一種低產氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母的篩選及應用的製作方法

2023-07-25 18:44:16

專利名稱：一種低產氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母的篩選及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術食品與釀酒工程技術領域，是現代生物和化工工程技術與傳統釀造工程技術的有機結合，是對目前葡萄酒生產中使用的葡萄酒酵母的性能改進而創造出一種適用於葡萄酒生產並能顯著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的葡萄酒酵母的篩選方法及其應用。
背景技術：
隨著我國經濟發展和人民生活水平的提高，人們對食品保健和質量安全越來越重視。葡萄酒屬富含營養並具保健作用的綠色飲品。20世紀90年代以來，我國葡萄酒的生產量、消費量均快速增長。葡萄酒產量從2000年20. 19萬噸增長到2008年120多萬噸，已躍居世界第六位。伴隨著葡萄酒行業的快速發展，葡萄酒市場激烈競爭和國外葡萄酒對我國市場衝擊也很嚴重。EC被發現是一種潛在致癌物以來，備受世界各國食品主管部門關注， 近年來各國食品安全部門有關EC的報導也不斷出現。我國作為發酵食品和酒精飲料生產和消費大國更應該重視EC問題，應該合理設置葡萄酒貿易技術壁壘，防止國外EC含量高的葡萄酒進入我國市場，抵禦或緩解國際葡萄酒市場對我國的衝擊和挑戰，保護我國葡萄酒消費者的利益及我國葡萄酒行業。與此同時急需對我國發酵食品和酒精飲料(尤其是葡萄酒)生產工藝的改進而創造出一種適用於葡萄酒生產並能顯著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的葡萄酒酵母的篩選方法。根據目前國內外的研究資料，一般認為葡萄酒中EC形成主要與兩種前體物質有關，既尿素和瓜氨酸。尿素和瓜氨酸在複雜的酒體環境中會乙醇自發反應生成EC。反應式如圖1。尿素和瓜氨酸在葡萄酒中的積累分別是葡萄酒酵母iSaccheiromyces cererisiae)和葡萄酒MLB乳酸菌對葡萄汁中精氨酸代謝的結果。葡萄酒中EC的形成的生物學機理主要與兩條途徑有關，即酵母的尿素循環途徑和MLB的精氨酸脫亞氨基酶途徑。另外，也有研究表明所有的氨甲醯類化合物都可能是EC的前體物質，這主要包括尿素、瓜氨酸、氨甲醯磷酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿囊素等。EC的形成與葡萄酒釀造時加入的營養添加劑及和發酵、陳釀、貯藏溫度和時間也有關係。目前國內外葡萄酒生產中降低可能形成EC的前體物質一氨甲醯類化合物(主要包括尿素、瓜氨酸、氨甲醯磷酸、氨甲酸、天冬氨酸、尿囊素等)含量的方法主要有
(1)葡萄種植者提供葡萄藤葉中氮含量平均降低40%的葡萄植株，和儘量減少施用尿素、氨氮類複合肥。(2)葡萄酒酵母代謝精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特異性。所以有人提出選育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株，特別是選育精氨酸酶活力低或用分子育種手段獲得精氨酸酶缺陷型酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。英屬哥倫比亞大學葡萄酒研究中心的專家發現，用他們改進的專利產品白蘭地發酵劑生產的葡萄酒中EC 含量比其它發酵劑生產的少839Γ89%。
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(3)蘋果酸-乳酸發酵菌(MLB)的精氨酸代謝及瓜氨酸分泌也具有菌株特異性， 在進行MLB葡萄酒降酸時，應選擇精氨酸代謝途徑很弱或代謝中沒有瓜氨酸分泌的菌株， 以儘量降低葡萄酒蘋果酸-乳酸發酵階段EC的產生。法國和阿根廷已經完成O. oeni和 L. hilgardii的arc基因簇全序列測序，這將為抑制MLB的精氨酸代謝研究提供更多的信息，但沒有選育成功實例報導。(4)選擇合理得釀造工藝，不向葡萄汁中添加過量的含氮營養劑，葡萄酒的陳釀、 貯藏、運輸儘量在低溫下進行也是減少EC產生量的方法。綜上所述採用某種篩選方法，分離選育不分泌尿素或分泌尿素量低的酵母菌株， 特別是選育精氨酸酶活力低下菌株，是可以降低葡萄酒中EC含量的。本專利通過以下篩選方法，分離篩選出一株能顯著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量的葡萄酒酵母菌株，從而完成了發明。

發明內容
本發明的一個目的是公開了一種低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母 Bl (F-15A1—Bi)編號 FI5-1-5 菌株(CGMCCN04727)。該菌株能顯著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)含量。其保藏地點是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間2011年4月1日，拉丁名稱免⑶力狀傭凡^ cererisiae，它具有的生理、生化特徵如下
(1)觀察菌株形態為奶油色(淺黃色)至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株。(2)誘變結果及穩定性試驗低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母刀豆氨酸抗性菌株Bi，編號為FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)，在同樣條件下誘導精氨酸酶，測定原始菌株 (F-15-A1)和 Bl (F-15A1—Bi)編號 FI5-1-5 菌株(CGMCCN04727)的精氨酸酶活如附 16 圖所示，原始菌株的比活力大約是Bl (F-15-A1-B1)，編號FI5-1-5的6倍。本發明的另一個目的是公開了低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母B1(F-15A1-B1) 編號FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)的篩選方法。本發明還一個目的是公開了低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母B1(F-15A1-B1)編號FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)在作為葡萄酒發酵劑方面的應用。為實現上述目的，本發明提供了低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母Bl (F-15A1-B1) 編號FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)菌株的篩選方法，該方法包括以葡萄酒酵母為出發菌株， 經紫外線一吖啶橙誘變，篩選獲得刀豆氨酸抗性FI5-1-5菌株；其過程如下
(1)以活性乾酵母F-15和從葡萄園分離出葡萄酒酵母G-1，並在混合培養基上長出單菌 F-15-A1 ；
(2)篩選獲得刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1經活化培養，其條件為取新鮮培養的斜面菌苔一環，加入盛有10mL，5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至
有大量氣泡產生；
(3)將上述培養活化後的菌株，接種至含有刀豆氨酸、精氨酸、鳥氨酸的混合胺基酸初篩培養基中進行培養；
(4)挑取可在混合胺基酸初篩培養基上生長的菌落，分別移接至精氨酸、鳥氨酸復篩培
5養基中培養；
(5)選擇在精氨酸復篩培養基中不能生長，而在鳥氨酸復篩培養基中可以生長的菌種為所需的刀豆氨酸抗性菌株Bi，編號為FI5-1-5菌株(CGMCCNQ4727)；
(6)將分離出來的刀豆氨酸抗性菌株Bi，接種YEPD液體培養基活化Mh後，吸取0.ImL 菌液塗布在混合培養基培養3d，在混合培養基上可以長出菌落的菌株進行保存。本發明所述的經紫外線一吖啶橙誘變的方法是取生長良好的F-15-A1種子液， 在紫外照射90s，然後把600 μ L經過紫外誘變的菌懸液接入到含有5mL誘變培養基的試管中30°C避光水浴振蕩培養1 ；其中誘變培養基中含有lmg/mL吖啶橙，劑量分別為80 μ L， 100 μ L, 150 μ L, 200 μ L, 250 μ Lo本發明所述的初篩培養基指的是瓊脂培養基和刀豆氨酸培養基其中瓊脂培養基為2%瓊脂，洲葡萄糖，50mL純水在115°C滅菌15min，50°C水浴保溫；刀豆氨酸培養基為1. 7g/L YDB (酵母氮源基礎培養基)，Img刀豆氨酸，10. OmM鳥氨酸，IOmM精氨酸，純水 50MmL，過濾滅菌於50°C水浴保溫；將這兩種培養基混合，迅速到平板即製得初篩培養基。本發明所述的精氨酸、鳥氨酸復篩培養基成分為(1)精氨酸培養基1.7g/L YDB (酵母氮源基礎培養基)，IOmM精氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L瓊脂；(2)鳥氨酸培養基 1. 7g/L YDB, IOmM 鳥氨酸，20g/L 葡萄糖，20g/L 瓊脂。本發明所述的篩選方法，其中還包括驗證精氨酸酶活低的葡萄酒酵母，該驗證步驟和方法為將活性乾酵母F-15和F-15-A1和Bl分別接種到YEPD (酵母完全培養基)中， 30°C過夜培養，發酵液5000r/min離心5min收集菌體，用無菌水洗3次，轉接到精氨酸酶誘導培養基上30°C培養證，測定活性乾酵母F-15、F-15-A1和Bl的精氨酸酶的活性，每個菌株作三個重複，1個精氨酸酶的活力單位定義為在PH9.5及37°C下，在0. IM精氨酸溶液中， 每min產生Inmol鳥氨酸所用酶的量。其中還包括驗證氨基甲酸乙酯低的葡萄酒酵母，該驗證步驟和方法為 (1)模擬葡萄汁發酵的驗證步驟和方法
①模擬葡萄汁培養配製儲液A 在375 mL蒸餾水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL ；儲液B 在250mL蒸餾水中加入L-酒石酸6g，L-蘋果酸3g，檸檬酸0. 5 g ；儲液 C 在250mL蒸餾水中加入無硫酸氨的氮基礎培養基1. 7g，肌醇6 mg,氯化鈣0. 2g，磷酸銨 lg, L-精氨酸0. 8g, L-脯氨酸lg，DL-色氨酸0. Ig ；將儲液A、B、C混合後用氫氧化鉀調節 pH至3. 25，過濾除菌；
②模擬葡萄汁發酵將編號為FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)斜面保存的菌苔轉接到裝有50mL模擬葡萄汁培養基的三角瓶中，在30°C，150r/min條件下過夜培養；然後再將 50mL過夜培養物轉接到500mL模擬葡萄汁培養基中，在下靜置厭氧發酵5 7天，發酵結束後取樣測定氨基甲酸乙酯含量；
本發明被篩選的葡萄酒酵母F-15-A1、G-1為未經基因修飾的酵母；篩選出的編號為 FI5-1-5菌株是經過基因修飾的。其中篩選出的F-15-Al、G-l、FI5-l-5菌株(CGMCCN。4727) 酵母已具備精氨酸酶活性低的性質，都能獲得低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母。本發明篩選出的F-15-A1、G-1、和 Bl (F-15A1—B1)編號 FI5-1-5 菌株 (CGMCCN04727)酵母已具備精氨酸酶活性低的性質。也就是說每株都能或多或少地降低葡萄酒的氨基甲酸乙酯的含量。
本發明通過特定的篩選方法，分離篩選出一株能顯著降低葡萄酒中氨基甲酸乙酯 (EC)含量的葡萄酒酵母菌株。具體的研究過程如下
1、發明理論依據和思路
根據測定中國四大葡萄酒產區不同葡萄品種的氮源與EC相關性可知，精氨酸的代謝與EC的形成相關性最大，因此通過研究酵母對精氨酸的代謝途徑來降低EC的生成量。如圖2所示，精氨酸被酵母分解為尿素和鳥氨酸，而尿素是一種氮源代謝的重要產物，這種化合物可以與乙醇反應生成氨基甲酸乙酯，所以在發酵培養基中儘可能消除或減少尿素的生成量，而菌株和發酵溫度對於最終發酵液中的尿素水平有顯著影響。圖2顯示了在酵母菌中精氨酸分解代謝和轉運相關的基因，CANl編碼的專一性轉運蛋白對精氨酸進行轉運， GAPl編碼的轉運蛋白不僅可以對精氨酸進行轉運，還可以對其他胺基酸進行轉運。精氨酸降解的第一步是由精氨酸酶(CAR1編碼)催化的，生成鳥氨酸和尿素。尿素被尿素醯胺解酶 (DUR1，2編碼產生，一種雙功能酶)催化而進一步代謝。尿素醯胺解酶有兩方面的活性尿素羧化產生尿基甲酸(Allophanate)，和水解尿基甲酸，生成2分子朋3和1分子C02。許多其它微生物都有脲酶的作用，直接降解尿素生成2分子NH3和1分子C02。酵母屬的酵母不具有脲酶活性。這樣帶來的問題是，酵母由於生理的原因而需要兩步反應才能降解尿素。在這個途徑中尿素羧化酶需要能量和一種基本的維生素(生物素)來催化尿素的降解。因此在缺乏能量和維生素的情況下，尿素就不能被酵母降解。這種方式的優點是將過量的氮源以 (相對無毒的)尿素的形式通過尿素促進擴散通透酶釋放出去，而不是生成(毒性較大的)銨離子，另外銨離子也不易釋放出去，因為至今還未見有銨離子促進擴散系統的報導。如上所述，酵母屬的酵母傾向於快速吸收培養基中的可供氮源，有時也能造成細胞內含氮物質濃度過高。排出尿素的能力的功用是，通過產生一種低毒性並且在生理和環境條件許可時易於重新吸收的含氮化合物，來調節細胞內含氮化合物的總水平。酵母這樣代謝也會產生另一個結果，那就是增大了在發酵後期釋放的尿素會與乙醇反應生成氨基甲酸乙酯概率。精氨酸的生物合成是通過細胞內的代謝網絡進行的，該代謝網絡由眾多的酶催化相互關聯的一系列化學反應以及特異性的膜轉移系統所構成。在酵母中L-精氨酸的合成是從穀氨酸開始的，經歷一個由8種酶的催化的合成途徑，L-精氨酸是合成途徑的最終產物，合成途徑如圖3所示
精氨酸合成途徑的調控體系是一個負控制阻遏體系，與精氨酸生物合成有關的結構基因形成精氨酸調節子，精氨酸合成有關的八個酶是由九個基因所編碼，這九個基因組成五個操縱子，它們可以接受同一個調節基因argR發出的信號，從而進行協調活動。除此之外， 精氨酸調節子上還有一個argP基因，它編碼鳥氨酸、賴氨酸的運輸蛋白。調節基因argR所編碼的阻遏物蛋白必須與輔阻遏物精氨醯-tRNA結合才能被活化，活化的阻遏物蛋白複合物阻遏精氨酸調節子的轉錄，但它對各個基因的轉錄的抑制效應不同。由於微生物合成精氨酸的途徑不同，其合成的調節機制也不同。在酵母中，被精氨酸抑制的關鍵酶是合成途徑的第2個酶一乙醯穀氨酸激酶，或第五個酶一乙醯鳥氨酸乙醯轉移酶，其餘的酶受精氨酸的阻遏。根據上面對精氨酸分解代謝和合成代謝途徑的分析，選育出一株低產氨基甲酸乙酯的釀酒酵母，篩選思路如下
第一種篩選思路篩選出的酵母不能利用精氨酸，從而不能產生尿素，氨基甲酸乙酯的
7量也就會相應的減少。但是在一般的葡萄汁中的主要胺基酸是脯氨酸和精氨酸，而脯氨酸降解的第一步是在線粒體中進行的，需要分子氧作為氫的受體。在厭氧發酵條件下，脯氨酸不能作為氮源利用。如果酵母再不能利用精氨酸，就會導致氮源缺乏，發酵終止或不完全。 因此這種完全使酵母不能利用精氨酸的篩選思路不可行。第二種篩選思路酵母屬的酵母能在細胞內可以積累大量胺基酸，鹼性胺基酸和中性胺基酸被大量存在於液泡中，這種亞細胞結構隔開了酶和它們的底物，這樣更能適應胺基酸的代謝調節機制。液泡的這種隔離作用使得細胞能迅速地吸收培養基中可利用的氮源，並將氮源儲存在液泡中，然後在需要時通過調節向細胞質中的釋放速率來利用這些物質。考慮到環境因素，酵母的調節方式似乎更好，因為酵母需要保證在培養基中積累乙醇的情況下對抗強大的質子流，這種快速吸收培養基中可供氮源的方式是酵母與其他不能採用這種方式積累和儲存胺基酸的微生物競爭的強大手段。因此我們可以篩選出的酵母具有很低的精氨酸酶活，使精氨酸進行緩慢代謝，這樣酵母就不會由於快速利用精氨酸產生大量尿素，細胞對於產生的少量尿素也能進行進一步的降解，因此細胞向環境排出的尿素減少， 相應的產生氨基甲酸乙酯的量也就減少了，從而達到我們篩選低產氨基甲酸乙酯釀酒酵母的目的。根據第二種篩選思路選育一株精氨酸酶(CAR1編碼)酶活相對較低的菌株，可以利用結構類似物的抗性進行選育，選育結構類似物抗性突變株，也是代謝控制發酵育種的主流。因此選用L-刀豆氨酸作為L-精氨酸的結構類似物(如附圖4)做抗性篩選。在各種含有精氨酸的有機體中，精氨酸一tRNA合成酶錯誤地將刀豆氨酸認為精氨酸，刀豆氨酸隨即合成到初期的多肽中，含刀豆氨酸的的蛋白質最終會打亂RNA和tRNA的正常代謝。這些含有L-刀豆氨酸的蛋白質在結構和作用方面存在缺陷，形態和生長上出現異常，如蛋白質的組成和結構的變異，酶活性的減弱，細胞對熱、輻射或其它刺激物的承受能力的降低。這些已經改變了生理活性、結構異常的蛋白質會破壞細胞生長所必需的關鍵過程。可靠實驗表明合成功能紊亂的包含L-刀豆氨酸的蛋白質是L-刀豆氨酸具有抗代謝性的重要基礎。正是L-刀豆氨酸被細胞選擇性地吸收破壞了細胞生長所必需的蛋白質，使L-刀豆氨酸起到抗代謝的作用。根據上面的分析，設計出一個篩選平板(混合培養基)對於精氨酸代謝正常的釀酒酵母來說(精氨酸酶酶活高)，精氨酸和刀豆氨酸一起進入細胞，由於精氨酸被精氨酸酶快速代謝，刀豆氨酸與精氨酸一tRNA合成酶結合，這樣導致合成功能紊亂的包含L-刀豆氨酸的蛋白質，破壞細胞的生長；而對於精氨酸代謝異常的釀酒酵母(精氨酸酶酶活低)，雖然精氨酸和刀豆氨酸一起進入細胞，但由於精氨酸酶活低，不能很快的對精氨酸進行代謝，細胞內積累的精氨酸與刀豆氨酸競爭結合精氨酸一tRNA合成酶，這樣導致的結果是一方面刀豆氨酸不能與精氨酸一tRNA合成酶結合，不能合成有缺陷的蛋白，從而不能破壞細胞的生長；另一方面精氨酸的積累，精氨酸與精氨酸一tRNA合成酶結合，激活調節基因argR所編碼的阻遏物蛋白，活化的阻遏物蛋白複合物阻遏精氨酸調節子的轉錄，造成氮源向其它途徑代謝而不合成精氨酸。將細胞懸浮液塗布在混合培養基平板上，在30°C條件下培養三天，如果長出菌落說明CARl發生突變，精氨酸酶沒有活性或是活性很低；如果沒有菌落長出，說明CARl未發生突變，細胞內沒有精氨酸的積累，因此刀豆氨酸抑制了細胞的生長。這樣就可以在混合培
8養基的平板上篩選出CARl突變的菌株。 為了防止所篩出的菌株發生的是CANl突變，因此需要進行驗證。把在混合培養基上長出的菌落分別接種到鳥氨酸培養基和精氨酸培養基上，如在精氨酸培養基上不長或生長微弱而在鳥氨酸培養基上長說明是CARl發生的突變。如在兩個培養基上都長，有可能 CANl發生了突變，使得刀豆氨酸不能進入細胞內，因此可以在混合培養基上生長。
綜上所述設計三個篩選平板
1).鳥氨酸培養基1.7 g/L YDB，IOmM鳥氨酸，20 g/L葡萄糖；
2).精氨酸培養基1.7 g/L YDB，IOmM精氨酸，20 g/L葡萄糖；
3).混合培養基1.7 g/L YDB, 10mg/L刀豆氨酸，IOmM鳥氨酸，IOmM精氨酸，20 g/L 葡萄糖。2.本發明的操作流程如附圖5所示 (1)出發菌株的獲得
①從國內外葡萄酒活性乾酵母生產廠商收集索取20多種樣品。②從國內河北沙城懷涿盆地葡萄產區、河北昌黎葡萄產區、山東煙臺葡萄產區和天津薊縣葡萄產區等地採集的葡萄皮上分離出的各種野生葡萄酒酵母。③由目前葡萄酒工廠生產使用的葡萄酒酵母菌株經化學誘變獲得的突變株。(2)目的菌株的篩選
出發菌株一活性葡萄酒乾酵母的活化一篩選平板分離(混合培養基平板)一CANl突變驗證(鳥氨酸培養基平板和精氨酸培養基平板)一精氨酸酶活檢測一精氨酸酶活低的菌株。(3)低產氨基甲酸乙酯菌株的發酵實驗
精氨酸酶活低的菌株一模擬葡萄汁發酵(發酵性能及氨基甲酸乙酯檢測)一生產性葡萄汁發酵(發酵性能、氨基甲酸乙酯及葡萄酒香氣成分的檢測)一獲得保持優良發酵性能， 釀製的葡萄酒香氣好並具有低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株。本發明菌株的特徵如下
(1)採用代謝控制發酵理論與經驗結合酵母菌的尿素、精氨酸的代謝途徑，巧妙地設計刀豆氨酸(精氨酸的結構類似物)抗性平板，和CANl突變驗證平板，能快速、高通量地分離篩選出低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株。(2)低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌F15-1-5菌株，經精氨酸酶活檢測其活性是出發菌株的1/6 10 ；以模擬葡萄汁為原料，測定比較出發菌株和？15-1-5(06110隊4727) 菌株發酵原酒的氨基甲酸乙酯含量，發現EC含量刀豆氨酸抗性菌株FI5-1-5(CGMCCNq4727) 比原始菌株下降57. 48% ；潛在EC含量下降65. 25 ；它在工業生產葡萄汁發酵中，顯示能很好利用果糖、葡萄糖，菌體生長和酒精生成速率高等優良釀造特性，並能保持原酒的香氣成分。本發明的優點和有益效果為
1、本發明是現代保健食品和傳統釀造工程技術的有機結合，它是應用酵母的代謝及代謝控制理論設計的，能快速、高通量地從葡萄酒活性乾酵母、釀酒葡萄產區的中分離出的各種野生葡萄酒酵母以及葡萄酒酵母的誘變菌株中分離篩選出低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母菌株。2、本發明篩選出的葡萄酒酵母F15-1-5菌株，能完全適用於目前國內葡萄酒(幹
9紅、乾白葡萄酒)的生產工藝，既不需作任何的工藝過程和操作的改變，又不需添加或改造生產設備，就能應用於葡萄酒的工業化生產，生產性能優良，產品保持原有風味的基礎上， 顯著降低氨基甲酸乙酯的含量。本發明技術先進、應用價值高，具有極高的社會和經濟效益。


圖1為乙醇自發反應生成EC的反應式； 圖2為精氨酸的分解代謝和轉運圖3為精氨酸生物合成途徑；圖中的酶1.乙醯穀氨酸合成酶2.乙醯穀氨酸激酶3.乙醯穀氨酸半醛脫氫酶4.乙醯鳥氨酸轉氨酶5.乙醯鳥氨酸酶6.鳥氨酸轉氨甲醯酶7.精氨酸琥珀酸合成酶8.精氨酸琥珀酸酶9.乙醯鳥氨酸轉移酶10.氨基甲醯磷酸合成酶(CPS)； 圖4為L-精氨酸與L-刀豆氨酸的結構圖； 圖5為低產氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母(CGMCCNJ727)選育流程圖； 圖6為混合培養基； 圖7為鳥氨酸基本培養基(Al); 圖8為精氨酸基本培養基(Al); 圖9為鳥氨酸基本培養基(A2)； 圖10為精氨酸基本培養基(A2)； 圖11為WL營養培養基篩選出菌株形態； 圖12為混合培養基上篩選出菌株；
圖13為紫外線一吖啶橙誘變後在混合培養基上長出Bl菌株； 圖14為鳥氨酸基本培養基(Bi); 圖15為精氨酸基本培養基(Bi)； 圖16為精氨酸酶活比較圖； 圖17為乾紅葡萄酒釀造工藝流程圖。
具體實施例方式
下面結合實施例說明本發明，這裡所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的範圍內，本發明的範圍和實質由權利要求來限定。其中刀豆氨酸有市售； F15活性乾酵母有市售；鳥氨酸和精氨酸有市售；吖啶橙有市售。實施例1 1.菌種的活化
取市售F15活性乾酵母0. 2g，加入盛有10mL5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至有大量氣泡產生。2.將活化後的乾酵母液0.1 mL塗布在混合培養基上，在30°C條件下培養三天， 如附圖6所示
3.把在混合培養基上長出的單菌落Al和A2挑出放入盛有無菌水的試管中，通過稀釋分離法再把0. 1 mL菌液塗布在混合培養基中進行單菌落的分離。4.為了防止所篩出的菌株發生的是CAm突變，因此需要進行驗證。把在混合培養基上長出的單菌落分別接種到鳥氨酸培養基和精氨酸培養基上，如在精氨酸培養基上不長或生長微弱而在鳥氨酸培養基上長說明是CARl (精氨酸酶編碼基因)發生的突變。如在兩個培養基上都長，有可能CANl (精氨酸酶編碼基因)發生了突變，使得刀豆氨酸不能進入細胞內，因此可以在混合培養基上生長，如附7、8、9、10圖所示
5.將初篩獲得的釀酒酵母屬酵母Al擴培後按5%的接種量接種入2. 5L廣口瓶裡，總裝液量為1.8L，用葡萄汁進行小容器發酵試驗。比較初篩菌株的發酵速率和所獲得酒的理化指標與工業對照菌株之間的差別，從而得出比較理想的能夠適合與工業生產上發酵的菌株。實施例2
1.自然發酵酵母的分離
在葡萄園中多點收集葡萄漿果，除梗破碎後裝入滅過菌或燻硫的容器中自然發酵，自發酵旺盛至發酵結束，每三天接種一次，吸取0. ImL塗布在YEPD (酵母完全培養基.)培養基上，在30°C培養箱培養2-3d，挑取單菌落保存。2. WL營養培養基篩選
WL營養培養基是被設計用來監測飲料發酵過程中的微生物類群。研究表明，在葡萄酒自然發酵過程中出現的大多數典型的酵母菌種都可以用WL營養培養基進行區分，主要基於菌落顏色及菌落形態。釀酒酵母屬酵母在WL營養培養基上生長的菌落顏色及其形態表現為奶油色帶綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀。將分離出來的酵母菌株，接種 YEPD液體培養基活化24h後接種到WL營養培養基，27°C培養5d後觀察，篩選出菌落顏色為奶油色(淺黃色)至綠色，表面為球形突起，光滑，不透明，奶油狀的菌株。得到符合釀酒酵母在WL營養培養基上菌落顏色及形態的菌株進行保存，如附圖11所示
3.將分離出來的酵母菌株，接種YEPD液體培養基活化24h後，吸取0.ImL菌液塗布在混合培養基培養3d，在混合培養基上可以長出菌落的菌株進行保存，如附圖12所示
4.為了防止所篩出的菌株發生的是CANl突變，因此需要進行驗證。把在混合培養基上長出的單菌落分別接種到鳥氨酸培養基和精氨酸培養基上，如在精氨酸培養基上不長或生長微弱而在鳥氨酸培養基上長說明是CARl發生的突變，並進行保存。如在兩個培養基上都長，有可能CAm發生了突變，使得刀豆氨酸不能進入細胞內，因此可以在混合培養基上生長。5.小容器釀酒試驗
將初篩獲得的釀酒酵母屬酵母G-I擴培後按5%的接種量接種入2. 5L廣口瓶裡，總裝液量為1.8L，用葡萄汁進行小容器發酵試驗。比較初篩菌株的發酵速率和所獲得酒的理化指標與工業對照菌株之間的差別，從而得出比較理想的能夠適合與工業生產上發酵的菌株。將理化檢測結果中酒精度大於9% (V/V)、殘糖小於4g/L、揮發酸小於0.6g/L的原酒判定為合格，則其相應的釀酒酵母判定為符合工業發酵的要求。
實施例3 1.菌種的活化
取F-15-A1斜面的菌苔接入盛有10mL5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至有大量氣泡產生。2.紫外線一吖啶橙誘變取生長良好的F-15-A1種子液，在紫外照射90s，然後
11把600 μ L經過紫外誘變的菌懸液接入到含有5mL誘變培養基的試管中30°C避光水浴振蕩培養12h。(誘變培養基中含有lmg/mL吖啶橙，劑量分別為80 μ L，100 μ L，150 μ L，200 μ L， 250 μ L)；
3.將誘變後酵母菌液液0.1 mL塗布在混合培養基上，在30°C條件下培養3d，如附圖 13所示把在混合培養基上長出的單菌落B1(F-15-A1-B1)挑出放入盛有無菌水的試管中， 通過稀釋分離法再把0. 1 mL菌液塗布在混合培養基中進行單菌落的分離。4.為了防止所篩出的菌株發生的是CAm突變，因此需要進行驗證。把在混合培養基上長出的單菌落分別接種到鳥氨酸培養基和精氨酸培養基上，如在精氨酸培養基上不長或生長微弱而在鳥氨酸培養基上長說明是CARl發生的突變。如在兩個培養基上都長，有可能CAm發生了突變，使得刀豆氨酸不能進入細胞內，因此可以在混合培養基上生長，如附圖14、15所示
5.將活性乾酵母F-15-A1和誘變獲得的刀豆氨酸抗性菌株Bl (F-15-A1-B1)分別接種到YEPD中，30°C過夜培養，發酵液5000r/min離心5min收集菌體，用無菌水洗3次，轉接到精氨酸酶誘導培養基上30°C培養證，測定活性乾酵母F15和Bl的精氨酸酶的活性。每個菌株作三個重複。1個精氨酸酶的活力單位定義為在PH9. 5及37°C下，在0. IM精氨酸溶液中，每min產生Inmol鳥氨酸所用酶的量。在同樣條件下誘導精氨酸酶，測定原始菌株和 Bl的精氨酸酶活如附圖16所示，原始菌株的比活力大約是Bl的6倍，這也證實在前面酵母初篩時進行的驗證試驗，Bl在精氨酸基本培養基上有緩慢的生長，說明Bl還是有精氨酸酶活。實施例4
1.將上述分離或誘變篩選出來的刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1、G-1和Bl (F-15-A1-B1) 按照實施列3的操作方法測定它們的精氨酸酶活性，獲得菌株的精氨酸酶活性最低，僅為原始菌株的1/10，被編號為刀豆氨酸抗性菌株B1(F-15A1-B1)編號FI5-1-5菌株 (CGMCCN04727)。2.將分離出來的刀豆氨酸抗性菌株F15-1-5，接種YEPD液體培養基活化24h後， 吸取0. ImL菌液塗布在混合培養基培養3d，在混合培養基上可以長出菌落的菌株進行保存。3.為了防止所篩出的刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1-B1在傳代過程中發生的是CANl 突變，因此需要進行驗證。把在混合培養基上長出的單菌落分別接種到鳥氨酸培養基和精氨酸培養基上，如在精氨酸培養基上不長或生長微弱而在鳥氨酸培養基上長說明是CARl 發生的突變，並進行保存。如在兩個培養基上都長，有可能CANl發生了突變，使得刀豆氨酸不能進入細胞內，因此可以在混合培養基上生長。不斷地在進行上述純化。4.模擬葡萄汁發酵 ①模擬葡萄汁培養配製
儲液A 在375 mL蒸餾水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL ； 儲液B 在250 mL蒸餾水中加入L-酒石酸6g，L-蘋果酸3g，檸檬酸0. 5g ； 儲液C 在250 mL蒸餾水中加入無硫酸氨的氮基礎培養基1. 7g，肌醇6mg，氯化鈣 0. 2g，磷酸銨lg，L-精氨酸0. 8g，L-脯氨酸lg，DL-色氨酸0. Ig ；
將儲液A、B、C混合後用氫氧化鉀調節pH至3. 25，過濾除菌。特別加以注意的是培
12養基須現用現配，儲液A、B、C混合Ia1後會出現沉澱。②模擬葡萄汁發酵
將一環(菌苔)刀豆氨酸抗性菌株FI5-A1-B1斜面保存的菌苔轉接到裝有50mL模擬葡萄汁培養基的三角瓶中，在30°C，150r/min條件下過夜培養。然後再將50mL培養物轉接到500mL模擬葡萄汁培養基中，在下靜置厭氧發酵5 7天，發酵結束後取樣測定氨基甲酸乙酯含量，發現EC含量刀豆氨酸抗性菌株F-I5-A1-B1 (CGMCCN04727)比原始菌株下降 57. 48% ；潛在EC含量下降65. 25% 實施例5
1.小容器釀酒試驗
將刀豆氨酸抗性菌株F-I5-A1-B1 (CGMCCN04727)擴培後按5%的接種量接種入2. 5L廣口瓶裡，總裝液量為2L。將發酵紅葡萄酒的廣口瓶放在18°C恆溫箱中進行小容器發酵試驗。2.選取煙臺君頂酒莊葡萄園生產的蛇龍珠葡萄進行的釀造實驗，釀造工藝流程 (屬於常規的釀造方法)分別如附圖17所示；發酵結束後測定殘糖均很低，小於4g/L，酒精度均大於9% (V/V)，因此篩選出來的菌株都符合工業發酵的要求。發酵完成後澄清過濾所得的幹紅原酒，取樣測定氨基甲酸乙酯含量和香氣成分及含量。結果如下(1)刀豆氨酸抗性菌株FI5-A1-B1(CGMCCNq4727)比原始菌株下降 61. 87% ； (2)刀豆氨酸抗性菌株FI5-A1-B1 (CGMCCN04727)發酵的原酒的香氣成分及含量和原始菌株基本吻合，沒有發生改變。
權利要求
1.一種低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母FI5-1-5菌株，其保藏號為CGMCCN04727。
2.權利要求1所述菌株的篩選方法，該方法包括以葡萄酒酵母為出發菌株，經紫外線一吖啶橙誘變，篩選獲得刀豆氨酸抗性FI5-1-5菌株；其過程如下(1)以活性乾酵母F-15和從葡萄園分離出葡萄酒酵母G-1，並在混合培養基上長出單菌 F-15-A1 ；(2)篩選獲得刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1經活化培養，其條件為取新鮮培養的斜面菌苔一環，加入盛有10mL，5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38、0°C水浴中活化2(T30min，直至有大量氣泡產生；(3)將上述培養活化後的菌株，接種至含有刀豆氨酸、精氨酸、鳥氨酸的混合胺基酸初篩培養基中進行培養；(4)挑取可在混合胺基酸初篩培養基上生長的菌落，分別移接至精氨酸、鳥氨酸復篩培養基中培養；(5)選擇在精氨酸復篩培養基中不能生長，而在鳥氨酸復篩培養基中可以生長的菌種為所需的刀豆氨酸抗性菌株Bi，編號為FI5-1-5菌株(CGMCCNQ4727)；(6)將分離出來的刀豆氨酸抗性菌株Bi，接種YEPD液體培養基活化Mh後，吸取0.ImL 菌液塗布在混合培養基培養3d，在混合培養基上可以長出菌落的菌株進行保存。
3.權利要求2所述的篩選方法，其中所述經紫外線一吖啶橙誘變的方法是取生長良好的F-15-A1種子液，在紫外照射90s，然後把600 μ L經過紫外誘變的菌懸液接入到含有 5mL誘變培養基的試管中30°C避光水浴振蕩培養1 ；其中誘變培養基中含有lmg/mL吖啶橙，劑量分別為 80 μ L, 100 μ L, 150 μ L, 200 μ L, 250 μ Lo
4.權利要求2所述的篩選方法，其中步驟(3)中所述的初篩培養基指的是瓊脂培養基和刀豆氨酸培養基其中瓊脂培養基為 瓊脂，洲葡萄糖，50mL純水在115°C滅菌 15min, 50°C水浴保溫；刀豆氨酸培養基為1. 7g/L YDB, Img刀豆氨酸，10. OmM鳥氨酸，IOmM 精氨酸，純水50MmL，過濾滅菌於50°C水浴保溫；將這兩種培養基混合，迅速到平板即製得初篩培養基。
5.權利要求2所述的篩選方法，其中步驟(4)中所指的精氨酸、鳥氨酸復篩培養基成分為⑴精氨酸培養基1.7g/L YDB，10mM精氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L瓊脂；(2)鳥氨酸培養基:1.7g/L YDB，10mM鳥氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L瓊脂。
6.權利要求2-5任一項所述的篩選方法，其中還包括驗證精氨酸酶活低的葡萄酒酵母，該驗證步驟和方法為將活性乾酵母F-15和F-15-A1和Bl分別接種到YEPD中，30°C過夜培養，發酵液5000r/min離心&nin收集菌體，用無菌水洗3次，轉接到精氨酸酶誘導培養基上30°C培養證，測定活性乾酵母F-15、F-15-A1和Bl的精氨酸酶的活性，每個菌株作三個重複，1個精氨酸酶的活力單位定義為在PH9. 5及37°C下，在0. IM精氨酸溶液中，每min 產生Inmol鳥氨酸所用酶的量。
7.權利要求2-5任一項所述的篩選方法，其中還包括驗證氨基甲酸乙酯低的葡萄酒酵母，該驗證步驟和方法為模擬葡萄汁發酵的驗證步驟和方法①模擬葡萄汁培養配製儲液A 在375 mL蒸餾水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL ；儲液B 在250mL蒸餾水中加入L-酒石酸6g，L-蘋果酸3g，檸檬酸0. 5 g ；儲液C 在250mL蒸餾水中加入無硫酸氨的氮基礎培養基1. 7g，肌醇6 mg,氯化鈣0. 2g，磷酸銨 lg, L-精氨酸0. 8g, L-脯氨酸lg，DL-色氨酸0. Ig ；將儲液A、B、C混合後用氫氧化鉀調節 pH至3. 25，過濾除菌；②模擬葡萄汁發酵將編號為FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)斜面保存的菌苔轉接到裝有50mL模擬葡萄汁培養基的三角瓶中，在30°C，150r/min條件下過夜培養；然後再將 50mL過夜培養物轉接到500mL模擬葡萄汁培養基中，在^TC下靜置厭氧發酵5 7天，發酵結束後取樣測定氨基甲酸乙酯含量。
8.權利要求2-4所述的篩選方法，其中被篩選的葡萄酒酵母F-15-A1、G-1為未經基因修飾的酵母；篩選出的編號為FI5-1-5菌株是經過基因修飾的。
9.權利要求2所述的篩選方法，其中篩選出的F-15-A1、G-I、FI5-1-5菌株 (CGMCCN04727)酵母已具備精氨酸酶活性低的性質，都能獲得低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母。
10.權利要求1所述的低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母FI5-1-5菌株(CGMCCN04727) 在作為葡萄酒發酵劑方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種低產氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母的篩選方法及在葡萄酒生產中應用。此方法採用精氨酸的結構類似物—刀豆氨酸抗性平板，可從自然界分離的、市售售(商品)活性乾酵母以及化學誘變劑誘變的突變株中篩選出低產氨基甲酸乙酯的菌株。此法是應用酵母胺基酸代謝理論設計的，方法簡便，能快速分離並獲得目的菌株。本發明將獲得刀豆氨酸抗性菌株B1，編號為FI5-1-5菌株(CGMCC NO.4727)應用於小型發酵容器葡萄酒的釀造中，在具備優良的葡萄酒釀造性能的基礎上，能有效地顯著降低葡萄酒生產中的胺基酸甲酸乙酯的含量,具有工業化生產應用的潛力。
文檔編號C12N15/01GK102220252SQ20111012948
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月19日 優先權日2011年5月19日
發明者張健, 李磊, 王德培, 高年發, 高強 申請人:天津科技大學