毒肽產生、植物中的肽表達和富含半胱氨酸的肽的組合的製作方法

2023-07-24 21:12:11 2

毒肽產生、植物中的肽表達和富含半胱氨酸的肽的組合的製作方法
【專利摘要】新的殺蟲蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表達、生產所述肽的方法、新的處置方法、生產技術、新的肽、新的製劑和新的生物、提高來自酵母表達系統的殺蟲肽生產產量的方法。本發明還涉及並公開了選定的我們稱為富含半胱氨酸的殺蟲肽(CRIPS)的內毒素，其是來源於蘇雲金芽孢桿菌(Bt)的肽及其基因，以及內毒素與稱為抑制物胱氨酸結(ICK)基因和肽的毒肽的組合、以及內毒素與其它類型的殺蟲肽例如胰蛋白酶調節抑卵因子(TMOF)肽序列的組合，它們用於基因和肽兩者的各種製劑和組合，用於控制昆蟲。
【專利說明】毒肽產生、植物中的肽表達和富含半胱氨酸的肽的組合
[0001] 相關申請的引用 本申請是PCT申請，其要求早期在2012年3月9日提交的美國臨時申請順序號 61/608,921、2012年5月8日提交的美國臨時申請順序號61/644,212、2012年9月7日 提交的美國臨時申請順序號61/698, 261和2012年11月26日的美國臨時申請順序號 61/729, 905的權益，所述申請的完整內容通過引用結合到本文中。 發明領域
[0002] 描述並要求保護新的殺蟲蛋白、核苷酸、肽、其在植物中的表達、生產所述肽的方 法、新的處置方法、生產技術、新的肽、新的製劑和產生比用於昆蟲控制的相關肽所預期的 更高產量的新的和已知生物體的組合。
[0003] 發明背景 通過現代農業和園藝生產的食物的全球安全性受到蟲害的挑戰。農民依靠殺蟲劑來抑 制蟲害，然而由於從市場中清除危險化學物質以及對所有主要類別的化學和生物殺蟲劑有 抗性的昆蟲品系的進化，農民可獲得的對安全實用的殺蟲劑的商業選擇正在縮小。新的殺 蟲劑對農民維持作物保護是必需的。
[0004] 殺蟲肽是對其目標（通常為某種類型的昆蟲或蜘蛛類動物）有毒的肽，所述肽常 常可具有節肢動物起源，例如來源於蠍或蜘蛛。所述肽可遞送到內部，例如通過注射將毒素 直接遞送到昆蟲的腸或內部器官，或通過誘使昆蟲從其食物中食入毒素，例如昆蟲攝食轉 基因植物，和/或當通過將毒素散布在昆蟲居住的場所將毒素遞送給昆蟲，或通過噴灑或 其它方法將毒素遞送至昆蟲的環境，然後昆蟲與所述肽有某種形式的接觸時，所述肽可具 有抑制生長、損害運動或甚至殺死昆蟲的能力。
[0005] 然而，殺蟲肽進入市場時有很大的問題，迄今很少（如有的話）殺蟲肽獲準並在市 場上銷售，只有一個著名的例外，即來源於蘇雲金芽孢桿菌（你 CiBi1S 或 Bt的肽。目前在昆蟲對Bt蛋白產生抗性方面存在顧慮。
[0006] Bt蛋白，或Bt肽，是以植物結合殺蟲劑（plant incorporated protectant)和葉 面噴撒兩種形式用於作物保護的有效殺蟲劑。Bt蛋白的商業製劑廣泛用於控制幼蟲期的昆 蟲。ICK肽包括具有殺蟲活性的許多分子。所述ICK肽對天然存在的生物目標物種（通常 為某種類型的昆蟲或蜘蛛類動物）常常是有毒的。通常ICK肽可具有節肢動物起源，例如蠍 或蜘蛛的毒液。Bt是一種並且是唯一的商用殺蟲肽的來源生物。已鑑定出潛在的其它類別 和類型的肽，例如胰蛋白酶調節抑卵因子（Trypsin modulating oostatic factor, TM0F) 肽。TMOF肽以各種方式被遞送到它們的生理作用部位，並且TMOF肽被鑑定為具有極大潛力 的潛在殺幼蟲劑，參見 D. Borovsky，Journal of Experimental Biology 206,3869-3875， 但像幾乎所有的其它殺蟲肽一樣，TMOF未被商業化或未被農民廣泛使用，並且有理由如此。
[0007] 具有可再現的肽形成和摺疊，以合理和經濟的價格，在商業規模上成功生產殺蟲 肽的能力可能受到挑戰。殺蟲肽種類繁多、性能獨特且性質特殊，結合極其多種的生產技 術，可提供肽應用和生產的眾多方法，但很少（如有的話）是商業上成功的。
[0008] 為什麼已鑑定的眾多殺蟲肽中如此少量已被推向市場有幾個原因。第一，大多數 殺蟲肽足夠脆弱或毒性不足而難以商用。第二，殺蟲肽難以商業化生產且昂貴。第三，許多 殺蟲肽快速降解並且半壽期短。第四，當通過植物表達時，極少殺蟲肽正確摺疊，因此在遺 傳修飾生物體（GMO)中失去其毒性。第五，大多數已鑑定的殺蟲肽當被昆蟲採食時，在昆蟲 中的全身分布被阻斷和/或喪失其毒性性質。Bt蛋白是最後這個問題的例外，並且因為它 們擾亂昆蟲攝食，因此被廣泛使用。
[0009] 在此，我們提出對於阻礙殺蟲肽的商業化和廣泛使用的這些主要問題的幾個解決 方法。在第一部分中，我們描述了如何產生允許植物產生和表達保持對昆蟲的毒性的正確 折置的殺蟲膚的特殊表達盒和系統。
[0010] 在第二部分中，我們描述了如何對肽的組成產生相對小的改變，並如此進行以顯 著提高可通過發酵生產的速率和量。該處置方法還同時降低商業化工業肽生產的成本。該 部分教導了如何可將蛋白質"轉化"成不同的更有成本效益的肽，所述肽可以更高產量生 產，並且出人意料地仍具有與轉化前恰好一樣的毒性。在第三和最後的部分中，我們描述了 如何將不同類別的殺蟲肽組合在一起，使得它們可以協同方式一起運作以顯著改變並提高 與其各個組分相比時組分肽的毒性和活性。該部分還提供支持我們的系統、方法和肽組合 和製劑的詳細資料和數據以應付正在逼近的Bt抗性昆蟲的發生和散布的威脅。Bt抗性昆 蟲代表了下一個對全球食物供應的巨大威脅，我們教導本領域技術人員如何迎接和戰勝這 種威脅。
[0011] 發明概沭 本發明描述了如何在植物中產生毒性殺蟲肽，因此當它們通過植物表達時正確摺疊。 本發明描述了如何使用各種載體在實驗室和商業生產環境中生產高產量的肽。本發明描 述了一個類別的毒性殺蟲肽，我們稱為CRIPS，其表示富含半胱氨酸的殺蟲肽（Cysteine Rich Insecticidal Peptides,CRIPS)。本發明描述了另一個類別的毒性殺蟲肽，我們稱為 PFIPS，其表不成孔殺蟲蛋白（Pore Forming Insecticidal Proteins，PFIPS)。本發明描 述了如何可將CRIPS和PFIPS的新的協同組合製備在一起並用於各種目的，包括保護作物 免遭Bt或蘇雲金芽孢桿菌肽抗性昆蟲。我們公開了如何製備和使用CRIPS和PFIPS的組 合以非常低的劑量殺死和控制昆蟲，甚至Bt抗性昆蟲。雖然不受理論約束，但是我們對Bt 或蘇雲金芽孢桿菌肽和蛋白質的理解，可供我們教導本領域的普通技術人員建立保護植物 和控制昆蟲的新的方法、組合物、化合物（蛋白質和肽）和程序。
[0012] 我們描述並要求保護包含與富含半胱氨酸的殺蟲蛋白（CRIP)(例如抑制物半胱 氨酸結（Inhibitor Cysteine Knot, ICK)基序蛋白）有效連接的內質網信號肽（ERSP)的 蛋白質，其中所述ERSP是所述蛋白質（ERSP-ICK)的N端。一種肽，其中所述ERSP是將表 達的CRIP導向植物細胞的內質網的任何信號肽。一種肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨 酸結（ICK)蛋白。一種肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。一種肽，其中所述ERSP是來源於 植物的長度為5-50個胺基酸的肽。一種與翻譯穩定性蛋白（Translational Stabilizing Protein，STA)有效連接的肽，其中所述ERSP是所述蛋白質的N端，翻譯穩定性蛋白（STA) 可在CRIP的N端一側，所述CRIP任選為ICK基序蛋白（ERSP-STA-ICK)或非ICK基序蛋白 (ERSP-STA-非 ICK);或在 ICK 或非 ICK 基序蛋白的 C 端一側（ERSP-ICK-STA)或（ERSP-非 ICK-STA)。
[0013] 我們描述並要求保護具有添加至已知肽並與所述已知肽有效連接的N端二肽的 肽，其中所述N端二肽由二肽N端的一個非極性胺基酸和二肽C端的一個極性胺基酸組成， 其中所述肽選自CRIP (富含半胱氨酸的殺蟲肽），例如選自ICK肽或非ICK肽。一種具有 添加至已知肽並與所述已知肽有效連接的N端二肽的肽，其中N端二肽由二肽N端的一個 非極性胺基酸和二肽C端的一個極性胺基酸組成。一種肽，其中來自N端二肽的N端氨基 酸的非極性胺基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲 硫氨酸。一種肽，其中N端肽的C端胺基酸的極性胺基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天 冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、色氨酸、酪氨酸。權利要求8的肽，其中N端二肽的N端胺基酸 的非極性胺基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫 氨酸且N端肽的C端胺基酸的所述極性胺基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、谷 氨醯胺、組氨酸、色氨酸、酪氨酸。一種肽，其中所述二肽由甘氨酸-絲氨酸組成。
[0014] 我們描述了包含至少兩種類型的殺蟲蛋白或肽的組合物，其中一種類型是成孔 殺蟲蛋白（PFIP)，另一種類型是富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)。一種組合物，其中CRIP 是ICK，任選所述ICK源自於或來源於rerMia或布魯山脈漏鬥網蝴蛛（Blue Mountain funnel web spider) ^Atrax robustus^Atrax formidabilis^Atrax infensus, 包括稱為U-ACTX多肽的毒素 U-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvlb或突變體或變體。 一種組合物，其中CRIP是非ICK CRIP，任選所述非ICK CRIP源自於或來源於具有非ICK CRIPS的動物例如海葵、海膽和海蛤蝓，任選包括名為hrii/i的海葵，任選包括 名為Av2和Av3的肽，尤其類似於Av2和Av3的肽，包括序列表所列出的這類肽或突變體或 變體。
[0015] 我們描述了使用權利要求13的組合物控制Bt抗性昆蟲的方法，所述方法包括產 生至少兩種類型的肽的組合物，其中一種類型的肽是成孔殺蟲蛋白（PFIP)，另一種類型的 肽是富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白選自權利要求1和本文描述的任 何組合物和序列表提供的任何蛋白質；然後將所述組合物施用於昆蟲所在地。一種控制Bt 抗性昆蟲包括保護植物免遭Bt抗性昆蟲的方法，所述方法包括產生表達至少兩種正確折 疊的肽的組合的植物，其中一種類型的肽是成孔殺蟲蛋白（PFIP)，另一種類型的肽是富含 半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白選自本文所述任何組合物和選自序列表提 供的任何蛋白質。一種方法，其中在PFIP影響昆蟲腸內襯期間的任何時間給予CRIP。一種 方法，其中在測試昆蟲的Bt抗性後給予CRIP，且其中所述昆蟲Bt抗性測試為陽性。我們描 述了將呈固體或液體形式的本文所述任何化合物施用於昆蟲、昆蟲所在地，或作為植物結 合殺蟲劑施用。
[0016] 附圖簡沭 圖1是發明的ERSP (內質網信號肽，以對角條紋表示）與CRIP (富含半胱氨酸的殺 蟲蛋白）例如ICK (抑制物半胱氨酸結）基序（以垂直條紋表示）的N端融合物的示圖。
[0017] 圖2是發明的ERSP (對角條紋）與融合STA (翻譯穩定性蛋白，以水平條紋表 示）的CRIP基序殺蟲蛋白（垂直條紋）的N端融合物的示圖。有圖2中所示的兩種可能 的方向。
[0018] 圖3是發明的ERSP (對角條紋）與CRIP基序（垂直條紋）融合的N端融合物的 示圖，所述CRIP基序與用水平條紋表示的翻譯穩定性蛋白（STA)融合。通過稱為間插接頭 肽（LINKER)(以方格圖案表示）的間插序列將STA與CRIP基序分隔。圖3中顯示兩種可 能的方向。
[0019] 圖4是類似於圖3的示圖，具有下標字母"N"的（LINKER-CRIP)基序表明 LINKER-CRIP基序可使用一次或重複數次，優選1-10個重複序列，有可能甚至更多達15、20 或25次。
[0020] 圖5是顯示CRIP-LINKER或ICK-LINKER組還可起STA-LINKER組的作用的示圖。 換句話說，CRIP-LINKER或ICK-LINKER的組合可起STA-LINKER的作用。換句話說，可以使 用兩個ICK基序與一個LINKER，並省去翻譯穩定性蛋白或STA的需要。
[0021] 圖6是抑制物半胱氨酸結（ICK)基序蛋白中半胱氨酸共價交聯的示圖。圖中的 箭頭表示β片層；數字表示形成ICK基序的胱氨酸胺基酸，按其在一級結構中從N到C端 出現的順序編號。粗曲線表示蛋白質的一級結構；細直線表示特定半胱氨酸共價交聯產生 ICK基序。有時包含半胱氨酸2號的β片層不存在。
[0022] 圖7是ACTX的ELISA檢測水平（作為總可溶性蛋白的百分比（%TSP))的示圖，所 述ACTX作為與不同的其它結構元件的翻譯融合物自編碼ACTX的植物轉基因的表達產生。
[0023] 圖8是具有不同蓄積定位的菸草瞬時表達的GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA 檢測的％TSP圖。APO :質外體定位；CYTO :胞質定位；ER :內質網定位。
[0024] 圖9是使用編碼具有以下3種不同ERSP序列的翻譯融合物的FECT表達載體，煙 草葉瞬時表達GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA檢測的％TSP圖：BAAS信號肽（BGIH)、伸 展蛋白信號肽（EGIH)和修飾的伸展蛋白信號肽（E*GIH)。
[0025] 圖10是從瞬時轉化的菸草葉提取的胰蛋白酶處理和非胰蛋白酶處理的Jun a 3 融合的ω-ACTX-Hvla蛋白的濃縮過程的示圖。
[0026] 圖11是含ω -ACTX-Hvla樣品的HPLC色譜圖。如下將樣品加載到HPLC系統中 以產生色譜圖：Α. 25 Pg合成的ω-ACTX-Hvla5B. 500 PL的樣品B I kD過濾截留物；C. 500 PL的樣品A I kD過濾截留物。
[0027] 圖12是在乳酸克魯維酵母尤菌株中產生的 U+2-ACTX-Hvla (本文有時亦稱"U+2"）和天然U-ACTX-Hvla (本文有時亦稱"天然U"） 兩者的歸一化肽產量的分布圖。U+2數據用黑色表示，天然U數據用灰色表示。X軸表示歸 一化產量，單位為在600 nm波長處的毫克/升/光吸收單位（mg/L. A.)。左邊y刻度表示 U+2菌株的分數。右邊y刻度天然U菌株的分數。
[0028] 圖13是來自U+2和天然U-ACTX-Hvla乳酸克魯維酵母菌株的歸一化肽產量的分 布圖。此處y軸表示各菌株的歸一化產量（針對下述相應培養物中的細胞密度歸一化），單 位為以600 nm波長處的毫克/升/光吸收單位（mg/L. A.)，X軸相當於所觀察到的各菌株 產量相對於針對經工程改造產生相同肽同種型的所有其它乳酸克魯維酵母菌株所觀察到 的產量的百分等級。
[0029] 圖14是用U+2和天然U-ACTX-Hvla的家蠅注射生物測定的劑量反應圖。U+2數據 用黑色圓點標示，天然U數據用灰色三角標示。X刻度表示以微微摩爾/克家蠅為單位的劑 量。y刻度表示死亡百分比。
[0030] 圖15是自巴斯德畢赤酵母O0ZcAia pasioris，/I pasioris)菌株生產的U+2和 天然U-ACTX-Hvla的肽產量的分布圖。U+2數據用黑色表示，天然U數據用灰色表示。X軸 表示單位為毫克/升的產量，y刻度表示自巴斯德畢赤酵母菌株生產的總U+2或天然U的 分數。
[0031] 圖16是另一個自巴斯德畢赤酵母菌株生產的U+2和天然U-ACTX-Hvla的肽產量 的分布圖。此處y軸表示各菌株的單位為毫克/升的產量，X軸相當於所觀察到的各菌株 產量的百分等級（相對於針對經工程改造以生產相同肽同種型的所有其它巴斯德畢赤酵 母菌株所觀察到的產量）。
[0032] 圖17是自乳酸克魯維酵母表達菌株產生的海葵毒素 Av3和Av3+2的肽產量的分 布圖。來自名為ririt/i的海葵的天然毒素稱為Av3。修飾毒素在此處標示為Av3 + 2。像上述實例一樣，我們在乳酸克魯維酵母菌株中產生毒肽。X軸表示單位為mAu. sec/ A的各菌株的肽產量，y軸表示菌株的分數。圖17中，天然Av3菌株用淺灰色表示，修飾的 高產量菌株Av3 +2用黑色表示。
[0033] 圖18表示通過以生產相同肽的轉化體的百分等級為函數對肽產量作圖，自相應 乳酸克魯維酵母菌株生產的Av3+2和天然Av3的肽產量的差異。此處y軸表示各菌株的歸 一化產量，單位為mAu. sec/A，X軸相當於所觀察到的各菌株產量相對於針對經工程改造產 生相同肽同種型的所有其它乳酸克魯維酵母菌株所觀察到的產量的百分等級。
[0034] 圖19在施用和暴露於ICK肽或Bt蛋白後葉生物測定24小時百分比死亡率相對 於蟲齡的示圖。
[0035] 圖20在對72小時幼蟲使用Bt蛋白或ICK肽或Bt + ICK肽的組合施用後18、24 和48小時，測量百分比死亡率的葉生物測定的示圖。
[0036] 圖21在暴露於Bt蛋白或非ICK CRIP或其組合後24小時和48小時，測量由Bt 抗性昆蟲引起的葉片損傷的食葉生物測定的示圖。
[0037] 圖22在對Bt蛋白抗性小菜蛾仍幻幼蟲使用Bt蛋白或ICK肽或其 組合施用後24和48小時，測量百分比死亡率的食葉生物測定的示圖。
[0038] 序列表簡沭 本發明包括1593個序列的序列表。
[0039] 在第 1 部分提到或提及 SEQ ID NO: 1-28、1553-1570 和 1593。
[0040] 在第2部分提到或提及SEQ ID NO: 29-32和1571-1592。
[0041] 在第3部分提到或提及SEQ ID NO: 33-1042。
[0042] SEQ ID NO: 1043-1221是來源於或具有蜘蛛源的序列。
[0043] SEQ ID NO: 1222-1262是來源於或具有海葵源的序列。
[0044] SEQ ID NO: 1263-1336是來源於或具有蠍源的序列。
[0045] SEQ ID NO: 1337-1365是來源於或具有蠍源的序列。
[0046] SEQ ID NO: 1366-1446是來源於或具有Cry或Cyt源的序列。
[0047] SEQ ID NO: 1447-1552是來源於或具有VIP源的序列。
[0048] 發明詳沭 定義 "ACTX"或"ACTX肽"意指自屬於Jiraciz7ae亞科的澳大利亞漏鬥網蜘蛛分離的殺蟲 ICK肽家族。一種這樣的蜘蛛稱為澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛，其學名為辦 。來自該種的ACTX肽的兩個實例是ω肽和U肽。
[0049] "農桿菌感染法（agroinfection) "意指其中通過使用農桿菌屬（Agrobacteria) 根癌農桿菌（^. 或髮根農桿菌ClrAizogefles)，將DNA導入植物細胞中的植 物轉化方法。
[0050] "BAAS"意指大麥α澱粉酶信號肽。它是ERSP的一個實例。
[0051] "二元載體"或"二元表達載體"意指可在大腸桿菌（A. cWi)菌株和農桿菌屬 菌株兩者中自我複製的表達載體。此外，載體含有被左和右邊界序列置於 中間的DNA區（常常稱為t-DNA)，所述邊界序列被待拷貝並被農桿菌遞送至植物細胞中的 毒力基因識別。
[0052] "Bt"亦稱蘇雲金芽抱桿菌（ifeciBws 或漢 ，意指 在全世界範圍內已使用60多年以控制農業、林業和公共健康蟲害的革蘭氏陽性土壤細菌。
[0053] "Bt蛋白"和"Bt肽"在此是指同一物，這些是由Bt產生的肽。所述肽常被寫為 "cry"、" Cyt"或"VIP"蛋白，由肩/功7基因編碼。Bt蛋白更常被認為是由c/T基 因編碼的殺蟲晶體蛋白。Bt蛋白是PFIPS (成孔殺蟲蛋白）的實例，參見下文定義。序列 表提供了實例PFIPS和其它Bt蛋白。
[0054] "嵌合基因"意指編碼來源於一個或多個編碼序列的部分的基因以產生新基因的 DNA序列。
[0055] "可切割接頭"意指是蛋白酶（可將蛋白質裂解並分成兩部分）的靶位點的蛋白質 中的短肽序列或被置於ORF的讀框中並編碼是蛋白酶（可將蛋白質裂解並分成兩部分）的 靶位點的蛋白質中的短肽序列的短DNA序列。
[0056] "條件培養基"意指已被細胞利用並且富含來源於細胞的物質但不含細胞的細胞 培養基。
[0057] "轉化"或"轉化的"是指製備HP肽的過程。
[0058] "CRIP"和"CRIPS"是一種或多種富含半胱氨酸的殺蟲蛋白的縮略語。富含半胱 氨酸的殺蟲肽（CRIPS)富含形成二硫鍵的半胱氨酸的肽。在具有至少10個胺基酸的蛋白 質或肽中，CRIPS含有至少四（4)個、有時六（6)個和有時八（8)個半胱氨酸胺基酸，其中 半胱氨酸形成兩（2)、三（3)或四（4)個二硫鍵。二硫鍵有助於殺蟲肽的摺疊、三維結構和 活性。它們形成的半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵和三維結構在這些殺蟲肽的毒性中起重要作 用。CRIP的實例為抑制性半胱氨酸結或ICK肽（通常具有6-8個半胱氨酸）和具有二硫 鍵但不被視為ICK肽的毒肽（非ICK CRIPS)兩者。ICK的實例可為來自蜘蛛和上文定義 的ACTX肽。非ICK CRIP的實例可為像Av2和Av3 (其是最早從海葵中鑑定的肽）的肽。 這些肽是調節昆蟲外周神經系統（PNS)中的鈉通道的一類化合物的實例。非ICK CRIPS可 具有形成2-4個二硫鍵的4-8個半胱氨酸。這些半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵穩定的毒肽 (CRIPS)當暴露於環境時可具有顯著的穩定性。許多CRIPS自分泌毒液的動物（例如蜘蛛、 蠍、蛇和海螺和海葵）中分離，並且它們對昆蟲是有毒的。下面提供其它描述。
[0059] "確定成分培養基"意指由已知化學組分組成但不含未加工的蛋白質性提取物或 副產物（例如酵母提取物或蛋白腖）的培養基。
[0060] "二硫鍵"意指通過兩個半胱氨酸胺基酸側鏈的兩個巰基的偶聯得到的兩個半胱 氨酸間的共價鍵。
[0061] "雙重轉基因肽表達載體"或"雙重轉基因表達載體"意指含有2拷貝的殺蟲肽表 達盒的酵母表達載體。
[0062] "ELISA"或"iELISA"意指其中將樣品固定在板的表面，然後如下檢測的分子生物 學方案：施加第一抗體，接著施加與酶綴合的第二抗體，所述酶將無色底物轉化成可在樣品 中檢出或定量的有色底物。在該方案過程中，洗去抗體，使得僅保留與其表位結合的抗體用 於檢測。我們手中的樣品是自植物分離的蛋白質，ELISA允許定量測定回收的已表達的轉 基因蛋白的量。
[0063] "表達0RF"意指編碼蛋白質複合物的核苷酸，並限定為ORF中的核苷酸。
[0064] "ER"或"內質網"是所有真核生物共有的亞細胞器，其中發生某些翻譯後修飾過 程。
[0065] "ERSP"或"內質網信號肽"是在轉基因 mRNA分子的蛋白質翻譯期間被宿主細胞信 號識別顆粒識別並結合的胺基酸N端序列，其使蛋白質翻譯核糖體/mRNA複合物移動至胞 質的ER中。結果是蛋白質翻譯暫停，直到它與ER相接，在其中翻譯繼續，所得蛋白質被注 入ER中。
[0066] "意指編碼肽ERSP的核苷酸。
[0067] "ER運輸"意指細胞表達的蛋白質運送到ER中用於翻譯後修飾、分選和轉運。
[0068] "FECT"意指使用剔除外被蛋白基因和三基因框（triple gene block)的狐尾草花 葉病毒的瞬時植物表達系統。
[0069] "GFP"意指來自水母維多利亞多管發光水母ricioria)的綠色突光蛋 白。它是翻譯穩定性蛋白的實例。
[0070] "高產肽"或"HP肽"意指按照本文所述程序能夠生產或"轉化"且一旦轉化，可在 生物系統中以高的產量或較高生產率或大於常量生產的肽。較高的生產率可為採用轉化前 用來生產肽的相同或類似生產方法，用轉化前的肽可達到生產率的20-400%或更大。
[0071] "雜合肽"，亦稱"雜合毒素"，亦稱"雜合-ACTX-Hvla"，亦稱"天然雜合ACTX-Hvla" 以及"U肽"，亦稱"U毒素"，亦稱"天然U"，亦稱"υ-ACTX-Hvla"，亦稱"天然U-ACTX-Hvla" 全是指ACTX肽，其是在稱為澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛辦MT 1SWia的蜘蛛中 發現的，是昆蟲電壓門控Ca2+通道和電壓門控K+通道的雙重拮抗劑。
[0072] "IGER"意指一種短肽的名稱，基於其一字母代碼的實際序列。它是間插接頭的實 例。
[0073] " ICK基序"、" ICK基序蛋白"、"抑制物胱氨酸結基序"、"毒性昆蟲ICK肽"、" ICK 肽"、"CK"肽"、"胱氨酸結基序"或"胱氨酸結肽"意指16-60個含至少6個半-胱氨酸核心 胺基酸、具有3個二硫橋的胺基酸肽，其中3個二硫橋是共價鍵，6個半-胱氨酸殘基中的共 價二硫鍵介於自N端胺基酸開始的6個核心半-胱氨酸胺基酸的第一和第四、第二和第五 及第三和第六個半-胱氨酸之間。這種類型的肽一般包含β-髮夾二級結構，通常由位於 基序的第四和第六個核心半-胱氨酸之間的殘基組成，髮夾通過由基序的3個二硫鍵提供 的結構交聯而被穩定。注意其它的半胱氨酸/胱氨酸或半-胱氨酸胺基酸可存在於抑制物 胱氨酸結基序內。序列表中提供了實例。
[0074] 意指編碼ICK基序蛋白的核苷酸。
[0075] "ICK基序蛋白表達0RF"或"表達0RF"意指編碼ICK基序蛋白複合物的核苷酸， 並限定為ORF中的核苷酸。
[0076] " ICK基序蛋白表達載體"或" ICK表達載體"或" ICK基序表達載體"意指含有表 達ORF的二元載體。二元載體還含有表達ORF周圍必要的轉錄啟動子和終止子序列以促進 其編碼的ORF和蛋白質表達。
[0077] "昆蟲"意指任何節肢動物和線蟲，包括蟎、已知侵染所有作物、蔬菜和喬木的昆 蟲，包括在林業、園藝和農業領域被視為有害生物的昆蟲。可用本文公開的方法保護的具體 作物的實例為大豆、玉米、棉、苜蓿和蔬菜作物。具體作物和昆蟲列表出現本文件結束時。
[0078] "昆蟲腸環境"或"腸環境"意指存在於昆蟲或昆蟲幼蟲的前腸、中腸或後腸中的特 定pH和蛋白水解酶條件。
[0079] "昆蟲血淋巴環境"意指存在於昆蟲或昆蟲幼蟲內的特定pH和蛋白水解酶條件。
[0080] "殺蟲活性"意指在昆蟲暴露於化合物或肽的時候或之後，昆蟲死亡，停止或減慢 其運動或其攝食，停止或減慢其生長，不能化蛹，無法生殖或無法生產能育後代。
[0081] "殺蟲肽"或"殺蟲蛋白"或"毒肽"或"毒蛋白"意指當被昆蟲食入、與昆蟲接觸或 注入昆蟲時具有殺蟲活性的蛋白質。
[0082] "殺蟲肽生產菌株篩選"意指從較低產的菌株鑑定出較高產的殺蟲肽生產酵母菌 株的篩選過程。在本文所述方法中，它是指利用反向HPLC或家蠅注射生物測定的篩選。 [0083] "整合表達載體或整合載體"意指本身可插入酵母細胞基因組的特定基因座並穩 定地變成酵母基因組的一部分的酵母表達載體。
[0084] "間插接頭"意指蛋白質中將所述蛋白質分隔成不同部分的短肽序列，或被置於 ORF的讀框中以將上遊和下遊DNA序列分隔的短DNA序列，使得在蛋白質翻譯期間DNA中編 碼的蛋白質可實現其獨立的二級和三級結構形成。在植物細胞環境中、在昆蟲和/或鱗翅 類腸環境中和在昆蟲血淋巴和鱗翅類血淋巴環境中，間插接頭可以是抗切割的或是易被切 割的。
[0085] "已知肽"意指已知具有生物活性的肽，且其可以是成熟肽或其任何形式或片段， 包括前肽和肽原（pro p印tide)及活性肽的綴合物。優選的已知肽是具有殺蟲活性的肽。
[0086] "L"在適當的上下文中意指連接翻譯穩定性蛋白與ICK基序蛋白或多個ICK基序 蛋白結構域的間插接頭肽，和連接相同或不同的多個ICK基序蛋白的間插接頭肽。當提及 胺基酸時，"L"也可指亮氨酸。
[0087] "接頭、LINKER"或在某些情況下"L"意指連接翻譯穩定性蛋白與ICK基序蛋白或 多個ICK基序蛋白結構域的間插接頭肽，和連接相同或不同的多個ICK基序蛋白的間插接 頭肽。接頭可具有以下（至少）3個作用之一：在昆蟲腸環境中裂解、在植物細胞中裂解或 設計成不刻意裂解。
[0088] "或茲矣〃意指編碼間插接頭肽的核苷酸。
[0089] "鱗翅類腸環境"意指存在於鱗翅類昆蟲或幼蟲的前腸、中腸或後腸內的特定pH和 蛋白水解酶條件。
[0090] "鱗翅類血淋巴環境"意指存在於鱗翅類昆蟲或幼蟲內的特定pH和蛋白水解酶條 件。
[0091] "多個ICK基序蛋白結構域"意指由被多個間插接頭肽連接的多個ICK基序蛋白組 成的蛋白質。多個ICK基序蛋白結構域中的ICK基序蛋白可以是相同的或不同的，且該結 構域中的間插接頭肽也可以是相同的或不同的。
[0092] "非ICK CRIPS"可具有4-8個形成2-4個二硫鍵的半胱氨酸。非ICK肽包括不是 ICK肽的胱氨酸結肽。非ICK肽可具有與ICK不同的胱氨酸鍵的連接順序。非ICK CRIP的 實例是像Av2和Av3 (其是最早從海葵中鑑定的肽）一樣的肽。這些海葵肽是調節昆蟲外 周神經系統（PNS)的鈉通道的一類化合物的實例。
[0093] "非極性胺基酸"是弱疏水性的胺基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸或gly是用於本發明二肽的最優選的非極性氨 基酸。
[0094] "歸一化肽產量"意指條件培養基中的肽產量除以在測量肽產量的時間點上的相 應的細胞密度。肽產量可用體積單位中所產生的肽的質量表示，例如mg/升或mg/L，或用 HPLC色譜儀中所產生的肽的UV吸光度峰面積表示，例如mAu. sec。細胞密度可用在600 nm 波長處培養物的可見光吸光度（0D600)表不。
[0095] "一字母代碼"意指以其一字母代碼列出以辨別蛋白質一級結構中不同胺基酸的 肽序列。丙氨酸=A，精氨酸=R，天冬醯胺=N，天冬氨酸=D，天冬醯胺或天冬氨酸=B，半胱氨 酸=C，穀氨酸=E，穀氨醯胺=Q，穀氨醯胺或穀氨酸=Z，甘氨酸=G，組氨酸=H，異亮氨酸=I，亮 氨酸=L，賴氨酸=K，甲硫氨酸=M，苯丙氨酸=F，脯氨酸=P，絲氨酸=S，蘇氨酸=T，色氨酸=W， 酪氨酸=Y，纈氨酸=V。
[0096] " ω肽"，亦稱" ω毒素"，亦稱" ω -ACTX-Hvla"，亦稱"天然ω -ACTX-Hvla"全是指 最早從稱為澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛辦MT1SWia的蜘蛛中分離的，且是昆蟲 電壓門控Ca 2+通道的拮抗劑的ACTX肽。
[0097] "0RF"或"開放閱讀框"或"肽表達0RF"意指編碼始於ATG起始密碼子並終於TGA、 TAA或TAG終止密碼子的蛋白質的DNA序列。ORF也可指DNA編碼的翻譯的蛋白質。
[0098] "有效連接"意指兩個鄰接DNA序列放置在一起使得一個的轉錄活性可作用於另一 個。
[0099] "PEP"意指植物表達的肽。
[0100] "肽表達盒"或"表達盒"意指由在生物表達系統中完成殺蟲肽轉錄所必需的全部 DNA元件組成的DNA序列。在本文所述方法中，它包括轉錄啟動子、編碼α-交配因子信號 序列和Kex 2切割位點的DNA序列、殺蟲肽轉基因、終止密碼子和轉錄終止子。
[0101] "肽表達載體"意指含有異源殺蟲肽轉基因的宿主生物表達載體。
[0102] "肽表達酵母菌株"、"肽表達菌株"或"肽生產菌株"意指可產生異源殺蟲肽的酵母 菌株。
[0103] "特殊製備的肽"意指之前自生物表達系統具有低肽產量並因使用本文所述用於 提高肽產量的方法而變成HP肽的肽。
[0104] "肽轉基因"或"殺蟲肽轉基因"意指編碼殺蟲肽並且可在生物表達系統翻譯的DNA 序列。
[0105] "肽產量"意指從肽表達酵母菌株的細胞中產生的條件培養基中的殺蟲肽濃度。它 可用體積單位中所產生的肽的質量表示，例如mg/升或mg/L，或用HPLC色譜儀中所產生的 肽的UV吸光度峰面積表示，例如mAu. sec。
[0106] "圍食膜"意指截留大的食物顆粒的昆蟲腸內的內襯可有助於所述食物顆粒運動 通過腸，同時允許消化，並且還保護腸壁。
[0107] "PFIP"意指可在內襯昆蟲腸的細胞（例如腸上皮細胞）中形成孔或通道的蛋白 質。PFIPS的實例為Bt蛋白例如cry、crt和VIP，其它PFIP實例可見於序列表。
[0108] "PIP"或"植物結合殺蟲劑"意指由轉基因植物產生的殺蟲蛋白和植物產生所述蛋 白質所必需的遺傳物質。
[0109] "植物可切割接頭"意指可切割的接頭肽，或編碼可切割的接頭肽的核苷酸，其含 有植物蛋白酶識別位點，並且可在植物細胞中在蛋白質表達過程期間被切割。
[0110] "植物再生培養基"意指這樣的任何培養基，其含有植物生長的必需元素和維生素 及促進細胞再生為可發芽並生成源於組織培養的小植株的胚所必需的植物激素。所述培養 基常常含有選擇劑，轉基因細胞表達針對所述選擇劑賦予所述選擇劑抗性的選擇基因。
[0111] "植物轉基因蛋白"意指在編碼所述蛋白質的DNA或RNA被遞送至一個或多個植物 細胞後在植物中表達的來自異源物種的蛋白質。
[0112] "極性胺基酸"是極性的胺基酸，包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯 胺、組氨酸、色氨酸和酪氨酸；優選的極性胺基酸為絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺和 穀氨醯胺；其中絲氨酸為最優選的。
[0113] "轉錄後基因沉默"或"PTGS"意指活細胞內抑制基因表達的細胞過程。
[0114] 在本文件中，"蛋白質"具有與"肽"相同的含義。
[0115] "重組載體"意指外源DNA插入其中的DNA質粒載體。
[0116] "選擇基因"意指賦予基因組修飾的生物在選擇壓力下生長的優勢的基因。
[0117] " STA"，或"翻譯穩定性蛋白"，或"穩定性蛋白"，或"融合蛋白"意指具有可在細胞 中蓄積而又不作為蛋白質降解的細胞過程的目標的充足三級結構的蛋白質。蛋白質可介於 5和50aa (例如另一種ICK基序蛋白）、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如幾丁質酶）和 750-1500aa (例如增強蛋白）之間。翻譯穩定性蛋白由ORF中與編碼殺蟲蛋白的序列融合 在框中的蛋白質的DNA序列編碼。融合蛋白可在殺蟲蛋白的上遊或下遊，並且在兩個序列 間可具有任何間插序列，只要間插序列不導致任一 DNA序列的移碼。翻譯穩定性蛋白還可 具有增加 ICK基序蛋白跨腸壁遞送並進入昆蟲血淋巴中的活性。這種遞送可如下實現：通 過跨腸壁主動運輸整個0RF，或通過在腸環境內切割以分開ICK基序蛋白同時翻譯穩定性 蛋白損壞圍食膜和/或腸壁以增加 ICK基序蛋白擴散進入血淋巴。
[0118] "意指編碼翻譯穩定性蛋白的核苷酸。
[0119] "TM0F"、"TM0F基序"或"TMOF蛋白"意指"胰蛋白酶調節抑卵因子"蛋白序列。序 列表中提供了實例。本文提供了許多實例和變體。SEQ ID NO :708是野生型TMOF序列。 SEQ. ID. NO: 709-721提供了其它非限制性變體。其它實例是已知的或可通過本領域技術 人員產生。
[0120] "TSP"或"總可溶性蛋白"意指可從植物組織樣品中提取並溶於提取緩衝液中的蛋 白質的總量。
[0121] "轉基因"意指轉化進入植物中的編碼蛋白質的異源DNA序列。
[0122] "轉基因宿主細胞"意指用基因轉化並針對其轉基因狀態通過另外的選擇基因選 擇的細胞。
[0123] "轉基因植物"意指來源於用外源DNA轉化的單細胞使得植物中的每個細胞都含有 該轉基因的植物。
[0124] "瞬時表達系統"意指基於根癌農桿菌的系統，其將編碼無害的（disarmed)植物病 毒的DNA遞送到植物細胞中，在其中DNA進行表達。植物病毒被工程改造以表達高濃度的 目標蛋白質，高達40%的TSP。在技術論證中，所採用的瞬時表達系統有兩個，TRBO和FECT 系統，植物細胞為菸草植物"AYcoiiaaa "的葉組織。
[0125] "TRB0"意指使用剔除病毒外被蛋白基因的菸草花葉病毒的瞬時植物表達系統。
[0126] "胰蛋白酶切割"意指使用蛋白酶胰蛋白酶（其識別暴露的賴氨酸和精氨酸氨基 酸殘基）將可切割接頭在該切割位點上切斷的體外測定。它還指胰蛋白酶切割該位點的作 用。
[0127] "U肽"、"U蛋白"，亦稱"U毒素"，亦稱"天然U"，亦稱"U-ACTX-Hvla"，亦稱"天然 U-ACTX-Hvla"以及"雜合肽"，亦稱"雜合毒素"，亦稱"雜合-ACTX-Hvla"，亦稱"天然雜合 ACTX-Hvla"全都是指天然蛋白質或天然毒素，其可存在於自然界或是以其它方式已知的， 在"U-ACTX-Hvla"，亦稱"天然U-ACTX-Hvla"的情況下，該蛋白質是天然蜘蛛毒素，最早發 現於澳大利亞布魯山脈起源的蜘蛛，並且是針對昆蟲電壓門控Ca 2+通道和K+通道的雙重 拮抗劑。從中發現毒素的蜘蛛已知為澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛，學名為辦 versuta。
[0128] "U+2肽"、"U+2蛋白"、"U+2毒素"或"U+2"或"U+2-ACTX-Hvla"全都指具有與天然 肽有效連接的另外二肽的任一毒素，並可指有時稱為U肽和上述其它名稱的蜘蛛毒素。與U 肽有效連接並因此標為"+2"或"加2"的另外二肽可從數種肽中選擇，其任一種可產生具有 本文所述的獨特性能的"U+2肽"。這些有時亦稱"高產肽"。當使用術語"U+2-ACTX-Hvla" 時，它是指特定的高產毒肽，包括來自澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛（學名為辦 的天然存在的肽。
[0129] "VIP"蛋白自針對可能的殺蟲活性篩選Bt的營養生長菌株的上清液而被發現。 它們與cry蛋白幾乎沒有或沒有相似性，且它們被命名為營養性殺蟲蛋白（Vegetative Insecticidal Protein)或VIP。具有鱗翅類活性的名為VIP3、Vip3蛋白或Vip毒素的是 本文件特別使用和優先使用的。它們被認為與Bt cry肽具有類似的作用方式。在本文件 中，VIP蛋白被歸類為PFIP型的蛋白質。
[0130] "酵母表達載體"或"表達載體"或"載體"意指可將異源基因和/或表達盒導入酵 母細胞中以被轉錄和翻譯的質粒。
[0131] "產量"是指肽的生產量，高的產量可意指生產量提高、生產率提高及平均產量或 中值產量提高和較高產量的頻率提高。
[0132] 第1部分.棺物結合狀或棺物表汰的狀"PIPS"和"PEPS" 植物結合殺蟲劑，或"PIPS"，為農民所面臨的昆蟲壓力提出一種解決方法。現代農業 利用作為植物轉基因蛋白表達的蘇雲金芽孢桿菌的基因以起PIPs的作用，但是天然抗性 昆蟲品系已在田間檢出，並且這個類別可能來臨。需要開發具有新的作用方式的其它PIPs 以控制抗性的發生。具有變成PIPs的潛力、有殺蟲活性的新的蛋白質類別被稱為富含半胱 氨酸的殺蟲蛋白（CRIPS)，這些蛋白質具有4、6或8個半胱氨酸和2、3或4個二硫鍵。這類 化合物的一個實例被視為具有被稱為抑制物半胱氨酸結（ICK)基序蛋白的類型。具有殺蟲 活性的ICK基序蛋白具有成為殺蟲蛋白和PIPs的潛力。
[0133] ICK基序蛋白是具有形成特定的ICK三級結構的至少6個半胱氨酸殘基的一類蛋 白質。ICK基序蛋白中半胱氨酸殘基的共價交聯形成導致這樣的三級結構的二硫橋：使蛋 白質對蛋白酶和有時對極端物理條件（pH、溫度、紫外線等）相對有抗性，並賦予針對離子 通道的活性，這可能對昆蟲是特異性的。在使用ICK基序蛋白作為毒素使其捕食者或獵物 不動或被殺死的無脊椎動物和脊椎動物毒液中，許多ICK基序蛋白發生進化。所述殺蟲肽 常常具有蠍、蜘蛛起源，有時具有蛇起源。在性質上，毒肽可通過注射流入昆蟲的腸或內部 器官。在PIP的情況下，遞送通常通過昆蟲攝食植物組織中表達的轉基因蛋白。在從其食 物攝食毒素時，例如昆蟲攝食轉基因植物，ICK基序蛋白可具有抑制生長、損害運動或甚至 殺死昆蟲的能力。
[0134] 然而，毒肽當在植物中表達時常常喪失其毒性。除非ICK基序蛋白作為正確摺疊 的蛋白質表達，否則其無法成功地保護植物或作物免遭蟲害。在某些情況下，植物表達的肽 需要在昆蟲內或在植物中的表達過程期間通過切割而被激活以便有活性。對以下的方法和 修飾的肽和核酸存在需要：使肽不僅僅能夠在植物中表達，而且還能夠表達、正確摺疊並在 某些情況下正確切割使得肽甚至在植物中表達後仍保留其針對昆蟲的活性。在該部分中， 我們提供了生產適宜在植物中表達的活性肽的幾種方法。
[0135] 我們描述了有效連接在一起以獲得新的蛋白質複合物的不同肽的各種組合。描 述了下列蛋白質複合物。一種包含與富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)例如抑制物胱氨酸結 (ICK)基序蛋白有效連接的內質網信號肽（ERSP)的肽，其命名為ERSP-ICK，其中所述ERSP 是所述肽的N端，且其中ERSP肽的長度為3-60個胺基酸、5-50個胺基酸、20-30個胺基酸和 /或其中肽是BAAS、或菸草伸展蛋白信號肽、或修飾的菸草伸展蛋白信號肽、或 aiei或/ aiei的Jun a 3信號肽。
[0136] 一種包含與富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)例如抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白 有效連接的內質網信號肽（ERSP)的肽，其命名為ERSP-ICK，其中ICK基序蛋白的長度介於 16和60個胺基酸之間、介於26和48個胺基酸之間、介於30和44個胺基酸之間和/或其 中 ICK 基序蛋白是 U-ACTX-Hvla、或 ω-ACTX-Hvla、或 κ-ACTX-Hvlc。
[0137] 一種包含與抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白有效連接的內質網信號肽（ERSP)的 肽，命名為ERSP-ICK，其中所述ERSP和抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白是本文所述任何大 小和長度的組合和/或包含本文件教導的任何已鑑定的序列。
[0138] 一種編碼本文描述的作為內質網信號肽（ERSP)和/或富含半胱氨酸的殺蟲肽 (CRIP)例如抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白的任何肽的核苷酸。一種包含編碼這些肽的任 何核苷酸的表達0RF。一種包含編碼這些肽的任何核苷酸的表達0RF，其被轉化至轉基因植 物基因組中。一種肽，其中所述ICK基序蛋白是殺蟲蛋白。一種肽，其中所述殺蟲肽是本文 描述的任何ICK基序蛋白或肽。一種肽，其中所述殺蟲肽是選自包括澳毒蜘蛛屬Oir aW 或的任何肽或肽源的任何肽。選自序列表的任何肽的殺蟲肽及其片段，包括所 述肽和序列號的成熟、前肽和肽原形式。一種肽，其中所述殺蟲肽是描述或選自ACTX蛋白 的任何所選的肽。一種TMOF蛋白。
[0139] 本文所述任何肽或核苷酸製備或轉化植物或植物基因組以在轉化植物中表達正 確摺疊的毒肽的用途。本文所述任何肽或核苷酸製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化 植物中表達正確摺疊的毒肽並使已表達的和正確摺疊的毒肽在所述植物中蓄積並使植物 對蟲害的抗性提高的用途。
[0140] 一種使用任何肽的核苷酸或在CRIP、ICK、非ICK、基序蛋白表達載體中的表達ORF 產生轉基因植物的方法。一種包含表達本文所述任何肽的任何核苷酸的ICK基序蛋白表達 載體。一種摻入到轉化植物中的ICK基序蛋白表達載體，其包含編碼本文公開的任何肽或 鑑於本文公開的教導內容可由本領域技術人員製備的核苷酸。一種生產具有或表達本文所 述任何肽的轉化植物的方法。一種由本文所述任何產品和處置方法產生的植物。
[0141] 一種包含與有效連接間插接頭肽（L或接頭）的抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白 或富含半胱氨酸的肽有效連接的內質網信號肽（ERSP)的蛋白質，其命名為ERSP-接頭-ICK (ERSP-L-ICK)或ERSP-ICK-接頭（ERSP-ICK-L)，其中所述ERSP是所述蛋白質的N端，和所 述L或接頭可位於ICK基序蛋白的N端一側（上遊）或ICK基序蛋白的C端一側（下遊）。 一種命名為ERSP-L-ICK或ERSP-ICK-L的蛋白質，其包含本文所述任何ERSP或ICK基序蛋 白，且其中所述L可以是不可切割的接頭肽或可切割的接頭肽，其在植物細胞中在蛋白質 表達過程期間是可切割的或在昆蟲腸環境和血淋巴環境中可被切割，且包含本文件描述或 教導的任何間插接頭肽（LINKER)，包括下列序列：IGER (SEQ ID NO. 1)、EEKKN (SEQ ID NO. 2)和 ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
[0142] 一種編碼所述作為內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白和/或 間插接頭肽（LINKER)的任何肽的核苷酸和編碼用於產生轉基因植物的這些蛋白質的任一 種的任何和所有核苷酸。
[0143] 所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白和/或間插 接頭肽（LINKER)的核苷酸的任一種在製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化植物中表 達正確摺疊的毒肽中的用途。所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK) 基序蛋白和/或間插接頭肽的核苷酸的任一個在製備或轉化植物或植物基因組從而在轉 化植物中表達正確摺疊的毒肽並使已表達的和正確摺疊的毒肽在所述植物中蓄積並使植 物對蟲害的抗性提高中的用途。
[0144] -種使用編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白和/或間插 接頭肽（LINKER)的核苷酸或表達ORF產生轉基因植物的方法。一種表達0RF，其包含在ICK 表達載體中的表達本文所述任何肽、ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的任何核苷酸。一 種摻入轉化植物中的ICK基序蛋白表達載體中的功能表達0RF，其包含編碼本文公開的任 何肽的核苷酸；編碼ERSP、ICK基序蛋白和/或LINKER的核苷酸；或鑑於本文公開的教導 內容可由本領域技術人員製備的核苷酸。一種生產具有或表達本文所述任何肽、ERSP、ICK 基序蛋白和/或LINKER的轉化植物的方法。一種由本文所述任何產品和處置方法產生的 植物。
[0145] 一種包含與有效連接翻譯穩定性蛋白（STA)的抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白有 效連接的內質網信號肽（ERSP)的蛋白質，其命名為ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA，其中所 述ERSP是所述蛋白質的N端，所述STA可位於ICK基序蛋白的N端一側（上遊）或ICK基 序蛋白的C端一側（下遊）。一種命名為ERSP-STA-ICK或ERSP-ICK-STA的蛋白質，其包含 本文所述的任何ERSP或ICK基序蛋白，且其中STA包含本文件所述或教導的任何翻譯穩定 性蛋白，包括GFP (綠色突光蛋白）、GNA (雪花蓮凝集素）、Juna3 和許多其它ICK基序蛋白。
[0146] 一種編碼所述作為內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白和/或 翻譯穩定性蛋白（STA)的任何肽的核苷酸和具有編碼用於產生轉基因植物的這些蛋白質 的任一種的這些功能類型的任一個的任何和所有核苷酸。
[0147] 所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白和/或翻 譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸的任一個在製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化植物 中表達正確摺疊的毒肽中的用途。所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結 (ICK)基序蛋白和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸的任一個在製備或轉化植物或植物 基因組從而在轉化植物中表達正確摺疊的毒肽並使已表達的和正確摺疊的毒肽在所述植 物中蓄積並使植物對蟲害的抗性提高中的用途。
[0148] 一種使用在ICK表達載體中編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基 序蛋白和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸或表達ORF以產生轉基因植物的方法。一種 表達0RF，其包含表達ERSP、ICK基序蛋白和/或STA的任何核苷酸。一種摻入轉化植物中 的ICK基序蛋白表達載體中的功能表達0RF，其包含編碼ERSP、ICK基序蛋白和/或STA或 鑑於本文公開的教導內容可由本領域技術人員製備的核苷酸。一種產生具有或表達ERSP、 ICK基序蛋白和/或STA的轉化植物的方法。一種由本文所述任何產品和處置方法產生的 植物。
[0149] 一種包含與有效連接與間插接頭肽（LINKER)有效連接的翻譯穩定性蛋白（STA) 的抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白有效連接的內質網信號肽（ERSP)的蛋白質，其命名為 ERSP-STA-LINKER-ICK、ERSP-ICK-LINKER-STA、ERSP-STA-L-ICK 或 ERSP-ICK-L-STA，其中 所述ERSP是所述蛋白質的N端，所述STA可位於ICK基序蛋白的N端一側（上遊）或ICK 基序蛋白的C端一側（下遊），且所述LINKER介於STA和ICK基序蛋白之間。一種命名為 ERSP-STA-LINKER-ICK 或 ERSP-ICK-LINKER-STA 的蛋白質，其包含本文所述 ERSP、ICK 基序 蛋白、間插接頭肽和翻譯穩定性蛋白的任一種。
[0150] 一種編碼所述作為內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白、間插 接頭肽（LINKER)和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的任何肽的核苷酸和編碼用於產生轉基因 植物的這些蛋白質的任一種的任何和所有核苷酸。
[0151] 所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白、間插接頭 肽和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸的任一種在製備或轉化植物或植物基因組從而在 轉化植物中表達正確摺疊的毒肽中的用途。所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱 氨酸結（ICK)基序蛋白、間插接頭肽（LINKER)和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸的任 一種在製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化植物中表達正確摺疊的毒肽並使已表達 的和正確摺疊的毒肽在所述植物中蓄積並使植物對蟲害的抗性提高中的用途。
[0152] 一種使用ICK表達載體中的編碼內質網信號肽（ERSP)、抑制物胱氨酸結（ICK)基 序蛋白、間插接頭肽和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸或表達ORF以產生轉基因植物 的方法。一種表達0RF，其包含在ICK表達載體中的表達ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/ 或STA的任何核苷酸。一種摻入轉化植物中的ICK表達載體中的功能表達0RF，其包含編 碼ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA或鑑於本文公開的教導內容可由本領域技術人 員製備的核苷酸。一種產生具有或表達ERSP、ICK基序蛋白、LINKER和/或STA的轉化植 物的方法。一種由本文所述的任何產品和處置方法產生的植物。
[0153] 一種包含與多個抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白結構域有效連接的內質網 信號肽（ERSP)的蛋白質，所述抑制物胱氨酸結基序蛋白結構域被有效連接與間插接 頭肽有效連接的翻譯穩定性蛋白（STA)的間插接頭肽（LINKER)有效連接，其命名為 ERSP-STA-(LINKERi-ICKj) N 或 ERSP-(ICKj-LINKERi)N-STA,有時為 ERSP-STA-(Li-ICKj) N或ERSP-(ICK j-Li)irSTA,其中所述ERSP是所述蛋白質的N端，所述STA可位於多個ICK 基序蛋白結構域（(LINKERi-ICW)的N端一側（上遊）或多個ICK基序蛋白結構域 ((ICKj-LINKERi) N)的C端一側（下遊），所述多個間插肽（LINKERi)介於STA和多個ICK基 序蛋白結構域之間和介於多個ICK基序蛋白結構域中的ICK基序蛋白之間。一種命名為 ERSP-STA-(LINKERi-ICKj)N 或 ERSP-(ICKj-LINKERi)irSTA 的蛋白質，其包含本文所述 ERSP、 ICK基序蛋白、間插接頭膚和翻譯穩定性蛋白的任一種。
[0154] 一種編碼所述作為內質網信號肽（ERSP)、多個抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白結 構域、間插接頭肽（LINKER)和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的任何肽的核苷酸和編碼用於產 生轉基因植物的這些蛋白質的任一種的任何和所有核苷酸。
[0155] 所述肽或編碼內質網信號肽（ERSP)、多個抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白結構 域、間插接頭肽（LINKER)和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸的任一種在製備或轉化植 物或植物基因組從而在轉化植物中表達正確摺疊的毒肽中的用途。所述肽或編碼內質網信 號肽（ERSP)、多個抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白結構域、間插接頭肽（LINKER)和/或翻 譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸的任一種在製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化植物 中表達正確摺疊的毒肽並使已表達的和正確摺疊的毒肽在所述植物中蓄積並使植物對蟲 害的抗性提高中的用途。
[0156] 一種使用編碼內質網信號肽（ERSP)、多個抑制物胱氨酸結（ICK)基序蛋白結構 域、間插接頭肽（LINKER)和/或翻譯穩定性蛋白（STA)的核苷酸或表達ORF以產生轉基因 植物的方法。一種表達0RF，其包含表達ERSP、多個ICK基序蛋白結構域、L或LINKER和/ 或STA的任何核苷酸。一種摻入轉化植物中的功能表達0RF，其包含編碼ERSP、多個ICK基 序蛋白結構域、LINKER和/或STA或鑑於本文公開的教導內容可由本領域技術人員製備的 核苷酸。一種產生具有或表達ERSP、多個ICK基序蛋白結構域、LINKER和/或STA的轉化 植物的方法。一種由本文所述的任何產品和處置方法產生的植物。
[0157] 一種嵌合基因，其包含與本文所述核苷酸的核酸或表達ORF有效連接的在植物中 有活性的啟動子。一種製備、生產或使用本文中描述的這些嵌合基因的方法。一種包含本 文所述嵌合基因的重組載體。一種製備、生產或使用本文所述重組載體的方法。一種包含 本文所述嵌合基因的轉基因宿主細胞。一種製備、生產或使用本文所轉基因宿主細胞的方 法。一種本文所述的轉基因宿主細胞，其是轉基因植物細胞。一種製備、生產或使用本文所 述的轉基因植物細胞的方法。一種包含本文所述的轉基因植物細胞的轉基因植物。一種制 備、生產或使用本文所述轉基因植物的方法。一種本文所述的轉基因植物，其由玉米、大豆、 棉、稻、小麥、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、馬鈴薯、番茄、菸草、任何綠葉蔬菜或任何果樹製備。 一種得自本文所述轉基因植物的種子，其中所述種子包含本文所述嵌合基因。一種製備、生 產或使用本文所述轉基因植物的方法。一種製備、生產或使用本文所述種子的方法。
[0158] 文獻描述了來自蝴蛛和蠍的植物表達的抑制半胱氨酸結（ICK)基序蛋白（Khan 等，Transgenic Res. , 2006,15 :349-357 ;Hern<5ndez-Campuzano 等，Toxicon. 2009 年 I 月；53(1): 122-8)。我們描述了如何製備有活性的並且在植物中蓄積至殺蟲劑量水平的植 物表達的ICK基序蛋白。我們表明植物表達的ICK基序蛋白的之前的描述實際上是已喪失 其天然毒性的無活性蛋白質的描述。我們描述了提高植物表達的效能、增加植物表達的蛋 白質的蓄積和顯著提高植物表達的蛋白質的殺蟲活性的方法。我們描述了如何由植物細胞 中的內質網信號轉導蛋白（ERSP)指導將植物表達的ICK基序蛋白引導進入內質網（ER)， 以便正確共價交聯殺蟲活性所需的基本三級ICK基序結構的肽二硫橋。我們還描述了植物 表達的ER運輸性含加入的翻譯穩定性蛋白結構域（STA)的ICK基序蛋白複合物以增加所 得ICK融合蛋白的大小，所述ICK融合蛋白促進肽在植物中蓄積。我們還描述了植物表達 的ER運輸性含上述加入的翻譯穩定性蛋白和含加入的間插接頭肽（LINKER)的ICK基序蛋 白，所述間插接頭肽允許潛在切割和回收具有殺蟲活性的ICK基序蛋白的活性形式。我們 還描述了植物表達的多肽，其含有ER運輸性的含被間插接頭肽（LINKER)分隔的多個ICK 基序蛋白、含加入的間插接頭肽、含加入的翻譯穩定性蛋白的ICK基序蛋白結構域，所述翻 譯穩定性蛋白允許正確摺疊的ICK基序蛋白在植物中蓄積至殺蟲劑量。
[0159] 本發明描述了是植物表達的並可成功保護植物或作物免遭蟲害的具有殺蟲活性 的ICK基序蛋白。本文所述ICK基序蛋白表達ORF是這樣的核苷酸，其使植物翻譯的肽不 僅能夠在植物中表達，而且能夠正確表達並摺疊，而且在植物中蓄積至殺蟲劑量。蛋白質表 達ORF的一個實例可以是按以下等式形式描述和在附圖或圖表中的示圖形式表示的ICK基 序蛋白表達ORF。
[0160] (茲義N，或 (CriZT7-茲義 上述表達式只是一個實例，對於其它類型的CRIP表達ORF可寫出類似表達式，例如ICK 表達ORF可寫作： ersp-sta-{接頭 fickSw^ersp-ijckj-接頭）N_sta 這些表達式、等式或線性示圖描述了一種類型的CRIP的多核苷酸開放閱讀框 (ORF)，其是表達ICK基序蛋白複合物的一種，可寫作ERSP-STA- (LINKER1-ICig N或 ERSP- (ICK廠LINKER1) N-STA，或 ERSP-STA- (L1-ICK1) N 或 ERSP- (ICK1-L1) N-STA，含有用短劃線 符號將各個組分間隔開的4種可能的肽組分。在上圖中，#5/7的核苷酸組分是編碼植物內 質網運輸信號肽（ERSP)的多核苷酸區段。的組分是編碼翻譯穩定性蛋白（STA)的多核 昔酸區段，其有助於表達的ICK基序蛋白在植物中畜積但可能不是ICK基序蛋白表達ORF 必需的。茲矣i的組分是編碼使ICK基序蛋白彼此間隔和與翻譯穩定性蛋白間隔開來的間 插接頭肽（L或LINKER)的多核苷酸區段，下標"i"表示不同類型的接頭肽可用於CRIP或 ICK基序蛋白表達0RF。在Sia不用於ICK基序蛋白表達ORF的情況下，可不用接頭 與編碼ICK基序蛋白的多核苷酸直接連接。的組分是編碼ICK基序蛋白（ICK)的多核 苷酸區段，下標"j"表示不同的ICK基序蛋白；（茲矣i-icW"表示編碼間插接頭肽和ICK 基序蛋白的核苷酸結構可在相同的ICK基序蛋白表達ORF的同一可讀框中重複"N"次，其 中N可以是1-10的任何整數。N可為1-10,具體地講N可為1、2、3、4或5,而在一些實施方 案中，N為6、7、8、9或10。重複序列可含有編碼不同間插接頭（LINKER)和不同ICK基序蛋 白的多核苷酸區段。包括在相同ICK基序蛋白表達ORF內的重複序列的不同多核苷酸區段 全在同一翻譯框內。
[0161] 如ICK基序蛋白表達ORF示圖中的4種主要組分茲關和cri/7或?的 任何組合，可用來產生PEP型ICK基序蛋白表達0RF，只要使用最小量的從沙和至少1拷貝 StJ crip WLick0
[0162] I. PEPs的ERSP或從沙組分。
[0163] ICK基序蛋白表達ORF始於其5'端的er577。對於正確摺疊和有功能的ICK基序 蛋白，當它從轉基因植物表達時，它必須具有與編碼ICK基序蛋白的多核苷酸在框中融合 的從沙核苷酸。在細胞翻譯過程中，翻譯的ERSP可通過與稱為信號識別顆粒的細胞組分 結合，指導正翻譯的ICK基序蛋白插入植物細胞的內質網（ER)中。在ER內，ERSP肽被信 號肽酶切割，ICK基序蛋白被釋放到ER中，其中ICK基序蛋白在翻譯後修飾過程中正確折 疊，例如形成二硫鍵。在沒有任何其它的保留蛋白質信號的情況下，該蛋白質通過ER轉運 到高爾基體，在此被最終分泌到質膜以外並進入質外體空間。ICK基序蛋白可在質外體空間 蓄積以有效達到在植物中的殺蟲劑量。圖1表示由與ICK基序功能性連接的ERSP組成的 簡單的兩種組分肽或核苷酸的代表性示圖。ICK可以是合適的CRIP。使用ERSP的更複雜 的蛋白質和多核苷酸見圖2-5,將在STA或翻譯穩定性蛋白的闡述中進一步討論這些圖。
[0164] ERSP肽位於植物翻譯的ICK基序蛋白複合物的N端區，且ERSP部分由大約3-60個 胺基酸組成。在一些實施方案，為5-50個胺基酸。在一些實施方案，為10-40個胺基酸，但 最通常由15-20、20-25或25-30個胺基酸組成。ERSP是所謂的信號肽，因為它指導蛋白質 的轉運。信號肽也可稱為引導信號、信號序列、轉運肽或定位信號。用於ER運輸的信號肽的 長度常常為15-30個胺基酸殘基，具有由兩側接帶正電荷的氨基端和極性但不帶電荷的羧 基端區域的疏水殘基的核心組成的三聯組構。（Zimmermann等，"Protein translocation across the ER membrane (跨 ER膜的蛋白質轉移）"，ei Jcia, 2011, 1808: 912-924)。
[0165] 許多ERSP是已知的。許多植物ERSP是已知的。ERSP來源於植物ERSP不是必須 的，非植物ERSP將按本文所述方法運作。然而，許多植物ERSP是眾所周知的，在此，我們描 述了一些植物來源的ERSP。例如，BAAS來源於植物大麥（/Yorifews ra&are)，並具有如下 的胺基酸序列： MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4) 植物ERSP，其選自已知表達並釋放進入植物質外體空間的蛋白質的基因組序列，少數 實例為BAAS、胡蘿蔔伸展蛋白、菸草PR1。下列參考文獻提供更多描述，並通過引用以其整 體結合到本文中。De Loose, M.等，"The extensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein from protoplasts (伸展蛋白信號肽允許異源蛋白質從 原生質體中分泌）" 99 (1991) 95-100。De Loose，Μ.等人描述了來自皺葉菸草 (/Vico )的伸展蛋白編碼基因的結構分析，其序列含有用於蛋白 質易位到內質網的典型信號肽。Chen, M.H.等 "Signal peptide-dependent targeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids and extracellular compartments of plant cells (稻α澱粉酶和貨物蛋白質的信號肽依賴性引導至植物細 胞的質體和胞外區室）"2004年7月；135(3): 1367-77.電子出版 物2004年7月2日。Chen，Μ. H.等人通過分析轉基因菸草中在有或沒有其信號肽的情況 下a-澱粉酶的表達，研究了 a-澱粉酶在植物細胞中的亞細胞定位。這些參考文獻和其 它文獻教導和公開了可用於本文描述的方法、程序及肽、蛋白質和核苷酸複合物和構建體 的信號肽。
[0166] II. PEPs的CRIP和ICK基序蛋白組分或crip和?。
[0167] 在我們的ICK基序蛋白表達ORF圖中，"id"意指編碼"ICK基序蛋白"或"抑制 物胱氨酸結基序蛋白"的多核苷酸，其為16-60個胺基酸肽，具有含3個二硫橋的至少6個 半-胱氨酸核心胺基酸，其中3個二硫橋是共價鍵，6個半-胱氨酸殘基中共價二硫鍵介 於自N端胺基酸開始的6個核心半-胱氨酸胺基酸的第一和第四、第二和第五及第三和第 六個半-胱氨酸之間。ICK基序蛋白還包含β-髮夾二級結構，通常由位於基序的第四和 第六核心半-胱氨酸間的殘基組成，髮夾通過由基序的3個二硫鍵提供的結構交聯而被穩 定。注意其它的半胱氨酸/半胱氨酸或半-胱氨酸胺基酸可存在於抑制物半胱氨酸結基 序中，如圖6所示。CRIP或ICK基序可以重複以增加毒肽在植物中的蓄積。參見圖4和圖 5。重複CRIP或ICK基序1-10次、有時高達15、20或25次的這種能力還見於本文描述為 (茲關 i-icAj) Ν 或 (icl.-茲關 的 CRIP 或 ICK 蛋白質表達 ORF 的等 式樣示圖中，其中通過下標數值N給出重複LINKER-ICK基序的數目，且N通常為1-10,但在 一些植物中甚至可以達到更高。
[0168] 可寫出類似的表達式像(貧關i-icij) N或-貧關, 並可描述其它CRIP肽。在該部分中，一種表達ORF的實例是用來增加植物中的肽表達 的表達0RF，並以ICK蛋白為最佳實例。在上圖中，使用含有4個可能的肽組分（各組分 用短劃線符號分隔）的表達ICK基序蛋白複合物的多核苷酸可讀框（0RF)，其可描述為 Ersp-Sta-(Linkeri-Ickj)n 或 Ersp-(Ickj-Linkeri)n-Sta,或為 Ersp-STA-(Li-Ickj)n 或 Ersp-(ICKt-Li)n-STAc顯示這種類型的構建體的替代方法可見圖中。在示圖和附圖中， 的核苷酸組分是編碼植物內質網運輸信號肽（ERSP)的多核苷酸區段。的組分是編碼 翻譯穩定性蛋白（STA)的多核苷酸區段，其有助於表達的ICK基序蛋白在植物中蓄積但可 能不是ICK基序蛋白表達ORF必需的。Λ的組分是編碼將ICK基序蛋白彼此分隔和與翻譯 穩定性蛋白分隔開來的間插接頭肽（L或LINKER)的多核苷酸區段，下標"i"表示不同類型 的接頭膚可用於ICK基序蛋白表達0RF。在不用於ICK基序蛋白表達ORF的情況下， #5/7可不用接頭與編碼ICK基序蛋白的多核苷酸直接連接。i味的組分是編碼ICK基序 蛋白（ICK)的多核苷酸區段，下標"j"表示不同的ICK基序蛋白；（茲矣i-icW"表示編碼 間插接頭膚和ICK基序蛋白的核昔酸結構可在相同的ICK基序蛋白表達ORF的同一可讀框 中重複"N"次，其中N可以是1-10的任何整數，但可以變得甚至更高至15、20和25,這些重 復序列可含有編碼不同間插接頭和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸區段。在相同ICK 或CRIP基序蛋白表達ORF內包括重複序列的不同的多核苷酸區段全都在同一翻譯框內。
[0169] 該基序在自許多物種的毒液中分離的肽中是共有的。無脊椎動物物種包括蜘蛛、 蠍、芋螺（cone snail)、海葵等，其它實例有很多，已知甚至蛇毒液都具有含ICK基序的肽。 我們使用的蜘蛛中的一個實例是來自澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛的一類ACTX肽，但是 本文所述程序是有用的，可應用於含ICK基序的任何蛋白質。
[0170] 含ICK基序的肽毒素的實例可見於下列參考文獻。Lew，M. J.等人 ("Structure-Function Relationships of ω-Conotoxin GVIA (ω-食魚螺毒素 GVIA 的結構-功能關係）" /oaraa/ o/ 第 272 卷，第 18 期，5月2日發行，第12014-12023頁，1997)回顧了 N型鈣通道阻斷劑ω-食魚螺 毒素。Quintero-Hernandez，V.等人（"Scorpion and Spider Venom Peptides: Gene Cloning and Peptide Expression (蠍和蝴蛛毒液肽：基因克隆和肽表達）" Tb^rico/?， 58，第644-663頁，2011)回顧了來自不同蜘蛛和蠍品種的許多節肢動物毒肽的概要。 在 Takahashi, H.等· "Solution structure of hanatoxinl, a gating modifier of voltage-dependent K+ channels: common surface features of gating modifier toxins (電壓依賴性K+通道的門控調節劑hanatoxinl的溶液結構：門控調節劑毒素的一般表面 特徵）" /otfraa/ o/ 第 297 卷，第 3 期，2000 年 3 月 31 日，第 771-780頁中，使用NMR光譜法，將Hanatoxinl的三維結構鑑定為抑制物半胱氨酸結基序。 Zhu, S.等· "Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides (抑制物胱 氨酸結肽的進化起源）/·，2003年9月17日，（12):1765-7,電子出版物2003 年7月3日發表了編碼蠍毒液ICK毒素肽Opicalcinel的cDNA的分離和鑑定。Dauplais, M.等人（"On the convergent evolution of animal toxins (有關動物毒素的趨同 潘:D'' Journal of Biological Chemistry. 1997 年 2 月 14 日；272 (7) : 4302-9)公 開了來自海葵及gra/w/i/era的K+通道阻斷性毒素 BgK的序列特異性排布和 二級結構鑑定° Escoubas, P.等人（"Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins (蝴蛛毒液神經毒素的結構和藥理學）" 第82卷，第9 - 10期， 2000年9月10日，第893-907頁）發表了強調表明半胱氨酸橋、半胱氨酸結形成和"成 結型（knotting-type) "摺疊的多肽毒素結構、作用方式和分子進化的蜘蛛毒液的組成和 藥理學的綜述。Galvez, A.等人（"Purification and characterization of a unique, potent, peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channel from venom of the scorpion Buthus tamulus (來自蠍Buthus tamulus毒液的 高傳導性鈣激活的鉀通道的獨特有效的肽基探針的純化和表徵） 1990 年 7 月 5 日；265 (19) : 11083-90)公開了純化的膚 iberiotoxin，一種 來自蠍（及毒液的Ca2+激活的K+通道的抑制劑。Gimenez-Gallego, G.等 人（"Purification, sequence, and model structure of charybdotoxin, a potent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels ( 一種?丐激活的鉀 通道的有效選擇性抑制劑卡律蠍毒素的純化、序列和模型結構）" /7TOC 1988年5月；85(10): 3329 - 3333)公開了純化的肽卡律蠍毒素，一種來自蠍Zeiwrw1S 的毒液的Ca2+激活的K+通道的抑制劑。根據這些和其它出版物，本領域 的技術人員應能夠容易地鑑定具有我們描述為ICK基序、ICK基序蛋白或"抑制物胱氨酸結 基序"的蛋白質和膚。
[0171] ICK基序蛋白可以是具有ICK基序且長度介於16和60個胺基酸之間的任何蛋白 質，其具有產生正確順序的共價交聯二硫鍵的至少6個半胱氨酸殘基。參見圖6。一些ICK 基序肽的長度介於26-60個胺基酸之間。一些ICK基序蛋白的長度介於16-48個胺基酸 之間。一些ICK基序蛋白的長度介於26-48個胺基酸之間。一些ICK基序蛋白的長度介 於30-44個胺基酸之間。具有天然殺蟲活性的ICK基序蛋白是優選的，但是具有其它類型 的活性（例如耐鹽性和耐霜性）的ICK基序蛋白是本領域技術人員已知的和本文要求保護 的。殺蟲ICK基序蛋白的實例包括ACTX肽和基因，並包括所有的肽及其稱為Magi6的編碼 基因。
[0172] 如下圖不的蛋白質表達ORF的Iv實例可以是ICK基序蛋白表達ORF : ersp-sta-{接頭「ick^^^ersp-ijckj-接頭 h N-sta 對於其它CRIP肽，可寫出類似的表達式。在該部分中，表達ORF的這個實例是用於高 肽表達的表達0RF，並以ICK蛋白為最佳實例。上圖為表達ICK基序蛋白複合物的多核苷 酸可讀框（ORF)，所述複合物可描述為 ERSP-STA- (LINKER1-ICig N 或 ERSP- (IcK1-LINKERi) n-STA，或 ErSP-STA-(Li-ICK1)n 或 ErSP-(ICK1-Li)n-STA,含有 4 種可能的肽組分，各組分用 短劃線符號分隔。在該圖中，#5/7的核苷酸組分是編碼植物內質網運輸信號肽（ERSP)的 多核苷酸區段。的組分是編碼翻譯穩定性蛋白（STA)的多核苷酸區段，其有助於表達的 ICK基序蛋白在植物中蓄積但可能不是ICK基序蛋白表達ORF必需的。A的組分是編碼將 ICK基序蛋白彼此分隔和與翻譯穩定性蛋白分隔開來的間插接頭肽（L或LINKER)的多核苷 酸區段，下標"i"表示不同類型的接頭肽可用於ICK基序蛋白表達0RF。在不用於ICK 基序蛋白表達ORF的情況下，#5/7可不用接頭與編碼ICK基序蛋白的多核苷酸直接連接。 的組分是編碼ICK基序蛋白（ICK)的多核苷酸區段，下標"j"表示不同的ICK基序蛋 白；（茲矣i-icW"表示編碼間插接頭肽和ICK基序蛋白的核苷酸結構可在相同的ICK基 序蛋白表達ORF的同一可讀框中重複"N"次，其中N可以是1-10的任何整數，且重複序列可 含有編碼不同間插接頭和不同ICK或CRIP基序蛋白的多核苷酸區段。在相同ICK或CRIP 基序蛋白表達ORF內包括重複序列的不同的多核苷酸區段全都在同一翻譯框內。
[0173] 殺蟲ICK基序蛋白的實例包括ACTX肽和基因，並包括上文和本文提供的參考文獻 中描述的所有肽及其編碼基因。所公開的用於提供實例的目的並且無意以任何方式限制 的ICK基序蛋白和肽的具體實例，是上述肽及其同源物，特別是來源於澳大利亞漏鬥網蜘 蛛毒液的肽和核苷酸。下列美國的文件通過引用以其整體予以結合，是本領域技術人員已 知的，並且全已發表。它們公開了許多ICK基序蛋白，其完整肽序列、其完整核苷酸序列已 明確公開，並通過引用予以結合，此外完整的公開內容（包括其所有序列表）均通過引用予 以結合。參見以下文獻：2008年4月8日授予專利權的US 7,354,993 B2,具體地說來自 7, 354, 993 B2的作為序列1-39列於其中的肽和核苷酸序列，和名為U-ACTX多肽的那些、 可形成2-4個鏈內二硫橋的這些和其它毒素及其變體，以及7, 354, 993 B2的第4-9列和圖 2中出現的肽。其它具體的序列可見於2008年10月8日公布和授予專利權的歐洲專利1 812 464 B1，參見Bulletin 2008/41，具體地說，序列表列出的肽和核苷酸序列，和可形成 2-4個鏈內二硫橋的那些其它毒素，和其中以1-39列出的那些序列，和名為U-ACTX多肽的 序列及其變體，以及歐洲專利1 812 464 Bl的段落0023-0055中出現的和圖1中出現的肽。
[0174] 參照本文鑑定的肽描述和予以結合的是所提及的序列的同源變體，與本文提及的 這樣的序列具有同源性，其按照本文所述處置方法也被鑑定為適於特別製備並要求保護， 包括與本文公開的任何序列或與通過引用結合的任何序列具有至少任何下列百分比同一 性的全部同源序列：與上述專利鑑定的任何和所有序列、與本文鑑定的任何其它序列（包 括本申請序列表中的每一個序列）有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%或99%或更大的同一性或100%同一性。當本文以數值（例如50%或更大）使用術 語同源或同源性時，則意味著是兩個肽之間的百分比同一性或百分比相似性。當不用數字 百分比使用同源或同源性時，則是指在進化或發育方面密切相關的兩個肽序列，因為它們 有共同的生理和功能方面，像局部毒性和類似的大小（即同源物在本文明確提及的或通過 本文的上述參考文獻鑑定的肽的長100%的長度或短50%的長度內）。
[0175] 通過參照本文鑑定的肽描述和予以結合包括以下的毒肽：存在於、分離自或來源 於以下蝴蛛的肽及其變體：澳毒蝴蛛屬或屬，包括屬種rersWia或 布魯山脈漏鬥網蝴蛛、Jtrax ro/wsiiAs、Jirax /brffiit/aAi/is、Jirax ;包括稱為 U-ACTX多肽、U-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvlb的毒素或突變體或變體，尤其這 些類型任一種的肽和尤其小於約200個胺基酸但大於約10個胺基酸的肽，和尤其小於約 150個胺基酸但大於約20個胺基酸的肽，尤其小於約100個胺基酸但大於約25胺基酸的 肽，尤其小於約65胺基酸但大於約25胺基酸的肽，尤其小於約55胺基酸但大於約25氨基 酸的肽，尤其約37或39或約36-42個胺基酸的肽，尤其具有小於約55個胺基酸但大於約 25個胺基酸的肽，尤其具有小於約45個胺基酸但大於約35個胺基酸的肽，尤其具有小於約 115個胺基酸但大於約75個胺基酸的肽，尤其具有小於約105個胺基酸但大於約85個氨基 酸的肽，尤其具有小於約100個胺基酸但大於約90個胺基酸的肽，包括可形成2、3和/或 4個或更多個鏈內二硫橋的本文提及的任何長度的肽毒素，包括破壞鈣通道電流的毒素、包 括破壞鉀通道電流的毒素、尤其破壞昆蟲I丐通道或其Us的毒素、尤其任何這些類型的毒素 或其變體，和具有口服或局部殺蟲活性、可通過本文所述處置方法特別製備的本文所述任 何類型的毒素的任何組合。
[0176] 來自澳大利亞漏鬥網蜘蛛澳毒蜘蛛屬和你屬的U肽當通過本發明所述 方法、程序或處置方法處理時特別適宜且運作良好。本文提供這類所測試並具有數據的合 適肽的實例。還明確已知下列物種攜帶通過本發明的處置方法適於植物表達成為PIPs的 毒膚。下列物種具體命名為：ro/wsiiAs、 rersWia。來源於上列任何屬和/或屬種和與U肽同源 的任何毒肽適於按照本發明的處置方法植物表達成為PIPS。
[0177] 本說明書中的實例無意且不應用來限制本發明，它們僅供說明本發明。
[0178] 如上所述，許多肽是作為用於植物表達成為PIP的處置方法主題的合適候選物。 上文、下文和序列表中所述序列是可在植物中作為PIP表達的特別合適的肽，且這些肽中 的一些已經作為本發明的PIP在植物中表達，其結果見下列實例。
[0179] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A (SEQ ID NO. 5) 名為"U+2-ACTX-Hvla"，在5-20、12-25、19-39位上具有二硫橋。分子量為4564. 85道 爾頓。ICK基序殺蟲蛋白的另一個實例： QYCVP VDQPC SLNTQ PCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA (SEQ ID NO: 6) 名為"U-ACTX-Hvla"，在3-18、10-23、17-37位上具有二硫橋。分子量為4426. 84道爾 頓。
[0180] 其它實例包括序列表中的許多序列。
[0181] III.翻譯穩定性蛋白組分STA或Wa。
[0182] ICK基序蛋白表達ORF之一 ERSP-ICK，足以在轉化植物中表達正確摺疊的ICK基 序肽，但為了有效地保護植物免遭害蟲損害，植物表達的ICK基序蛋白必須蓄積到殺蟲水 平。隨著正確構建的ICK基序蛋白表達ORF的轉化，轉基因植物可表達並蓄積更大量的正 確摺疊的ICK基序蛋白。當植物蓄積更大量的正確摺疊的毒肽時，可更容易地對抗或殺死 攻擊和攝食植物的昆蟲。翻譯穩定性蛋白可用來顯著增加毒肽在植物中的蓄積，因此提高 PIP的效能（尤其當PIP具有自身的翻譯穩定性蛋白時）。參見圖2-5中和下文所用各種 線性示圖或等式樣表達式中STA如何可用於表達ORF的各種表述。翻譯穩定性蛋白可為另 一種蛋白質的結構域或可包含完整的蛋白質序列。翻譯穩定性蛋白是一種具有充足三級結 構的蛋白質，它可在細胞中蓄積而又不會成為蛋白質降解的細胞過程的目標。蛋白質可介 於5和50aa之間（例如另一種ICK基序蛋白）、50-250aa (GNA)、250-750aa (例如幾丁質 酶）和750-1500aa (例如增強蛋白）。
[0183] 除圖2-5以外，下面的線性示圖描述了編碼與ICK基序蛋白融合的穩定性蛋白的 ICK基序蛋白表達ORF的一個實例： ersp s ta -I ~i ck 該蛋白質或蛋白質結構域可含有除翻譯穩定以外沒有有用特性的蛋白質，或它們可具 有除翻譯穩定以外的其它有用特性。有用特性可包括：另外的殺蟲活性，例如對圍食膜是破 壞性的活性、對腸壁是破壞性的活性和/或主動將ICK基序蛋白跨過腸壁轉運的活性。翻 譯穩定性蛋白的一個實施方案可以是包括ICK基序蛋白的融合蛋白的聚合物。本文提供翻 譯穩定性蛋白的一個具體實例以說明翻譯穩定性蛋白的用途。該實例無意以任何方式限制 本公開內容或權利要求書。有用的翻譯穩定性蛋白是本領域眾所周知的，如本文所公開的， 可以使用這種類型的任何蛋白質。評價和測試肽產生的程序均是本領域已知的，並且在本 文中予以描述。一種翻譯穩定性蛋白的一個實例是SEQ ID NO: 7, 一字母代碼如下： ASKGE ELFTG VVPIL VELDG DVNGH KFSVS GEGEG DATYG KLTLK FICTT GKLPV PffPTL VTTFS YGVQC FSRYP DHMKR HDFFK SAMPE GYVQE RTISF KDDGN YKTRA EVKFE ⑶TLV NRIEL KGIDF KEDGN ILGHK LEYNY NSHNV YITAD KQKNG IKANF KIRHN IEDGS VQLAD HYQQN TPI⑶ GPVLL PDNHY LSTQS ALSKD PNEKR DHMVL LEFVT AAGIT HGMDE LYK (SEQ ID NO: 7)。名為 "GFP"。 分子量為26736. 02道爾頓。
[0184] 在一些實施方案中，STA甚至可以是CRIP或ICK，如圖5所示。在這些實施方案中， 沒有單獨的STA蛋白，STA蛋白與所用的CRIP或ICK相同。可以是同一個ICK與LINKER 結合，或可能有不同的ICK，一種類型與LINKER結合，另一種類型起STA的作用。在LINKER 部分還論述了這些替代的排布。
[0185] 翻譯穩定性蛋白的其它實例可見於下列參考文獻，通過引用以其整體予以結 合：Kramer, K. J.等· "Sequence of a cDNA and expression of the gene encoding epidermal and gut chitinases of Manduca sexta (編碼Manduca Sezia 表皮和腸幾 丁質酶的基因的 cDNA 序列和表達）" /aseci SiocAeffii1Stry aflt/ifo/ecw/ar 第23卷，第6期，1993年9月，第691-701頁。Kramer，K.J.等人從菸草天蛾幼蟲 ifeflt/wca Sezia 中分離出幾丁質酶編碼 cDNA 並測序。Hashimoto, Y.等."Location and nucleotide sequence of the gene encoding the viral enhancing factor of the /?i granulosis virus (編碼粉紋夜蛾顆粒體病病毒的病毒增強因子的基 因的定位和核昔酸序列）" o/ （1991)，72，2645-2651。 Hashimoto, Y.等人克隆了編碼粉紋夜蛾/?i)顆粒體病病毒的病毒增強因 子的基因並測定了完整的核苷酸序列。Van Damme, E.J.M.等· "Biosynthesis, primary structure and molecular cloning of snowdrop {Gal an thus nivalis L.) lectin (雪 花蓮/?i ra7i5· L.)凝集素的生物合成、一級結構和分子克隆）" /oaraa/ o/202，23-30 (1991)。Van Damme，E.J.M.等人從成熟子房中 分離出雪花蓮凝集素（GNA)的富含Poly (A)的RNA，當在無麥胚細胞系統中翻譯時產生單一 的17-kDa凝集素多肽，稱為凝集素（agglutin)。這些參考文獻和其它文獻教導和公開了可 用於本文描述的方法、程序及肽、蛋白質和核苷酸複合物和構建體的翻譯穩定性蛋白。
[0186] IV. PEPs的間插接頭肽組分LINKER、接頭、L或如果為多核苷酸:茲矣或/ 本發明所述的ICK基序蛋白表達ORF還在編碼ICK基序蛋白（id)和翻譯穩定性蛋白 Gte)的多核苷酸序列之間，或在編碼多個ICK基序蛋白結構域的多核苷酸序列 或之間（如果表達ORF包括多個ICK基序蛋白結構域表達）摻入了編碼間插接 頭肽的多核苷酸序列。間插接頭肽（LINKERS)將表達的ICK基序蛋白複合物分隔成不同的 部分，有助於在表達過程期間複合物的不同部分的正確摺疊。在表達的ICK基序蛋白複合 物中，不同的間插接頭肽可涉及隔開不同的功能結構域。具有LINKER的蛋白質的各種表述 見（圖3-5)。LINKER與CRIP (例如ICK)連接，並且該二價體類型（bivalent group)可 重複至多10次（N=I-IO)，可能甚至超過10次，以利於正確摺疊的殺蟲肽在被保護的植物中 蓄積。
[0187] 間插接頭肽的長度通常介於1和30個胺基酸之間。在植物中在表達的ICK基序 蛋白複合物中它不是必需的基本組分。可將可切割的接頭肽設計到ICK基序蛋白表達ORF 中，以在轉化的植物中從表達的ICK基序蛋白複合物中釋放正確摺疊的ICK基序蛋白，來 改進ICK基序蛋白對植物保護免遭蟲害。間插接頭肽的一種類型是植物可切割的接頭肽。 在植物細胞中在翻譯後表達過程中，這種類型的接頭膚可從表達的ICK基序蛋白表達複合 物中完全去除。因此，通過這種類型的間插接頭肽連接的正確摺疊的ICK基序蛋白可在翻 譯後表達過程期間，在植物細胞中從表達的ICK基序蛋白複合物中釋放。在此我們顯示了 LINKER的許多實例。
[0188] 可切割的間插接頭肽的另一種類型在植物中在表達過程中是不可切割的。然而， 它具有對絲氨酸、蘇氨酸、光胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶有特異性的蛋白酶切割 位點。該類型的可切割接頭肽被存在於昆蟲和鱗翅類腸環境和/或昆蟲血淋巴和鱗翅類血 淋巴環境中的蛋白酶消化，以將ICK基序蛋白釋放到昆蟲腸或血淋巴中。在此我們顯示了 LINKER的許多實例。這些接頭只作為實例提供，並不應視為限制本發明。利用本公開內容 所教導的信息，對於本領域的技術人員而言，製備或發現可用於本發明的LINKER的其它實 例應是一個常規事件。
[0189] 說明本發明的間插接頭的可切割類型的一個實例列於SEQ ID NO: 1中，但是可 切割接頭不限於該實例。SEQ ID NO: 1 (-字母代碼）為IGER，在本文我們將其命名為 "IGER"。該間插接頭或LINKER的分子量為473. 53道爾頓。
[0190] 間插接頭肽（LINKER)還可以是沒有任何類型的蛋白酶切割位點的間插接頭，即 不可切割的間插接頭肽。其一個實例為接頭ETMFKHGL (SEQ ID NO. 3)。
[0191] 間插接頭肽的其它實例可見於下列參考文獻，其通過引用以其整體予以結合：在 Heath 等· "Characterization of the protease processing sites in a multidomain proteinase inhibitor precursor from Nicotiana alata (來白 TVYcotfafla alata ^ 多結構域蛋白水解酶抑制物前體中蛋白酶加工位點的表徵）" European Journal of Biochemistry, 1995; 230: 250-257中發現植物表達的絲氨酸蛋白水解酶抑制物前體含 有被6個相同接頭肽分隔的5種同源的蛋白質抑制物。在Chang, H. C.等."De novo folding of GFP fusion proteins: high efficiency in eukaryotes but not in bacteria (GFP融合蛋白的從頭摺疊：在真核生物但非細菌中高效率）" /oaraW 〇/ ifohcWar 沿〇/〇燈，2005年10月21日；353(2): 397-409中，探索了綠色螢光蛋白通過6種不同 接頭的摺疊行為的比較。在 Daskalova, S.M.等人"Engineering of N. benthamiana L. plants for production of N-acetylgalactosamine-glycosylated proteins (用 於產生N-乙醯半乳糖胺糖基化蛋白質的N. benthamiana L.植物的工程改造）" 沒2010 年 8 月 24 日；10: 62 中表明人GalNAc-Ts 家族的同種型 GalNAc-T2 在Λ 植物中表達時保持其定位和功能性。在Kwok, E. Y.等."GFP-labelled Rubisco and aspartate aminotransferase are present in plastid stromules and traffic between plastids (GFP標記的核酮糖二磷酸羧化酶一加氧酶和天冬氨酸氨基轉 移酶存在於質體基質填充小管中並在質體間運輸）" 2004年3月；55(397) : 595-604.電子出版物2004年1月30日中，表明了內源質 體蛋白質通過基質填充小管移動的能力。Borovsky, D.等人"Expression of Aedes trypsin-modulating oostatic factor on the virion of TMV: A potential larvicide (TMV病毒體中伊蚊胰蛋白酶-調節抑卵因子的表達：潛在的殺幼蟲劑）他以Jcai/ 2006年12月12日；103(50): 18963 - 18968提交了有關用蚊十肽激素胰蛋白酶-調 節抑卵因子（TMOF)對菸草花葉病毒（TMV)病毒體表面的工程改造的報告。這些參考文獻 和其它文獻教導和公開了可用於本文描述的方法、程序及肽、蛋白質和核苷酸複合物和構 建體的間插接頭。
[0192] 上述ICK基序蛋白表達ORF可瞬時或穩定地克隆到任何植物表達載體中用於植物 中的ICK基序蛋白表達。
[0193] 瞬時植物表達系統 對於植物中的一些特殊ICK基序蛋白表達，瞬時植物表達系統可用來迅速優化ICK基 序蛋白表達ORF的結構，包括一些組分的必要性，一些組分的密碼子優化，各組分的順序的 優化等。瞬時植物表達載體常常來源於植物病毒基因組。由於植物病毒的感染性質所致， 植物病毒載體在植物中提供快速和高水平的外源基因表達的優勢。全長的植物病毒基因組 可用作載體，但常常剔除病毒組分，例如外被蛋白，將轉基因 ORF亞克隆到該位置上。ICK基 序蛋白表達ORF可亞克隆至這個位點以產生病毒載體。這些病毒載體可被機械地導入植物 中，因為它們本身是感染性的，例如通過植物傷口、噴射等。它們還可通過農桿菌感染法，通 過將病毒載體克隆至根癌細菌根癌農桿菌或髮根細菌髮根 農桿菌a? rAizogefles)的T-DNA中，來轉化至植物中。該載體中ICK基序蛋 白的表達受RNA病毒複製的控制，而將病毒翻譯成mRNA用於複製受強病毒啟動子的控制， 例如，來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子。具有ICK基序蛋白表達ORF的病毒載體通常克 隆至二元載體中的T-DNA區域，所述二元載體自身可在大腸桿菌菌株和農桿菌屬菌株兩者 中重複。植物的瞬時轉化可通過用含有用於ICK基序蛋白表達的病毒載體的農桿菌細胞浸 潤植物葉來進行。在瞬時轉化的植物中，由於轉錄後基因沉默（PTGS)所致，外源蛋白質表 達在短時間內停止是常見的。有時PTGS抑制性蛋白質基因必須與用ICK基序蛋白表達ORF 驅動表達的相同類型的病毒載體一起瞬時共轉化植物。這改進和延長ICK基序蛋白在植物 中的表達。最常用的PTGS抑制性蛋白質是自番茄叢矮病毒（TBSV)發現的P19蛋白。
[0194] 瞬時植物表達的證明可見於圖7。
[0195] 圖7顯示瞬時表達的植物轉基因蛋白。圖7中報告了通過ELISA測定的與％ TSP 相比ICK蛋白的相對蓄積。在圖7中，有4種變化的ICK表達0RF，說明ERSP對得到正確 摺疊的ICK和STA對得到蛋白質蓄積的必要性。條形柱A報告了表達SEQ ID NO: 8即無 任何融合的ω肽（ICK)的FECT表達系統。條形柱B報告了表達SEQ ID NO: 9即與ω肽 (ICK)融合的BAAS ERSP的TRBO表達系統。條形柱C報告了表達SEQ ID NO: 10即與融 合雜合毒素（ICK)的IGER (接頭）融合的GFP (STA)的FECT表達系統。條形柱D報告了 表達SEQ ID NO: 11即與融合與雜合毒素（ICK)融合的IGER (接頭）的GFP (STA)融合的 BAAS (ERSP)的FECT表達系統。條形柱A和B的檢測水平顯示可忽略的蛋白質檢測。在 條形柱A中，這可能是因在ER中發生的ICK的未正確摺疊所致，在條形柱B中，這可能是因 正確摺疊但因缺乏STA而無蓄積所致。在條形柱C和D中有可檢測水平。當進行條形柱C [(SEQ ID NO: 10)，一種與融合雜合毒素（ICK)的IGER (接頭）融合的GFP (STA)]的實 驗時，有檢出的高水平的GFP螢光（數據未顯示），表明了大量TSP是融合蛋白，然而，當進 行ELISA時，只檢出0. 01%的TSP，這可能是由於缺乏正確摺疊所致，所述正確摺疊未發生， 因為這種蛋白質沒有導向在其中發生摺疊的ER。用於ELISA的抗體只檢測正確摺疊的蛋 白質的三級結構。當進行條形柱D [SEQ ID N0:11，一種與融合與雜合毒素（ICK)融合的 IGER (接頭）的GFP (STA)融合的BAAS (ERSP)]的實驗時，有一些檢出的GFP螢光和蓄積 0. 1%的TSP即與GFP融合的ICK肽。當條形柱A、B、C和D的數據合在一起時，顯然，為了 得到正確摺疊，ICK表達ORF中的ERSP是必需的，而對於增加肽的蓄積，STA是必需的。
[0196] 我們證實並記載了在使用設計用於引導表達的不同FECT載體瞬時轉化的菸草葉 中GFP-雜合融合蛋白構建體的綠色螢光的GFP發射。我們在使用用於APO (質外體定位） 蓄積的PFECT-BGIH載體、用於CYTO (胞質定位）蓄積的pFECT-GIH載體和用於ER (內質 網定位）蓄積的PFECT-BGIH-ER載體中獲得成功。數據未顯示。
[0197] 我們證實並記載了用在不同類型的ERSP瞬時轉化的菸草葉中GFP-雜合融合蛋白 構建體的綠色螢光的GFP發射。我們在證實用pFECT-BGIH載體的表達、用FECT-EGIH載體 的表達和用pFECT-E*GIH載體的表達中獲得成功。數據未顯示。
[0198] 我們測量了肽蓄積的水平，這顯示於圖8和9中。圖8是具有不同蓄積定位的煙 草瞬時表達的GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA檢測的％TSP圖。APO :質外體定位；CYTO : 胞質定位；ER :內質網定位。圖9是使用編碼具有3種不同ERSP序列的翻譯融合物的FECT 表達載體，菸草葉瞬時表達GFP融合的U-ACTX-Hvla的iELISA檢測的％TSP圖：BAAS信號 肽（BGIH)、伸展蛋白信號肽（EGIH)和修飾的伸展蛋白信號肽（E*GIH)。
[0199] 採用穩定植物轉化技術使蛋白質表達ORF整合至植物基因組 採用穩定植物轉化技術，ICK基序蛋白表達ORF還可整合至植物基因組，因此，ICK基序 蛋白可在植物中穩定表達，並世世代代保護轉化的植物。對於植物的穩定轉化，ICK基序蛋 白表達載體可以是環狀的或線性的。幾個關鍵組分必須包括在載體DNA中。為了穩定植物 轉化，可根據上述瞬時植物表達中的研究，應仔細設計用於在植物中最佳表達的ICK基序 蛋白表達〇RF。ICK基序蛋白的表達通常受在轉基因植物所有細胞的一些中啟動轉錄的啟 動子控制。啟動子可以是強植物病毒啟動子，例如，來自花椰菜花葉病毒（CaMV)的組成型 35S啟動子；它也可以是強植物啟動子，例如來自擬南芥ClraAiorOAsi1S iAa/iaaa)的氫過 氧化物裂解酶啟動子（pHPL)、來自大豆的Glycine max多聚遍在蛋白（Gmubi)啟動子、來自 不同植物物種（稻、玉米、馬鈴薯等）等的遍在蛋白啟動子等。植物轉錄終止子常常出現在 ORF的終止密碼子之後以停止RNA聚合酶和mRNA的轉錄。為了評價ICK基序蛋白表達，報 道基因可包括在ICK基序蛋白表達載體中，例如用於⑶S染色測定的β -葡糖醛酸糖苷酶 基因（GUS)、用於紫外線下的綠色螢光檢測的綠色螢光蛋白（GFP)基因等。對於轉化植物的 選擇，選擇標記基因通常包括在ICK基序蛋白表達載體中。標記基因表達廣物可提供對特 定抗生素（例如卡那黴素、潮黴素等）或特定除草劑（例如草甘膦等）有抗性的轉化植物。 如果農桿菌感染法技術用於植物轉化，則T-DNA左邊界和右邊界序列也包括在ICK基序蛋 白表達載體中以將T-DNA部分轉運到植物中。可採用多種轉化技術，將構建的ICK基序蛋 白表達載體轉化到植物細胞或組織中。農桿菌感染法是一種使用根癌農桿菌菌株或髮根農 桿菌菌株轉化植物的非常普遍的方法。粒子轟擊（亦稱基因槍或生物射彈（Biolistics)) 技術也非常普遍地用於植物轉化。其它不太常用的轉化方法包括組織電穿孔、碳化矽晶須、 DNA直接注射等。在轉化後，將轉化的植物細胞或組織放入植物再生培養基中，以將轉化的 植物細胞或組織成功地再生為轉基因植物。轉化的植物中ICK基序蛋白表達ORF的整合和 表達的評價可如下進行。
[0200] 轉化植物的評價 轉化植物的評價可在DNA水平、RNA水平和蛋白質水平上進行。穩定轉化的植物可在所 有這些水平上評價，而瞬時轉化的植物通常只在蛋白質水平上評價。為了確保ICK表達基 序蛋白表達ORF整合到穩定轉化的植物的基因組中，可從穩定轉化的植物組織中提取基因 組DNA用於PCR評價或DNA印跡法應用。穩定轉化的植物中ICK基序蛋白的表達可在RNA 水平上評價，即可從轉化的植物組織中提取總mRNA，並可將RNA印跡法技術和RT-PCR技術 應用於定性或定量評價ICK基序蛋白的mRNA水平。轉化植物中ICK基序蛋白的表達也可 直接在蛋白質水平上評價。存在許多評價在轉化植物中表達的ICK基序蛋白的方法。如果 報導基因連同ICK基序蛋白表達ORF轉化到植物中，則可進行報導基因測定法以初步評價 轉化的ICK基序蛋白表達ORF的表達，例如用於⑶S報導基因表達的⑶S染色測定、用於 GFP報導基因表達的綠色螢光檢測實驗、用於螢光素酶報導基因表達的螢光素酶測定等。此 夕卜，可從轉化的植物組織中提取的表達的總蛋白質用於直接評價轉化的植物中的ICK基序 蛋白的表達。提取的表達的總蛋白質樣品可用於Bradford測定法以評價樣品中總的蛋白 質水平。分析型HPLC色譜技術、蛋白質印跡技術或iELISA測定法可用於定性或定量評價 從轉化的植物組織中提取的總蛋白質樣品中的ICK基序蛋白。還可在昆蟲生物測定中，通 過使用從轉化的植物組織中提取的總蛋白質樣品，來評價ICK基序蛋白表達。最後，可在昆 蟲生物測定中測試轉化的植物組織或完整的轉化植物以評價ICK基序蛋白表達及其對植 物的保護。
[0201] 我們如下提供了第I部分的詳細描述和摘要： 我們描述了包含與富含半胱氨酸的殺蟲蛋白（CRIP)例如抑制物半胱氨酸結（ICK) 基序蛋白有效連接的內質網信號肽（ERSP)的蛋白質，其中所述ERSP是所述蛋白質 (ERSP-ICK)的N端。ERSP是將表達的CRIP導向植物細胞的內質網的任何信號肽。CRIP 可以是抑制物半胱氨酸結（ICK)蛋白或非ICK蛋白。ERSP是來源於植物的長度為5-50個 胺基酸的肽，其與翻譯穩定性蛋白（STA)有效連接，其中所述ERSP是所述蛋白質的N端， 並且間插STA序列可在CRIP的N端一側，CRIP任選為ICK基序蛋白（ERSP-STA-ICK)或非 ICK基序蛋白（ERSP-STA-非ICK);或間插STA序列可在ICK或非ICK基序蛋白的C端一側 (ERSP-ICK-STA)或（ERSP-非ICK-STA)。ERSP是長度介於3-60個胺基酸之間的肽，或長 度介於5-50個胺基酸之間的肽，或長度介於20-30個胺基酸之間的肽。它可來源於植物， 具有SEQ ID NO 4的大麥α澱粉酶信號肽（BAAS)。ERSP可以是具有SEQ ID NO 18的煙 草伸展蛋白信號肽的肽。ERSP可以是具有SEQ ID NO 19的修飾的菸草伸展蛋白信號肽或 來自aiei的具有SEQ ID NO 27的Jun a 3信號肽。
[0202] 我們描述了一個CRIP實例，其是長度介於16和60個胺基酸之間、長度介於26和 48個胺基酸之間、長度介於30和44個胺基酸之間的ICK基序蛋白，其中它選自具有抑制性 半胱氨酸結基序的任何肽或肽源，或殺蟲肽，且其中它是包括澳毒蜘蛛屬或屬 的任何肽或肽源、來源於rerMia的任何肽，為一種ACTX肽。ICK基序蛋白是 任何殺蟲肽及其片段，包括所述肽和序列號的成熟、前肽和肽原形式以及肽區段的任何突 變或缺失或添加但仍保持抑制性半胱氨酸結結構。ICK基序蛋白可以是具有SEQ ID NO: 6 的U-ACTX-Hvla、具有SEQIDN0:24的ω-ACTX-Hvla、κ-ACTX-Hvlc。一種表達0RF，其包 含編碼這些肽的任何核苷酸。一種表達0RF，其包含編碼整合到轉基因植物基因組中的肽的 任何核苷酸。本文所述任何肽或核苷酸在製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化的植物 中表達正確摺疊的殺蟲肽，和/或製備或轉化植物或植物基因組從而在轉化的植物中表達 正確摺疊的殺蟲肽並引起表達和正確摺疊的殺蟲肽在所述植物中蓄積並使植物對蟲害的 抗性提高中的用途。我們描述了使用核苷酸產生具有或表達本文所述任何肽的轉基因植物 和轉化植物的程序。我們描述了由這些產物和處置方法的任一種製備的轉化植物。
[0203] 我們描述了包含與任選為與翻譯穩定性蛋白（STA)有效連接的抑制物半胱氨酸 結（ICK)基序蛋白或非ICK蛋白的CRIP有效連接的內質網信號肽（ERSP)的蛋白質，其中 所述ERSP是所述蛋白質的N端，間插翻譯穩定性蛋白序列可以在ICK基序蛋白的N端一側 (ERSP-STA-ICK)或任選（ERSP-非 ICK-STA)或 ICK 基序蛋白的 C 端一側（ERSP-ICK-STA) 或 ERSP-STA-非 ICK)。
[0204] 我們描述了分子量為12 kD和12 kD以上的這類STA，其中所述STA可以是多種 蛋白質，包括分子量為12 kD和12 kD以上的ICK基序蛋白，或分子量為12 kD和12 kD以 上的與接頭肽（L)連接的多個ICK基序蛋白，例如ERSP-ICK-(Li-ICKj) N或ERSP-(ICKj-Li) N_ICK。我們解釋了接頭肽可以是相同的或不同的。我們表明一種STA是來源於水母的具 有SEQ ID NO 13的綠色螢光蛋白質（GFP)，STA可以是具有SEQ ID NO 28的雪花蓮凝集素 凝集素（GNA)，並且 STA可以是具有 SEQ ID NO 26的/仙//?6?/7/5· asAei 蛋白質Jun a 3。
[0205] 我們描述了 LINKER是長度為4-20個胺基酸的任何肽。我們描述了作為含有蛋白 酶識別位點的任何肽的LINKER。我們描述了 LINKER為含有植物蛋白酶切割位點的任何肽。 我們描述了 LINKER是含有 IGER (SEQ ID N0:1)、EEKKN (SEQ ID N0:2)和（SEQ ID NO: 3) 的胺基酸序列的肽。我們描述了 LINKER為可在昆蟲消化系統中或在昆蟲血淋巴中被切割 的任何肽。我們描述了 LINKER，其中所述LINKER是含有胰蛋白酶切割位點的肽。
[0206] 我們描述了編碼所述任何蛋白質的核苷酸，包括包含編碼所述肽的任何核苷酸的 表達ORF，以及包含編碼所述肽的任何核苷酸的表達ORF，其整合到轉基因植物基因組中， 以及轉化到植物或植物基因組中從而在轉化的植物中表達正確摺疊的殺蟲肽，以及轉化到 植物或植物基因組中從而在轉化的植物中表達正確摺疊的殺蟲肽並引起表達和正確摺疊 的殺蟲肽在所述植物中蓄積並使植物對蟲害的抗性提高。我們描述了產生於這些描述的轉 基因植物和具有或表達本文所述任何肽的轉化植物。
[0207] 我們解釋和描述了包含編碼本文所述肽的任何核苷酸的表達ORF以及整合到轉 基因植物基因組中的表達0RF，這樣做的一個原因是製備或轉化植物或植物基因組從而在 轉化的植物中表達正確摺疊的殺蟲肽，且這樣做的一個原因是使轉化的植物引起表達和正 確摺疊的殺蟲肽在所述植物中蓄積並使植物對蟲害的抗性提高。我們教導了如何使用這些 程序，並表達本文所述肽和本領域的技術人員鑑於本文教導和使用本文所述任何產物和處 置方法使用的任何其它肽，來製備轉基因植物。
[0208] 我們教導了如何製備這樣的蛋白質，其包含有效連接與有效連接間插接頭肽（L) 的翻譯穩定性蛋白（STA)有效連接的抑制物半胱氨酸結（ICK)基序蛋白的內質網信號肽 (ERSP)，其中所述ERSP是所述蛋白質的N端，且所述LINKER介於STA和ICK基序蛋白之 間，所述翻譯穩定性蛋白可位於ICK基序蛋白的N端一側（上遊）或ICK基序蛋白的C端 一側（下遊），並描述為 ERSP-STA-L-ICK 或 ERSP-ICK-L-STA。我們解釋了上述 ERSP、CRIP 和ICK、LINKER、STA可以是本文描述的任何肽和本領域的技術人員鑑於本文教導內容並使 用本文所述任何產物和處置方法使用的任何其它肽。
[0209] 我們教導了如何製備這樣的蛋白質，其包含有效連接與有效連接間插接頭肽（L) 的翻譯穩定性蛋白（STA)有效連接的多個抑制物半胱氨酸結（ICK)基序蛋白結構域（其中 ICK基序蛋白通過間插接頭肽（L)彼此連接）的內質網信號肽（ERSP)，其中所述ERSP是所 述蛋白質的N端，所述LINKER介於STA和多個ICK基序蛋白結構域之間，且所述STA可位於 多個ICK基序蛋白結構域的N端一側（上遊）或多個ICK基序蛋白結構域的C端一側（下 遊），並描述為 ERSP-STA-(Li-ICKj)N 或 ERSP-(ICKj-Li)N-STAt5
[0210] 我們教導了如何製備編碼這些蛋白質的核苷酸，即表達ORF ;如何製備並將所述 核苷酸整合至轉基因植物基因組、嵌合基因、重組載體、轉基因宿主細胞、轉基因植物細胞、 轉基因植物，所述轉基因植物為玉米、大豆、棉、稻、小麥、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、馬鈴薯、 番茄、菸草、任何綠葉蔬菜或任何果樹或本文提及的任何植物和物種和來自這些程序的轉 基因植物的種子，其中所述種子包含嵌合基因。 實施例
[0211] 本說明書中的實施例無意且不應用來限制本發明；它們僅供說明本發明。
[0212] 實施例1 兩個瞬時植物表達系統之間的表達比較。
[0213] 採用瞬時植物轉化技術以快速優化ICK基序蛋白表達ORF用於植物表達。用植物 病毒載體的農桿菌感染法技術因其高效率、簡易和便宜而在此處被用於瞬時植物轉化。本 文針對植物中的ICK基序蛋白表達，評價了兩個病毒瞬時植物表達系統。一個是菸草花葉 病毒過量表達系統（TRBO, Lindbo JA, Plant Physiology, 2007，V145: 1232-1240)。 TRBO DNA載體具有用於農桿菌感染法的T-DNA區域，其含有驅動沒有編碼病毒外被蛋白的 基因的菸草花葉病毒RNA表達的CaMV 35S啟動子。另一個病毒瞬時植物表達系統是FECT 表達系統（Liu Z 和 Kearney CM, BMC Biotechnology, 2010，10:88)。FECT 載體也含有 用於農桿菌感染法的T-DNA區域，其含有驅動沒有編碼病毒外被蛋白的基因和三基因框的 狐尾草花葉病毒RNA表達的CaMV 35S啟動子。兩個表達系統使用"無害的"病毒基因組，因 此，可有效地防止病毒植物-植物間的傳遞。為了有效表達所導入的異源基因，FECT表達系 統還需要共表達P19, 一種來自番茄叢矮病毒的RNA沉默抑制蛋白，以防止所導入的T-DNA 的轉錄後基因沉默（PTGS)。（TRBO表達系統不需要P19的共表達）。如下文所述，通過煙 草〇Vicoiia/?a 中ICK基序蛋白的瞬時表達，對兩個瞬時植物表達系統進行 了測試和比較。
[0214] ICK基序蛋白表達ORF被設計成可編碼一系列翻譯融合的結構基序，描述如下： Ν' -ERSP-Sta-L-ICK-C'。在此用於表達的ICK基序蛋白是U-ACTX-Hvla，其具有下列氨基 酸序列（Ν'至C'，一字母代碼）： QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID NO: 12) 在此所用的ERSP基序為大麥α澱粉酶信號肽（BAAS)，其包含如下所示的24個胺基酸 (Ν'至C'，一字母代碼）： MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG (SEQ ID NO: 4) 在該表達ORF中的穩定性蛋白（Sta)是綠色螢光蛋白（GFP)，其具有如下的胺基酸序列 (Ν'至C'，一字母代碼）： MASKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCF SRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGNYKTRAEVKro⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSH NVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVT AAGITHGMDELYK (SEQ ID NO: 13) GFP和U-ACTX-Hvla間的接頭肽含有胰蛋白酶切割位點並具有以下所示的胺基酸序列 (Ν'至C'，一字母代碼）： IGER (SEQ ID NO: 1) 按照ICK基序表達ORF式，該特定的ICK表達ORF可描述為BAAS-GFP-IGER-雜合體或 BGIH。BGIH ORF通過在其5'端加入Pac I限制位點和在其3'端加入Avr II限制位點來 化學合成。合成BGIH的序列如下： TTAATTAAATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTG CAAGCGGAGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCAC TACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATC CGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTC AAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACA TCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAA CTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGAC ACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGA TTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTT AATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAG AGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 14) 將BGIH ORF克隆至FECT表達載體的Pac I和Avr II限制位點中以產生BGIH表達載 體用於FECT瞬時植物表達系統（pFECT-BGIH)。為了使FECT表達系統中的BGIH表達最大 化，產生表達RNA沉默抑制蛋白P19的FECT載體（pFECT-P19)用於共轉化。為了產生用於 TRBO瞬時植物表達系統的BGIH表達載體，進行常規PCR程序以將Not I限制位點加至上述 BGIH ORF的3'端。然後將新的BGIH ORF克隆至TRBO表達載體的Pac I和Not I限制位 點中以產生BGIH表達載體用於TRBO瞬時植物表達系統（pTRBO-BGIH)。
[0215] 通過FECT和TRBO表達系統，將根癌農桿菌菌株GV3101用於BGIH在菸草葉中的 瞬時表達。為了製備感受態GV3101細胞，進行了下列程序：使用GV3101的過夜培養物接種 200 mL Luria-Bertani (LB)培養基。然後使細胞生長到其0D600介於0.5和0.8之間的 對數期。然後通過在4°C下以5000 rpm離心10分鐘使細胞沉澱。細胞然後用10 mL預冷 的TE緩衝液（Tris-HCl 10 mM，EDTA ImM，pH8. 0)洗滌1次，然後重新懸浮於20 mL LB培 養基中。GV3101細胞重懸液然後以250 PL部分等分入1.5 mL微管中。然後將等分試樣在 液氮中速凍並保存在_80°C冰箱中以備未來轉化。
[0216] 然後如下採用凍融方法，將pFECT-BGIH和pTRBO-BGIH載體轉化到感受態GV3101 細胞中：將保存的感受態GV3101細胞在冰上融化，然後與1-5 Pg純DNA (pFECT-BGIH或 pTRBO-BGIH載體）混合。之後將細胞-DNA混合物保持在冰上5分鐘，然後轉移到-80°C下 5分鐘，隨後在37°C水浴中溫育5分鐘。凍融處理的細胞然後被稀釋入I mL LB培養基中， 在振動臺上在室溫下振蕩2-4小時。200 PL細胞-DNA混合物的等分試樣然後鋪於具有適 當抗生素（10 Kg/mL利福平、25 Pg/mL慶大黴素和50 Pg/mL卡那黴素用於pFECT-BGIH轉 化和pTRBO-BGIH轉化兩者）的LB瓊脂板上，並在28°C下溫育2天。然後挑選出所得轉化 體菌落，在6 mL等分的具有合適抗生素的LB培養基的中培養用於轉化DNA分析，並製備轉 化GV3101細胞的甘油貯液。
[0217] 用3 mL無針注射器進行葉注射來進行菸草葉的瞬時轉化。將轉化的GV3101細胞 在具有合適抗生素（如上所述）的LB板上劃痕，在28°C下溫育2天。將轉化的GV3101細 胞的一個菌落接種至5 ml LB-MESA培養基（補充10 mM MES、20 μΜ乙醯丁香酮的LB培養 基）和上述相同的抗生素中，在28°C下過夜。通過以5000 rpm離心10分鐘收集過夜培養 物的細胞，以1. 〇的最終0D600重新懸浮於誘導培養基（10 mM MES、10 mM MgC12、100 μ M 乙醯丁香酮）中。然後將細胞在誘導培養基中在室溫下溫育2小時至過夜，然後準備就緒用 於菸草葉的瞬時轉化。使用3 mL未附帶針的注射器通過注射，使處理細胞侵潤AYcoiiaaa 知植物的連接的葉的底面。對於FECT瞬時轉化，將等量的pFECT-BGIH轉化的 GV3101細胞和pFECT-P19轉化的GV3101細胞混合在一起用於通過用3 mL注射器注射侵潤 菸草葉。對於TRBO瞬時轉化，僅使pTRBO-BGIH轉化的GV3101細胞侵潤菸草葉。在浸潤後 6-8天評價菸草葉中的ICK基序蛋白表達。
[0218] BGIH 表達 ORF 含有 GFP (STA)與 U-ACTX-Hvla (ICK)的融合蛋白，在 GFP 與 U-ACTX-Hvla之間具有IGER (SEQ ID NO: 1)接頭肽（LINKER)。如圖3所示，在紫外線下 檢測用FECT和TRBO載體轉化的菸草葉中轉基因的表達GFP部分的綠色螢光。引人關注的 是，綠色螢光顯得均勻分布在FECT載體轉化的菸草葉（維管組織除外）中，而TRBO載體轉 化的菸草葉中的綠色螢光顯得在維管組織中蓄積，這是由於TRBO保留其病毒運動蛋白而 FECT不保留所致。
[0219] 為了定量評價ICK基序蛋白表達，通過此處所述的下列程序，提取轉化菸草葉中 的表達的蛋白質。通過用大開孔的1000 μ?移液管頭鑽取葉片，來收集100 mg轉化的葉組 織圓盤。將所收集的葉組織放入具有532"直徑不鏽鋼磨球的2 mL微管中，並在-80°c下 冰凍1小時，然後使用Troemner-Talboys高通量勻漿器勻漿。將750 PL冰冷的TSP-SEl 提取溶液（磷酸鈉溶液50 mM、1:100稀釋的蛋白酶抑制劑混合物、EDTA ImM、DIECA 10mM、 PVPP 8%，pH 7.0)加入管中並渦旋混合。然後將微管靜置在室溫下15分鐘，然後在4°C下以 16,000 g離心15分鐘。取出100 KL所得上清液，加載到0.45 Mm Millipore MultiScreen 過濾器微量滴定板中的預裝填Sephadex G-50的柱中，其底部具有接受Costar微量滴定板 的空間。微量滴定板然後在4°C下以800 g離心2分鐘。所得濾液，本文稱為菸草葉的總可 溶性蛋白提取物（TSP提取物），準備就緒用於定量分析。
[0220] 採用Pierce Coomassie Plus蛋白質測定法，估算TSP提取物的總可溶性蛋白濃 度。具有已知濃度的BSA蛋白質標準品用來產生蛋白質定量標準曲線。將2 PL的各TSP 提取物混合入Coomassie Plus蛋白質測定試劑盒的200 PL顯色試劑（CPPA試劑）中，使 其反應10分鐘。然後採用SpectroMax-M2讀板儀，使用SoftMax Pro作為控制軟體，通過 讀取0D595來評價顯色反應。來自FECT-BGIH表達葉和TRB0-BGIH表達葉的TSP提取物中 的總可溶性蛋白的濃度分別為0.788 ± 0.20 Pg/^L和0.533 ± 0.03 Pg/^L。這些結果 用來計算在iELISA測定法中TSP (%TSP)中表達的U-ACTX-Hvla的百分比。
[0221] 如下進行間接ELISA (iELISA)測定法以定量評價用FECT和TRBO表達系統瞬時 轉化的菸草葉中的ICK基序蛋白。將5 PL葉TSP提取物稀釋在Immulon 2HD 96孔板的孔 中的95 PL CB2溶液（Immunochemistry Technologies)中，按需進行系列稀釋。然後使來 自提取物樣品中的葉蛋白質在室溫下避光包被孔壁3小時，隨後除去CB2溶液，各孔用200 μ? PBS (Gibco)洗滌兩次。之後將150 PL封閉溶液（含5%脫脂奶粉的Block BSA/PBS) 加入各孔中，在室溫下避光溫育1小時。在除去封閉溶液和PBS洗滌各孔後，將100 PL的 兔抗U-ACTX-Hvla抗體（第一抗體）（1:250稀釋於封閉溶液）加入各孔中，在室溫下避光 溫育1小時。隨後除去第一抗體，各孔用PBS洗滌4次。然後將100 PL HRP綴合的山羊抗 兔抗體（第二抗體，按1:1000稀釋於封閉溶液中使用）加入各孔中，在室溫下避光溫育1 小時。在除去第二抗體並用PBS洗滌孔後，將100 PL底物溶液（ABTS過氧化物酶底物溶液 A和溶液B的1:1混合物，KPL)加入各孔中，使顯色反應進行直到出現足夠的顯色。然後將 100 PL過氧化物酶終止溶液加入各孔中以終止反應。使用SpectroMax_M2讀板儀，SoftMax Pro用作控制軟體，在405 nm處讀取板中各反應混合物的吸光度。在iELISA測定中按如上 所述的相同方式，處理系列稀釋的已知濃度的純U-ACTX-Hvla樣品以生成質量-吸光度標 準曲線用於定量分析。通過iELISA檢測表達的U-ACTX-Hvla，在來自FECT-BGIH轉化的煙 草的葉TSP提取物中為3.09 ± 1.83 ng/^L;在來自TRB0-BGIH轉化的菸草的葉TSP提取 物中為3. 56 ± 0. 74 ng/^L。或對於FECT-BGIH轉化體，表達的U-ACTX-Hvla為0. 40%總 可溶性蛋白（%TSP)，在TRB0-BGIH轉化體中為0.67% TSP。
[0222] 綜上所述，兩個FECT和TRBO瞬時植物表達系統可用來在植物中表達ICK基序蛋 白。兩個系統中的ICK基序蛋白表達水平非常接近。然而，在FECT系統中，表達均勻分布 在農桿菌侵潤的葉中，而在TRBO系統中，表達蓄積在農桿菌侵潤的葉的維管組織中。
[0223] 實施例2 菸草葉中ICK基序蛋白瞬時表達伴隨在不同的亞細胞目標中蓄積。
[0224] 植物表達的ICK基序蛋白需要在植物中蓄積到一定水平以有效保護植物免遭蟲 害。植物表達的ICK基序蛋白的蓄積水平可受其在植物細胞中的最終定位影響。在該實施 例中，我們研究了植物表達的ICK基序蛋白的不同亞細胞定位對植物中的蛋白質蓄積水平 的影響（使用FECT瞬時植物表達系統）。在該實施例中，研究了 3個亞細胞目標，植物細胞 壁質外體（APO)、內質網（ER)和胞質（CYTO)。
[0225] APO導向的ICK基序蛋白表達ORF被設計成編碼一系列翻譯融合的結構基序，可如 下描述：N'-ERSP-Sta-L-ICK-C'。本研究中ICK基序蛋白再次為U-ACTX-Hvla，並使用實施 例1的BGIH表達0RF。此處使用與實施例1相同的載體，pFECT-BGIH。
[0226] CYTO導向的ICK基序蛋白表達ORF被設計成編碼一系列翻譯融合的結構基序，可 如下描述：Ν' -Sta-L-ICK-C'。本研究中，從BGIH表達ORF中剔除編碼大麥α -澱粉酶信 號肽的DNA序列，變成GIH表達0RF，其可讀框序列如下： ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAAT GGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCAC TACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATC CGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTC AAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACA TCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAA CTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGAC ACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGA TTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGTTCTCTT AATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTATTGTAG AGCTTAA (SEQ ID NO: 15) 將GIH表達ORF克隆至FECT表達載體的Pac I和Avr II限制位點中以產生GIH表達 載體用於FECT瞬時植物表達系統（pFECT-GIH)，以用於U-ACTX-Hvla的CYTO引導表達。
[0227] 通過在BGIH表達ORF的C'端加入編碼ER引導信號肽的DNA序列設計ER導向的 ICK基序蛋白表達0RF，其被命名為BGIH-ER表達0RF。此處所用的ER引導信號肽具有下列 胺基酸序列（胺基酸的一字母代碼）： KDEL (SEQ ID NO: 16) BGIH-ER表達ORF的DNA序列如下： ATGGCTAATAAACACCTGAGTTTGTCACTATTCCTCGTGTTGCTCGGGTTATCTGCTTCACTTGCAAGCGG AGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCAC AAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTG GAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGA TCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAA AGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAA AGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATGTATA CATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGT TCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGC TGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACC ATGTTCTATTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGT TTATTATTGTAGAGCTAAAGATGAGCTCTAA (SEQ ID NO: 17) 將BGIH-ER表達ORF克隆至FECT表達載體的Pac I和Avr II限制位點中以產生 BGIH-ER表達載體用於FECT瞬時植物表達系統（pFECT-BGIH-ER)，用於U-ACTX-Hvla的ER 導向表達。
[0228] 將所有 3 種載體 pFECT-BGIH、pFECT-GIH 和 pFECT-BGIH-ER 轉化至農桿菌 菌株GV3101中，並採用實施例1所述方法，使用所得的轉化GV3101細胞瞬時轉化至 AYcoiiaaa 葉中。所有3種表達ORF應瞬時表達融合蛋白，其包含GFP融合的 U-ACTX-Hvla，在所述兩個結構結構域之間具有胰蛋白酶可切割接頭。
[0229] 在瞬時菸草轉化6天後，通過檢測紫外線下的綠色螢光，初步檢查GFP融合的 U-ACTX-Hvla的表達。在所有轉化的菸草葉中檢測到不同水平的綠色螢光。具有GFP融合 的U-ACTX-Hvla的CYTO導向蓄積的轉化葉顯示最強的綠色螢光，而具有APO或ER導向的 融合蛋白蓄積的那些葉顯示較弱的綠色螢光。因此，結果表明菸草葉中與APO和ER導向表 達相比，CYTO導向表達可促進轉基因 GFP融合的U-ACTX-Hv I a蛋白的更大蓄積。在該實驗 的3次重複中，具有CYTO導向表達的轉化菸草葉總是顯示類似或強於具有APO導向表達的 葉的綠色螢光，且用ER導向構建體轉化的菸草葉中檢出最弱的綠色螢光。這些初步結果表 明CYTO導向表達可蓄積同樣或高於APO導向表達的轉基因融合蛋白，且ER導向表達產生 最少的蓄積。
[0230] 從用不同FECT載體轉化的菸草葉提取總可溶性蛋白樣品（方案詳細描述於實施 例1)。如實施例1中所述進行Pierce Coomassie Plus蛋白質測定法以測定TSP提取物 中總可溶性蛋白的濃度，對於APO導向、CYTO導向和ER導向表達，分別得到下列濃度估值： 0.31 ± 0.04 Pg/^L、0.31 ± 0.03 Pg/^L 和 0.34 ± 0.05 Pg/^L (N = 3)。
[0231] 然後使用TSP提取物按實施例1中所述進行間接ELISA方案以定量測定 U-ACTX-Hvla蛋白的表達水平為總可溶性蛋白的百分比（%TSP)，對於APO導向、CYTO導向和 ER導向表達，分別得到下列百分比估值：0.126 ± 0.032%、0. 049 ± 0.085%和0.025 土 0.018% (N = 3)。圖8概括了上述各種轉化菸草葉的表達的U-ACTX-Hvla的量化（為％TSP 值）。這些結果表明APO導向轉基因表達導致葉中表達的正確摺疊的ICK基序蛋白的最大 蓄積。
[0232] 總的來說，雖然經轉化產生CYTO導向的轉基因 GFP融合的U-ACTX-Hvla的菸草 葉呈現最強的綠色螢光信號，但實際上iELISA結果發現這些轉基因菸草葉中U-ACTX-Hvla 肽最少，大大小於對ER導向表達的轉化葉（其具有最弱的綠色螢光信號）所檢出的肽。在 iELISA測定法中，第一抗體（兔抗U-ACTX-Hvla抗體）僅可與正確摺疊的U-ACTX-Hvla肽 結合。
[0233] 實施例3 用於ICK基序蛋白在植物中表達的替代信號肽。
[0234] 因為ER信號肽可以蛋白質表達水平中起作用，所以使用之前實施例中所述的 FECT表達系統測試了兩種其它的ERSP。兩種ERSP候選物為菸草伸展蛋白信號肽，本研究 中簡寫為"E"（Memelink等，the Plant Journal, 1993，V4: 1011-1022)，其變體之一簡 寫為"E*"（Pogue GP 等，Plant Biotechnology Journal, 2010，V8: 638-654)。它們的 胺基酸序列列舉如下（Ν'至C'，一字母代碼，非相同的殘基用粗體字表示）： 伸展蛋白信號肽（EMGKMASLFASLLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 18) 伸展蛋白信號肽變體（E*) :MGKMASLFATFLVVLVSLSLASESSA (SEQ ID NO: 19) 如下設計編碼E的DNA序列用於菸草表達： ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT CTGCT (SEQ ID NO: 20) 採用寡核苷酸延伸PCR (oligo extension PCR)，用4個合成DNA引物產生E DNA序 列。然後，為了將Pac I限制位點加至其5'端並將GFP 5'端DNA序列的一部分加至其 3'端，使用E DNA序列作為模板進行進一步的PCR，得到117 bp DNA片段。然後使用該 片段作為正向PCR引物以擴增編碼來自載體pFECT-BGIH的GFP-IGER接頭-U-ACTX-Hvla ORF的DNA序列（參見實施例1和實施例2)，因此在我們的ICK基序蛋白表達ORF之一 設計為ERSP-Sta-L-ICK後，產生編碼（自Ν'至C'端）伸展蛋白信號肽-GFP-IGER接 頭-U-ACTX-Hvla的U-ACTX-Hvla表達0RF。這個表達0RF，稱為"EGIH"，在其5'端具有Pac I限制位點，在其3'端具有Avr II限制位點。EGIH具有下列DNA序列： TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTTCTCTGCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGAT GTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTAT TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCC GTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATA TCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGA GTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATG TATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCC GTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTG CTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGT TCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTA TTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 21) 將EGIH DNA序列克隆至FECT載體的Pac I和Avr II限制位點中以產生pFECT-EGIH 載體用於GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白的瞬時植物表達。
[0235] 如下設計編碼變體伸展蛋白信號肽（E*)的DNA序列用於菸草表達： ATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTTCTGAATCTT CTGCT (SEQ ID NO: 22) 採用上述用於EGIH ORF的相同技術產生"E*GIH" DNA序列，其編碼（自Ν'至C'列 出）變體伸展蛋白信號肽-GFP-IGER接頭-U-ACTX-Hvla蛋白的翻譯融合物。所得E*GIH ORF具有下列DNA序列： TTAATTAAATGGGTAAGATGGCTTCTCTGTTTGCTACTTTTCTGGTTGTTCTGGTTTCTCTGTCTCTGGCTT CTGAATCTTCTGCTGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGAT GTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAAAGCTTACCCTTAAATTTAT TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCC GTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATA TCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGA GTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTCACACAATG TATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCC GTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCT GTCGACACAATCTGCCCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTG CTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAAATTGGTGAAAGACAATATTGTGTTCCAGTTGATCAACCATGT TCTCTTAATACTCAACCATGTTGTGATGATGCTACTTGTACTCAAGAAAGAAATGAAAATGGACATACTGTTTATTA TTGTAGAGCTTAACCTAGG (SEQ ID NO: 23) 將E*GIH DNA序列克隆至FECT載體的Pac I和Avr II限制位點以產生pFECT-E*GIH 載體用於GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白的瞬時植物表達。
[0236] 使用 3 種不同的 FECT 表達載體 pFECT-BGIH、pFECT-EGIH 和 pFECT-E*GIH，在菸草 植物中瞬時表達GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白以評價蛋白質表達水平如何受不同ERSP的 影響。將3種FECT表達載體轉化至農桿菌GV3101中，然後採用實施例1中所述技術，將轉 化的GV3101注射入菸草葉中用於GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白在菸草葉中的瞬時表達。
[0237] 首先通過視覺檢查紫外線下的綠色螢光，評價來自上述3種不同的FECT表達載體 的GFP融合的U-ACTX-Hvla的表達水平。來自3種不同FECT載體的瞬時轉化的菸草葉的 綠色螢光是肉眼可見的。所有葉顯示相似的綠色螢光水平，表明了所測試的3種ERSP無一 引起GFP融合的U-ACTX-Hvla蛋白表達水平的顯著增加。
[0238] 從用上述3種ERSP FECT載體轉化的菸草葉提取總可溶性蛋白樣品（方案詳細描 述於實施例1)。然後進行Pierce Coomassie Plus蛋白質測定法（按實施例1中所述）以 測定所得TSP樣品中總可溶性蛋白的濃度，對於對應於BGIH、EGIH和E*GIH表達ORF的樣 品分別得到 0.85 ± 0.68 Pg/^L、0.70 ± 0.47 Pg/^L 和 0.76 ± 0.77 Pg/^L 的值（N = 4)。
[0239] 然後使用TSP提取物進行間接ELISA(按實施例1中所述）以定量測定 U-ACTX-Hvla蛋白的表達水平為總可溶性蛋白的百分比（%TSP)，對於對應於具有BGIH、 EGIH和E*GIH表達ORF的FECT載體的樣品，分別得到0.39 ± 0.17% (N=3,因為一個數據 點被作為無關項剔除）、0.48 ± 0.26% (N=4)和0.62 ± 0.38% (N=4)的值。圖9概括了 對從用上述3種ERSP ORF轉化的菸草葉得到的所有樣品估算的U-ACTX-Hvla水平，為總可 溶性蛋白的百分比（%TSP)。雖然來自3種FECT載體轉化的％TSP數據看上去不同，但通過 Student's t檢驗它們沒有統計學上地不同。換句話說，在瞬時轉化的菸草葉中，3種ERSP 在U-ACTX-Hvla的表達水平上並無不同。
[0240] 實施例4 作為與ICK基序蛋白的融合蛋白表達的穩定性蛋白有助於ICK基序蛋白在轉化植物中 蓄積。
[0241] 在該實施例中，用於植物表達的ICK基序蛋白是ω-ACTX-Hvla，來源於澳大利亞 布魯山脈漏鬥網蝴蛛rerswia。ω-ACTX-Hvla具有下列胺基酸序列（一字母 代碼）： SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24) 使用FECT表達系統在菸草植物AYcoiiaaa 中表達ω-ACTX-Hvla。對編 碼不同ω -ACTX-Hvla表達ORF的2種FECT載體進行了工程改造。這些表達ORF之一編碼 在其Ν'端具有大麥α澱粉酶信號肽（BAAS)而無任何穩定性蛋白的ω-ACTX-Hvla。將這個 表達ORF (本文亦稱"BO"）亞克隆以產生FECT表達載體pFECT-BO。另一種ω -ACTX-Hvla 表達ORF編碼ω-ACTX-Hvla與蛋白質Jun a 3的翻譯融合物。成熟的Jun a 3是一種約 30 kDa植物防禦蛋白，也是某些人的變應原，由aiei喬木產生，並用於該ORF 中作為翻譯穩定性蛋白（STA)。下面列出其胺基酸序列（一字母代碼）： MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVVKFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWG RTGCTFDASGKGSCQIODCGGQLSCTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADI NAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQYCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO:25) 下面以SEQ ID NO: 26提供成熟的Jun a 3蛋白。
[0242] KFDIKNQCGYTVWAAGLPGGGKRLDQGQTWTVNLAAGTASARFWGRTGCTFDASGKGSCQTCDCGGQLS CTVSGAVPATLAEYTQSDQDYYDVSLVDGFNIPLAINPTNAQCTAPACKADINAVCPSELKVDGGCNSACNVFKTDQ YCCRNAYVDNCPATNYSKIFKNQCPQAYSYAKDDTATFACASGTDYSIVFC (SEQ ID NO: 26) SEQ. ID. 25的ORF中編碼的ERSP是Jun a 3天然信號肽，如以下SEQ. ID 27所示。 MARVSELAFLLAATLAISLHMQEAGVV SEQ. ID. 27〇
[0243] 實施例1詳細描述了通過在ORF中編碼的介於ω-ACTX-Hvla結構域和Jun a 3結構域之間的序列編碼的IGER接頭。總之，這個ω -ACTX-Hvla表達ORF稱為 S-Juna3-IGER-c〇 或 SJI0。同樣，SJIO 表達 ORF 所插入的 FECT 載體命名為 pFECT-SJIO。
[0244] 使用2種ω -ACTX-Hvla FECT表達載體pFECT-BO和pFECT-SJIO在菸草植物中瞬 時表達ω-ACTX-Hvla蛋白。採用實施例1中詳細描述的技術，將2種FECT表達載體轉化 進入農桿菌菌株GV3101，並將所得GV3101轉化體注入菸草葉中用於在菸草葉中瞬時表達 ω-ACTX-Hvla。
[0245] 在菸草轉化後第6天，收集轉化的菸草葉，從葉中提取葉總可溶性蛋白質（有關詳 細方法參見實施例1)。然後進行Pierce Coomassie Plus蛋白質測定法以測定葉總可溶 性蛋白質的濃度，對於用編碼pFECT-SJIO和pFECT-BO的構建體轉化的葉，分別得到3. 047 ± 0· 176 Pg/^L (N=2)和 2. 473 ± 0· 209 Pg/^L 的值（N=2)。
[0246] 然後按實施例1中所述，使用上述TSP提取物進行間接ELISA方案以定量評價 ω-ACTX-Hvla蛋白的表達水平作為總可溶性蛋白的百分比（%TSP)，對於用pFECT-SJIO和 pFECT-BO 載體轉化的葉，分別得到 0. 133 ± 0. 014% (N=2)和 0. 0004 ± 0. 0003% 的值 (N=2)。這些數據表明，作為與Jun a 3的翻譯融合物表達的ω-ACTX-Hvla蓄積至未以與 Jun a 3蛋白的翻譯融合物表達的ω-ACTX-Hvla的300倍以上的較高穩態水平。
[0247] 上述實施例4, STA的作用還可用具有下列序列的雪花蓮凝集素（GNA)進行： DNILYSGETLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCNLVLYDVDKPIWATNTGGLSRSCFLSMQTDGNLVVYNPSNKPIW ASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYGTDRWATG(SEQ ID NO: 28) 〇
[0248] 實施例5 ICK基序融合蛋白表達ORF中穩定性蛋白結構域和ICK基序蛋白結構域間的可切割接 頭提高在轉基因植物中表達的所得ICK基序蛋白的殺蟲活性。
[0249] 因為大多數咀嚼式口器昆蟲分泌胰蛋白酶進入其腸中以消化食物，我們設計了編 碼在融合物的穩定性蛋白結構域和ICK基序蛋白結構域之間的胰蛋白酶可切割接頭的融 合蛋白表達0RF，以促進昆蟲腸中ICK基序結構域從完整融合蛋白中釋放。
[0250] 此處植物表達的ICK基序蛋白是ω-ACTX-Hvla，其胺基酸序列如下（一字母代 碼）： SPTCIPSGQPCPYNENCCSQSCTFKENENGNTVKRCD (SEQ ID NO: 24)。
[0251] 所使用的ω-ACTX-Hvla表達ORF編碼包含下列結構域的融合蛋白（Ν'至C'）： Jun a 3 信號肽：：Jun a 3: : IGER接頭：：ω-ACTX-Hvla，如上述結構式 ERSP-Sta-L-ICK 中 一樣。Jun a 3的起源和序列如上述實施例4中所述。
[0252] 在此所用的ERSP是Jun a 3天然信號肽，如上文實施例中所述。
[0253] 實施例1詳細描述了由在ORF中編碼的ω-ACTX-Hvla結構域和Jun a 3結構域 之間的序列編碼的IGER接頭。總之，這個ω-ACTX-Hvla表達ORF稱為S-Juna3-IGER-c〇 或SJI0。同樣，SJIO表達ORF所插入的FECT載體命名為pFECT-SJIO。
[0254] 然後使用載體pFECT-SJIO在菸草植物中瞬時表達ω-ACTX-Hvla蛋白。採用實施 例1中詳細描述的技術，將載體轉化至農桿菌GV3101中，之後將轉化的GV3101注入菸草葉 用於在葉中ω-ACTX-Hvla的瞬時表達。
[0255] 菸草葉轉化後第6天，收集3.3 g轉化的菸草葉，在液氮中研磨。按照實施例1描 述的程序，使用50 mL TSP-Sel緩衝液從研磨葉提取總可溶性蛋白（TSP)。從TSP提取程序 中回收總共26 mL提取物，然後將其均勻地分成2個樣品A和B，每組13 mL提取物。通過 在37°C下加入1.3 mL含I mg/mL胰蛋白酶的I mM HC1，用胰蛋白酶處理樣品A 1小時以 從融合的Jun a 3蛋白中釋放ω-ACTX-Hvla。樣品B不通過胰蛋白酶切割處理。為了得到 生物活性濃度範圍中的ω-ACTX-Hvla，按如下相同方式將2組濃縮。第一，將提取物加載 到具有10 kD截止值濾膜的濃縮器中，以3200 g離心2小時。然後保存I. 4 mL來自樣品 A的截留物和I. I mL來自樣品B的截留物以備稍後的試驗。12. 5 mL來自樣品A的濾液和 12. 5 mL來自樣品B的濾液通過具有I kD截止值濾膜的濃縮器以3200 g離心16小時進一 步濃縮。從樣品A中回收I. 3 mL截留物，從樣品B中回收I. I mL截留物。保存兩種I kD 截止值過濾截留物以備稍後的試驗。該樣品濃縮程序概述於圖10。將從pFECT-SJIO轉化 的菸草葉的總TSP提取物均勻地分成2個樣品。一個樣品（A)用胰蛋白酶切割處理，另一 個（B)不處理。兩組通過在具有10 kD然後I kD截止值濾膜的濃縮器中離心濃縮，保存自 10 kD和I kD截止值過濾的截留物用於進一步試驗。
[0256] SJIO表達ORF表達如下融合蛋白，Jun a 3: :IGER: : ω-ACTX-Hvla，其包含總共 266個胺基酸殘基，預測分子量為28, 204. 28 Da。該融合蛋白的胰蛋白酶切割應釋放分子量 為 4049. 2 Da 的 ω-ACTX-Hvla 和分子量為 24,155.1 Da 的 Jun a 3:: IGER 融合蛋白。因 此，如果胰蛋白酶切割反應在處理中完成，則預期過濾樣品的主要組分如下： 樣品A 10 kD過濾截留物Jun a 3: : IGER融合物。
[0257] 樣品 A I kD 過濾截留物：ω-ACTX-Hvla。
[0258] 樣品 B 10 kD 過濾截留物 Jun a 3: : IGER: : ω-ACTX-Hvla 融合物。
[0259] 樣品B I kD過濾截留物：無 SJIO表達的蛋白質。
[0260] 為了定量測定截留物樣品中的ω-ACTX-Hvla肽，按實施例1中所述進行iELISA。 樣品中所檢出的ω-ACTX-Hvla濃度如下： 樣品 A 10 kD 過濾截留物：1· 328 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 L 86 Pg。
[0261] 樣品 A I kD 過濾截留物：2. 768 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 3. 60 Pg。
[0262] 樣品 B 10 kD 過濾截留物：12. 656 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 13. 92 Pg。
[0263] 樣品 B I kD 過濾截留物：0· 752 ng/^L 的 ω-ACTX-Hvla，共 0· 83 Pg。
[0264] 如所表明的，在所分析的所有過濾樣品中檢出ω -ACTX-Hvla。在A組10 kD過濾 截留物中檢出的ω-ACTX-Hvla推測主要是因為未切割的融合蛋白的物理保留所致。同樣， B組I kD過濾截留物樣品中檢出的ω-ACTX-Hvla可能是由於未切割的融合蛋白通過10 kD 截止值濾膜的低速率的假過濾所致。
[0265] 為了證實胰蛋白酶-切割反應是成功的，進行了反向高效液相色譜法（rpHPLC)以 分析所保留的過濾樣品中的組分。使用具有Onyx 100 monolithic C18柱（4. 6 X 100 mm) 的Varian E218 HPLC系統，使用含0. 1%三氟乙酸的水（溶劑A)和含0. 1%三氟乙酸的乙 腈（溶劑B)為流動相組分，進行HPLC。使用10分鐘內10-20%溶劑B的線性梯度，以2 mL/ 分鐘的流速，將ω -ACTX-Hvla肽從柱上洗脫。將99%純的合成ω -ACTX-Hvla的樣品用於 rpHPLC以生成標準曲線（使峰面積與所注入的肽質量關聯）。圖11表示3個不同的洗脫 圖11A、11B、11C。如圖IlA所示，ω-ACTX-Hvla肽在注入後6.5分鐘洗脫出。當將來自B 組I kD過濾截留物的500 PL樣品加載到HPLC系統中時，在注入後6和7分鐘間，在相應 的HPLC色譜圖中沒有蛋白質峰（圖11Β)。當將來自A組I kD過濾截留物的500 PL樣品 加載到HPLC系統中時，在相應色譜圖的6. 3分鐘保留時間上有峰（參見圖11中的虛線）， 這就表示通過胰蛋白酶切割從融合蛋白中釋放的ω-ACTX-Hvla (圖11C)。該峰的面積相 當於樣品A I kD過濾截留物中ω-ACTX-Hvla的濃度介於16-70 ng/^L之間（取決於對峰 積分所採用的方法）。
[0266] 使用儲備的過濾樣品進行家蠅注射生物測定以測試呈融合蛋白形式和呈從融 合蛋白中釋放的形式的《-ACTX-Hvla的活性。家蠅蛹Clfesca 購自Benzon Research，Inc.，並保持在25°C的塑料盒中，盒蓋上有氣孔，盒中有蠅食物（1:1比率糖和奶 粉）和浸於水中的棉球。成體家蠅羽化的當天，使用〇)2線（CO2 line)將蠅固定，然後使用 CO2浸漬墊（infusion pad)保持不動。選擇重為12-18 mg的蠅用於注射生物測定。為了 進行家蠅注射，使用加載了帶有30號針的I cc玻璃注射器（其中加載了注射溶液）的微 型給藥器（microapplicator)，將0.5 PL劑量遞送至蠅的後胸。然後把經注射的蠅放入經 標記的帶有氣孔的盒中，並對注入後24小時的死亡率評分。給家蠅注射下列樣品（10隻蠅 的各組用於各樣品）： 水注射為陰性對照。
[0267] A組10 kD過濾截留物。
[0268] A組IkD過濾截留物。
[0269] B組10 kD過濾截留物。
[0270] B組I kD過濾截留物。
[0271] 0. 13 mg/mL胰蛋白酶溶液為陰性對照。
[0272] 在注射後24小時，樣品A 10 kD過濾截留物和樣品A I kD過濾截留物引起100% 的家蠅死亡率，而注射其它樣品的蠅觀察到〇%死亡率。純的天然序列ω -ACTX-Hvla顯示在 該家蠅注射生物測定中LD5tl為100 pmol/克家蠅；因此，為在該示例中引起100%死亡率，注 射的ω-ACTX-Hvla的濃度必須至少25 ng/^L。這與生物測定結果一致，因為樣品A I kD 過濾截留物的HPLC分析表明ω-ACTX-Hvla濃縮物的濃度為16-70 ng/^L。在家蠅注射生 物測定中，不包含用胰蛋白酶切割處理的材料的過濾樣品不引起死亡，這表明了與被胰蛋 白酶從融合構建體切除的天然-序列ω-ACTX-Hvla相比，Jun a 3融合的ω-ACTX-Hvla的 活性要小得多。因此，當設計成可切割的，使得ICK融合蛋白的ICK基序結構域可通過蛋白 酶解從蛋白質的其它結構結構域中釋放時，植物ICK基序蛋白表達ORF的接頭區可顯示殺 蟲功能提1?。
[0273] 第II部分.高產狀 在商業規模上成功生產具有可再現的肽形成和摺疊並具有成本控制的殺蟲肽的能力 可能是富有挑戰性的。肽的種類繁多、性能獨特且性質特殊，結合極其多種的可能的生產技 術，可提供肽生產的眾多方法。
[0274] 然而，有不多（如有任何描述的話）描述了如何改變肽使得它將以比改變前通常 生產肽的生產率高得多的生產率在生物系統中生產。在此我們提供了改變肽的組成的方 法，並且如此進行以提高肽生產的速率和量，同時降低肽生產的成本。我們描述了改變或 "轉化"一種肽成為一種不同的更有成本效益、但出人意料地仍具有正如其轉化前一樣毒性 的肽的新方法。
[0275] 我們描述了這些新的轉化肽的實例，而且我們表明這些用於改變或轉化肽的方法 如何可使肽的產量產生重大改進而不引起其活性顯著改變。本文描述並要求保護用於產生 這些肽的新的處置方法、新的肽、新的製劑和新的生物。描述了通過在殺蟲肽的N端加入二 肽來增加酵母表達系統的殺蟲肽產量的方法。加入二肽不會不利地影響殺蟲肽的殺蟲活 性。
[0276] 我們描述了這些新的轉化肽的實例，而且我們表明這些改變或轉化肽的方法如何 可在肽的產量中產生重大改進而不引起其活性顯著改變。本文描述並要求保護用於生產這 些肽的新的處置方法、新的肽、新的製劑和新的生物。
[0277] 用於生產高產肽的詳細程序。
[0278] 我們描述了可增加肽產量的處置方法和肽。當遵循這些技術時，可通過在天然肽 的N端加入二肽提供轉化肽，所述轉化肽在3個不同的方面具有比天然肽更好的生產率。第 一，二肽 -天然肽類（dipeptide-native peptide strain)的總平均產量好於天然類的總 平均產量；第二，二肽-天然肽類的中值產量好於天然的中值產量；第三，在較高的生產率 範圍下有比對於天然肽類而言更多的二肽類。此處所述方法可用於各種體內系統，包括植 物、動物和微生物。本發明需要在天然肽的N端加入二肽，所述天然肽在加入二肽之前是已 知的肽。已知肽然後被"轉化"，並且它隨後可以比之前料想的更高產量生產。在一個實施 方案中，殺蟲肽與二肽連接。這些二肽-天然肽系統可用於可產生所述肽的植物。植物生 產的肽具有各種用途，從生產到僅產生通過害蟲採食而獲得的毒肽，因此保護植物或可能 提供其它益處。
[0279] 在一個實施方案中，我們描述了用於通過在殺蟲肽的N端加入任何二肽在酵母表 達系統中提高殺蟲肽產量的方法。二肽由非極性胺基酸和極性胺基酸組成。非極性胺基酸 可選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸是 優選的非極性胺基酸。極性胺基酸可選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、 組氨酸、色氨酸和酪氨酸。絲氨酸是優選的極性胺基酸。描述了其中非極性胺基酸位於二 肽的N端的處置方法和胺基酸，在一個實施方案中，優選的二肽N端是甘氨酸。描述了其中 極性胺基酸位於二肽的C端的處置方法和胺基酸，在一個實施方案中，優選的二肽C端為絲 氨酸。
[0280] 在本發明的一個實施方案中，二肽為甘氨酸-絲氨酸、gly-ser或GS。這些胺基酸 通常由下列密碼子編碼：Gly可通過密碼子例如GGT、GGC、GGA、GGG編碼，Ser可通過密碼子 例如 TCT、TCC、TCA、TCG、AGT 和 AGC 編碼。
[0281] 設計殺蟲肽的轉基因使得其轉基因序列被優化以用於可能需要的特殊表達。例 如，可優化殺蟲肽的轉基因用於在酵母、植物、細菌和病毒中表達。本發明的這類用途的實 例可包括作物像玉米和大豆的轉基因的工程改造和優化，其目的是保護它們免遭蟲害。在 一個實例中，我們設計殺蟲肽的轉基因，使得其轉基因序列被優化用於在酵母表達系統的 特殊表達，例如使用乳酸克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母O cYcAia pasioris)和釀酒酵母cererisiae)。其它合適的酵母表達系統是本領域 已知的。二肽例如甘氨酸-絲氨酸（gly-ser)的核苷酸密碼子被加在成熟殺蟲肽的轉基因 序列的5'端。然後將轉基因序列與合適的表達載體連接，所述表達載體可提供合適的選擇 標記、用於特定酵母表達系統的強啟動子-終止子組、用於分泌的信號序列和介於各自的 信號序列和成熟肽序列之間的切割位點。然後通過本領域技術人員已知方法，包括電穿孔 或化學轉化方法，將殺蟲肽表達載體轉化到酵母細胞中，以產生穩定肽表達酵母菌株。當這 些酵母菌株在合適的培養基中生長時，產生通過將二肽序列甘氨酸-絲氨酸加至成熟殺蟲 肽的N端而修飾的殺蟲肽，其被分泌到生長培養基中。二肽甘氨酸-絲氨酸加到成熟殺蟲 肽的N端顯著增加殺蟲肽的產量，對肽的殺蟲活性無不利作用。
[0282] 我們的數據表明，使用我們在此描述了的程序，可製備以比別的方式可能的顯著 更高的產量生產的任何富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)。我們證實了使用我們描述了的高產 量技術，ICK和非ICK兩種類型的CRIP的產量可顯著增加。在此我們提供了兩種非常不同 的CRIP類型的產量引人注目並出乎意料地提高的證據。
[0283] 可被轉化的殺蟲肽可選自殺蟲毒液，例如蜘蛛的毒液。蜘蛛可以是澳大利亞漏鬥 網蜘蛛。來自澳毒蜘蛛屬或你屬的肽是U-ACTX-Hvla及其類似物，並且採用本文 所述程序特別易於製備。本文提供的序列表中描述了來自蜘蛛的具體肽實例。這些肽和其 它肽可採用本文所述程序轉化。
[0284] 可轉化的殺蟲肽可選自海葵毒素例如實施例3描述的ririt/is。海葵 在其正常生境中與澳毒蝴蛛屬或屬的漏鬥網蝴蛛相距甚遠，來自J/76WO/76 1 ririt/is的毒液不被視為與來自澳毒蝴蛛屬或的有毒肽一樣的ICK類型的毒 液，但是雖然海膽的毒液，像U-ACTX-Hvla毒肽和其它殺蟲毒液一樣，是ICK類型的毒液，但 它們全都是我們稱為富含半胱氨酸的殺蟲肽或CRIP的毒液類型，並在此首次如此鑑定出。 在所有部分中，本文所述程序預期並被認為與序列表的所有肽和與所述序列有關的本領域 技術人員將理解為是富含半胱氨酸的殺蟲肽或CRIP的所有肽一起運作。所有的這類肽和 其它肽可採用本文所述程序轉化。
[0285] 除所述方法以外，我們還公開了包含與肽的一端結合的二肽的新的高產肽，本文 為"HP肽"。在我們的實施方案中，所述肽是殺蟲肽。在一個實施方案中，將二肽加到肽的N 端。我們證實了生產具有ICK和非ICK CRIP肽兩者的高產量菌株的成功。在另一個實施 方案中，二肽由非極性胺基酸和極性胺基酸組成。在另一個實施方案中，非極性胺基酸選自 甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，極性胺基酸選自 絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、色氨酸和酪氨酸。在一個具體的實 施方案中，HP肽包括被修飾以具有二肽甘氨酸-絲氨酸作為本未修飾的成熟肽的前2個氨 基酸的肽。HP肽可通過將甘氨酸-絲氨酸加到U肽及其類似物以產生HP肽來產生。
[0286] 通過本文所述方法製備的修飾肽是新的，並且分別被要求保護。這些肽通過其全 部性質而不僅僅是其序列來描述。這些肽是新的，並具有獨特性質。本文公開並要求保護 HP肽及其製備方法兩者。
[0287] 有用肽的實例是眾所周知的，並可見於許多參考文獻。有用肽的一個類別是殺蟲 肽。殺蟲肽可通過其肽性質及其活性、通常為口服或注射殺蟲活性鑑定。在此我們提供幾 個實例以更好地說明和描述本發明，但本發明不限於這些實例。所有的這些實例和在此未 顯示的其它實例是對新的材料的描述，在此其首次被描述並要求保護。
[0288] HP (高產）肽在此定義為採用本文所述技術能夠以大於正常生產率生產的任何 肽。所述肽可具有殺蟲活性。通常，當給昆蟲注射時，殺蟲肽顯示活性，但局部施用於昆蟲 時，大多數沒有明顯活性。以多種方式測定HP肽的殺蟲活性。測量的常用方法廣為本領域 技術人員所知。所述方法包括但不限於根據各個參數例如癱瘓、死亡率、無法增加體重等的 計分，通過劑量反應圖擬合，確定中值反應劑量（例如〇) 5。、^)5(|、^：5(|』05(|)。可針對暴露於 不同劑量的所述殺蟲製劑中的昆蟲組群進行測量。可通過產生由概率單位分析和/或希爾 方程等限定的曲線進行數據分析。在這種情況下，劑量可通過皮下注射、通過高壓輸注、通 過提供殺蟲製劑作為食物或誘餌樣品的一部分等來給予。
[0289] 所公開的用於提供實例的目的且無意以任何方式限制的HP肽的具體實例為來源 於澳大利亞漏鬥網蜘蛛毒液的U肽及其同源物。這些肽的描述可參見本文件較早的部分。
[0290] 本說明書中的實例無意且不應用來限制本發明，它們僅供說明本發明。
[0291] 如上所述，許多肽是作為特別製備的處置方法主題的合適候選物。上文、下文和序 列表中所述序列是可特別製備的尤其合適的肽，且這些的一些已按照本發明特別製備，其 結果見下列實例。
[0292] GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHT VYYCR A SEQ ID NO: 5 (-字母代碼）。
[0293] 命名為"U+2-ACTX-Hvla"，在以下位置具有二硫橋：5-20、12-25、19_39。分子量為 4564. 85道爾頓。
[0294] GSRSC CPCYff GGCPff GQNCY PEGCS GPKV SEQIDN0: 29 (-字母代碼）。命名為"Av3+2"，在以下位置具有二硫橋：5-19、6-13、 8-24。分子量為3076. 47道爾頓。
[0295] HP狀的制各 本文所述HP肽可如下製備。設計殺蟲肽的可讀框（ORF)使得將其核苷酸序列優化用 於物種特異性表達。下面顯示的是通過將二肽加至殺蟲肽的N端以提高來自酵母表達系統 的殺蟲肽產量的方法的一個具體實例。二肽由非極性胺基酸和極性胺基酸組成。非極性氨 基酸可選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，甘氨 酸是優選的非極性胺基酸。極性胺基酸可選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、 酪氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺，絲氨酸是優選的極性胺基酸。在下面的實例中，非極性氨基 酸位於二肽的N端，並且是甘氨酸。在下面的實例中，極性胺基酸位於二肽的C端，並且是 絲氨酸。
[0296] 如下設計殺蟲肽ORF用於從宿主酵母細胞中分泌：0RF以信號肽序列開始，接著編 碼Kex 2切割位點（賴氨酸-精氨酸）的DNA序列，接著在5'端加入甘氨酸-絲氨酸密碼 子的殺蟲肽轉基因，最後以3'端的終止密碼子結束。所有這些元件可在酵母細胞中作為單 一可讀框表達成融合肽。α-交配因子信號序列最常用於促進重組殺蟲肽通過重組酵母的 內源分泌途徑的代謝加工，即表達的融合肽通常進入內質網，在其中α -交配因子信號序 列被信號肽酶活性除去，然後所得殺蟲肽原可運輸到高爾基體中，上述賴氨酸-精氨酸二 肽在其中被Kex 2內切蛋白酶完全除去，之後在其N端包含另外的非天然甘氨酸-絲氨酸 二肽的成熟的HP殺蟲肽從細胞中分泌出來。
[0297] 為了提高殺蟲肽在重組酵母細胞中的表達水平，殺蟲肽ORF的密碼子常被優化以 在特定的宿主酵母菌種中表達。指定宿主生物的內源可讀框內觀察到的天然存在的密碼子 頻率不一定被優化用於高效率表達。此外，不同的酵母菌種（例如乳酸克魯維酵母、巴斯德 畢赤酵母、釀酒酵母等）具有用於高效率表達的不同最優密碼子。因此，應對肽ORF包括編 碼信號序列的序列元件、Kex2切割位點和殺蟲肽，考慮密碼子優化，因為它們在重組酵母細 胞中最初作為一個融合肽翻譯。
[0298] 然後將密碼子優化肽表達DNA連接至合適的表達載體用於酵母表達。有許多可用 於酵母表達的表達載體，包括附加型載體和整合載體，並且它們常被設計成用於特定的酵 母菌株。鑑於將用於肽生產的特定的酵母表達系統，應仔細選擇合適的表達載體。我們在 此使用整合載體，其整合至轉化酵母細胞的染色體中，並在整個細胞分裂和增殖周期中是 穩定的。
[0299] 表達載體通常含有用於在大腸桿菌中DNA製備的一些大腸桿菌元件，例如大腸杆 菌複製起點、抗生素選擇標記等。載體還含有用於目標轉基因表達所需的一系列序列元件， 例如轉錄啟動子、終止子、酵母選擇標記、與宿主酵母DNA同源的整合DNA序列等。有許多 可利用的合適的酵母啟動子，包括天然和改造的啟動子。在我們的工作中，使用了酵母啟動 子例如pLAC4、pA0Xl、pUPP、pADHl、pTEF、pGall等。我們還使用下列常用的酵母選擇標記 ： 乙醯胺原養型選擇、zeocin抗性選擇、遺傳黴素抗性選擇、諾爾絲菌素抗性選擇、尿啼陡缺 乏選擇。還可使用本領域的技術人員已知的其它標記。整合DNA序列與轉化酵母菌種中的 定向基因組DNA基因座同源，所述整合序列包括pLAC4、25S rDNA、pA0Xl和TRP2等。殺蟲 肽轉基因的位置可在整合DNA序列附近（插入載體）或在整合DNA序列內（置換載體）。
[0300] 為了得到更多拷貝的整合至宿主酵母染色體的殺蟲肽0RF，可設計並產生含有2 個或3個拷貝的殺蟲肽表達盒的表達載體。表達載體中殺蟲肽表達盒的每個拷貝可含有包 括啟動子、信號序列、Kex2切割序列和殺蟲肽轉基因、終止密碼子、轉錄終止子的獨立和完 整的表達結構。
[0301] 然後將肽表達載體轉化至酵母細胞中。首先，表達載體通常通過特定的限制性內 切酶切割線性化以利於通過同源重組的染色體整合。線性表達載體然後通過化學或電穿孔 轉化方法轉化至酵母細胞中，並通過同源重組整合至酵母基因組的定向基因座。整合可多 次發生在相同的染色體基因座；因此，轉化酵母細胞的基因組可含有殺蟲肽轉基因的多個 拷貝。可利用有利於經工程改造進入表達載體並與殺蟲肽轉基因共整合至酵母染色體中的 選擇標記的生長條件，來鑑定成功的轉化體；這類標記的實例包括但不限於乙醯胺原養型、 zeocin抗性、遺傳黴素抗性、諾爾絲菌素抗性和尿嘧啶原養型。
[0302] 由於不可預測和可變因素（例如基因和基因網絡的後天修飾和進行轉化程序的 群體中各個細胞中發生的整合事件數目的變化）的影響，指定轉化過程的各個酵母轉化體 在其廣生轉基因殺蟲膚的能力上將不同。因此，可針對商廣量菌株篩選攜帶殺蟲膚轉基因 的酵母轉化體。用於這種篩選的兩種有效方法（各依賴於轉化體的小規模培養物的生長以 提供條件培養基樣品用於後續分析），使用反向HPLC或家蠅注射程序以分析來自轉化體的 條件培養基樣品。
[0303] 轉化體培養通常在14 mL圓底聚丙烯培養管（含5-10 mL確定成分培養基加入各 管中）或48孔深孔培養板（含1-2 mL確定成分培養基加入各孔）中進行。確定成分培養 基，不含未加工的蛋白質性提取物或副產物例如酵母提取物或蛋白腖，被用於培養以降低 收穫用於稍後篩選步驟的條件培養基的蛋白質背景。培養在最適溫度（例如對於乳酸克魯 維酵母為23.5°C)下進行5-6天，直到達到最大細胞密度。殺蟲肽此時由轉化體產生，並分 沁到細胞以外進入生長培養基。為了製備用於篩選的樣品，通過離心從培養物中除去細胞， 收集上清液作為條件培養基，然後使其通過〇. 22 Mm濾膜過濾澄清，之後使之準備就緒用於 殺蟲肽生產菌株篩選，下面描述了所述篩選方法的兩個實例。
[0304] 篩選方法之一是轉化體的反向HPLC (rpHPLC)篩選。在這種篩選方法中，使用具 有C18鍵合相的HPLC分析柱。乙腈和水用作流動相溶劑，設置在220 nm處的UV吸光度檢 測器用於肽檢測。將適量的條件培養基樣品加載到rpHPLC系統中，用線性梯度的流動相溶 劑洗脫。HPLC色譜儀中相應的殺蟲肽峰面積用來定量測定條件培養基中的殺蟲肽濃度。以 相同的HPLC方案，使已知量的純殺蟲肽通過相同的rpHPLC柱運行以證實肽的保留時間，以 生成用於定量的標準肽HPLC曲線。
[0305] 第二種篩選方法是家蠅注射測定法。當以實測劑量通過後胸體壁注射時，殺蟲肽 可殺死家蠅。殺蟲肽的效能可通過肽的致死劑量中值（LD50)定義，所述死劑量中值引起已 注射家蠅的50%死亡率。純的殺蟲肽通常用於家蠅注射測定法以生成標準劑量反應曲線， 從該曲線中可求出LD50值。利用來自所述純的殺蟲肽的標準劑量反應曲線分析的LD50值， 採用用系列稀釋的相應條件培養基進行的家蠅注射測定法，可實現由酵母轉化體產生的殺 蟲肽的定量。
[0306] 殺蟲肽生產菌株篩選可從數百個轉化體中鑑定出高產量酵母菌株。當使用優化發 酵培養基和發酵條件時，可將這些菌株在生物反應器發酵以達到高達6 g/L的殺蟲肽產量。 與採用在轉化前用來生產肽的相同或類似生產方法的轉化前的肽可能達到的產量相比，更 高的生產率可以是介於 20-400、20-100、20-200、20-300、40-100、40-200、40-300、40-400、 60-100,60-200,60-300,60-400,80-100,80-200,80-300,80-400,100-150,100-200, 150-200、200-250、250-300、250-350、250-400、300-350、300-400% 和 350-400 或所提供的 任何值的任何範圍或甚至更高的產量。
[0307] 利用此處教導的程序和本領域的普通技術人員的知識，來自序列表的任何序列， 和據我們所知任何CRIP全都可用來製備類似於下文所述的我們稱其為"U+2"肽的來自 澳大利亞布魯山脈漏鬥網蜘蛛的ACTX基序或我們在以下實施例中教導和描述的毒海葵 的Av3+2肽的高產肽。另外，任何其它合適的CRIP肽都可以類似的方式 用於生產高產肽或加2 (即+ 2)肽。
[0308] 高產狀的實施例 本說明書中的實施例無意且不應用來限制本發明，它們僅供說明本發明。
[0309] 實施例1 天然U和U+2-ACTX-Hvla在乳酸克魯維酵母中中的表達。
[0310] 待表達的殺蟲膚： U+2-ACTX-Hvla ： GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID N0:5)和 天然 U-ACTX-Hvla : QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA (SEQ ID N0:6)。
[0311] 為了在乳酸克魯維酵母中表達上述兩種殺蟲肽，使用表達載體pKLACl和乳酸克 魯維酵母菌株 YCT306,其可獲自 New England Biolabs，Ipswich，MA，USA。pKLACl 載體是 一種整合表達載體。一旦將U+2和天然U-ACTX-Hvl轉基因克隆至pKLACl並轉化至YCT306 中，其表達受LAC4啟動子控制。所得的轉化體產生包含α-交配因子信號肽、Kex2切割位 點和成熟殺蟲肽的前肽原（pre-prop印tide)。α-交配因子信號肽引導前肽原完成內源分 泌途徑，最後將成熟殺蟲肽釋放到生長培養基中。
[0312] 在兩輪中進行U+2-ACTX-Hv I a表達的密碼子優化。在第一輪中，根據高表達DNA序 列的一些共同特徵，設計了表達α_交配因子信號肽、 Kex2切割位點和U+2-ACTX-Hvla肽的 肽ORF的33個變體，並在乳酸克魯維酵母的YCT306菌株中評價其表達水平，得到初步的乳 酸克魯維酵母表達算法。在第2輪優化中，根據初步乳酸克魯維酵母表達算法設計了 5個 更多的變體U+2-ACTX-Hvla肽ORF以進一步細調乳酸克魯維酵母表達算法，並鑑定出用於 在乳酸克魯維酵母中U+2-ACTX-Hvla肽表達的最佳0RF。該DNA序列具有編碼α-交配因 子信號肽、Kex2切割位點和U+2-ACTX-Hvla肽的可讀框。使用Hind III和Not I限制位 點，將優化的DNA序列克隆至pKLACl載體，得到U+2-ACTX-Hvla表達載體pLB10V5。
[0313] 為了使更多拷貝的優化U+2-ACTX-Hvla轉基因在轉化期間能夠整合至乳酸克魯 維酵母基因組，如下進行含有2拷貝的U+2-ACTX-Hvla表達盒的U+2-ACTX-Hvla表達載體 的產生：合成了 3,306 bp完整U+2-ACTX-Hvla表達盒DNA序列，其包含完整LAC4啟動子元 件、密碼子優化的U+2-ACTX-Hvla肽ORF元件和pLAC4終止子元件。然後將該完整的表達 盒在PLB10V5的pLAC4終止子下遊的Sal I和Kpn I限制位點之間連接至pLB10V5載體， 得到雙重轉基因 U+2-ACTX-Hvla表達載體pLB10V5D。
[0314] 為了產生天然U-ACTX-Hvla表達載體，使用Stratagene位點定向誘變試劑盒，通 過使U+2-ACTX-Hvla轉基因區的5'端的甘氨酸-絲氨酸密碼子缺失，使pLB10V5載體誘 變。這種誘變得到含有單拷貝的密碼子優化的天然U-ACTX-Hvla表達盒的新的載體pLB12。 為了產生雙重轉基因天然U-ACTX-Hvla表達載體，再次使用Stratagene位點定向誘變試 劑盒，以除去之前合成的3, 306 bp U+2-ACTX-Hvla表達盒轉基因中U+2-ACTX-Hvla轉基 因區的5'端的甘氨酸-絲氨酸密碼子，接著通過連接將該誘變盒在Sal I和Kpn I限制 位點之間插入PLB12載體，得到質粒pLB12D，一種包含2個完整拷貝的密碼子優化的天然 U-ACTX-Hvla表達盒的表達載體。
[0315] 然後按照乳酸克魯維酵母蛋白質表達試劑盒所提供的說明書，使用Sac II限制 性內切核酸酶使雙重轉基因載體PLBlOVro和pLB12D線性化，並化學轉化至乳酸克魯維酵 母的YCT306菌株中。使所得的轉化體在補充5 mM乙醯胺的YCB瓊脂板上生長，僅乙醯胺 酶-表達的轉化體可有效利用乙醯胺作為氮的代謝源。
[0316] 對於殺蟲肽產量評價，從pLBlOVro轉化體板中挑選出316個菌落，從pLB12D轉化 體板中挑出40個菌落。將菌落的接種物各自培養在6 mL加入2%純甘油作為碳源的確定 成分的乳酸克魯維酵母培養基中。在280 rpm下振蕩的同時，將培養物在23. 5°C下溫育6 天，屆時培養物中的細胞密度達到最大水平，如通過600 nm處的吸光度（0D600)所表明。然 後通過以4, 000 rpm離心10分鐘，從培養物中除去細胞。所得上清液（條件培養基）通過 0.2 μ m膜過濾用於HPLC產量分析。
[0317] 對於膚產量評價，在配備Onyx monolithic 4. 5 X 100 mm、C18反向分析型HPLC 柱和自動注射器的Agilent 1100 HPLC系統中分析經過濾的條件培養基樣品。HPLC級水和 乙腈，兩者都含有〇. 1%三氟乙酸，構成用於HPLC分析的兩種流動相溶劑。使用HPLC色譜 儀測量天然U和U+2-ACTX-Hvl兩者的峰面積，然後用來計算在條件培養基中的肽濃度，然 後進一步將其歸一化至相應的最終細胞密度（如通過0D600測量所測定）作為歸一化肽產 量。
[0318] 採用家蠅注射生物測定評價肽的殺蟲活性。將條件培養基系列稀釋以生成來自家 蠅注射生物測定的完整劑量反應曲線。在注射前，成年家蠅你 /?sea 用CO2固 定，選擇12-18 mg家蠅用於注射。使用加載Icc注射器和30號針的微型給藥器，將0.5μ?7 蠅劑量的系列稀釋的條件培養基樣品通過後胸體壁給家蠅注射。將經注射的蠅放入具有潮 溼濾紙和蓋上有呼吸孔的封閉容器中，在注入後24小時，通過死亡率評分對其進行檢測。
[0319] 計算歸一化產量。肽產量意指條件培養基中的肽濃度，單位為mg/L。但是肽產量 不總是足以精確比較菌株的生產率。各菌株可能具有不同的生長速率，因此在收穫培養物 時，不同培養物的細胞密度可能改變。具有高細胞密度的培養物可能在培養基中產生較高 濃度的肽，即使菌株的肽生產率低於具有較高的生產率的另一個菌株。因此術語"歸一化產 量"通過肽產量除以相應培養物中的細胞密度產生，這允許更好地比較菌株間的肽生產率。 細胞密度用600 nm處單位為"A"（吸光度單位）的吸光度表示。
[0320] 表1、圖12和圖13概括了來自乳酸克魯維酵母菌株的U+2-和天然U-ACTX-Hvla 歸一化肽產量分布。來自乳酸克魯維酵母菌株的總體平均U+2-ACTX-Hvla歸一化肽產量為 4. 06 ± 3. 05 mg/L.A，通過99%置信水平的Stuent's t檢驗，這統計顯著性地高於平均的 天然U-ACTX-Hvla歸一化肽產量2.73 ± 1.25 mg/L.A。U+2-ACTX-Hvla乳酸克魯維酵母 菌株的歸一化肽產量中值為9. 36 mg/L. A，這幾乎是天然U-ACTX-Hvla菌株產量中值（3. 35 mg/L.A)的3倍。與天然U-ACTX-Hvla菌株相比，在高產量水平下U+2-ACTX-Hvla肽表達菌 株具有高得多的菌株計數比率。所有這些結果表明甘氨酸-絲氨酸二肽加至U-ACTX-Hvla 肽的N端有助於表達該肽的酵母轉化體的預測產量的顯著增加。
[0321] 表1表示來自乳酸克魯維酵母菌株的肽產量的比較。
[0322] 表I. U+2和天然U-ACTX-Hvla肽產量比較
【權利要求】
1. 一種包含與富含半胱氨酸的殺蟲蛋白（CRIP)例如抑制物半胱氨酸結（ICK)基序蛋 白有效連接的內質網信號肽（ERSP)的蛋白質，其中所述ERSP是所述蛋白質（ERSP-ICK)的 N端。
2. 權利要求1的肽，其中所述ERSP是將表達的CRIP導向植物細胞的內質網的任何信 號肽。
3. 權利要求2的肽，其中所述CRIP是抑制物半胱氨酸結（ICK)蛋白。
4. 權利要求2的肽，其中所述CRIP是非ICK蛋白。
5. 權利要求2的肽，其中所述ERSP是來源於植物的長度為5-50個胺基酸的肽。
6. -種與翻譯穩定性蛋白（STA)有效連接的權利要求1的肽，其中所述ERSP是所 述蛋白質的N端，翻譯穩定性蛋白（STA)可在任選為ICK基序蛋白（ERSP-STA-ICK)或 非ICK基序蛋白（ERSP-STA-非ICK)的CRIP的N端一側；或者在ICK或非ICK基序蛋白 (ERSP-ICK-STA)或（ERSP-非 ICK-STA)的 C 端一側。
7. -種具有添加至已知肽並與所述已知肽有效連接的N端二肽的肽，其中所述N端 二肽由二肽N端的一個非極性胺基酸和二肽C端的一個極性胺基酸組成，其中所述肽選自 CRIP (富含半胱氨酸的殺蟲肽），例如選自ICK肽或非ICK肽。
8. -種具有添加至已知肽並與所述已知肽有效連接的N端二肽的權利要求7的肽，其 中所述N端二肽由二肽N端的一個非極性胺基酸和二肽C端的一個極性胺基酸組成。
9. 權利要求8的肽，其中所述來自N端二肽的N端胺基酸的非極性胺基酸選自甘氨酸、 丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。
10. 權利要求8的肽，所述N端肽的C端胺基酸的極性胺基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱 氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、色氨酸、酪氨酸。
11. 權利要求8的肽，其中所述來自N端二肽的N端胺基酸的非極性胺基酸選自甘氨 酸、丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸，所述N端肽的C端氨 基酸的極性胺基酸選自絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、組氨酸、色氨酸、酪 氨酸。
12. 權利要求11的肽，其中所述二肽由甘氨酸-絲氨酸組成。
13. -種包含至少兩種類型的殺蟲蛋白或肽的組合物，其中一種類型是成孔殺蟲蛋白 (PFIP)，另一種類型是富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)。
14. 權利要求13的組合物，其中所述CRIP是ICK，任選所述ICK源自於或來源於 Fersyte 或布魯山脈漏鬥網蝴蛛、Jtraz 包括稱為 U-ACTX 多肽、U-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvla、rU-ACTX-Hvlb 的毒素或突 變體或變體。
15. 權利要求14的組合物，其中所述CRIP是非ICK CRIP，任選所述非ICK CRIP源自 於或來源於具有非ICK CRIPS的動物，例如海葵、海膽和海蛤蝓，任選包括名為 hrit/i的海葵，任選包括名為Av2和Av3的肽，尤其類似於Av2和Av3的肽，包括序列表所 列出的這類肽或突變體或變體。
16. -種使用權利要求13的組合物控制Bt抗性昆蟲的方法，所述方法包括產生至少兩 種類型的肽的組合物，其中一種類型的肽是成孔殺蟲蛋白（PFIP)，另一種類型的肽是富含 半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋白選自權利要求1和本文描述的任何組合物 和序列表提供的任何蛋白質；然後將所述組合物施用於昆蟲所在地。
17. -種包括保護植物免遭Bt抗性昆蟲在內的控制Bt抗性昆蟲的權利要求16的方 法，所述方法包括產生表達至少兩種正確摺疊的肽的組合的植物，其中一種類型的肽是成 孔殺蟲蛋白（PFIP)，另一種類型的肽是富含半胱氨酸的殺蟲肽（CRIP)，且PFIP和CRIP蛋 白選自本文所述的任何組合物和選自序列表提供的任何蛋白質。
18. 權利要求16的方法，其中在PFIP影響昆蟲腸內襯期間的任何時間給予CRIP。
19. 權利要求18的方法，其中在測試昆蟲的Bt抗性後給予CRIP，且其中所述昆蟲的Bt 抗性測試為陽性。
20. 將呈固體或液體形式的本文所述任何化合物施用於昆蟲、昆蟲所在地，或作為植物 結合殺蟲劑施用。
【文檔編號】A01N63/02GK104411714SQ201380024489
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年3月8日 優先權日:2012年3月9日
【發明者】R.M.甘迺迪, W.特德福德, C.亨德裡克森, R.維納布爾, C.富涅, J.麥金泰爾, A.卡爾森, 鮑林 申請人:韋斯塔隆公司