通過質譜細胞術對組織樣品的多重成像的製作方法

2023-08-08 16:12:32

本發明涉及使用雷射燒蝕-電感耦合等離子體-質譜法(LA–ICP–MS)或質譜細胞術(mass cytometry)的組織樣品的成像。

背景技術：

分子靶的單細胞測量和多重定量檢測可以對單獨細胞的狀態和表現提供洞察。已用於單細胞分析的技術包括與特異的標記技術(例如使用免疫細胞化學)、單細胞成像質譜法、表面增強的拉曼散射光譜和LA–ICP–MS結合的顯微術。

這些技術中的一些可以容易地延伸到組織的原位成像(例如使用免疫組織化學)，但其他的不能。例如，方法諸如免疫螢光顯微術(IFM)可用於低至納米解析度的成像，但實踐中局限於同時測量七個或更少的靶。與之相比，LA–ICP–MS提供單細胞中的抗原表達的高度多重的定量分析，但其目前缺少對於組織樣品內的單細胞的成像必需的解析度。

本發明的目標是提供用於組織樣品成像的另外的並且改進的技術，並特別地使LA-ICP-MS適於用作單細胞成像技術。

詳述

ICP–MS已被用於單細胞分析，但僅用於懸浮液中的細胞[1]。發明人現已使雷射燒蝕(LA)適合於ICP–MS，以使得該技術適用於組織樣品中的單細胞成像。儘管先前已經報導了經由LA–ICP–MS的組織成像，公開的過程尚未實現高的空間解析度。例如，LA-ICP-MS已被用於獲得腦切片的[2]和癌症組織的[3、4]圖像，但未實現單細胞或亞細胞解析度。在所有的情況中，解析度被燒蝕雷射的光斑尺寸和/或被在連續燒蝕中釋放的材料的分析之間的重疊/混合限制。例如，40μm的光斑尺寸[2]不能以對組織樣品中單細胞成像足夠高的解析度燒蝕材料。類似地，如果燒蝕的材料不能在少於100ms內運輸到ICP-MS，那麼以10Hz的頻率燒蝕將導致重疊信號；例如，參考文獻3中使用的以該燒蝕頻率的燒蝕單元具有大大超過1秒的衝洗時間(作者未提示)。

現在發明人提供了LA–ICP–MS系統，其克服了這些缺點並且能夠實現亞細胞解析度，因此第一次使適用於組織的單細胞成像的LA–ICP–MS技術可用。因此，本發明提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個不同的標記原子標記所述組織樣品中的多個不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經受具有亞細胞解析度的雷射燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經受電感耦合等離子體質譜法，藉此檢測所述煙流中的標記原子允許構造所述組織樣品的圖像。本發明的一個一般的優勢是其與已在免疫組織化學(IHC)中使用的技術和方案兼容，但通過LA-ICP-MS檢測的標記物的使用現在允許更多的靶定位在樣品中。

本發明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個不同的標記原子標記所述組織樣品中的多個不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經受雷射燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經受使用飛行時間質量分析器的電感耦合等離子體質譜法，藉此所述煙流中的標記原子的檢測允許構造所述組織樣品的圖像。

本發明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用不同的標記原子標記所述組織樣品中的至少四種不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經受雷射燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經受電感耦合等離子體質譜法，藉此所述煙流中的標記原子的檢測允許構造所述組織樣品的圖像。

本發明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用多個不同的標記原子標記所述組織樣品中的多個不同的靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)劃分所述樣品中的單獨的細胞；(iii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經受雷射燒蝕，以形成多個煙流；(iii)和使煙流經受電感耦合等離子體質譜法，藉此所述煙流中的標記原子的檢測允許構造所述組織樣品的圖像。

本發明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)用標記原子標記所述組織樣品中的一個或更多個靶分子，以提供標記的組織樣品；(ii)使用4μm或更少的雷射光斑尺寸使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經受雷射燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經受電感耦合等離子體質譜法，藉此所述煙流中的標記原子的檢測允許構造所述組織樣品的圖像。

本發明還提供了一種使包含多個細胞的組織樣品成像的方法，所述方法包括以下的步驟：(i)提供標記的組織樣品，其中多個不同的靶分子已用多個不同的標記原子標記；(ii)使所述標記的組織樣品的多個細胞在多個已知的位置經受具有亞細胞解析度的雷射燒蝕，以形成多個煙流；和(iii)使煙流經受電感耦合等離子體質譜法，藉此所述煙流中的標記原子的檢測允許構造所述組織樣品的圖像。

本發明還提供了用四種或更多種(例如5、6、7、8、9、10、12、13、14、15或更多)不同的過渡金屬原子標記組織樣品的方法。這些原子與特定的細胞靶相關，因此允許通過LA-ICP-MS的下遊檢測。然後，來自LA-ICP-MS的數據可被用於創建樣品的圖像。

本發明還提供了使組織樣品成像的方法，其中所述組織樣品的多個細胞經受為亞細胞解析度的質譜細胞術。

本發明還提供了LA-ICP-MS的方法，其中單個標記的細胞的基本所有的內含物被用單一雷射射出燒蝕，並且然後經受ICP-MS。因此，完整細胞的基本所有內含物可被質譜細胞術分析。燒蝕提供含有基本所有的細胞的內含物的煙流，並且然後該煙流可以被引入到ICP並且經受MS，因此檢測標記的材料並且允許在單個分析中對完整細胞的多重分析。

LA-ICP-MS和質譜細胞術

本發明在組織樣品成像方法中使用耦合到電感耦合等離子體質譜法的雷射燒蝕(LA-ICP-MS)。用不同的標記原子標記樣品中的不同的靶分子，並且然後LA-ICP-MS跨越標記的組織樣品的多個細胞使用。通過將所檢測的信號與引起那些信號的雷射燒蝕的已知位置聯繫起來，方法允許將所標記的靶分子定位到樣品上的特定位置，並因此構造樣品的圖像。

LA-ICP-MS涉及使組織樣品經受雷射脈衝，所述雷射脈衝從樣品生成燒蝕材料的煙流，並且這些煙流被作為氣霧劑傳送到ICP-MS儀器以用於分析。樣品中的標記原子可由MS區分，並且因此它們的檢測揭示煙流中多個靶的存在或缺乏。

以該方式生成的信號的空間解析度取決於兩種主要因素：(i)當信號在被燒蝕的總面積上積分時，雷射的光斑尺寸；以及(ii)相對於以其正在生成煙流的速度，以其可分析煙流以便避免來自如以上提到的連續煙流的信號的重疊的速度。

因此，為了分析單獨的細胞，本發明使用不大於這些細胞的雷射光斑尺寸，並且更具體地，使用可燒蝕材料的具有亞細胞解析度的雷射光斑尺寸。該尺寸將取決於樣品中的特定細胞，但通常雷射光斑將具有小於4μm的直徑(例如，在範圍0.2--4μm、0.25-3μm或0.4-2μm之內)。因此，雷射光斑可具有大約3μm、2μm、1μm或0.5μm的直徑。在優選的實施方案中，雷射光斑直徑在0.5--1.5μm的範圍內，或為大約1μm。可使用縮小的較寬雷射束和近場光學器件來實現小的光斑尺寸。1μm的雷射光斑直徑對應於1μm的雷射聚焦點，但由於將雷射束傳送到樣品表面上的物鏡的數值孔徑，雷射聚焦點可改變±20％。

為了組織樣品的快速分析，需要高頻率(例如，10Hz或更大(即，每秒10次燒蝕，每秒產生10次煙流))的燒蝕。在優選實施方案中，燒蝕的頻率在範圍10-200Hz內、在範圍15-100Hz內或者在範圍20-50Hz內。至少20Hz的燒蝕頻率允許在合理的時間中實現典型組織樣品的成像。如以上所指出的，在這些頻率下，儀器必須能夠足夠快速地分析燒蝕的材料，以便避免連續燒蝕之間的大量信號重疊。優選地是，源自連續煙流的信號之間的重疊在強度上<10％(更優選地<5％，並且理想地<1％)。煙流的分析所需的時間將取決於燒蝕單元的衝洗時間、煙流氣霧劑到達和通過ICP的渡越時間、以及分析電離的材料所花費的時間。

因此，具有短的衝洗時間(例如100ms或更少)的燒蝕單元與本發明一起使用是有利的。具有長衝洗時間的單元將限制可以生成圖像的速度，或將導致來自連續樣品斑點的信號之間的重疊(例如，參考文獻5，其具有超過10秒的信號持續時間)。因此，氣霧劑衝洗時間是對於實現高解析度而不增加總掃描時間的關鍵限制因素。具有<100ms的衝洗時間的燒蝕單元在本領域是已知的。例如，參考文獻6公開了具有低於100ms的衝洗時間的燒蝕單元。在參考文獻7中公開了特別地適合的燒蝕單元(還參見參考文獻8)，其具有30ms或更少的衝洗時間，因此允許高燒蝕頻率(例如在20-40Hz之間)並且因此快速分析。本文的實例論證，由20Hz雷射燒蝕射出生成的煙流的信號可被該燒蝕單元完全分離，因此使短時間中大面積成像能夠實現。因此使用本發明的方法，實現最終的圖像中每空間分辨的像素的時間小於100ms是可能的。

通過將燒蝕單元定位在ICP附近以及通過確保足夠的氣體流用於以適當的速度將氣霧劑直接運輸到ICP來簡單地控制煙流氣霧劑到達和通過ICP的渡越時間。使用如參考文獻7中描述的氬氣和氦氣的運輸提供良好的結果。

分析電離的材料所花費的時間將取決於用於離子的檢測的質量分析器的類型。例如，使用法拉第杯的儀器通常對於分析快速信號來說太慢。總的來說，期望的成像速度(並因此燒蝕頻率)、解析度(並因此雷射光斑尺寸和燒蝕單元)以及多路復用的程度將指示應使用的質量分析器的一種類型或多種類型(或相反地，質量分析器的選擇將決定可實現的速度、解析度和多路復用)。

例如使用點離子檢測器，每次檢測在僅一個質荷比(m/Q，在MS中通常被稱為m/z)的離子的質譜儀儀器將給出使用多個標記物的單個細胞成像中的不良結果。第一，在質荷比之間切換所花費的時間限制以其可確定多個信號的速度，並且第二，如果離子處於低豐度，那麼當儀器聚焦於其他質荷比時，信號可被遺漏。因此，儘管在參考文獻2和3中使用的儀器(Agilent 4500)是靈敏的，其基於四極的檢測器不很好地適用於多個標記物成像，因為通過設計，不同質荷比的離子順序地通過並且所以對於多個標記物的數據獲得是慢的。類似的，在參考文獻4和7中使用的儀器(Thermo Fisher ElementXR and Element2)一次僅分析一個m/Q，並且當測量在超過靜電場跳躍的範圍的範圍內的多個m/Q值時，具有關於磁體跳躍(magnet jump)的大的建立時間。

因此，優選地使用該技術，其提供具有不同m/Q值的離子的基本同時檢測。例如，可能使用陣列檢測器(例如，參見參考文獻9的29章)而不是使用點離子檢測器。可使用多收集器扇形場ICP-MS儀器(例如，Thermo ScientificNeptune Plus、Nu Plasma II和Nu Plasma 1700系統)，並且特別是具有Mattauch-Herzog幾何結構的那些儀器(例如，SPECTRO MS，其可使用半導體直接電荷檢測器在單個測量中同時記錄從鋰到鈾的所有元素)。這些儀器可基本同時測量多個m/Q信號。可通過在檢測器中包括電子倍增器來增加它們的靈敏度。然而，陣列扇形儀器不是理想的，因為儘管它們對檢測正在增大的信號有用，但是當信號水平正在減小時，它們不太有用，並且因此它們不很好地適用於其中標記物以高度可變的濃度存在的情況中。

用於與本發明一起使用的最優選的MS方法基於飛行時間(TOF)檢測，其可準同時地在單個樣品中記錄多個質量。理論上，由於它們的空間電荷特徵，TOF技術並不理想地適用於ICP離子源，但發明人已經示出TOF儀器可足夠快速地和足夠靈敏地分析ICP離子氣霧劑，以允許可行的單細胞成像。然而，TOF質量分析器對於原子分析來說通常是不受歡迎的，這是因為用於處理TOF加速器和飛行管中的空間電荷效應所需的折衷，本發明的組織成像方法通過檢測僅標記的原子可為有效的，並且因此可移除其他原子(例如，具有低於100的原子質量的那些原子)。這導致富集於(例如)100-250道爾頓區域中的質量的不那麼密集的離子束，其可被更有效地操縱和聚集，從而促進TOF檢測並利用TOF的高光譜掃描率。因此，可通過使TOF檢測與選擇樣品中不常見的標記原子結合以及例如通過使用較高質量過渡元素理想地使質量高於未標記樣品中所看到的質量來實現快速成像。使用標記物質量的較窄窗口因此意味著TOF檢測將被用於有效的成像。

合適的TOF儀器可獲得自Tofwerk、GBC科學儀器(例如，Optimass9500ICP-TOFMS)和加拿大富魯達(例如，CyTOFTM和CyTOFTM2儀器)。這些CyTOFTM儀器具有比Tofwerk和GBC儀器更大的靈敏度，並且由於它們可快速地和靈敏地檢測稀土金屬的質量範圍中的離子(特別在100-200的m/Q範圍中)[10]，因此已知被用於質譜細胞術。因此這些為用於本發明的優選儀器，並且它們可用於通過本領域中已知的儀器設置進行成像，例如參考文獻11&12。它們的質量分析器可以以高頻率雷射燒蝕的時間標度上的高質譜獲取頻率準同時地檢測大量的標誌物[4]。它們可測量標記原子的豐度，其中每個單元的檢測極限約為100，從而允許組織樣品的圖像的靈敏構造。由於這些特徵，質譜細胞術可現在用於滿足以亞細胞解析度的組織成像的靈敏度和多路復用需要。先前，質譜細胞術僅被用於分析懸浮液中的細胞，並且關於組織或腫瘤微環境內的細胞-細胞相互作用的信息已經因此丟失。通過使質譜細胞術儀器與高解析度雷射燒蝕系統和快速渡越低分散燒蝕腔室結合，可能允許通過實際時間標度上的高多路復用來構造組織樣品的圖像。可在參考文獻1和13中找到關於質譜細胞術的進一步細節。

用於樣品的燒蝕的雷射器的波長和功率的選擇可遵循通過ICP-MS的細胞分析的正常使用。雷射必須具有足夠的能量密度(fluence)，以導致燒蝕到達所需的深度，而基本上不燒蝕支撐樣品保持器。以20Hz的在2-5J/cm2之間的雷射能量密度(例如，從3-4J/cm2或大約3.5J/cm2)通常為合適的。理想地，單個雷射脈衝將足以燒蝕細胞材料以用於分析，使得雷射脈衝頻率匹配通過其生成燒蝕煙流的頻率。雷射器將通常為準分子雷射器或複合受激態雷射器。可使用氟化氬雷射器(λ＝193nm)獲得合適的結果。使用25μm的孔徑，通過25倍的縮小可將該雷射成像到組織樣品上，以便產生具有1μm直徑的光斑尺寸。這些雷射器的10-15ns的脈衝持續時間可實現充分的燒蝕。還可使用飛秒雷射器(即，脈衝持續時間<1ps)，並且由於傳送到樣品中的熱量減少，所述飛秒雷射器將是有益的，但它們非常昂貴且可在沒有它們的情況下實現良好的成像結果。

總的來說，結合MS檢測器的響應特徵來選擇雷射脈衝頻率和強度，以便允許區分單獨的雷射燒蝕煙流。結合使用小的雷射光斑以及具有短衝洗時間的燒蝕單元，快速和高解析度成像現在是可行的。

構造圖像

LA-ICP-MS可為煙流中的多個標記原子提供信號。煙流中的標記的檢測揭示其同源靶在燒蝕位置處的存在。通過在樣品的表面上的已知空間位置處生成一系列煙流，MS信號揭示樣品上標記的位置，並且因此信號可被用於構造樣品的成像。通過用可區分的標記物來標記多個靶，可能使標記原子的位置與同源靶的位置相關聯，所以本發明可以構建複雜圖像，從而達到遠超過使用現在技術可實現的那些的多路復用水平。發明人已經示出通過本發明的方法所生成的圖像可重現染色模式以及如通過IFM確定的表達給定標誌物的細胞的比例，從而證實本發明適合用於成像。

理想地，將通過在組織樣品上執行雷射的光柵掃描來構造圖像。光柵掃描中連續燒蝕的間距(步長)以及光柵掃描中相鄰線之間的間距理想地與所使用的雷射光斑尺寸相同(例如，對於1μm雷射光斑，間距為1μm)，以便實現感興趣的區域的完整覆蓋。然而，在一些實施方案中，方法可使用小於雷射光斑尺寸的步長(例如，至少2倍、4倍或5倍更小)，因為這可導致更小的燒蝕面積並因此提高成像解析度。為了實現掃描，可能移動雷射器，但通常移動燒蝕單元(或單元的內含物)是更方便的。移動速度將取決於燒蝕頻率和光柵間距，例如，在1μm光柵間距和20Hz燒蝕的情況下，燒蝕單元將具有20μm/s的平移速度。可實現1μm或更小的步長的支撐平臺是可用的(例如，具有500nm或200nm步長(或甚至更小))。

通常基於燒蝕表面層的內含物，本發明的方法用於創建樣品的二維(2D)圖像。可通過組合來自在z軸中相鄰的單個樣品的切片的大量的2D圖像的堆疊(在x,y平面中)來製備組織的3D圖像。然而，作為以該方式組合2D圖像的可選方案，本發明方法還可用於直接3D成像。這可以以多種方式來實現。例如，如果燒蝕導致具有基本恆定深度的氣化，然後在單一x,y點的重複的燒蝕揭示z軸中逐漸地更深的信息。如果燒蝕不具有基本上恆定的深度，那麼可測量燒蝕材料的體積(例如，相對於已知體積標準)，並且該體積可被容易地轉化為z軸深度。在執行3D成像的情況下，可能執行多個z軸燒蝕，同時維持x,y位置(「鑽孔」)，或者逐層燒蝕樣品(即，在移動到更深的z軸層之前執行x,y區域的燒蝕)。逐層燒蝕為優選的。3D成像的準確性由諸如燒蝕材料的再沉積、維持恆定燒蝕深度的能力以及標記物刺入樣品中的能力的因素限制，但仍可在這些限制的範圍內實現有用的結果。

將信號組合為圖像將使用計算機，並且可使用已知的技術和軟體包來實現。例如，參考文獻3使用來自Kylebank軟體的GRAPHIS包，但還可使用諸如TERAPLOT的其他包。使用來自諸如MALDI-MSI的技術的MS數據的成像在本領域中是已知的，例如，參考文獻i公開了用於在Matlab平臺上查看和分析MS成像文件的「MSiReader」界面，並且參考文獻14公開了兩種軟體儀器(例如，「Datacube Explorer」程序)，其用於全空間和光譜解析度中2D MSI數據集和3D MSI數據集兩者的快速數據探索和可視化。

可以進一步分析(例如以分析IHC結果的相同的方式)使用本發明的方法獲得的圖像。例如，圖像可用於描繪樣品內的細胞亞群體，並且可提供對臨床診斷有用的信息。類似地，SPADE分析可用於從本發明方法提供的高維細胞術數據提取細胞層次結構[16]。

組織樣品的標記

本發明提供了已經用多個不同的標記原子標記的樣品的圖像，其中在雷射燒蝕的煙流中通過ICP-MS檢測標記原子。對多個不同原子的提及意味著多於一個的原子種類用於標記樣品。可使用ICP-MS區分這些原子種類(例如，它們具有不同的m/Q比)，使得煙流內兩種不同標記原子的存在產生兩種不同的MS信號。

本發明適合用於比兩種多得多的不同的標記原子的同時檢測，從而允許多重標記物檢測(例如，至少3種、4種、5種、10種、20種、30種、32種、40種、50種或甚至100種不同的標記原子)。標記原子還可以以組合方式來使用，以便甚至進一步增加可區分的標記物的數目。實例論證成像方法中32種不同標記原子的使用，但LA-ICP-MS本質地適用於較高數目的不同原子的並行檢測(例如，甚至超過100種不同原子種類[10])。通過以不同的標記原子來標記不同的靶，在單個圖像中確定多個靶的細胞位置是可能的。

可與本發明一起使用的標記原子包括任何種類，其通過LA-ICP-MS是可檢測的並且基本上不存在於未標記的組織樣品中。因此，例如，12C原子將不適於用作標記原子，因為它們是自然界大量存在的，而11C原子在理論上可以使用，因為其為不自然發生的人造同位素。然而，在優選實施方案中，標記原子為過渡金屬，諸如稀土金屬(15號鑭系元素，加上鈧和釔)。這些17種元素提供可容易地被ICP-MS區分的許多不同的同位素。可獲得以濃縮同位素的形式的這些元素的很多種，例如，釤具有6種穩定同位素，並且釹具有7中穩定同位素，其全部以濃縮形式可獲得。15號鑭系元素提供具有非冗餘唯一質量的至少37種同位素。適於用作標記原子的元素的實例包括鑭(La)、鈰(Ce)、鐠(Pr)、釹(Nd)、鉕(Pm)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、鋱(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、鉺(Er)、銩(Tm)、鐿(Yb)、鑥(Lu)、鈧(Sc)和釔(Y)。例如，本發明可使用如表1至5中列出的鑭系元素的任何同位素。除了稀土金屬之外，其他金屬原子(例如，金(Au)、鉑(Pt)、銥(Ir)、鐒(Rh)、鉍(Bi)等等)適用於通過ICP-MS進行檢測。放射性同位素的使用不是優選的，因為它們不便於處理且不穩定，例如，在鑭系元素當中，Pm不是優選的標記原子。

為了促進TOF分析(參見以上)，使用具有在範圍80-250內(例如，在範圍80-210內或在範圍100-200內)的原子質量的標記原子是有用的。該範圍包括全部的鑭系元素，但排除Sc和Y。100-200的範圍通過使用不同的標記原子允許理論上的101-重(plex)分析，同時允許本發明利用TOF MS的高光譜掃描率。如以上所提及的，通過選擇其質量位於高於未標記樣品中所看到的那些的窗口中的標記原子(例如，在100-200的範圍內)，TOF檢測可用於提供生物學顯著水平的快速成像。

標記組織樣品通常要求標記原子附接到特定結合對(sbp)的一個成員。該標記的sbp與組織樣品接觸，使得其可與sbp的另一個成員(靶sbp成員)交互(如果其存在)，從而將標記原子定位到樣品中的特定位置。本發明的方法然後檢測標記原子在該特定位置的存在，並且將該信息轉化為其中靶sbp成員在所述位置存在的圖像。稀土金屬和其他標記原子可通過已知的技術結合到sbp成員，例如，參考文獻17描述鑭系元素原子到用於ICP-MS檢測的寡核苷酸探針的附接，參考文獻18描述使用釕以標記寡核苷酸，並且Fluidigm Canada出售MaxParTM金屬標記試劑盒，其可用於將超過30種不同的標記原子結合到蛋白質(包括抗體)。

各種數目的標記原子可附接到單個sbp成員，並且當更多標記原子附接到任何sbp成員時，可實現更大的靈敏度。例如，大於10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個標記原子可附接到sbp成員。例如，可使用包含多個單體單元的單分散性聚合物，每個包含諸如DTPA的螯合劑。例如，DTPA結合具有解離常數為大約10-6M的3+鑭系元素離子[1]。這些聚合物可在巰基反應性基團(例如，馬來醯亞胺)中終止，所述巰基反應性基團可用於附接到sbp成員。例如，巰基反應性基團可結合到抗體的Fc區域。其他功能性基團(例如，諸如N-羥基琥珀醯亞胺酯的胺反應性基團，或者針對羧基或針對抗體的糖基化具有反應性的基團)還可用於這些聚合物的結合。任何數目的聚合物可結合到每個sbp成員。可使用的聚合物的特定實例包括直鏈(「X8」)聚合物或第三代樹枝狀(「DN3」)聚合物，這兩者都可用作MaxParTM試劑。金屬納米顆粒的使用還可用於增加標記物中原子的數目。

如以上所提及的，標記原子附接到sbp成員，並且該標記的sbp成員與組織樣品接觸，其中其可發現靶sbp成員(如果存在的話)，從而形成標記的sbp。標記的sbp成員可包括任何化學結構，其適用於附接到標記原子並然後根據本發明用於成像。

一般來說，本發明的方法可基於任何sbp，所述任何sbp已經已知用於在確定組織樣品中靶分子的位置(例如，如在IHC中或螢光原位雜交FISH中使用)中使用，但與樣品接觸的sbp成員將攜帶通過ICP-MS可檢測的標記原子。因此可容易地通過使用可用的IHC和FISH試劑、僅僅通過修改標記物來實施本發明，所述標記物先前已經用於例如修改FISH探針以便攜帶可被ICP-MS檢測的標記物。

sbp可包括以下項中的任一項：核酸雙鏈體；抗體/抗原複合物；受體/配體對；或適體/靶對。因此，標記原子可附接到核酸探針，其然後與組織樣品接觸，使得探針可在其中與互補核酸雜交(例如，以便形成DNA/DNA雙鏈體、DNA/RNA雙鏈體或RNA/RNA雙鏈體)。類似地，標記原子可附接到抗體，抗體然後與組織樣品接觸，使得其可結合到其抗原。標記原子可附接到配體，配體然後與組織樣品接觸，使得其可結合到其受體。標記原子可附接到適體配體，適體配體然後與組織樣品接觸，使得其可結合到其靶。因此，標記的sbp成員可用於檢測樣品中的多種靶(包括DNA序列、RNA序列、蛋白質、糖、脂質或代謝物)。

在本發明的典型實施方案中，標記的sbp成員為抗體。可以通過將結合分子的一個或更多個標記原子結合到抗體來實現抗體的標記(例如，使用如以上所描述的MaxParTM結合試劑盒)。識別對成像有用的細胞蛋白質的抗體已經廣泛地可用於IHC用途，並且通過使用標記原子而不是當前標記技術(例如，螢光)，這些已知的抗體可容易地適用於本發明的方法，但具有增加的多重能力的益處。與本發明一起使用的抗體可識別細胞表面上的靶或細胞內的靶。抗體可識別多種靶，例如，它們可特異地識別單獨的蛋白質，或可識別共享共同表位的多個相關蛋白質，或可識別蛋白質上的特定翻譯後修飾(例如，以便在感興趣的蛋白質上的酪氨酸和磷酸-酪氨酸之間進行區分、以便在賴氨酸和乙醯基-賴氨酸之間進行區分、以便檢測泛素化等等)。在結合到其靶之後，結合到抗體的標記原子可被檢測以揭示樣品中該靶的位置。

標記的sbp成員通常將直接與樣品中的靶sbp成員相互作用。然而，在一些實施方案中，標記的sbp成員與靶sbp成員間接地相互作用是可能的，例如，在夾心分析法模式中，第一抗體可結合到靶sbp成員，並且標記的第二抗體可然後結合到第一抗體。然而，本發明通常依賴於直接相互作用，因為所述直接相互作用可更容易地實現並允許較高的多重化。然而，在兩種情況下，樣品與可結合到樣品中的靶sbp成員的sbp成員接觸，並且在稍後階段，檢測附接到靶sbp成員的標記物。

本發明的一個特徵是其檢測樣品中多個(例如，10個或多於10個，並且甚至高達100個或多於100個)不同靶sbp成員的能力(例如，以便檢測多個不同的蛋白質和/或多個不同的核酸序列)。為了允許這些靶sbp成員的差異檢測，它們各自的sbp成員應攜帶不同的標記原子，使得它們的信號可由ICP-MS區分。例如，在檢測十種不同蛋白質的情況下，可使用十種不同的抗體(每個對不同的靶蛋白質特異)，其每個攜帶獨特的標記物，使得來自不同抗體的信號可被區分。在一些實施方案中，期望的是針對單個靶使用多個不同的抗體(例如，所述多個不同的抗體識別相同蛋白質上的不同表位)。因此，由於該類型的冗餘性，方法可使用多於靶的抗體。然而，通常，本發明將使用多個不同的標記原子以檢測多個不同的靶。

如果多於一個標記抗體與本發明一起使用，那麼優選的是，抗體應具有針對它們各自抗原的類似親和性，因為這幫助確保通過LA-ICP-MS檢測的標記原子的數量和組織樣品中靶抗原的豐度之間的關係將在全部不同sbp內更加一致(特別在高掃描頻率下)。

如果靶sbp成員位於細胞內，則通常有必要在樣品與標記物接觸之前或期間透化細胞膜。例如，當靶為DNA序列但標記的sbp成員不能透過活細胞的膜時，可固定和透化組織樣品的細胞。然後標記的sbp成員可進入細胞並與靶sbp成員形成sbp。在這方面，可利用用於IHC和FISH的已知方案。

通常，本發明的方法將檢測至少一個細胞內靶和至少一個細胞表面靶。然而，在一些實施方案中，本發明可用於檢測多個細胞表面靶同時忽略細胞內靶。總的來說，由於本發明將提供樣品中所選擇靶的位置的圖像，因此靶的選擇將通過從方法所需的信息來確定。

組織樣品

本發明提供對組織樣品進行成像的方法。組織樣品包括多個相互作用的細胞，並且方法使多個這些細胞經受雷射燒蝕，以便提供組織樣品中這些細胞的圖像。通常，本發明可用於分析目前通過IHC技術研究但是使用了適用於通過LA-ICP-MS進行檢測的標記的組織樣品。

任何合適的組織樣品可在本文描述的方法中使用。例如，組織可以是上皮組織、肌肉組織、神經組織等等以及它們的組合。出於診斷或預測目的，組織可來自腫瘤。在一些實施方案中，樣品可來自已知的組織，但樣品是否包含腫瘤細胞可為未知的。成像可揭示指示腫瘤的存在的靶的存在，因此促進診斷。組織樣品可包括乳腺癌組織(例如，人類乳腺癌組織或人類乳腺上皮組織(HMLE))。組織樣品可包含福馬林固定的、石蠟包埋(FFPE)組織。可從任何活的多細胞有機體(但通常將是人類)獲得組織。

通常組織樣品將為切片(例如，具有在2-10μm範圍內(諸如在4-6μm之間)的厚度)。用於製備此類切片的技術(例如，使用切片機，包括脫水步驟、包括包埋等等)在IHC的領域是所眾所周知的。因此，組織可為化學上固定的並且然後可在所需平面中製備切片。冷凍切片或雷射捕獲顯微切割還可用於製備組織樣品。樣品可被透化(例如，以便允許用於細胞內靶的標記的試劑(參見以上內容))。

儘管最大尺寸將由雷射燒蝕裝置指定，並且特別地由可適合其燒蝕單元的樣品的尺寸指定，但是將被分析的組織樣品的尺寸將類似於當前IHC方法。多達5mm x 5mm的尺寸為典型的，但更小的樣品(例如，1mm x1mm)也是有用的(這些維度指的是切片的尺寸，不是其的厚度)。

除了對組織樣品進行成像是有用的之外，本發明反而可用於細胞樣品(諸如貼壁細胞單層或固體表面上固定的細胞單層(如在傳統免疫細胞化學中))的成像。這些實施方案對分析貼壁細胞是特別地有用的，所述貼壁細胞不可被容易地溶解用於細胞懸浮液質譜細胞術。因此，和對增強當前免疫組織化學分析有用一樣，本發明可用於增強免疫細胞化學。

根據本發明，在被製備之後，樣品將被放置在雷射燒蝕單元中，並且然後經受分析。

單細胞分析

本發明的方法包括樣品中的多個細胞的雷射燒蝕，並且因此分析來自多個細胞的煙流，並且將它們的內含物映射到樣品中的特定位置，以提供圖像。在大多數情況中，方法的使用者將需要將信號定位到樣品內的特定的細胞，而不是將信號定位到作為整體的樣品。為了實現將信號定位到樣品內的特定細胞，可以劃分樣品中細胞的界限(例如質膜，或在一些情況中細胞壁)。

劃分細胞的界限可以以多種方式實現。例如，可使用可劃分細胞界限的傳統的技術研究樣品，諸如顯微術。然後可使用本發明的方法製備該樣品的圖像，並且該圖像可疊加在較早的結果上，因此允許LCP-MS信號定位到特定的細胞。

然而，為了避免使用多個技術的需要，劃分細胞界限作為本發明的成像方法的一部分是可能的。從IHC和免疫細胞化學此類界限劃分策略是熟悉的，並且通過使用可被ICP-MS檢測的標記物，這些方法可被適用。例如，方法可包括標記已知定位在細胞界限的靶分子，並且然後來自這些標記物的信號可被用於界限劃分。合適的靶分子包括細胞界限的豐富的或普遍的標誌物，諸如粘附複合體的成員(例如β-連環蛋白或E-鈣粘素)。一些實施方案可標記多於一種膜蛋白以便增強劃分。

除了通過包括合適的標記物劃分細胞界限之外，以該方式劃分特定的細胞器也是可能的。例如，抗原諸如組蛋白(例如H3)可被用於鑑定細胞核，並且標記線粒體特異的抗原、細胞骨架特異的抗原、高爾基體特異的抗原、核糖體特異的抗原等也是可能的，因此通過本發明的方法允許分析細胞的超微結構。

可通過肉眼評價，或可通過計算機使用圖像加工分析劃分細胞(或細胞器)的界限的信號。此類技術在本領域對於其他成像技術是已知的，例如參考文獻19描述了分割方案，其使用空間濾波從螢光圖像來確定細胞界限，參考文獻20公開了算法，其從明視野顯微鏡圖像確定界限，參考文獻21公開了CellSeT方法來從共聚焦顯微鏡圖像提取細胞幾何形狀，以及參考文獻22公開了CellSegm MATLAB工具箱用於螢光顯微鏡成像。可與本發明一起使用的方法使用分水嶺轉化(watershed transformation)和高斯模糊(Gaussian blurring)。這些圖像加工技術可以獨立地使用，或其可被使用並且然後肉眼檢查。

已劃分細胞的界限後，將來自特定的靶分子的信號分配到單獨的細胞是可能的。定量單獨的細胞中的靶分析物的量也可以是可能的(例如，通過針對定量標準校正方法)。本發明的方法是高度定量的。與已知的方法比較，本發明的方法不經受樣品的自發螢光，當與MALDI和SIMS成像中共有的那些方法相比，基體效應最小或不存在，不存在對於放大步驟的需要，諸如在IHC中通常採用的，組織可被完全地取樣，並且方法具有～105的寬的動態範圍。

與其他技術的結合

本發明的方法可以與其他成像技術結合，並且從不同技術獲得的圖像可以結合以給出更豐富的綜合圖像。例如，首先可以通過傳統的技術諸如顯微術使用螢光和/或可見標記物(例如IHC分析)使樣品成像。由於此類技術是非破壞性的，並且由於它們的標記物通常不包括給出有用的LCP-MS信號的原子(通常它們由與樣品自身相同的原子組成；如果它們確實含有在MS光譜中將是可見的原子，那麼它們的存在可在MS步驟中被容易地補償，例如通過不使用這些原子作為標記原子)，然後樣品可通過本發明的方法成像，並且顯微術和質譜細胞術結果可結合使用。

如果本發明的方法與另一種破壞性成像技術(例如MALDI成像[23])結合，那麼對同一組織的相鄰切片使用這兩種技術是優選的。

一般

術語「包含(comprising)」涵蓋「包括(including)」以及「組成(consisting)」例如「包含」X的組合物可以獨一地由X組成或可包括另外的一些例如X+Y。

與數值x有關的術語「約」是任選地並且意味著例如x+10％。

術語「基本地(substantially)」不排除「完全地(completely)」例如「基本不含」Y的組合物可以完全沒有Y。必要時，單詞「基本地」可以從本發明的定義省略。

附圖簡述

圖1a示出了使用識別五種標誌物(從上到下：H3；HER2；CK8/18；E-Cad；Vim)的未標記的(左)和金屬標記的(右)抗體，對管腔HER2+亞型(病例號37)的連續乳腺癌組織切片的IFM。字母指示標記物顏色，其中c＝藍綠色，r＝紅色，y＝黃色。

圖1b示出了使用識別與圖1a相同的五種標誌物的金屬標記的抗體，對管腔HER2+亞型(病例號210、23和37)的乳腺癌組織切片的IFM(左)和CyTOF成像質譜細胞術(右)。

圖2a示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號210)的質譜細胞術圖像。以1-μm解析度同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。細胞角蛋白8/18(紅色)、H3(藍綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖2b示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號210)的質譜細胞術圖像。以1-μm解析度同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。細胞角蛋白7(紅色)、H3(藍綠色)和CD44(黃色)的疊加。

圖2c示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號210)的質譜細胞術圖像。以1-μm解析度同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。泛-肌動蛋白(紅色)、孕酮受體(藍色)和CD68(黃色)的疊加。

圖2d示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號23)的質譜細胞術圖像。以1-μm解析度同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。HER2(紅色)、H3(藍綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖2e示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號23)的質譜細胞術圖像。以1-μm解析度同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。E-鈣粘蛋白(紅色)、細胞角蛋白7(黃色)和S6上的S235/S236上的磷酸化(藍色)的疊加。

圖2f示出了管腔HER2+乳腺癌組織樣品(病例號23)的質譜細胞術圖像。以1-μm解析度同時測量了總共32個蛋白和磷酸化位點(表1和2)。β-連環蛋白(紅色)、雌激素受體(藍色)和CD68(黃色)的疊加。比例尺，25μm。

圖3示出了通過成像質譜細胞術(上兩行；C)或IFM(下兩行；IFM)的貼壁細胞的分析。顯微照片示出了如用金屬標記的抗體所指示的，標記的和成像的人類乳腺上皮細胞，所述金屬標記的抗體識別一組磷酸化殘基(從左向右：PLCγ2，pY759；ERK，pT202/pY204；p38，pT180/pY182；S6，pS235/pS236)，該人類乳腺上皮細胞經(行1&3；+)或未經(行2&4；–)酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸酯處理30-min。比例尺，25μm。對於每個對照刺激的比較，保持恆定的曝光，但不同的抗體之間不保持恆定的曝光。

圖4a示出了以指示的標誌物模式鑑定重疊的細胞群體的SPADE樹。淺灰色區域含有在所有通道具有低標誌物表達的細胞。Vim，波形蛋白；E-Cad，E-鈣粘蛋白；CK8/18，細胞角蛋白8/18；CK7，細胞角蛋白7；β-Cat，β-連環蛋白；ER，雌激素受體；CAH IX，碳酸酐酶IX；PR，孕酮受體；med，培養基。

圖4b示出了顯示對腫瘤病例號201的CD20側群的聚類樹。顏色表示指示的標誌物的表達水平，並且結節的尺寸對應來自給定患者的落在細胞聚類內的細胞的百分比。

圖4c到4i示出了聚類樹，所述聚類樹示出了HER2+樣品的細胞亞群。病例號是(c)359(d)254(e)210(f)199(g)201(h)294(i)276，其是管腔樣品。

圖5示出燒蝕小室在20Hz的信號分離。示出的信號是所有感興趣的同位素相加的強度。讀數是對所有測量的通道相加。

圖6示出了通過IFM(左)和CyTOF成像質譜細胞術(右)對管腔HER2+亞型的乳腺癌組織切片分析的金屬標記的抗體的特異性的比較(PR病例號210、HER2和細胞角蛋白8/18病例號23)。Hoechst 33258和H3以藍綠色示出，而三種特異的標誌物以紅色示出(上：PR；中：Her2；下：CK8/18)。指示每雷射射出計數的比例最大值被調整如下：H3,200(病例號210)和400(病例號23)；PR,10；HER2,50；細胞角蛋白8/18,30。圖像中白色尺寸條指示25μm。

圖7a示出了組織號210的圖像，顯示β-連環蛋白(紅色)、H3(藍綠色)和pS6(黃色)的疊加。對於圖7a-d，指示每雷射射出計數的比例最大值被調整如下：pS6，15(組織號210)和20(組織號23)；H3，200(組織號210)和400(組織號23)；β-連環蛋白，20；HER2，30；CAH IX，15；E-鈣粘蛋白，20；波形蛋白，400；細胞角蛋白8/18,25。圖像中白色尺寸條指示25μm。

圖7b示出了組織號210的圖像，顯示HER2(紅色)、H3(藍綠色)和CAH IX(黃色)的疊加。

圖7c示出了組織號210的圖像，顯示E-鈣粘蛋白(紅色)、H3(藍綠色)和波形蛋白(黃色)的疊加。

圖7d示出了組織號23的圖像，顯示細胞角蛋白8/18(紅色)、H3(藍綠色)和S6上磷酸化(黃色)的疊加。

圖8A-E示出了病例號37的連續切片上金屬標記的抗體(左上)和未標記的抗體(右上)的IFM圖像。示出了金屬標記的抗體(左下)和未標記的抗體(右下)的IFM分析的單細胞強度分布，其描繪針對事件的強度。事件數目未被標準化。平均信號由紅色線代表。中值信號由綠色方形代表。

圖9a和9b示出了在單重IHC(左側兩個插圖)和32重成像質譜細胞術(右側的插圖)測量結果之間的比較。使用了管腔HER2+腫瘤(病例號210)的切片，但切片不是連續的。指示每雷射射出計數的比例最大值被調整如下：HER2，30；PR，10；CK8/18，80；H3，200。圖像中白色尺寸條指示25μm。

進行本發明的模式

以下提出的實施例論證成像技術，所述成像技術延伸基於CyTOF的質譜細胞術的多重分析能力來進行使用LA-ICP-TOFMS的空間分辨的測量。進一步的詳述公開在參考文獻24以及其補充信息中(全部通過引用併入本文)，包括圖1-4和6-9的彩色拷貝。

實施例1-使用質譜細胞術使組織樣品成像

已經開發了將質譜細胞術、ICC和IHC分析與高解析度雷射燒蝕系統耦合的工作流程，以允許貼壁細胞和組織切片的具有1μm的亞細胞解析度的分析。

第一步中，使用常規ICC和IHC方案，製備細胞樣品或組織切片用於抗體標記[25]。選擇抗體以靶向與乳腺癌相關的32種蛋白和蛋白修飾。在染色之前，用限定原子質量的獨特稀土金屬同位素對抗體加標籤。

空氣乾燥後，將樣品安置在參考文獻7中描述的雷射燒蝕小室內，該雷射燒蝕小室使氣霧劑分散最小化，用於高解析度、高通量和高靈敏度分析。然後，逐光斑和逐行燒蝕組織，並且然後通過混合的氬氣和氦氣的流將燒蝕的材料運輸到CyTOF質譜細胞儀。

圖5示出了，對所有測量的通道相加的、在20Hz的單獨的雷射射出的信號被完全地分開。假設泊松統計，檢測的極限是近似六個離子計數(對應～500分子)。

在數據預處理之後，使用每個單一雷射射出的坐標描繪32個瞬時的、單一的同位素信號，並且通過疊加所有分析的測量通道生成樣品的高維度圖像。下一步，使用分水嶺算法在計算機上分割單細胞特徵，並且使標誌物表達數據與單獨的細胞匹配。單細胞數據被用於所有的下遊數據分析，並且來研究總共來自20個乳腺癌患者的一組21個腫瘤和正常樣品內的細胞亞群。

患者和標本特徵

組織微陣列(TMA)含有如先前描述的[26]主要亞型的FFPE乳腺癌組織和正常的乳腺組織。通過成像質譜細胞術分析的所有腫瘤被兩個有經驗的臨床病理學家通過蘇木精和曙紅染色再評價，以鑑定代表性區域。根據國際癌症控制聯盟(UICC)和世界衛生組織(WHO)標準，分配腫瘤階段和Bloom-Richardson-Elston(BRE)級別。乳腺癌亞型的分類是基於ER、PR和HER2的IHC表達模式。通過HER2IHC和HER2FISH評價HER2狀態[27]。

準備HMLE細胞用於成像質譜細胞術

使人類乳腺上皮(HMLE)細胞[28]在玻璃蓋玻片上生長到～80％匯合，並且在37℃用模擬物處理或用125μM釩酸酯處理持續30min。使用標準的ICC方案[25]，準備細胞用於成像質譜細胞術和IFM。

抗體

獲得在無載體/蛋白的緩衝液中的抗體並且然後根據供應商的說明書[29]使用抗體綴合試劑盒製備。在我們通過在280nm的吸光度的測量，確定百分產率之後，在穩定液中稀釋金屬標記的抗體用於在4℃的長期儲存。在該研究中使用的抗體在表1至5中列出。

準備乳腺癌組織切片用於IHC、IFM和成像質譜細胞術

這些實施例中論證的TMA的所有經典IHC染色在Ventana Benchmark XT上使用Ventana預稀釋的抗體和標準的方案進行。將樣品對HER2、PR、細胞角蛋白8/18和H3染色。對於每個抗體的比較分析，保持給定標誌物的曝光時間恆定。通過ImageJ軟體加工圖像。

將組織號23和FFPE乳腺癌TMA及相應的健康組織切成5-μm厚度用於成像質譜細胞術。在二甲苯中過夜使切片脫蠟，然後在梯度系列的乙醇中復水(純乙醇、乙醇：去離子水為90:10、80:20、70:30、50:50、0:100；每次10min[30])。在88℃水浴中的pH為9的Tris-EDTA緩衝液中，進行熱誘導的表位修復持續20min。在立即冷卻之後，用在PBS/0.1％Triton X-100中的1％BSA封閉TMA持續30min。為了染色，使TMA樣品與抗體預混液在4℃孵育過夜(表1、4和5)。然後用PBS/0.1％Triton X-100洗滌樣品五次。

對於在圖1b、2和7中示出的TMA核心號210，使用了以下的方案：在92–94℃在pH為9的Tris-EDTA緩衝液中熱誘導的表位修復持續20min。在立即冷卻之後，用TBS/0.1％Triton X-100中的3％BSA封閉TMA切片持續45min。使TMA樣品與抗體預混液在4℃孵育過夜(表2)，該抗體預混液含有除了抗-pSHP2、抗-CD31、抗-TWIST、抗-CD3、抗-SLUG和抗-EGFR之外的所有抗體。在用2×TBS/0.1％Triton X-100和2×TBS的洗滌步驟之後，添加那些抗體，並且在室溫孵育樣品2.5小時，以及然後在4℃孵育1小時。在洗滌之後，在成像質譜細胞術之前，使樣品在室溫乾燥。

高空間解析度雷射燒蝕

通過如以上討論的成像質譜細胞術分析組織切片。修改的ArF準分子GeoLas C雷射系統(Coherent)將均質的UV雷射束(λ＝193nm)遞送到25μm的孔，所述均質的UV雷射束通過25倍縮小在組織樣品上成像。得到的1μm直徑和3.5J/cm2雷射能量密度的雷射束被用於以20Hz的頻率燒蝕抗體染色的組織。得到的組織的雷射燒蝕坑直徑為～1μm(如通過掃描電子顯微術確定的)。雷射燒蝕小室的平移速度是20μm/s。為了完全取出在感興趣的區域內的組織層，以1-μm距離光柵掃描單獨的線掃描。用於使在雷射燒蝕系統上的高空間解析度、高靈敏度成像成為可能的雷射燒蝕小室在參考文獻7中被詳述。燒蝕的樣品氣霧劑通過氬氣和氦氣氣流被直接地運輸到CyTOF質譜細胞儀。CyTOF儀器設置[11、12]先前被關於CyTOF軟體版本5.1.598描述。

單細胞分割

在單細胞蛋白表達分析之前，拓撲單細胞分割是必需的。為了檢測圖像中的細胞界限，將細胞膜蛋白β-連環蛋白、HER2和細胞角蛋白8/18摻入實驗方案；對蛋白H3染色，用於鑑定細胞核。圖像示出了對齊良好的形態學細胞界限和中央。通過分水嶺轉化實現了進一步的細胞分割[31、32]。首先，使膜圖像和陰性細胞核圖像疊加，以產生最大的細胞界限信息。然後圖像被高斯模糊以使成像偽跡和噪音最小化。最後，用Matlab成像工具箱(Matlab R2011b)沿著細胞膜尋找分水嶺。用先前的高斯模糊(3–4.5像素的核心寬度)和用於分水嶺的標準參數[30]，實現了最佳分割結果。如果必要的話，視覺評價以及修正所有的單細胞界限。然後，使界限罩的內含物經受單細胞分析。最後，將單細胞標誌物表達對從每個圖像獲得的中值H3信號標準化。

單細胞標誌物強度的比較

對於免疫螢光圖像，使用CellProfiler[33]分割流水線進行單細胞分割。所有強度被從0至1重新修改比例，並且移除異常值(90％的上皮細胞表達這些標誌物，如圖9a和b中示出的。同一管腔HER2+腫瘤(病例號210)的切片被用於圖9a和9b中示出的質譜細胞術和IHC，但切片不是連續的。染色模式中未發現明顯差異。指示每雷射射出計數的比例最大值被調整如下：HER2，30；PR，10；CK8/18，80；H3，200。對於圖9a，對於成像質譜細胞術和IHC分析使用同一抗體克隆。對於圖9b，對於成像質譜細胞術和IHC分析使用不同抗體克隆(成像質譜細胞術：HER2，BD(3B5)；PR，Epitomics(EP2)和IHC:HER2，Ventana(4B5)；PR，Ventana(1E2))。

在IFM分析中以一式兩份測量的抗體在表達給定分析的標誌物的腫瘤細胞的空間分布和百分比方面示出與32重CyTOF分析中的那些相當的性質(圖1b和圖6)。總之，這些結果指示，多重化不導致抗體表現的可觀察的變化。

因此，這些實施例中展示的結果示出，成像質譜細胞術使具有亞細胞解析度的同時且高度多重化的組織成像成為可能。在未標記的和標記的抗體之間，或在單重IHC、雙重IFM和使用成像質譜細胞術的多重分析之間不存在特異性和性能的明顯變化。

實施例5-評價ICC方案中的貼壁細胞系

測試成像質譜細胞術以確定其是否可以被用於評價ICC方案中的貼壁細胞系。通過模擬物處理的和磷酸酪氨酸磷酸酶抑制劑處理的HMLE細胞的質譜細胞術的28個標誌物的分析揭示了預期的信號傳導反應。表3示出了該分析中使用的標誌物和抗體的細節。如圖3中示出的，在PLCγ2上的Y759上、在ERK1上的T202和Y204上(在ERK2上的T184和Y186上)以及在p38上的T180和Y182上觀察到增加的磷酸化。

圖3示出了通過IFM和成像質譜細胞術對貼壁細胞的分析。圖3中示出的顯微照片中示出了如用識別一組磷酸化殘基的抗體所指示的，標記的且成像的人類乳腺上皮細胞，該人類乳腺上皮細胞未經酪氨酸磷酸酶抑制劑釩酸酯(「對照」)和經(「刺激」)的30-min的處理。對於每個對照刺激的比較保持恆定的曝光，但不同的抗體之間不保持恆定的曝光。注意，一抗和二抗檢測被分別用於成像質譜細胞術和IFM。

對質譜細胞術獲得的結果與來自類似地處理的和製備的HMLE細胞的IFM分析的數據一致(圖3)。對於其他非酪氨酸磷酸化位點，包括在S6上的S235和S236上，未觀察到誘導。

因此，本發明的方法適用於成像貼壁細胞單層以及離體樣品。

實施例6-乳腺癌中的腫瘤異質性分析

乳腺癌中，HER2、雌激素受體(ER)和PR的表達被用於定義主要的亞型，包括管腔HER2-、管腔HER2+、HER2+和三陰性[35]和[36]。測試本發明的方法具有以下的目的：(i)使用我們的多重測量結果描繪細胞亞群的表型和(ii)評價是否可以使用成像質譜細胞術，檢測先前觀察到的在那些亞型內和之間的乳腺癌異質性[37]、[38]和[39]。使用32重成像大量細胞分析法來分析組織微陣列(TMA)上的21個FFPE樣品，所述21個FFPE樣品先前已被病理學家分類為主要的乳腺癌亞型或為正常的。

使用密度標準化事件的生成樹級數分析(spanning-tree progression analysis of density-normalized events，SPADE)[16]，鑑定細胞亞群和細胞轉變。對於分析的腫瘤的SPADE分析，在http://cytobank.org/上並且使用軟體工具SPADE[16]分析從分水嶺算法中提取的細胞事件。以下概括了在基於成像的該單細胞分析的條件內的SPADE算法。首先，進行所有的提取的細胞事件的密度依賴的縮小取樣到預定的靶數目。實施以下的設置：Arcsinh Cofactor＝5，聚類的靶數目＝150，縮小取樣到事件的靶數目＝5。通過使用軟體Cytoscape_v.2.8.3，運行分析。然後，根據19種標誌物(ER、PR、CD68、CD20、c-MYC、HER2、pAMPK、H3、pERK、pBad、CD44、β-連環蛋白、波形蛋白、細胞角蛋白7、CAH IX、E-鈣粘蛋白、pS6、半胱天冬酶3和細胞角蛋白8/18)的表達，將縮小取樣的細胞事件聚類為細胞的表型上類似的團塊。細胞的表型上類似的團塊經由邊緣連接，以畫出最小生成樹。下一步，進行放大取樣步驟以將來自初始數據集的每個細胞事件分配到最具代表性的團塊。最後，最小生成樹投射到兩個維度，並且代表細胞團塊的樹的圈被給定的測量參數的中值強度水平著色，允許跨越整個細胞層次的標誌物的表達可視化。對於代表細胞群體的SPADE樹，結節尺寸作為總百分比被給出(例如，來自給定圖像的細胞的數目落入細胞聚類)。使用屬性值：0/5/7/15/最大，結節尺寸：60/120/150/200/200。圖4中，對於HER2，在4-9的範圍中設定彩色條具有步長4/4.5/5/6/7/8.5/9。展示了CD20陽性細胞亞群，並且在以下步長的0-9的範圍中設定彩色條：1/3/5/6/7/8/9。

圖4示出了腫瘤異質性的成像質譜細胞術分析。分析了來自20個乳腺癌患者的21個樣品。SPADE樹鑑定了具有指示的標誌物模式的重疊細胞群體。淺灰色區域含有在所有通道中具有低標誌物表達的細胞(圖4a)。圖4b示出了顯示對腫瘤病例號201的CD20側群的聚類樹。圖4c-g示出了通過乳腺癌亞型HER2+細胞亞群反映以下這些細胞的潛在的異質性：示出了病例號359(c)、254(d)、210(e)、199(f)和201(g)。圖4h-i示出了聚類樹，所述聚類樹示出了HER2+(病例號294；h)和管腔HER2+樣品(病例號276；i)的細胞亞群。顏色表示指示的標誌物的表達水平，並且結節的尺寸對應來自給定患者的落在細胞聚類內的細胞的百分比。

SPADE樹反映表達波形蛋白的基質細胞亞群、表達寬範圍的標誌物的上皮腫瘤細胞亞群、和CD20+免疫細胞(圖4a和b)。HER2(圖4a、c–i)、波形蛋白、PR、ER、β-連環蛋白、碳酸酐酶(CAH)IX、E-鈣粘蛋白、c-MYC和其他的水平變化相當大(圖4a)。甚至在同一腫瘤內，可見表達的明顯差異，特別對於細胞角蛋白8/18、細胞角蛋白7、HER2和E-鈣粘蛋白染色(圖2)。當分支被用於患者分類的標誌物驅動時，鑑定的細胞亞群還部分地反映預期的乳腺癌亞型：例如，HER2+和管腔HER2+(圖4e、f、h、i)。

SPADE分析部分地反映了腫瘤亞型，如圖4中可見的。然而，這不減損SPADE工具對於高維度單細胞數據的強大的可視化能力，允許細胞亞群的人工分配並且因此描繪如以上示出的乳腺癌細胞亞群的圖。

七個樣品被分類為HER2+或管腔HER2+。這些樣品構成SPADE樹中的HER2陽性分支，但還存在在細胞角蛋白8/18、E-鈣粘蛋白、β-連環蛋白和c-MYC的表達中不同的獨特亞群(圖4a)。例如，管腔HER2+腫瘤號210(圖4e)，其過量表達c-MYC。在同一乳腺癌亞型內的這些差異指示患者間的腫瘤異質性(圖4e、f、h、i)。

執行本發明的這些模式證實，質譜細胞術使細胞類型標誌物、癌症的信號傳導活性和標誌諸如缺氧的同時成像成為可能。總之，這些分析描繪在分析的FFPE樣品中存在的乳腺癌細胞亞群，鑑定了它們的空間排列，並且揭示了在同一患者內和患有同一腫瘤分類的患者之間的差異。

將理解的是，以上僅通過實施例的方式描述了本發明，並且可作出修改，同時保持在本發明的範圍和精神之內。

參考文獻

[1]Tanner et al.Cancer Immunol Immunother(2013)62：955-965

[2]Hutchinson et al.(2005)Anal.Biochem.346：225-33.

[3]Seuma et al.(2008)Proteomics 8：3775-84.

[4]Giesen et al.(2011)Anal.Chem.83：8177-83.

[5]Kindness et al.(2003)Clin Chem 49：1916-23.

[6]Gurevich&(2007)J.Anal..At.Spectrom.，22：1043-1050.

[7]Wang et al.(2013)Anal.Chem.85：10107-16.

[8]WO2014/146724.

[9]Herbert&Johnstone，Mass Spectrometry Basics，CRC Press 2002.

[10]Bandura et al.(2009)Anal.Chem.，81：6813-22.

[11]Bendall et al.(2011)Science 332，687-696.

[12]Bodenmiller et al.(2012)Nat.Biotechnol.30：858-867.

[13]US patent 7479630.

[14]Robichaud et al.(2013)JAm Soc Mass Spectrom 24(5)：718-21.

[15]Klinkert et al.(2014)Int J Mass Spectrom http：//dx.doi.org/10.1016/j.ijms.2013.12.012

[16]Qiu et al.(2011)Nat.Biotechnol.29：886-91.

[17]Brückner et al.(2013)Anal.Chem.86：585-91.

[18]Gao&Yu(2007)Biosensor Bioelectronics 22：933-40.

[19]Arce et al.(2013)Scientific Reports 3，article 2266.

[20]Ali et al.(2011)Mach Vis App/23：607-21.

[21]Pound et al.(2012)The Plant Cell 24：1353-61.

[22]Hodneland et al.(2013)Source Code for Biology and Medicine 8：16.

[23]McDonnell&Heeren(2007)Mass Spectrom Rev.26(4)：606-43.

[24]Giesen et al.(2014)Nature Methods 11：417-422.

[25]Blurry.Immunocytochemistry，a Practical Guide for Biomedical Research(Springer，2010).

[26]Theurillat，J.P.et al.NY-BR-1 protein expression in breast carcinoma：a mammary gland differentiation antigen as target for cancer immunotherapy.Cancer Immunol.Immunother.56，1723-1731(2007).

[27]Kherlopian et al.(2008)BMC Syst.Biol.2：74.

[28]Elenbaas，B.et al.Human breast cancer cells generated by oncogenic transformation of primary mammary epithelial cells.Genes Dev.15，50-65(2001).

[29]Lou，X.et al.Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.46，6111-6114(2007).

[30]Robertson，D.，Savage，K.，Reis-Filho，J.S.&Isacke，C.M.Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded(FFPE)tissue.BMC Cell Biol.9，13(2008).

[31]Meyer，(1994)Topographic distance and watershed lines.Signal Processing 38，113-125.

[32]Shapiro，L.G.&Stockman，G.C.Computer Vision(Prentice Hall，2001).

[33]Kamentsky，L.et al.Improved structure，function and compatibility for CellProfiler：modular high-throughput image analysis software.Bioinformatics 27，1179-1180(2011).

[34]Currie(1995)Nomenclature in evaluation of analytical methods including detection and quantification capabilities(IUPAC recommendations 1995).Pure Appl.Chem.67，1699-1723.

[35]Perou et al.(2000)Molecular portraits of human breast tumours.Nature 406，747-752.

[36]Sims，A.H.，Howell，A.，Howell，S.J.&Clarke，R.B.Origins of breast cancer subtypes and therapeutic implications.Nat.Clin.Pract.Oncol.4，516-525(2007).

[37]Marusyk，A.，Almendro，V.&Polyak，K.Intra-tumour heterogeneity：a looking glass for cancer？Nat.Rev.Cancer 12，323-334(2012).

[38]Hanahan，D.&Coussens，L.M.Accessories to the crime：functions of cells recruited to the tumor microenvironment.Cancer Cell 21，309-322(2012).

[39]Nowell，P.C.The clonal evolution of tumor cell populations.Science 194，23-28(1976).

表1-用於腫瘤病例號23的抗體(圖1和2)

表2-用於腫瘤病例號210的抗體(圖1、2和6)

表3-用於粘附細胞成像的抗體(圖3)

表4-用於組織成像的抗體(TMA1)

表5-用於組織成像的抗體(TMA2)