一種應用於生物催化轉化的組合固定化方法
2023-08-08 06:38:06
專利名稱：一種應用於生物催化轉化的組合固定化方法
技術領域：
本發明涉及生物化工及酶工程技術領域。具體涉及組合固定化方法的開發及在不同生物催化反應體系中的應用。
背景技術：
生物催化劑(酶與細胞)的固定化是將具有化學催化活性的蛋白質固定，即定位於一定的空間範圍內，實現催化反應。由於它具有反應後易於與底物、產物分開，活性蛋白質的穩定性提高，可反覆使用、連續化操作和反應所需空間小等顯著優點，因此與游離酶及細胞相比可大大降低生產成本，增強對苛刻反應條件的適應能力，提高生物反應器單位體積的生產能力。目前，固定化技術的應用已涉及食品、化工、醫藥、化學分析、環境保護和能源開發等諸多領域。
多年來，國內外皆投入了大量人力、物力、財力對固定化技術進行研究，固定化技術也因此成為當今生物工程中的關鍵技術之一。目前發展的固定化方法主要包括吸附法、包埋法、交聯法、化學共價法、微囊化法、絮凝法等，現有的各種固定化方法各有其優缺點，上述方法不是存在固定化後生物催化活性損失大、再生困難等缺點，就是存在生物催化劑易洩漏、脫落、製備困難、穩定性差、固定化費用高的不足，從中還不能找出一種既經濟高效又較為普適的固定化方法。需要十分強調的是現有的各種固定化方法在實際應用中屬於隨機固定化，即生物催化劑(酶和細胞)與固定化載體的結合位點及方向是隨機的，因此，很難預測這種隨機固定化酶與細胞的性質，也很容易被鄰近生物催化劑分子(酶分子或細胞)接觸的空間位阻屏障，從而大大降低生物催化劑(酶分子或細胞)催化活性。還應指出的是，儘管固定化方法是一條十分有效地保持或增加生物催化劑穩定性的途徑，但是由於對生物催化劑的複雜失活因素及失活機理的基礎研究還不夠深入，往往導致固定化載體介質、固定化過程中及固定化後反應微環境所引起的生物催化劑的失活。
目前，如何解決這些問題已經成為固定化技術的研究熱點，研究者不斷對固定化載體進行改良並提出新的載體和新的固定化方法，並在組合固定化方面進行了大量的研究。組合固定化技術就是將兩種或者兩種以上的固定化方法組合應用，及添加穩定因子和促進因子的固定化方法。它能夠平衡傳統單一固定化方法的優缺點，使酶在保持原有活性的基礎上，穩定性也有所提高，還具有操作簡單，成本低廉等優點。為傳統的固定化方法注入了新的特點和活力，使固定化技術的應用前景更加廣闊。凝膠包埋法是細胞固定化最常用的方法，即將細胞包裹於凝膠的微小格子內，該方法操作簡單，對細胞活性影響較小，製作的固定化細胞球的強度較高。常用的凝膠包埋固定化載體有卡拉膠、海藻酸鈣(SA)、聚乙烯醇(PVA)、瓊脂、明膠以及丙烯醯胺(ACRM)等。可以用於微生物(或酶)固定化的動物腸衣是一種膠原蛋白膜，具有化學穩定性好，安全無毒和生物體有較好的相容性的特點，且由於膠原是從牛筋中提取出來的具有蛋白質結構的天然生物材料，原料易得。但是動物腸衣存在耐水性差，易溶脹溶解的缺點，在水相反應體系中，由於長期與水接觸，動物腸衣易溶於水中，動物腸衣的固定化體系無法長期使用，為了增加動物腸衣的耐水性能，需要進行改性，不同的改性方法，如熱處理、縮醛化、等離子體改性，得到的改性動物腸衣的物理化學性質及動物腸衣的結構和性能不盡相同。因此，需要選取較為合適的改性方法應用於動物腸衣固定化技術，尋找一個合適的具有很好的穩定性及可反應性的固定化載體，最終將動物腸衣固定化技術應用於工業化生產。
發明內容
本發明的目的是為了克服現有固定化技術生物催化活性損失大、再生困難、生物催化劑易洩漏、脫落、製備困難、穩定性差、固定化費用高的缺點而提供了一個操作簡單、成本低廉、機械強度好、酶活回收率高的應用生物催化轉化的組合固定化方法。
本發明的技術方案為一種應用於生物催化轉化的組合固定化方法，其具體步驟如下A)固定化顆粒的製備將凝膠加入水，加熱溶解後，冷卻37-45℃，以溼細胞或者酶為生物催化劑，與酶保護劑製成菌懸液或者酶懸浮液，與凝膠混勻，倒入培養皿中，冷卻、硬化及活化處理，再於冰箱中靜置，切成顆粒，即得凝膠顆粒；或者量取一定量的以溼細胞或者酶為生物催化劑發酵液，移置容器中，攪拌下緩慢加入絮凝劑，加入完畢後，繼續攪拌10～15min，靜置分層，抽濾得到絮凝團。
B)將上述所得的凝膠顆粒或絮凝團包埋於改性的動物腸衣中；C)將步驟B)中所製得的裝有凝膠顆粒或絮凝團的改性動物腸衣浸沒於生物反應的底物溶液中反應。
其中步驟A)中的凝膠為卡拉膠、明膠、瓊脂、海藻酸鈣、聚乙烯醇或丙烯醯胺的一種或兩種的混合；以溼細胞或者酶為生物催化劑為天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10、豬胰脂肪酶、天冬氨酸酶產生菌E.coli ATCC 11303、產氨短桿菌MA-2或黃色短桿菌MA-3；絮凝劑為殼聚糖、CaCl2或聚丙烯醯胺。
其中酶保護劑為海藻糖溶液和/或Mg2+溶液。酶保護劑的加入量以整體固化溶液為基準，海藻糖溶液為50mmol/L～250mmol/L，Mg2+溶液為2mmol/L～5mmol/L；絮凝劑的加入量為50～80mg/L。生物催化劑的加入量同凝膠的質量比為3～5∶1。
其中生物反應的底物溶液分別為苯丙酮酸與天冬氨酸溶液、烯丙醇酮與醋酸乙烯酯溶液、富馬酸銨或富馬酸鈉溶液，上述成組底物溶液的摩爾比為1∶1左右。底物溶液的加入量根據不同的反應體系及不同的反應條件而變化。
其中步驟B)中，不同的改性膠動物腸衣是在動物腸衣的基礎上，通過常規的鐵離子改性法、絡合物改性法或甲醛改性法得到的改性動物腸衣。
其中步驟C)反應溫度與反應時間為常規反應溫度和時間，一般為37℃，4～5h。
本發明提供了一個操作簡單、成本低廉、機械強度好、酶活回收率高的固定化體系，尤其應用於L-蘋果酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸製備及烯丙醇酮等手性物質的拆分。
有益效果1、本發明採用單一或混合凝膠(卡拉膠、海藻酸鈣等)包埋的游離酶或微生物細胞，或者採用絮凝劑絮凝菌體或者酶形成絮凝團與改性動物腸衣形成組合固定化體系，運用於生物催化轉化過程中。若將動物腸衣與游離菌體直接包埋，勢必會使菌體局限在一個非常狹小的空間裡，不利於反應的進行，如果將菌體首先進行凝膠包埋，再將凝膠包埋得到的固定化顆粒包埋於動物腸衣中，包埋後固體顆粒的體積增加了，不僅可以增加菌體與底物溶液的接觸機會，還可以增加動物腸衣的通透性。
2、在凝膠中添加鎂離子和海藻糖等輔助因子，顯著保護酶的催化活性，提高酶活回收率和生物轉化體系的可反應性，能形成良好的組合固定化體系。
3、作為一種普適性的固定化方法，該方法成本低，製備工藝簡單，具備普適性，可用於多個生化產品的酶催化轉化中，具有很好的實際應用價值。
具體實施例方式實例1清水洗去動物腸衣表面雜質，將動物腸衣浸於50mL 2g/L的Fe2(SO4)3改性劑中浸漬5h，清水洗滌至洗液呈中性待用。取10g卡拉膠，溶解於250mL水中，配製成4％的卡拉膠溶液；先將0.03mol海藻糖晶體加入100mL水配製成海藻糖溶液，取50mL海藻糖溶液加入到50g天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10溼細胞，製成菌懸液，45℃下與卡拉膠溶液混合，倒入培養皿中冷卻，在0.3M的KCl溶液中固化3～4h，再於冰箱中靜置，切成3×3×3mm的顆粒，即得固定化顆粒。再與鐵離子改性動物腸衣組合固定化應用於固定化天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coliEP8-10製備L-苯丙氨酸的反應體系中。
將採用10g溼細胞製得的裝有凝膠顆粒的改性動物腸衣浸沒於200mL以L-天冬氨酸為氨基供體，苯丙酮酸溶液濃度為0.1～0.12mol/L，L-天冬氨酸與苯丙酮酸摩爾比約為1.1∶1，pH值為8.5的底物溶液中37℃下反應5h。此時天冬氨酸轉氨酶的酶活回收率高達95.6％。
實例2清水洗去動物腸衣表面雜質，將動物腸衣於50mLCr2O35g/L，NaCl 10g/L，Na2SO4·10H2O 20g/L的改性劑中42℃下浸漬5h，維持pH3.4，最後清水洗滌至洗液呈中性待用。取10g卡拉膠，溶解於250mL水中，配製成4％的卡拉膠溶液；同時，取1.2mmol Mg2+加入100mL水配製成Mg2+溶液，取50mL Mg2+溶液加入到50g天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10溼細胞，製成菌懸液，在37℃下與卡拉膠溶液混合，倒入培養皿中冷卻，在0.3M的KCl溶液中固化3～4h，再於冰箱中靜置，切成3×3×3mm的顆粒，即得固定化顆粒。再與鉻絡合物改性動物腸衣組合固定化應用於固定化天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10製備L-苯丙氨酸的反應體系中。
將採用10g溼細胞製得的裝有凝膠顆粒的改性動物腸衣浸沒於200mL以L-天冬氨酸為氨基供體，苯丙酮酸溶液濃度為0.1～0.12mol/L，L-天冬氨酸與苯丙酮酸摩爾比約為1.1∶1，pH值為8.5的底物溶液中37℃下反應5h。此時天冬氨酸轉氨酶的酶活回收率為88.9％。
實例3清水洗去動物腸衣表面雜質，將動物腸衣於50mLNaCl 15g/L，Na2CO34-5g/L，Na2SO4·10H2O 20g/L，HCHO(40％)8g/L的改性劑中，清水洗滌至洗液呈中性待用。將卡拉膠與明膠以3.5∶0.5的質量比混合，溶解於250mL水中，配製成4％的卡拉膠與明膠混合凝膠溶液；同時，取0.15mol海藻糖晶體及3mmolMg2+加入100mL水配製成海藻糖與Mg2+混合溶液，取50mL混合溶液加入到50g天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10溼細胞，製成菌懸液；在37℃下與卡拉膠溶液混合，倒入培養皿中冷卻，在0.3M的KCl溶液中固化3～4h，再於冰箱中靜置，切成3×3×3mm的顆粒，即得固定化顆粒。再與甲醛改性動物腸衣組合固定化應用於固定化天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10製備L-苯丙氨酸的反應體系中。
將採用10g溼細胞製得的裝有凝膠顆粒的改性動物腸衣浸沒於200mL以L-天冬氨酸為氨基供體，苯丙酮酸溶液濃度為0.1～0.12mol/L，L-天冬氨酸與苯丙酮酸摩爾比約為1.1∶1，pH值為8.5的底物溶液中，37℃下反應5h。此時天冬氨酸轉氨酶的酶活回收率為91.3％。上述組合固定化體系連續反應操作兩個月，天冬氨酸轉氨酶活力仍然保持在88％以上，反覆利用率高。
實例4取10g海藻酸鈉，不斷攪拌加入到250mL水中，完全溶解後靜置30min；同時，取0.09mol海藻糖晶體加入100mL水配製成海藻糖溶液，取50mL海藻糖溶液加入到50g豬胰脂肪酶(L3126-500G，SIGMA公司)中製成懸浮液，與海藻酸鈉溶液均勻混合，用10mL移液管擠混合物於0.2M CaCl2溶液中，將海藻酸鈣凝膠球在CaCl2溶液中固化20min，即得固定化顆粒，凍幹除水。將凝膠顆粒和鉻絡合物改性動物腸衣的組合固定化應用於固定化豬胰脂肪酶拆分烯丙醇酮的反應體系中。
將裝有凝膠顆粒的改性動物腸衣浸沒於以1∶1.2摩爾比的烯丙醇酮與醋酸乙烯酯底物溶液中、置於錐形瓶中，於40℃，800r/min下反應48h。此時採用鉻絡合物改性動物腸衣固定化所得到的拆分轉化率達到了75.3％，已接近工業化指標。
實例5量取250mL天冬氨酸酶產生菌E.coli ATCC 11303發酵液(相當於10g溼細胞)，移置三角瓶中，在電磁攪拌器攪拌下緩慢加入15mg的殼聚糖，使發酵液中殼聚糖的濃度達到60mg/L，加入完畢後，繼續攪拌10～15min，靜置分層，抽濾得到絮凝團；將絮凝團載入改性動物腸衣中進行組合固定化。將該組合固定化體系應用於固定化天冬氨酸酶產生菌E.coli ATCC 11303製備L-天門冬氨酸的反應體系中。
1.8mol/L的富馬酸銨溶液250mL，與載有天冬氨酸酶產生菌E.coli ATCC11303絮凝團的改性動物腸衣組合固定化體系混合，37℃下反應4h，此時，固定化大腸桿菌顆粒中天門冬氨酸酶的相對活力最高，富馬酸銨的轉化率達99.9％以上。將上述組合固定化體系連續反應操作三個月，天門冬氨酸酶活力仍然保持在96％以上，具有良好的操作穩定性。
實例6量取250mL產氨短桿菌MA-2、黃色短桿菌MA-3發酵液(相當於10g溼細胞)，移置三角瓶中，在電磁攪拌器攪拌下緩慢加入17.5mg的聚丙烯醯胺，使發酵液中聚丙烯醯胺的濃度達到70mg/L，加入完畢後，繼續攪拌15～20min，靜置分層，抽濾抽濾得到絮凝團，並將絮凝團載入改性動物腸衣中進行組合固定化。將該組合固定化體系應用於固定化產氨短桿菌MA-2，黃色短桿菌MA-3製備L-蘋果酸的反應體系中。
將1.8mol/L富馬酸銨溶液250mL，與載有產氨短桿菌MA-2，黃色短桿菌MA-3絮凝團的改性動物腸衣組合固定化體系混合，37℃下反應4h，此時，兩菌的延胡索酸酶活回收率達96％以上。將上述組合固定化體系連續反應操作三個月，延胡索酸酶活力仍然保持在92％以上，具有良好的操作穩定性。
注本發明所提到的天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coli EP8-10、天冬氨酸酶產生菌E.coli ATCC 11303或產氨短桿菌MA-2，黃色短桿菌MA-3在下列文章中公開過徐虹等《微生物學報》發表《大腸桿菌EP8-10轉化苯丙酮酸生產L-苯丙氨酸的研究》1999年6月39卷3期；胡永紅等《生物工程學報》發表《固定化產氨短桿菌MA-2，黃色短桿菌MA-3反應動力學的研究》2002年3月18卷2期；胡永紅等《工業微生物》發表《絮凝方法收集產氨短桿菌MA-2，黃色短桿菌MA-3條件的優化》2003年12月33卷4期；徐虹等《南京化工大學學報》發表《游離酶法生產L-天冬氨酸的工藝研究》1996年1月18卷1期。
權利要求
1.一種應用於生物催化轉化的組合固定化方法，其具體步驟如下A)固定化顆粒的製備將凝膠加入水加熱溶解後，冷卻37～45℃，以溼細胞或者酶為生物催化劑，與酶保護劑製成菌懸液或者酶懸浮液，與凝膠混勻，倒入培養皿中，冷卻、硬化及活化處理，再於冰箱中靜置，切成顆粒，即得凝膠顆粒；或者量取一定量的以溼細胞或者酶為生物催化劑的發酵液，移入容器中，在電磁攪拌器攪拌下緩慢加入絮凝劑，加入完畢後，繼續攪拌10～15min，靜置分層，抽濾得到絮凝團；B)將上述所得的凝膠顆粒或絮凝團包埋於改性的動物腸衣中；C)將步驟B)中所製得的裝有凝膠顆粒或絮凝團的改性動物腸衣浸沒於生物反應的底物溶液中反應。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟A)中的凝膠為卡拉膠、明膠、瓊脂、海藻酸鈣、聚乙烯醇或丙烯醯胺的一種或兩種的混合；生物催化劑為天冬氨酸轉氨酶產生菌E.coliEP8-10、天冬氨酸酶產生菌E.coliATCC 11303、產氨短桿菌MA-2、黃色短桿菌MA-3或豬胰脂肪酶；絮凝劑為殼聚糖、CaCl2或聚丙烯醯胺。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於酶保護劑為海藻糖溶液和/或Mg2+溶液。
4.根據權利要求1或3所述的方法，其特徵在於酶保護劑的加入量以整體固化溶液為基準，海藻糖溶液為50mmol/L～250mmol/L，Mg2+溶液為2mmol/L～5mmol/L。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於絮凝劑的加入量以整體固化溶液為基準為50～80mg/L。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟A中生物催化劑的加入量同凝膠的質量比為3～5∶1。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於生物反應的底物溶液分別為苯丙酮酸與天冬氨酸溶液、烯丙醇酮與醋酸乙烯酯溶液、富馬酸銨或富馬酸鈉溶液。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於其中步驟B)中改性的膠動物腸衣是在動物腸衣的基礎上，通過鐵離子改性法、絡合物改性法或甲醛改性法得到的。
全文摘要
本發明涉及一種應用於生物催化轉化的組合固定化方法，採用單一或混合凝膠(卡拉膠、海藻酸鈣等)包埋的游離酶或微生物細胞，或者採用絮凝劑絮凝菌體或者酶形成絮凝團與改性動物腸衣形成組合固定化體系，運用於生物催化轉化過程中。該方法操作簡單、成本低廉、機械強度好、酶活回收率高。
文檔編號C12N1/20GK1962861SQ20061009746
公開日2007年5月16日 申請日期2006年11月10日 優先權日2006年11月10日
發明者胡永紅, 湯天羽, 楊文革, 周華, 沈樹寶, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學