Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測試劑盒及其製備方法和檢測方法
2023-07-24 12:42:41
專利名稱：Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測試劑盒及其製備方法和檢測方法
技術領域：
本發明涉及Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測試劑盒及其製備方法，本發明還涉及一種Bt晶體蛋白放射免疫檢測方法。
背景技術：
轉Bt基因植物具有很好的抗蟲性，所以Bt基因被廣泛地轉入棉花、玉米等農作物中。Bt晶體蛋白是轉Bt基因生物的Bt基因表達產物，是鑑定抗蟲性的重要指標，其快速、準確測定，為育種、轉基因植物的蟲害管理和基因標識提供技術支撐。
現有技術所用的酶聯免疫檢測Bt晶體蛋白方法存在如下的缺陷1、檢測結果不穩定，因酶促反應易受反應條件的影響，；2、反應時間長，測樣時間長達24小時以上(包括包被時間)；3、操作步驟多，較為繁瑣。
放射免疫法檢測Bt晶體蛋白，雖測定結果穩定，但傳統放射免疫法需離心分離抗原-抗體複合物，操作繁瑣，且檢測時間最短也需3小時。現有的較新技術放射免疫法抗原抗體反應是在固相界面進行，不需離心，但是反應時間比傳統放射免疫方法還長。
因此，現有技術的檢測Bt晶體蛋白方法均不能達到快速、簡便的要求。
發明內容
本發明的目的是建立一種快速、簡便的Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測方法，並提供一種快速、簡便的Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測試劑盒。
本發明提供了一種用於檢測Bt晶體蛋白CrylAc的放射免疫檢測試劑盒，該盒包括有磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體和磁性微粒聯接的羊抗兔IgG。
所述檢測試劑盒中還包括本領域技術人員進行Bt晶體蛋白放射免疫檢測所用的其它常規試劑，如Bt晶體蛋白CrylAc標準溶液、125IBt晶體蛋白CrylAC、質量控制樣品及蛋白提取液等。
上述用於檢測Bt晶體蛋白CrylAc的放射免疫檢測試劑盒的製備方法如下1、製備超順磁微粒，並與Bt晶體蛋白Cry1Ac抗體聯接，提供磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體；2、製備磁性聯接羊抗兔IgG，形成磁性微粒聯接的羊抗兔IgG；所述磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白的製備方法是將Aerosol604的戊二醛溶液與Fe3O4水溶液混合，將混合液調製為鹼性，離心得到100nm微粒；將所得微粒經過戊二醛活化後再離心，將所得沉澱物與Bt晶體蛋白CrylAc抗血清混合、再經離心得到磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體；所述磁性微粒聯接的羊抗兔IgG的製備方法是將Aerosol604的戊二醛溶液與鐵粉溶液混合，將混合液調製為鹼性，離心得到100nm微粒；將所得微粒經過戊二醛活化後再離心，將所得沉澱物與羊抗兔IgG混合、再經離心得到磁性微粒聯接的羊抗兔IgG。
其中磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白和磁性微粒聯接的羊抗兔IgG的製備中，所述鹼性為pH10-12。所述將混合液調製為鹼性後，進行氮氣脫氧後振蕩，使反應均勻、完全。
上述檢測試劑盒中其它成分均為本領域公知的Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測所用的其它常規試劑，可以外購或按文獻配製，詳見實施例。
將所述檢測試劑盒中所有成分按一定量裝入盒中，即可。
用本發明的檢測試劑盒進行Bt晶體蛋白放射免疫檢測的方法是，在若干放射免疫管中分別加入待測樣品、Bt晶體蛋白CrylAc標準溶液和質量控制樣品，然後對每一放射免疫管分別進行如下操作1.加入上述磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體；2.加入125I-Bt晶體蛋白CrylAc，混勻；3.將放射免疫管放置在磁分離器的管架上，連接磁分離器底部磁鐵25分鐘，再移走磁鐵；4.加入上述磁性微粒聯接的羊抗兔IgG，振蕩搖勻。再連接磁分離器底部磁鐵5分鐘；5.倒出溶液，加緩衝液衝洗一次後測沉澱放射性計數(cpm)；6.計算各管的結合率，作標準曲線，根據標準算出待測樣品的含量。
在外加磁場的作用下，所製備的超順磁顆粒吸附抗體，可加速與抗原的免疫反應，反應時間30分鐘可達到平衡。
免疫反應平衡後，在反應容器底部放置磁鐵，磁二抗(磁性聯接羊抗兔IgG)可與抗原-抗體複合物(Bt晶體蛋白CrylAc抗原與Bt晶體蛋白CrylAc抗體複合物)結合併自動沉澱，不用離心即可進行分離。
本發明在現有的放射免疫檢測技術的基礎上進行改進，所建立的檢測方法和檢測試劑盒可提高抗原抗體反應速率，減少測樣時間，測定時間小於40分鐘(達到免疫反應平衡時間30分鐘)。本發明操作簡便，抗原-抗體複合物為液-液反應，且分離時無需離心；制樣簡單蛋白只需粗提，不用離心分離。種子樣品不用去酚和脫脂。
具體實施例方式實施例11、Bt晶體蛋白CrylAc的提取、純化培養基液體LB(參見金冬雁等翻譯，原著J.薩姆布魯克，1992。分子克隆實驗指南第二版，科學出版社)Tryptone1％，Yeast extract 0.5％，NaCl1％，pH7.0，15磅，20min。
液體Z氏(參見左雅慧等，1999，幾種Bt培養基的篩選和晶體蛋白純化方法初探，植物保護，25(3)，31-31)蛋白腖1％，酵母粉0.2％，可溶性澱粉0.3％，葡萄糖0.2％，K2HPO40.1％，KH2PO41％，CaCO30.2％，pH7.0，15磅，20min。活化菌株挑取單菌落(HD-73)於LB液體培養基中，37℃，200rpm，搖瓶培養20-24小時。提取步驟按1％的接菌量將活化的菌液轉接Z氏液體培養基中，37℃搖瓶培養36-48小時。離心，5000rpm，5min，收集所有菌體，Na2CO3裂解4-6hrs，0℃；aAc沉澱4hrs，0℃；離心，12000rpm，10min，4℃；收集沉澱，加適量Na2CO3溶解沉澱，0℃；DS-PAGE電泳定量檢測，獲得BtCry蛋白(130KD)Trypsin酶解BtCry蛋白取1mlBt Cry蛋白液，按蛋白Trypsin＝50∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解8小時得到酶解產物(Bt Cry蛋白的毒素部分60KD)。
BtCry蛋白的活性檢測BtCry蛋白對小菜蛾、棉鈴蟲均有較高的殺蟲活性。
2、抗血清製備把Bt蛋白配製成0.6mg/ml溶液，加等量福氏完全試劑乳化，在紐西蘭白兔背部皮內多點注射，每兩周加強免疫一次，免疫劑量減半，二個月後靜脈取血，用放射免疫法測定抗血清。當抗血清滴度達到1∶5000以上時，可全部取血，取血清，離心進行純化。(所得抗血清滴度1∶10000)3、標準配置取純品Bt晶體蛋白CrylAc，用緩衝液配成標準系列0，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml。
4、超順磁微粒的研製與抗體聯接(1)用戊二醛將Aerosol604配成1％。溶液。
(2)用少量蒸餾水溶解一定量Fe3O4粉末，加入100ml上述溶液中。混合液置入一個帶蓋的溶液中，滴加10N NaOH至pH11。
(3)用氮氣使其脫氧後，將容器蓋緊，並將其放到振蕩器中。
(4)在室溫下振蕩24小時，每隔一定時間用10N NaOH調節pH，使維持pH11。
(5)將混合物對水充分透析。
(6)以2000×g離心30分鐘，使微粒沉澱。
(7)將微粒懸在蒸餾水中。
(8)加入戊二醛，使微粒活化1小時。
(9)離心，棄上清，加入抗血清(Tris-HCl緩衝液稀釋)，在室溫下作用8小時。
(10)離心，棄上清，用PBS洗滌，用BSA液封團未被聯接的區域。
(11)去除BSA液，洗滌。在4℃下保存。
5、磁分離劑研製製備方法同4相似，只是把3％的鐵液代替Fe3O4溶液，用羊抗兔IgG代替抗血清。
6、Bt晶體蛋白CrylAc的125I標記將185MbqNa125I與100μl的Bt晶體蛋白CrylAc溶液(30μ)，用氯胺T法標記，經凝膠層析分離，收集125I-蛋白峰。用0.1M，pH7.4PBS稀釋至200μl中含有2000cpm。
7、組裝(1)抗體最適量的確定選取結合率為50-60％時的抗體濃度為實用濃度；(2)標準調製按表1順序加樣(從左至右)，用對數紙作結合率-濃度曲線，求相關係數。
當相關係數小於0.9990時，調整標準濃度。
表1加樣順序 (單位μl)
(3)把抗體、125I標記抗原、分離劑、標準和質控(由純品配製，濃度分別為10ng/ml，400ng/ml和1000ng/ml)，放置包裝盒內。
實施例2試劑盒組成1.Bt晶體蛋白CrylAc標準溶液(0.05M磷酸緩衝液pH7.4)系列，濃度分別為1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、1ng/ml和0ng/ml，共7瓶，各1ml。
2.磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體溶液(Tris-HCl緩衝液)一瓶，10ml。蘭色。
Bt晶體蛋白CrylAc抗體的製備參見文獻(李振甲韓春生王建勳主編，實用放射免疫學。科學技術出版社pp21-40)。
磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體的製備Aerosol 604的1％戊二醛溶液與Fe3O4水溶液混合，並調製為一定的pH後，經氮氣脫氧後振蕩24小時(保持pH)，對水透析、離心，得到100nm微粒。微粒經過戊二醛活化後離心，沉澱物與Bt晶體蛋白CrylAc抗血清(Tris-HCl緩衝液)混合，在室溫下作用8小時。經離心、磷酸緩衝液洗滌、牛血清白蛋白封閉即得。
3.125I Bt晶體蛋白CrylAC一瓶，10ml，紅色，每100μl放射性活度約20000cpm。製備方法參見文獻(李振甲 韓春生 王建勳主編，實用放射免疫學。科學技術出版社pp41-59。
4.磁分離劑(磁性微粒聯接的羊抗兔IgG)一瓶，100ml，黑色。其主要成分為磁性微粒聯接的羊抗兔IgG。
羊抗兔IgG購自北京欣經科生物技術有限公司，產品號10227。
磁性微粒聯接的羊抗兔IgG的製備Aerosol 604的1％戊二醛溶液與鐵粉溶液混合，並調製為一定的pH後，經氮氣脫氧後振蕩24小時(保持pH)，對水透析、離心，得到100nm微粒。微粒經過戊二醛活化後離心，沉澱物與羊抗兔IgG(Tris-HCl緩衝液)混合，在室溫下作用8小時。經離心、磷酸緩衝液洗滌即得。
5.質量控制樣品，低、中、高濃度各1瓶，各1ml。
由Bt晶體蛋白CrylAc陽性和陰性質量控制標準樣品(Agdia公司，陽性質量控制樣品LPC05200(貨號)及陰性質量控制樣品LNC05200)配製。
6. 蛋白提取液一瓶，200ml(1L蒸餾水中含有無水碳酸鈉2.66g、氯化鈉2.92g和Vclg，自行配製，用於測樣時樣品的蛋白粗提)
實施例3測樣過程1.樣品採集和蛋白粗提取籽粒或新鮮葉片1g，加入蛋白提取液(1L蒸餾水中含有無水碳酸鈉2.66g、氯化鈉2.92g和Vclg)2ml，研磨成勻漿，轉移到小試管中，稍微甩一下，靜止5分鐘。吸取上清液待測。
2.操作程序1)在塑料試管上編號，包括非特異管(NSB)、零結合管(S0)、標準管(S1-S6)、質控管(Qcl，2，3)，樣本管(U)，以上試管必須雙管標號。
2)向NSB管加入200μl零標準品，S0管加入100μl零標準品，向其它試管加入100μl相對應的標準、質控或樣本。
3)向除了NSB管之外的所有試管中加入100μl微粒聯接抗血清。
4)向所有試管中加入100μl125I-Bt晶體蛋白CrylAc，混勻，任取三管測放射性計數，取其平均值作為總放射性計數(T)。
5)把所有試管置於磁分離器的上層管架上，連上磁分離器底部磁鐵，37℃放置25分鐘。移走底部磁鐵。
6)向所有試管中加入1.0ml磁分離劑，振蕩搖勻。再連上磁分離器底部磁鐵，5分鐘。
7)倒出溶液，加緩衝液衝洗一次。測沉澱放射性計數(cpm)。
3.結果計算1)計算每對試管(T、NSB、B0、B)的平均計數，淨計數＝平均cpm-本底計數2)非特異結合率和最大結合率分別為NSB/T×100，(B0-NSB)/T×1003)各標準管、樣本管結合率為B/B0％＝(B-NSB/B0-NSB)×100，其中B＝標準管(或樣本管)雙管計數的均值，B0＝零標準(S0)雙管計數的均值，NSB＝非特異雙管計數的均值。
4)以上各標準碘的B/B0％為縱坐標，以標準點濃度為橫坐標，在Logit-Log雙坐標紙上作標準曲線。
5)根據待測樣本的結合率，從標準曲線上查出相應的樣品Bt蛋白含量。
表2不同免疫反應時間下的測定效果
注1.免疫反應時間在30分鐘時，結合率、質控測定值在允許範圍內。
2.分離無需離心。
3.分析靈敏度為0.5ppb(0.5ng/ml)。
4.反應溫度為37℃。
實施例4與酶聯免疫法相比較進行Bt晶體蛋白CrylAc測定分別用本發明的方法與現有酶聯免疫方法測定了玉米和棉花樣品中Bt晶體蛋白Cry1Ac含量，並進行了比較。
實驗目的檢查本發明方法及試劑盒的檢測結果的準確性；測定方法1、樣品的提取，同實施例3測樣過程1.樣品採集和蛋白粗提；2、酶聯免疫法的測定依照Bt晶體蛋白CrylAc試劑盒(Agdia公司，貨號PSA05200/0096)說明書進行；3、本發明方法的測定步驟同本發明實施例3中的2.操作順序；結果見下表。
表3玉米和棉花Bt晶體蛋白CrylAc測定結果
從表中數據可看出陰性樣品用本發明方法測定的結果為陰性，陽性樣品用本發明方法測定的結果為陽性，並且兩種方法測定樣品含量的數據無顯著性差異。
結論本發明方法測定結果與酶聯免疫法相符。
權利要求
1.一種用於檢測Bt晶體蛋白CrylAc的放射免疫檢測試劑盒，該盒包括有磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體、磁性微粒聯接的羊抗兔IgG及用於Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測所用的常規試劑。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒的製備方法，其中所述磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體的製備方法是將Aerosol 604的戊二醛溶液與Fe3O4水溶液混合，將混合液調製為鹼性，離心得到100nm微粒；將所得微粒經過戊二醛活化後再離心，將所得沉澱物與Bt晶體蛋白CrylAc抗血清混合、再經離心得到磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體；所述磁性微粒聯接的羊抗兔IgG的製備方法是將Aerosol604的戊二醛溶液與鐵粉溶液混合，將混合液調製為鹼性，離心得到100nm微粒；將所得微粒經過戊二醛活化後再離心，將所得沉澱物與羊抗兔IgG混合、再經離心得到磁性微粒聯接的羊抗兔IgG。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒的製備方法，其中磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體和磁性微粒聯接的羊抗兔IgG的製備中，所述鹼性為pH10-12。
4.根據權利要求2所述的檢測試劑盒的製備方法，其中磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體和磁性微粒聯接的羊抗兔IgG的製備中，將混合液調製為鹼性後，進行氮氣脫氧後振蕩。
5.一種Bt晶體蛋白CrylAc放射免疫檢測方法，其步驟是，在若干放射免疫管中分別加入待測樣品、Bt晶體蛋白CrylAc標準溶液和質量控制樣品，然後對每一放射免疫管分別進行如下操作1)加入磁性微粒聯接的Bt晶體蛋白CrylAc抗體；2)加入125I-Bt晶體蛋白CrylAc，混勻；3)將放射免疫管放置在磁分離器的管架上，連接磁分離器底部磁鐵25分鐘，再移走磁鐵；4)加入磁性微粒聯接的羊抗兔IgG，振蕩搖勻，再連接磁分離器底部磁鐵5分鐘；5)倒出溶液，加緩衝液衝洗一次後測沉澱放射性計數(cpm)；6)計算各管的結合率，作標準曲線，根據標準算出待測樣品的含量。
全文摘要
本發明提供了一種Bt晶體蛋白Cry 1Ac放射免疫檢測試劑盒及其製備方法和檢測方法。本發明用戊二醛、Aerosol 604和四氧化三鐵製備磁性微粒，並與Bt晶體蛋白Cry 1Ac抗體連接，在磁場下Bt晶體蛋白Cry 1Ac與Bt晶體蛋白Cry 1Ac抗體特異反應加快，測樣時間縮短到40分鐘。本發明還用磁性微粒連接IgG製備免疫分離劑，在磁場的作用下，抗原抗體複合物自動沉澱，不需離心即可分離。
文檔編號G01N33/68GK1501082SQ0214881
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月18日 優先權日2002年11月18日
發明者潘家榮, 張維, 張 傑, 喬豔紅, 宋平, 李錦波, 林敏 , 黃大昉 申請人:中國農業科學院原子能利用研究所