
其結果如圖7和圖8所示。也就是說，圖7是表示巖藻依聚糖及其分解產物的IFN-γ產生誘導作用的圖，圖中縱軸表示IFN-γ產生量(pg/ml)，橫軸表示各試樣以及添加量(μg/ml)。
另外，圖8是表示巖藻依聚糖及其分解產物的IL-12產生誘導作用的圖，圖中縱軸表示IL-12產生量(pg/ml)，橫軸表示各試樣以及添加量(μg/ml)。
如圖7、圖8所示，在致敏淋巴細胞的抗原刺激下，源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖按1～100μg/ml的用量，I級分、II級分、III級分和7-12SFd-F按10～500μg/ml的用量顯示用量依存的IFN-γ和IL-12產生增強作用。另外，其它各參考例記載的巖藻依聚糖及其分解產物也顯示同樣的作用。
從開始培養10天後回收細胞，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基稀釋到規定濃度，向96孔圓底微板中分別注入100μl。
關於細胞的細胞毒性，以51Cr標記的EL4胸腺腫瘤細胞(以下稱為EL4細胞)作為靶細胞，測定游離到培養上清液中的γ射線量。也就是說，向EL4細胞中加入鉻-51放射性核素(Chromium-51Radionuclide)(New England Nuclear公司)1850kBq，在37℃下培養1小時，通過離心分離用RPMI-1640培養基洗滌3次。將該細胞懸濁於含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中，調節至1×105細胞/ml。在上述96孔圓底微板中分別注入100μl，在37℃、5％CO2存在下培養5小時，採集上清液100μl後，用γ射線閃爍計數器測定游離的γ射線量。如下所示計算出細胞毒性。
細胞毒性(％)＝〔(實驗值-對照值)/(總放射活性值-對照值)〕×100這裡，總放射活性值表示使用0.1％Triton-X 100μl代替培養脾細胞時的γ射線量。另外，對照值表示用培養基100μl代替培養脾細胞時的γ射線量，實驗值表示使用培養脾細胞時的γ射線量。
其結果如圖9所示。也就是說，圖9是表示源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖對小鼠脾臟淋巴細胞的細胞毒性免疫增強作用的圖，縱軸表示細胞毒性(％)，橫軸表示對照的效應細胞和添加參考例1記載的源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖達到10μg/ml進行培養得到的效應細胞(E)與靶細胞(T)的比(E/T比)。條形圖表示每組5隻的平均值和標準誤差。
如圖9所示，小鼠的培養脾細胞(效應細胞)對EL4細胞(靶細胞)顯示細胞毒性(對照)。加入巖藻依聚糖達到10μg/ml進行培養得到的細胞對EL4細胞的細胞毒性增強，巖藻依聚糖添加組儘管效應細胞和靶細胞的比低，仍顯示高細胞毒性，因而巖藻依聚糖增強了細胞毒性免疫。
另外，參考例記載的其它各種巖藻依聚糖、其分解產物、I級分、II級分、III級分以及7-12SFd-F也顯示同樣的活性。
其結果，確認在所討論的用量下沒有G-巖藻依聚糖產生的IFN-γ產生誘導作用。(2)致敏淋巴細胞的抗原刺激下的IFN-γ產生誘導作用由日本SLC購入C57BL/6小鼠(雌性，6周齡，體重約20g)，預飼養1周後，用於實驗。作為試樣，將參考例3-(2)製得的G-巖藻依聚糖溶解於蒸餾水，配製成100mg/ml，用培養基稀釋至顯示量的10倍濃度。向接種了按照上述方法製得的脾臟淋巴細胞以及Meth-A小鼠肉瘤細胞的微板各孔中添加G-巖藻依聚糖，使最終濃度達到10～500μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培養器中培養4天。另外，對照組添加與試樣等量的培養基，進行培養。培養後，回收培養上清液，用ELISA試劑盒測定IFN-γ量和IL-12量。
其結果如圖10和圖11所示。也就是說，圖10是表示G-巖藻依聚糖的IFN-γ產生誘導作用的圖，圖中縱軸表示IFN-γ產生量(pg/ml)，橫軸表示試樣以及添加量(μg/ml)。另外，圖11是表示G-巖藻依聚糖的IL-12產生誘導作用的圖，圖中縱軸表示IL-12產生量(pg/ml)，橫軸表示試樣以及添加量(μg/ml)。如圖10、圖11所示，在致敏淋巴細胞的抗原刺激下，G-巖藻依聚糖按10～500μg/ml的用量具有用量依存的IFN-γ產生增強作用。對於IL-12也確認按500μg/ml的用量具有顯著的產生增強作用。
如圖12所示，抗原呈遞反應時源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖引起的IL-12的產生誘導被抗IL-12抗體、抗CD28抗體或抗CD40抗體完全抑制。另一方面，來自致敏淋巴細胞的IFN-γ產生誘導被抗IL-12抗體抑制約50％，被抗CD28抗體或抗CD40抗體完全抑制。
各種巖藻依聚糖的IFN-γ產生誘導作用的比較給C57BL/6小鼠接種Meth-A小鼠肉瘤細胞進行免疫，接種24天後摘出脾臟。混合按照上述方法製得的源於C57BL/6小鼠的脾臟淋巴細胞以及Meth-A小鼠肉瘤細胞，接種在96孔微板上。作為試樣，使用參考例1製得的源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖、參考例8製得的源於衝繩海蘊的巖藻依聚糖、參考例5製得的源於墨角藻的巖藻依聚糖和參考例4製得的源於裙帶菜的巖藻依聚糖，與實施例2-(1)同樣進行配製、添加，使各種巖藻依聚糖的最終濃度達到10～500μg/ml，在37℃、5％二氧化碳培養器中培養4天。另外，對照組添加與試樣等量的培養基，進行培養。培養後，回收培養上清液，用ELISA試劑盒測定IFN-γ量。
其結果如圖13所示。也就是說，圖13是表示各種巖藻依聚糖的IFN-γ產生誘導作用的圖，圖中縱軸表示IFN-γ生產量(pg/ml)，橫軸表示各試樣和添加量(μg/ml)。
如圖13所示，關於致敏淋巴細胞的抗原刺激下的IFN-γ產生誘導能力，確認源於Kjellmaniella crassifolia與墨角藻的巖藻依聚糖具有同等的IFN-γ產生誘導作用，衝繩海蘊、裙帶菜具有較弱的IFN-γ產生誘導作用。
採集的血液離心分離(2000rpm，5分鐘)後，分離血漿，通過使用大鼠的被動皮膚過敏症(PCA)反應測定抗原特異性IgE量。也就是說，使用生理鹽水製備血漿的2倍至64倍梯度稀釋系列，分別給剔毛後的7周齡Wistar系雄性大鼠的背部真皮內注射0.1ml。真皮內注射48小時後，由尾靜脈注射0.05％蛋清蛋白和0.5％伊凡斯藍(Nakalaitesque公司制)的混合溶液1ml。尾靜脈注射30分鐘後，斷頭、放血處死大鼠，觀察背部出現的青色斑點，以直徑為5mm以上的斑點為陽性，IgE效價用最高稀釋倍數表示。
參考例1-(1)製得的源於Kjellmaniell acrassifolia的巖藻依聚糖的給藥組從抗原致敏日7天前至採血日將0.1％或1％的源於Kjellmaniell acrassifolia的巖藻依聚糖裝入給水瓶中，使之自由攝取。另外，對照組同樣給予自來水。結果，通過飲水攝取1％源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖顯著抑制蛋清蛋白致敏引起的抗原特異性IgE量上升。其結果如表1所示。
表1動物No. IgE抗體效價對照 1 8264316416532源於Kjellmaniella 1 8Crassifolia的232巖藻依聚糖0.1％332432源於Kjellmaniella 1＜2Crassifolia的2＜2巖藻依聚糖1％3＜24 45 8
參考例1-(1)製得的源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖的給藥組從追加免疫日至採血日將0.1％或1％的源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖裝入給水瓶中，使之自由攝取。另外，對照組同樣給予自來水。結果，通過飲水攝取1％源於Kjellmaniella crassifolia的巖藻依聚糖顯著抑制蛋清蛋白引起的抗原特異性IgE量上升。由此表明巖藻依聚糖除了預防性給予，即使從抗原致敏時治療性給予，也是有效的。其結果如表2所示。
表2動物No. IgE抗體效價對照 182 323 324 325 32源於Kjellmaniella1 16Crassifolia的2 16巖藻依聚糖0.1％3 324 32源於Kjellmaniella12Crassifolia的22巖藻依聚糖1％324452實施例9(1)配合原料，使1.5g中含有作為巖藻依聚糖的源於Kjellmaniellacrassifolia的巖藻依聚糖20mg，作為多元酚的市售蘋果提取物(商品名Applephenon，Nikka Whisky(株)制)、葡萄籽提取物(商品名Gravinol，KIKKOMAN(株)制)、甜茶提取物(商品名Sunten-chaS，SUNTORY(株)制)合計82mg，其餘為牛肉提取物(大日本製藥(株)制)、啤酒酵母(KIRIN啤酒(株)制)、乳糖、玉米澱粉(加藤化學(株)制)、還原麥芽糖(東和化成工業(株)制)，使用擠出造粒機製造本發明的飼料添加物(直徑1mm)，一包為1.5g。(2)大型犬(體重約30kg)的場合1日3包，中型犬(體重約10kg)的場合1日2包，小型犬(體重約5kg)的場合1日1包，分別在飼料中添加上述飼料添加劑作為營養輔助食品。
通過攝取本發明的飼料添加劑，大型犬、中型犬、小型犬均變得活躍，食慾也增加了。另外，基於身體狀況的改善效果，毛色得以改善，體臭、糞尿的臭味減輕。特別是對於老犬可明顯見到這些效果，本發明的飼料對於改善老犬的身體狀況、恢復健康、恢復青春是非常有用的。保藏的生物材料(1)保藏機構的名稱通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究所日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號(郵政編碼305-8566)(2)保藏的微生物(i)交替單胞菌屬(Alteromonas sp.)SN-1009原保藏日 平成8年2月13日移送至國際保藏的請求日平成8年11月15日保藏號 FERM BP-5747(ii)黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)SA-0082原保藏日 平成7年3月29日移送至國際保藏的請求日平成8年2月15日保藏號FERM BP-5402工業實用性按照本發明提供一種含有顯示細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用和抗變態反應作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的對需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病以及變應性疾病有效的藥物。該藥物具有調節生物體內白介素類、幹擾素類等生成的活性，作為癌、免疫性疾病等必須調節細胞因子生成的疾病的治療劑或預防劑有用。
另外，特別是作為需要使用這些藥物作為IFN-γ產生調節劑、IL-2產生調節劑、NO產生誘導劑的疾病的治療劑有用。
有時不必要狀態下的免疫系統活化或增強會引起變態反應、自身免疫疾病等疾病，但本發明製劑引起的細胞因子增強、免疫增強是選擇性的，僅僅在病毒感染或癌等體內存在應排除的抗原且必需增強細胞性免疫時作用，因而本發明的製劑對於生物防禦非常有用。
另外，本發明的製劑能抑制過剩的體液性免疫活化，本發明的製劑對於抑制變態反應也非常有用。
而且，能夠使用具有細胞因子生成調節作用、一氧化氮產生誘導作用和抗變態反應作用的巖藻依聚糖和/或其分解產物製備飲食品或飼料，通過作為日常的飲食品攝取，能夠改善需要調節細胞因子生成的疾病、如動脈硬化等需要產生一氧化氮的疾病、變應性疾病等的症狀等。
因此，以巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分的功能性飲食品或飼料由於這些生理作用，是對於維持生物的體內平衡有用的功能性飲食品或飼料。
另外，還提供一種細胞因子生成調節劑，該調節劑對於研究細胞因子類的功能、篩選與細胞因子有關的疾病用藥物是有用的。
權利要求
1.一種需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的治療劑或預防劑，其特徵在於，含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。
2.如權利要求1所述的治療劑或預防劑，巖藻依聚糖源於藻類或源於棘皮動物。
3.如權利要求1或2所述的治療劑或預防劑，細胞因子為白介素類或幹擾素類。
4.如權利要求3所述的治療劑或預防劑，幹擾素類為幹擾素-γ。
5.如權利要求3所述的治療劑或預防劑，白介素類為白介素-12。
6.如權利要求1或2所述的治療劑或預防劑，變應性疾病為需要抑制IgE產生的疾病。
7.如權利要求1～6中任意一項所述的治療劑或預防劑，為口服用治療劑或口服用預防劑。
8.一種調節細胞因子生成用食品、飲料或飼料、誘導一氧化氮產生用食品、飲料或飼料或者抗變態反應用食品、飲料或飼料，是含有巖藻依聚糖和/或其分解產物的調節細胞因子生成用、誘導一氧化氮產生用或者抗變態反應用食品、飲料或飼料。
9.如權利要求8所述的食品、飲料或飼料，巖藻依聚糖源於藻類或源於棘皮動物。
10.如權利要求8或9所述的食品、飲料或飼料，細胞因子為白介素類或幹擾素類。
11.如權利要求10所述的食品、飲料或飼料，幹擾素類為幹擾素-γ。
12.如權利要求10所述的食品、飲料或飼料，白介素類為白介素-12。
13.如權利要求8或9所述的食品、飲料或飼料，抗變態反應用食品、飲料或飼料為抑制IgE產生用食品、飲料或飼料。
14.巖藻依聚糖和/或其分解產物在治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病中的用途。
15.巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的治療劑或預防劑中的用途。
16.一種治療或預防需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的方法，使用巖藻依聚糖和/或其分解產物。
17.一種細胞因子生成調節劑、一氧化氮產生誘導劑、抗變態反應劑或IgE產生抑制劑，含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。
18.巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備細胞因子生成調節劑、一氧化氮產生誘導劑、抗變態反應劑或IgE產生抑制劑中的用途。
19.巖藻依聚糖和/或其分解產物在製備調節細胞因子生成用食品、飲料或飼料、誘導一氧化氮產生用食品、飲料或飼料或者抗變態反應用食品、飲料或飼料中的用途。
20.一種細胞因子生成調節方法、一氧化氮產生誘導方法、變態反應抑制方法或IgE產生抑制方法，使用巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。
21.巖藻依聚糖和/或其分解產物在調節細胞因子生成、誘導一氧化氮產生、抑制變態反應或抑制IgE產生中的用途。
全文摘要
本發明涉及需要調節細胞因子生成的疾病、需要產生一氧化氮的疾病或變應性疾病的治療劑或預防劑,其特徵在於含有巖藻依聚糖和/或其分解產物作為有效成分。還涉及含有巖藻依聚糖和/或其分解產物的調節細胞因子生成用食品、飲料或飼料、誘導一氧化氮產生用食品、飲料或飼料或者抗變態反應用食品、飲料或飼料。
文檔編號A61K31/737GK1382055SQ00814678
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月17日 優先權日1999年8月20日
發明者富永隆生, 山下周作, 水谷滋利, 佐川裕章, 加藤鬱之進 申請人:寶酒造株式會社