活性重組d－乙內醯脲酶的製作方法

2023-07-24 22:11:56

專利名稱：活性重組d－乙內醯脲酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組(rec-)乙內醯脲酶(hydantoinase)，其可以通過特異方法以更活性的方式獲得。本發明還涉及來自生物體成晶節桿菌(Arthrobacter crystallopoietes)DSM20117的重組乙內醯脲酶，編碼這種蛋白質的核酸，和含有所述核酸的載體。
乙內醯脲酶是能任選地立體選擇性地將5』取代的乙內醯脲轉變為L-或D-N-氨甲醯胺基酸(方案1，圖6)。
外消旋的5』取代的乙內醯脲可以通過化學合成優選地非常直接地獲得(Kleinpeter，結構化學1997，8，161-173；Ogawa等，Tibtech1999，17，1039-43；Beller等，Angew.Chem.1999，111，1562-65)。因此，生產對映異構體富集的胺基酸的定向方法優選是以工業規模進行的(Drauz K，Kottenhahn M，Makryaleas K，Klenk H，Bemd M，Angew Chem，(1991)，D-ω-脲基胺基酸的化學酶促合成，103，704-706；方案2，圖7)。
篩選利用乙內醯脲的微生物已經導致從5種不同系統發育組群中分離了革蘭氏陽性和革蘭氏陰性原核生物產鹼菌(Alcaligenes)，節桿菌(Arthrobacter)，芽孢桿菌(Bacillus)，芽生桿菌(Blastobacter)，黃桿菌(Flavobacterium)，諾卡氏菌(Nocardia)，假單胞菌(Pseudomonas)，叢毛單胞菌(Comamonas)，棲熱菌(Thermus)和土壤桿菌(Agrobacterium)。到目前為止，只對3種生物體闡述了編碼參與降解的酶的基因的完整排列。這種酶的編碼結構基因在基因組DNA上(節桿菌和土壤桿菌)或在質粒上(假單胞菌)，以「hyu基因簇」的形式彼此相鄰排列(hyu是指「利用乙內醯脲」，Watabe等，細菌學雜誌，1992，174，3461-66；同上，962-969)。在三個hyu基因簇中，土壤桿菌和假單胞菌含有用於D-選擇性裂解的基因，節桿菌含有用於L-選擇性裂解的基因(Hils，Stuttgart大學博士論文，1998；Watabe等，如前所述；Wiese，Stuttgart大學博士論文，2000，Verlag Ulrich Grauer)。
還已知生物體成晶節桿菌DSM20117具有D-乙內醯脲酶(Syldatk等，Jahrbuch生物技術學，第二卷，1988/1989，P.Prave編輯)。已經可以闡述這種酶N末端序列(A.Marin，Stuttgart大學博士論文，1997)。
然而，到目前為止還不能以重組和活性形式產生所述的乙內醯脲酶(M.Werner，Stuttgart大學博士論文，2001)。
本發明的目的以如下所述方式達到。本發明涉及一種通過發酵微生物生產活性重組乙內醯脲酶的方法，其在存在二價金屬離子的情況下形成重組乙內醯脲酶，這種方法特徵在於發酵肉湯包含引起活化的濃度的這些金屬離子。本發明方法的優選實施方案中，所述金屬離子特別是新離子的濃度為≥30μmol/l。在本發明方法的另一優選實施方案中，所述重組乙內醯脲酶為來自成晶節桿菌DSM20117的重組乙內醯脲酶。本發明還涉及以這種方式獲得的重組乙內醯脲酶，編碼這種酶的核酸，包含本發明核酸的載體，與本發明核酸雜交的核酸，以及經PCR方法生產本發明核酸的優選的引物。本發明還涉及一種起自本發明核酸的改良的乙內醯脲酶的生產方法，其特徵在於將核酸進行誘變；將所得的核酸克隆入適當的載體中，並將載體移至適當的表達系統中，檢測並分離所形成的具有改良活性和/或選擇性的蛋白質。本發明還涉及具體的改良重組乙內醯脲酶，以及本發明的重組乙內醯脲酶和核酸的具體應用。
圖2為載體pJOE4036的示意圖。
圖3為載體pJOE的示意圖。
圖4為載體pMWl0的示意圖。
圖5為方案1，其示出乙內醯脲酶能任選地立體選擇性地將5』取代的乙內醯脲轉變為L-或D-N-氨甲醯胺基酸。
圖6為方案2，其示出生產對映異構體富集的胺基酸的定向方法。
因此發酵肉湯優選包含使活性提高的Zn2+濃度。加入到發酵肉湯中的金屬離子尤其是Zn2+的最佳濃度，可以由本領域技術人員通過常規實驗確定。一方面，選擇的濃度應足夠高以根據本發明達到活化/提高活性，但另一方面，所述濃度不應高到使微生物的生長被過度抑制而不能產生活性的進一步提高。在發酵期間金屬離子如Zn2+的濃度，優選提高至≥30μmol/l，尤其優選≥50μmol/l，特別優選≥80μmol/l。重組乙內醯脲酶特別優選包括來自成晶節桿菌DSM20117的乙內醯脲酶。
進一步地，本發明涉及通過本發明方法獲得的重組乙內醯脲酶。據信，儘管活化的和非活化的酶在其一級結構上是匹配的，但是發酵過程中鋅離子濃度的增加可能對酶的二級結構甚至三級結構有影響，由此實現該蛋白質的比活性的改善。
本發明涉及編碼來自成晶節桿菌DSM20117的D-乙內醯脲酶的核酸。
通過提供編碼來自成晶節桿菌DSM20117的D-乙內醯脲酶的核酸，可以方便地獲得可以提供足夠量的工業酶促生產D-胺基酸所需的酶的物質。通過使用重組方法，可以用核酸從快速生長的宿主生物體中獲得高產量的酶。
另外，本發明的基因序列用於生產改良的乙內醯脲酶變異體。
在第一個實施方案中，本發明涉及包含一或多種本發明核酸的質粒或載體。
值得考慮的質粒或載體原則上可以是本領域技術人員為此目的可獲得的任何類型。這種質粒可見於Studier等，酶學方法1990，185，61-69所述，或見於Novagen，Promega，新英格蘭生物實驗室，Clontech或Gibco BRL公司的使用手冊所述。優選的質粒和載體可以見於DNA克隆實用方法，第I-III卷，D.M.Glover編輯，IRL出版公司，牛津，華盛頓DC，1985，1987；Denhardt，D.T.和Colasanti，J.在大腸桿菌中調節克隆的DNA表達的載體的概況，Rodriguez，R.L.和Denhardt，D.T.(編輯)，載體，Butterworth，Stoneham，MA，1987，pp179-204；基因表達技術，Goeddel，D.V.(編輯)，酶學方法，第185卷，科學出版社，San Diego，1990；Sambrook，J.，Fhtsch，E.F.和Maniatis，T.1989；分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY。
使用其可以非常優選地將包含本發明核酸的基因構建體克隆入宿主生物體中的質粒是pKK-177-3H(Roche生物化學公司)，pBTac(Roche生物化學公司)，pKK-233(Stratagene公司)或pET(Novagen)。除了具有完整卡那黴素抗性的TOPO系列之外，所有其它質粒應含有氨苄青黴素抗性的β-內醯胺酶。以下是特別優選的質粒

本發明還涉及包含本發明核酸的微生物。
將核酸克隆入微生物的目的是增加及獲得足量的重組酶。用於此目的的方法是本領域技術人員所熟知的(Sambrook等，1989，分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，Balbas PBolivarF.1990，在大腸桿菌中設計和構建表達質粒載體，酶學方法185，14-37)。可以使用的微生物原則上可以是本領域技術人員所公認的任何生物體。為此目的應優選大腸桿菌菌株。以下是特別優選的菌株大腸桿菌NM522，JM109，JM105，RR1，DH5α，TOP 10或HB101。將包含本發明核酸的基因構建體優選克隆入宿主生物體中的質粒如上述。
本發明還涉及在嚴格條件下，與本發明單鏈核酸或其互補單鏈核酸雜交的核酸。術語「在嚴格雜交條件下」見於Sambrook等所述(分子克隆實驗手冊，冷泉港實驗室出版社(1989)，1.101-1.104)。當陽性的雜交信號在用1×SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)在50℃，優選在55℃，更優選在62℃，最優選在68℃洗1小時後仍然能觀測到，及更優選地用0.2×SSC和0.1％SDS在50℃，優選在55℃，更優選在62℃，最優選在68℃洗1小時後仍然能觀測到時，優選地獲得本發明的嚴格雜交條件。
本發明以下的另一方面涉及通過所有類型PCR產生本發明基因序列的引物。這些引物包括編碼相應胺基酸序列的有義和反義引物。
適當的引物原則上可以是用本領域技術人員已知的方法獲得的。本發明的引物通過與已知DNA序列相對比，或通過將所述胺基酸序列翻譯成所述生物體的密碼子而加以鑑別(例如對於鏈黴菌屬見Wright等，基因1992，113,55-65)。來自「超家族」的蛋白質的胺基酸序列的共同特徵也可以用於此目的(Firestine等，化學與生物1996，3，779-783)。相關的進一步信息可見於寡核苷酸合成實用方法，M.J.Gait編輯，IRL出版公司，牛津，華盛頓DC，1984；PCR方法和應用指導，M.A.Innis編輯，D.H.Gelfound，J.J.Sninsky和T.J.White，科學出版社，San Diego，1990。以下引物是特別優選的IPCR的引物

克隆結構基因的引物

在鼠李糖表達載體中測序DNA的引物

在進一步的方案中，本發明涉及一種生產改良的重組乙內醯脲酶的方法，及以此方式獲得的重組乙內醯脲酶或編碼重組乙內醯脲酶的核酸，其中從編碼重組乙內醯脲酶的本發明的核酸開始，(a)將核酸進行誘變，(b)將得自(a)的核酸克隆入適當的載體中，並將後者移至適當的表達系統中，及(c)檢測並分離所形成的具有改良的活性和/或選擇性的蛋白質。
根據本發明通過誘變方法改良酶的步驟，本領域技術人員已經熟知。值得考慮的誘變方法是本領域技術人員為此目的所能利用的任何方法。這些方法尤其是飽和誘變，隨機誘變，改組方法和定點誘變(見下述文獻)。將所得新的核酸序列使用上述方法克隆入宿主生物體中(見上述文獻)，並用適當的篩選方法檢測表達的酶(RobertsJ.，Stella V.J.和Decedue C.J.(1985)胰脂肪酶的一種比色分析通過凝膠過濾快速檢測脂肪酶和輔脂肪酶，脂質20(1)42-45；PrattR.F.，Faraci W.S.和Govardhan C.P.(1985)，直接分光光度分析D-丙氨酸羧肽酶和β-內醯胺酶的酯酶活性，分析生物化學144(1)204-206；Bruckner，H.，R.Wittner，和H.Godel(1991)，全自動高效液相層析分離用o-鄰苯二醛與N-異丙基半胱氨酸一起產生的DL-胺基酸，食物樣品應用)。
本發明還涉及本發明的任選經過突變改良的重組乙內醯脲酶生產N-氨甲醯胺基酸或胺基酸的用途。
本發明的編碼重組乙內醯脲酶的核酸及另外進一步改良的核酸，還優選適於生產全細胞催化劑(DE10037115.9和在此所引用的文獻)。
本發明的核酸因此優選用於生產重組乙內醯脲酶。通過本領域技術人員熟知的重組方法，可獲得能提供足量的進行工業生產的所述酶的生物體。本發明的重組酶是用本領域技術人員已知的基因工程方法生產的(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)，分子克隆，冷泉港實驗室出版社；載體分子克隆載體及其使用概觀，R.L.Rodriguez D.T.Denhardt編輯，205-225)。對於通用方法(PCR和融合PCR，反向PCR，克隆，表達等)，參見下述文獻及其引用的參考文獻Riley J，Butler R，Finniear R，Jenner D，Powell S，AnandR，Smith JC，Markham AF(1990)。一種從酵母人工染色體(YAC)克隆中快速分離末端序列的新方法，核酸研究18，8186；Triglia T，Peterson MG，Kemp DJ(1988)。一種在體外擴增位於已知序列邊界之外的DNA節段的方法，核酸研究16，8186；Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(1989)，分子克隆冷泉港實驗室出版社；載體分子克隆載體及其使用概觀，R.L.RodriguezD.T.Denhardt，II。
如上所述，本發明的核酸也可用於生產本發明乙內醯脲酶的新突變體。這種突變體可以通過已知的各種類型誘變而得自本發明的DNA。使用的誘變類型優選是以下參考文獻中所提及的(Eigen M.和Gardinger W.(1984)，基於RNA複製的進化的分子工程，純化及應用化學56(8)，967-978；ChenArnold(1991)非水溶劑的酶學工程隨機誘變以增強極性有機培養基中枯草蛋白酶E的活性，生物/技術9，1073-1077；Horwitz，M.和L.Loeb(1986)，「選自隨機DNA序列的啟動子」，美國科學院院報83(19)7405-7409；Dube，D.和L.Loeb(1989)，「通過將隨機寡核苷酸插入β-內醯胺酶基因的活性位點中而產生的突變體」，生物化學28(14)5703-5707；Stemmer PC(1994)。通過DNA穿梭蛋白質在體外的快速進化，自然370，389-391；和Stemmer PC(1994)通過隨機片段化和重裝配的DNA穿梭體外重組以使分子進化，美國科學院院報91，10747-10751)。
本發明乙內醯脲酶的基因與來自Streptomyces coelicolor(T28685)的一假設蛋白呈現最高同源性，為43％胺基酸相同性，然而該蛋白目前還未知其功能。與來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(JC2310Mukohara等，1994)，放射形土壤桿菌NRRLB11291(Q44184Grifantini等，1996)和假單胞菌(Stover等，2000，La Pointe等，1998)的二氫嘧啶酶的相同性分別為40％，42％和39％。
除了與真核二氫嘧啶酶(來自Mus musculus，Homo sapiens和Rattus norvegicus)和腦衰蛋白應答介質蛋白3(CRMP-3)同源之外，與各種尿囊素酶和二氫乳清酸酶也具有同源性。
與來自金黃節桿菌DSM3745(May等，生物化學1998，379，743-747)和DSM3747(Wiese，Stuttgart大學博士論文，2000)的L-乙內醯脲酶的相同性為29％。
根據本發明，光學富集的(對映異構體富集的，enantiomer-enriched)化合物，意味著混合物中存在一個光學對映體的數量＞50mol％。
乙內醯脲也指產生自2，4-二氧咪唑烷(dioxoimidazolidines)的化合物，這種化合物5』位置由產生自胺基酸的α殘基的殘基取代。
胺基酸的α殘基是指位於α-胺基酸的α-C原子上的殘基。所述殘基可以衍生自天然胺基酸，如Beyer-Walter，Lehrbuch derorganischen Chemie，S.Hirzel Verlag Stuttgart，第22版，1991，pp822所述。然而，也包括非天然α-胺基酸的相應α-殘基，如DE19903268所示。
生物體成晶節桿菌DSM20117已經以所述的保藏號保藏在德意志微生物保藏中心，並是公眾可以獲得的。
本文中，術語「活化的」或「活化」是指本發明的重組酶與相同的OD600下的非活性重組酶相比，在細胞提取物中(15000psi，60秒，4℃、10000rpm離心10分鐘後的上清)，活性提高至少1.5倍，優選2倍，更優選5倍(測定條件如實施例VI)。
術語核酸是指所有單鏈或雙鏈DNA和RNA或其混合物的總稱。
本文中，改良的重組乙內醯脲酶尤其是指在所用反應條件下，呈現改變的底物範圍、更具活性和/或選擇性或更穩定的酶。
根據本發明，所述的蛋白質序列和核酸序列還包括這樣的序列，其與這些序列之一具有高於80％，優選高於90％，91％，92％，93％或94％，更優選具有高於95％或96％，尤其優選高於97％，98％或99％的同源性(排除天然簡併)，條件是這種序列的作用模式或用途仍保留。文中術語「同源性」(或相同性)可以通過等式H(％)＝〔1-V/X〕×100加以闡述，其中H表示同源性，X是對比序列的核苷酸鹼基/胺基酸總數，V是相對於對比序列，參比序列中不同的核苷酸鹼基/胺基酸數目。
表11L營養溶液的相關數值

將第一個預培養物(V＝20ml)在30℃和110rpm溫育過夜。然後將全部預培養物用於接種第二個預培養物(V＝2L)。在溫育2天後，將1.5L第二個預培養物用作發酵接種物(V＝20L)。由於誘導劑乙內醯脲在生長期間被消耗，用計量泵持續供應，以使培養基內乙內醯脲的濃度保持在0.2g/l的恆定水平。一旦收穫細胞，將205g溼生物量(WB)等分並貯存於-20℃。實施例II.從成晶節桿菌中獲得D-乙內醯脲酶從成晶節桿菌中獲得D-乙內醯脲酶的方法，是基於Marin所述的獲得D-乙內醯脲酶的蛋白質的方法加以修改而進行的(博士論文，Stuttgart大學，1997)。如果可能，純化階段在4℃進行，各級分中乙內醯脲酶的活性通過Ehrlich光量檢測法迅速初步確定。然後將陽性樣品的等分用標準底物D，L-苄基乙內醯脲溫育，並通過HPLC確定提取物活性。
將得自培養(見實施例I所述)的成晶節桿菌DSM 20117的生物量形成30％細胞懸浮液，用玻珠在攪拌球磨中破碎。在記錄破碎動力學後，在破碎20分鐘後蛋白質濃度可以達到接近16.5g/l。將細胞碎片和不溶的成分通過離心除去，並將澄清的上清用於隨後的硫酸魚精蛋白沉澱。通過這種方法，在進行層流DEAE柱層析之前，可降低溶液的粘度。
層析柱中結合的蛋白質通過通用鹽梯度洗脫。將活性的集合的層流級分與相同體積的2M(NH4)2SO4溶液組合，以進行隨後的疏水作用層析(HIC)進一步分離。然後組合具有最高乙內醯脲活性的級分，並在MonoQ層析柱上通過離子交換層析從其它的蛋白質中分離。
乙內醯脲酶純化數據概括於表2所示；純化的D-乙內醯脲酶的SDS-PAGE表明這種酶的分子量為50+/-5kDa〔在濃縮MonoQ級分後純化的D-乙內醯脲酶進行10％SDS-PAGE，ProSieve分子量標記和來自A.aurescens DSM 3745的L-乙內醯脲酶作為49.7kDa內部標準(May，論文，Stuttgart大學，1998)〕。
表2D-乙內醯脲酶的純化數據

實施例III.胰酶消化D-乙內醯脲酶N末端測序提供的可靠測序結果只是針對前30個胺基酸。然而，Marin的研究中闡述的序列不能衍生引物。結果，必須將蛋白質經蛋白酶消化為肽，以獲得進一步的序列信息。酶促片段化是用胰蛋白酶進行的，這是一種特異性針對賴氨酸和精氨酸的內肽酶。然而，必須預料到在存在酸性胺基酸的情況下，其活性降低，甚至在存在脯氨酸殘基的情況下不發生水解。在賴氨酸和精氨酸在蛋白質中平均發生率分別為5.7％和5.4％的情況下，預期完全消化產生的肽的長度平均為大約9個胺基酸。然後將肽混合物通過定量HPLC分離。
為用胰蛋白酶消化來自成晶節桿菌DSM20117的乙內醯脲酶，如上所述從MonoQ級分中獲得乙內醯脲酶，然後用Amicon濾膜濃縮(截斷值30kDa)，並通過SDS-PAGE分離。為確定蛋白質確實是D-乙內醯脲酶，將一部分凝膠通過Western印跡移至膜上，切割，並確定N末端的前8個胺基酸。除了第2位之外，確定的所有胺基酸與Marin確定的N末端匹配(論文，Stuttgart大學，1997)，這樣可假定在這種情況中分離的蛋白質與已經由Marin闡述並定性的酶是相同的。
因此，將乙內醯脲酶條帶直接從分離的MonoQ級分的聚丙烯醯胺凝膠中切下，並在原位根據生產者的指導進行胰蛋白酶消化(Sigma，Steinheim)。將肽從凝膠中用乙腈提取，並通過製備HPLC彼此分離。將級分在SpeedVac儀器中乾燥，然後通過Edman降解進行N末端測序。
總之，除了N末端之外，明確證實可以對9個肽精確測序。這種肽級分之一包含環醯胺酶共有的GXXDXHXH基序，其參與結合活性中心中的Zn原子(Abendroth等，Acta Cryst.2000，D56，1166-1169)。在不是以賴氨酸(K)或精氨酸(R)結尾的那些肽序列中，因為技術問題或樣品的數量和質量不充分，測序結果不準確。實施例IV.克隆hyu基因簇1.從成晶節桿菌DSM20117中分離染色體DNA將通過在乳酸培養基中培養成晶節桿菌DSM20117獲得的溼生物量(見實施例I所述)，也用於分離染色體DNA。在細胞裂解並通過氯化銫密度梯度離心純化後可以分離高純度的基因組DNA。通過記錄吸收光譜而核實質量，以便能排除酚汙染。經分光光度法確定的DNA濃度為60μg DNA/ml。2.用簡併引物進行PCR通過對得白胰酶消化的肽進行測序(見實施例III所述)，證實除了D-乙內醯脲酶的N末端序列，還可以獲得進一步序列信息。將這種肽與已知的Agrobacterium sp.IP I-671的蛋白質序列使用ClustalX軟體進行對比(Thompson等，1997，ClustalX Windows界面通過質量分析工具幫助的多重序列對比的靈活策略，核酸研究24，4876-4882)。
為從已知的肽序列中產生簡併引物，應從兩種肽中選擇在其胺基酸組成中具有低度簡併性的序列部分。為此選擇肽61.61和73.31。引物61.61a偶聯於DNA的正鏈，引物73.31b偶聯於負鏈。
表3構建簡併引物

為進一步降低引物61.61a的簡併度，基於CUTG資料庫考慮來自Arthrobacter sp.的密碼子的分布頻率(Nakamura等，核酸研究1999，27，292)。結果，在構建引物時可以忽略此寡核苷酸的第3位中的三聯鹼基「GTA」，因為此密碼子在纈氨酸中出現的概率較低，為10.4％。
為估計PCR擴增子的長度，將兩個引物與來自Agrobacterium sp.IP I-671的D-乙內醯脲酶進行序列對比。根據序列對比，兩個寡核苷酸之間的缺口為69個胺基酸，這樣使用簡併引物61.61a和73.31b的PCR，應產生長度大約為207bp的PCR產物。
根據標準批次的溫度分布圖，在42℃的退火溫度進行PCR，並優化Mg含量為2mM濃度。然後將PCR產物在3％瓊脂糖凝膠中分離，並用Imagemaster顯影分析軟體確定條帶的大小(來自Novex的分子量標記D-15)。將經計算為218bp大小的條帶從凝膠中洗脫，並連接於pCRTOPOBluntII載體(

圖1)中。所得質粒稱為pJW1。對該載體接著進行的測序表明與已知的二氫嘧啶酶同源，這樣第一個DNA部分已經克隆入D-乙內醯脲酶的結構基因中。3.通過反向PCR測序hyu基因簇使用反向PCR(IPCR)以獲得兩側的DNA區域的進一步的序列信息。
使用限制酶BamHI，EcoRI，SacI，PstI，BglII，HindIII，SalI，MunI和MluI，消化來自成晶節桿菌DSM 20117的基因組DNA。將消化產物用1％瓊脂糖凝膠分離，並通過Southern印跡固定於尼龍膜上。
適當的探針是通過用32P-α-ATP進行切口平移(RocheDiagnostics的切口平移試劑盒)產生放射性標記的MunI線性化的質粒pJW1而產生的，並與印跡一起使用進行雜交(分子量標記MWMVII)。
基於得自Southern印跡的雜交信號的大小，將基因組PstI消化產物(大約2000bp)在以下的IPCR中用作模板。為此，將消化產物在瓊脂糖凝膠上分離，從凝膠中洗脫1500-2800bp範圍(分子量標記MWM VII)，然後再連接並用MunI線性化。引物IPCR1+(Seq.3)和IPCR-(Seq.4)可以得自乙內醯脲酶基因的已知序列，以進行IPCR。60℃的退火溫度得自寡核苷酸的熔解溫度。
可以產生一個單一條帶作為擴增子，將其隨後洗脫並克隆入TOPO系統中(圖1)。所得質粒稱為pJW2。基於對pJW2測序而重建的hyu基因簇含有D-乙內醯脲酶hyuH的開放讀框，和D-氨甲醯酶hyuCD的部分開放讀框。實施例V.表達D-乙內醯脲酶將D-乙內醯脲酶結構基因克隆入鼠李糖表達載體pJOE4036(圖2)的質粒衍生物中。將兩種氨甲醯酶用來自成晶節桿菌基因組DNA的相應引物擴增。在此，引物在N末端具有NdeI限制位點的附加序列，和/或在C末端具有BamHI限制位點的附加序列。在具有His標籤的酶的情況中，在C末端引物上省略終止密碼子。
由於乙內醯脲酶基因含有兩個內部NdeI限制位點，不可以使用針對氨甲醯酶所用的克隆入pJOE4036中的方案。改為使用一種引物，其除了N末端DNA序列之外，在5』末端編碼Shine-Dalgarno序列和一個BamHI限制位點。C末端引物包含一個HindIII限制位點，其具有終止密碼子或具有Strep標籤序列。然後將以此方式從基因組DNA中擴增的DNA克隆入pJOE3078中。所得構建物稱為pMW10(圖4)。
將一種含有質粒pMW10(圖4)的大腸桿菌如下在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中培養——將10ml LB培養基中的一個單菌落移至100ml搖瓶中，並在37℃溫育過夜；
——將含有所述數量氨苄青黴素的100ml LB培養基，與已經溫育過夜的2ml培養物在500ml搖瓶中組合(批次1)；——將相同數量的過夜培養物，LB培養基和氨苄青黴素導入另一個搖瓶中(500ml)，並另外與1ml的100mM ZnSO4*7H2O溶液(培養物中Zn2+濃度為1mM)組合(批次2)；——將批次1在37°溫育2小時，直至OD600為大約0.4。批次2溫育3小時以達到相同OD值。
——將這兩個批次均與L-鼠李糖組合以誘導表達，直至達到0.1g/L濃度。然後將這兩個批次在30℃進一步培養6小時。
——然後將細胞在4℃以7000rpm離心10分鐘。將所得沉澱貯存於-10℃。
比活性是以通過Bradford方法測定的每mg總蛋白質的單位數表示。1單位的D-乙內醯脲酶在pH7.5和50℃，每分鐘從D-苄基乙內醯脲中催化1μmol氨甲醯胺基酸形成。圖5示出兩批的細胞提取物與不含有hyd的微生物相比的D-乙內醯脲酶的比活性結果。
可以看出在Zn2+濃度增加的情況下發酵的樣品含有的乙內醯脲酶的活性提高12倍以上。
序列表110德古薩股份公司120活性重組D-乙內醯脲酶130010141 AM14014116025170PatentIn Ver.2.121012111314212DNA213Arthrobacter crystallopoietes220221CDS222(1)..(1314)4001atg gat gcg aaa ctc ctt gtt ggc ggc act att gtt tcc tcg acc ggc 48Met Asp Ala Lys Leu Leu Val Gly Gly Thr Ile Val Ser Ser Thr Gly1 5 10 15aaa atc cga gcc gac gtg ctg att gaa aac ggc aaa gtc gcc gct gtc 96Lys Ile Arg Ala Asp Val Leu Ile Glu Asn Gly Lys Val Ala Ala Val20 25 30ggc atg ctg gac gcc gcg acg ccg gac aca gtt gag cgg gtt gac tgc 144Gly Met Leu Asp Ala Ala Thr Pro Asp Thr Val Glu Arg Val Asp Cys35 40 45gac ggc aaa tac gtc atg ccc ggc ggt atc gac gtt cac acc cac atc 192Asp Gly Lys Tyr Val Met Pro Gly Gly Ile Asp Val His Thr His Ile50 55 60gac tcc ccc ctc atg ggg acc acc acc gcc gat gat ttt gtc agc gga 240Asp Ser Pro Leu Met Gly Thr Thr Thr Ala Asp Asp Phe Val Ser Gly65 70 75 80acg att gca gcc gct acc ggc gga aca acg acc atc gtc gat ttc gga 288Thr Ile Ala Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Gly85 90 95cag cag ctc gcc ggc aag aac ctg ctg gaa tcc gca gac gcg cac cac 336Gln Gln Leu Ala Gly Lys Asn Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ala His His100 105 110aaa aag gcg cag ggg aaa tcc gtc att gat tac ggc ttc cat atg tgc 384Lys Lys Ala Gln Gly Lys Ser Val Ile Asp Tyr Gly Phe His Met Cys115 120 125gtg acg aac ctc tat gac aat ttc gat tcc cat atg gca gaa ctg aca 432Val Thr Asn Leu Tyr Asp Asn Phe Asp Ser His Met Ala Glu Leu Thr130 135 140cag gac gga atc tcc agt ttc aag gtc ttc atg gcc tac cgc gga agc 480Gln Asp Gly Ile Ser Ser Phe Lys Val Phe Met Ala Tyr Arg Gly Ser145 150 155 160ctg atg atc aac gac ggc gaa ctg ttc gac atc ctc aag gga gtc ggc 528Leu Met Ile Asn Asp Gly Glu Leu Phe Asp Ile Leu Lys Gly Val Gly165 170 175tcc agc ggt gcc aaa cta tgc gtc cac gca gag aac ggc gac gtc atc 576Ser Ser Gly Ala Lys Leu Cys Val His Ala Glu Asn Gly Asp Val Ile180 185 190gac agg atc gcc gcc gac ctc tac gcc caa gga aaa acc ggg ccc ggg 624Asp Arg Ile Ala Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Gly Lys Thr Gly Pro Gly195 200 205acc cac gag atc gca cgc ccg ccg 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1.一種通過發酵微生物生產活性重組乙內醯脲酶的方法，所述微生物在存在二價金屬離子的情況下形成重組乙內醯脲酶，這種方法特徵在於發酵肉湯包含導致活化的濃度的這些金屬離子。
2.權利要求1的方法，其特徵在於金屬離子尤其Zn2+的濃度≥30μmol/l。
3.權利要求1的方法，其特徵在於所述重組乙內醯脲酶包括來自成晶節桿菌DSM20117的重組乙內醯脲酶。
4.通過權利要求1的方法獲得的重組乙內醯脲酶。
5.編碼來自成晶節桿菌DSM20117的D-乙內醯脲酶的核酸。
6.包含權利要求5的一或多種核酸的質粒，載體和微生物。
7.在嚴格雜交條件下與權利要求5的單鏈核酸或其互補單鏈核酸雜交的核酸。
8.通過PCR產生權利要求5的核酸的引物。
9.一種從編碼權利要求4的重組乙內醯脲酶的核酸生產改良的重組乙內醯脲酶的方法，其特徵在於a)將所述核酸進行誘變，b)將得自a)的核酸克隆入適當的載體中，並將載體移至適當的表達系統中，和c)檢測並分離所形成的具有改良活性和/或選擇性的蛋白質。
10.通過權利要求9的方法獲得的重組乙內醯脲酶或編碼重組乙內醯脲酶的核酸。
11.權利要求4或10的重組乙內醯脲酶生產N-氨甲醯胺基酸的用途。
12.權利要求5或10的核酸生產全細胞催化劑的用途。
全文摘要
本發明涉及可通過特異方法以更具活性的方式獲得的重組乙內醯脲酶。本發明還涉及來自生物體成晶節桿菌DSM20117的重組乙內醯脲酶，編碼這種蛋白質的核酸，和含有所述核酸的載體。
文檔編號C12N5/10GK1393556SQ0212269
公開日2003年1月29日 申請日期2002年6月20日 優先權日2001年6月22日
發明者奧利弗·邁, 安德烈亞斯·博馬留斯, 卡爾梅因茨·德拉奧茨, 梅爾廷·西曼－赫茨貝格, 克裡斯託夫·西勒達克, 馬庫斯·維爾納, 約瑟夫·阿爾滕比希納 申請人:德古薩股份公司