微生物中可誘導型基因的檢測的製作方法

2024-04-05 22:52:05 1

專利名稱：微生物中可誘導型基因的檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及通過誘導mRNA表達並檢測誘導的mRNA，來檢測微生物，特別是分枝桿菌屬(Mycobacterium)生長緩慢的細菌存在的方法。
背景技術：
儘管存在有效的抗菌療法，結核病仍然是世界上致病和致死的主要根源，並越來越遍及全世界。結核性腦膜炎的早期診斷和治療的迅速啟動改善了這種疾病的後果，但是通過常規方法檢測腦脊髓液(CSF)中的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)始終是一個挑戰。診斷分枝桿菌的挑戰在於結核分枝桿菌生物體數量少並且生長緩慢，從而限制了採用耐酸染色和培養技術檢測(Molavi A和J.L.Lefrock.，Med.Clin.North.Am.69315-331.1985)。
幾個研究小組已描述了用於靈敏並特異性檢測臨床樣本中結核分枝桿菌的PCR分析。通過PCR擴增特異性靶核酸序列直接鑑定臨床樣本中的分枝桿菌具有在感染的同一天診斷的能力。已將PCR技術應用於實際臨床樣本，但是受可檢測樣本量小、臨床樣本中存在的生物體量低、由於汙染導致假陽性和存在PCR抑制劑等方面限制(Kox等，J.Clin Micro32672-678，1994)。
檢測的預測值極大地依賴於研究的臨床樣品中陽性結核分枝桿菌樣本的發生率。Grosset和Mouton建議在PCR技術充分可靠並且存在內部和外部質量控制程序前，不應將PCR用於結核病的日常診斷(Grosset J.和Y Mouton.，Tubercle Lung dis 76183-184，1995)。在一次國際合作質量控制研究中，30個實驗室中只有5個實驗室正確地鑑定出所有20個樣本中存在或不存在分枝桿菌DNA(Noordhoek G.T.J.Clin.Microbiology 342522-2525.1996)。該研究還顯示缺乏特異性是比缺乏靈敏性更主要的問題。目前，基於擴增的檢測技術還沒有替代常規診斷技術(Piersimoni等，363601-3604，1998，J.Clin Microbioogy；另參見Piersimoni等，35193-196，1997，J.Clin Microbioogy)。
副結核分枝桿菌(Mycobacterium paratubreculosis)是一種慢性腸道病原菌，其可感染包括靈長類的許多不同的動物種類(Chiodini等，Comell Vet.74218-262，1984)。在100年前該生物體作為德國牛的腸道慢性炎症的病因首次鑑定出來。動物中約內氏病或副結核病的分類特徵是感染的腸道中存在數百萬桿菌型耐酸分枝桿菌及巨噬細胞而很少有另外的炎性細胞浸潤。副結核分枝桿菌很難以來自這些動物的桿菌形式培養。動物中的多桿菌-少微生物型的副結核病的臨床病理學譜令人想起人類中以瘤型麻風和結核樣麻風為代表的極其嚴重的情況。近年來由於實驗室中通過常規培養來鑑定這種物質不時遇到極大困難，所以極大地延緩了我們對結核分枝桿菌及由它引起的疾病的理解進程(Chiodini等，Clin.Microbiol.Rev.290-117，1989)。在英國尤其在高峰期，零售消毒牛奶中存在殘留的結核分枝桿菌是非常危險的。
因此，仍然需要檢測分枝桿菌屬，特別是檢測結核分枝桿菌的靈敏、特異的方法。

發明內容
根據本發明的第一個方面，本發明提供了一種檢測待測樣本中微生物存在的方法，該方法包括將待測樣本暴露於能誘導所述微生物中至少一個基因表達的誘導物下並檢測從暴露於所述誘導物而被誘導的基因轉錄的mRNA的存在。
在一個優選實施方式中，所述微生物可以為生長緩慢的細菌。優選生長緩慢的細菌包括，例如，疏螺旋體屬(Borreliae)、片球菌屬(Pediococcus)、支原體屬(Mycoplasma)、和分枝桿菌屬的株系。
最優選本方法用於檢測分枝桿菌屬，特別是結核分枝桿菌、副結核分枝桿菌(如鳥分枝桿菌副結核亞種(M.avium subsp.paratuberculosis))和牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)。
懷疑含有微生物的「待測樣本」通常主要是取自用於檢測所述微生物存在的個體的臨床樣本。
檢測特異性mRNA序列存在優選對從待測樣本中分離的核酸製備物進行檢測。該核酸製備物必須包含mRNA，然而，根據用於檢測特異性mRNA存在的技術的特徵，該核酸製備物沒有必要是純化的聚腺苷酸化mRNA製備物，並且，整個RNA製備物甚至同時含有RNA和基因組DNA的整個核酸製備物也適於作為起始原料。實質上，本領域已知的用於分離包含mRNA的核酸製備物的任何技術可以用於從待測樣本分離核酸。優選的技術為US-A-5,234,809和EP-B-0389,063中描述的「Boom」分離方法。該方法可以用於分離同時含有RNA和DNA的核酸製備物，其基於在離液劑硫氰酸胍(GuSCN)存在下，二氧化矽顆粒的核酸結合特性。
在一個優選實施方式中，檢測從暴露於誘導物而被誘導的基因轉錄的mRNA存在的步驟包括進行擴增反應以擴增全長或部分mRNA並檢測擴增反應的特異性產物。更優選地，擴增反應為反轉錄-多聚酶鏈式反應(RT-PCR)或依賴核酸序列的擴增(NASBA)。
本領域熟知將RT-PCR用於檢測特異性mRNA序列。可以在標準課本中找到進行RT-PCR並檢測RT-PCR反應的特異性產物的方法，例如PCR方案方法和應用指南(PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications)，Eds Innis等，學術出版社(Academic Press)，聖地牙哥，加利福尼亞，1990；生物分析中的PCR分子生物學方法(PCR inBioanalysisMethods in Molecular Biology)，卷92，S.J.Smeltzer編輯，Humana出版社，Totowa，NJ.，1998)。NASBA是擴增RNA的相對新的方法(參見Compton，自然(Nature)，35091-92(1991))。NASBA是本領域普通技術人員熟知的，並且描述於，例如US-A-5,409,818中。NASBA是體外大量產生靶RNA序列的有效方法，其可以檢測原待測樣本中存在的濃度非常低的靶RNA序列。
NASBA方法是基於使用與PCR的引物組合類似的引物組合，但一個引物用啟動子序列，如T7啟動子修飾。已顯示NASBA擴增的靈敏性和特異性與PCR相同並且比多數RT-PCR方案更好。由於NASBA方法是一種等溫分析且依賴RNA酶H，所以它不能用於擴增DNA。
NASBA優選按照如下步驟進行(a)組裝反應混合物，該混合物包含適用於通過NASBA擴增靶微生物mRNA一段區域的NASBA P1和NASBA P2引物對(見下)、RNA指導的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體的RNA鏈而不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識別NASBA P1引物中存在的啟動子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸；(b)在允許NASBA擴增反應的反應條件下將反應介質與從懷疑含有微生物的待測樣本中分離的核酸製備物一起溫育；並且(c)檢測和/或定量測定NASBA擴增反應的任何微生物特異性產物。
可採用許多不同的方法檢測NASBA反應的特異性產物(即，靶RNA的正義和/或反義拷貝)。在一個方法中，可使用能特異性退火於NASBA產物的靶特異性雜交探針來檢測NASBA產物。所述雜交探針可結合於顯色標記，例如螢光、發光、放射性或化學發光化合物或酶標記或本領域普通技術人員已知的其它類型的標記。這些標記的精確特性並不是特別關鍵，但是它應該能夠通過其本身或與一種或多種額外物質結合(如酶的底物)，產生外源方法可檢測的信號。
所謂的「實時NASBA」也在本發明的範圍內，該方法可以在反應的過程中，持續監測NASBA反應產物的形成。如WO95/13399所述，這可通過採用「分子標燈」探針完成，所述的分子標燈探針包含能夠退火於NASBA產物的靶特異性序列、形成髮夾的寡核苷酸序列和一對螢光劑/淬滅劑。以下將更詳細地描述分子標燈技術。如果在擴增之前將分子標燈探針加入反應混合物中，其可以實時監測NASBA產物的形成(參見Leone等，核酸研究(Nucleic Acids Research)，1998，卷26，2150-2155)。
在進一步的方法中，如下所述，分子標燈技術可與一個NASBA擴增中使用的寡核苷酸引物結合，以利於實時監測NASBA反應而不需要單獨的雜交探針。
在更進一步的方法中，可以採用一種通用的已標記檢測探針監測NASBA反應產物，該探針可與引物2的5』端的核苷酸序列雜交。這與Organon Teknika提供的「NucliSensTM」檢測系統等同。在該系統中，可採用靶特異性捕獲探針獲得針對靶mRNA的NASBA產物的特異性，所述的靶特異性捕獲探針包含如本文所述與固體支撐物例如磁性微珠結合的探針寡核苷酸。最優選地，通用的帶有標記的檢測探針是由OrganonTeknika提供的ECLTM檢測探針。NASBA複製子與HPV-特異性捕獲探針和通用的ECL探針雜交(通過引物2的互補序列)。雜交後，微珠/複製子/ECL探針複合體可被捕獲在自動ECL讀數器的磁電極上(如Organon Teknika提供的NucliSensTM讀數器)。隨後，電壓脈衝引發ECLTM反應。
「被誘導的基因或多個基因」可以是能被外界刺激如化學試劑或環境變化誘導的任何基因。一個或多個基因表達的誘導及隨後特異性檢測至少一個誘導基因的轉錄本增加了擴增的水平，因此與依賴mRNA表達而沒有誘導步驟的檢測方法相比提高了靈敏性。
實質上，「誘導物」可以是任何能誘導靶微生物種類中一個或多個基因表達的物質。誘導物可以是化學物質或環境刺激，如，暴露於特定波長的光下。
將需要檢測微生物存在的待測樣本暴露於誘導物一段時間以足以誘導產生期望的基因表達。所需要的精確暴露時間將根據誘導物和被誘導的靶基因的特性而變化。對於任何給定的誘導物/基因組合可通過例行試驗依照經驗決定。在暴露於誘導物之後，可如上所述，從待測樣本中分離核酸。
在一個實施方式中，本發明提供一種檢測微生物的方法，該方法基於將待測樣本暴露於氧或過氧化氫來誘導編碼過氧化物歧化酶的基因的表達，然後檢測與該基因對應的mRNA轉錄本的存在。該方法優選用於檢測分枝桿菌屬，更有利於結核分枝桿菌或副結核分枝桿菌，但也適用於檢測任何具有過氧化物歧化酶基因的微生物，其中由於暴露於氧或過氧化氫而誘導該基因的表達。在結核分枝桿菌中將編碼過氧化物歧化酶的基因表示為sodA(GenBank登記號AF061030；SEQ ID NO57和58)。在鳥分枝桿菌副結核亞種中，將編碼過氧化物歧化酶的基因表示為sod(GenBank登記號AF180816；SEQ ID NO59和60)。其它種類微生物的SodA/sod同系物也可用本領域技術人員熟知的方法鑑定，例如通過檢索可公開獲得的序列資料庫和/或通過直接篩選基因組DNA。
檢測與過氧化物歧化酶基因對應的mRNA轉錄本存在的步驟可通過採用RT-PCR或NASBA擴增全長或部分mRNA並檢測過氧化物歧化酶特異性擴增產物來完成。
下面給出了用RT-PCR或NASBA擴增SodA mRNA的適合的引物組合。這些引物組合可用於檢測所有分枝桿菌屬的種，但特別適用於檢測結核分枝桿菌和牛分枝桿菌。
用於NASBA檢測的引物組合包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物和包含SEQID NO25的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO61的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO62的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO64的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO65的NASBA P2引物；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，優選引物4-85；引物4-92和包含SEQ ID NO64的NASBA P2引物，優選引物4-91；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，優選引物4-103；引物4-122和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，優選引物4-115；用於RT-PCR檢測的引物組合包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物；包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物；包含SEQ ID NO61的PCR引物和包含SEQ ID NO62的PCR引物；或包含SEQ ID NO64的PCR引物和包含SEQ ID NO65的PCR引物。
在每種情況下，「SEQ ID NOs」指表1中列出的序列，「引物號」指表2列出的引物。
如下所述，本發明還提供使用這些特異性引物組合，適用於進行檢測NASBA和RT-PCR反應的產物的探針寡核苷酸。
在進一步的實施方式中，本發明提供一種檢測微生物的方法，該方法基於將待測樣本暴露於化學誘導物而誘導pncA基因的表達，所述化學誘導物可以是異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或吡嗪醯胺，然後檢測與pncA基因對應的mRNA轉錄本的存在。本方法也優選用於檢測分枝桿菌屬。結核分枝桿菌pncA的完整cDNA序列可在GenBank登記號U59967獲得(也可參見SEQ ID NO98和99)。其它種類微生物的pncA同系物也可採用本領域技術人員熟知的方法鑑定。
再次，檢測與pncA基因對應的mRNA轉錄本存在的步驟可通過採用RT-PCR或NASBA擴增全長或部分mRNA並檢測pncA-特異性擴增產物來完成。
下面給出了特異性用於通過RT-PCR或NASBA擴增結核分枝桿菌pncA mRNA的適合的引物組合。
用於NASBA檢測的引物組合包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物；引物4-2和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，優選引物4-1；引物4-8和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，優選引物4-7；或引物4-14和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，優選引物4-15。
用於RT-PCR檢測的引物組合包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；或包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物。
本發明進一步提供了通過RT-PCR或NASBA檢測分枝桿菌屬，特別是檢測分枝桿菌屬的靶特異性引物和寡核苷酸探針。
特別地，本發明提供了引物和探針寡核苷酸，其包含表1中如SEQ IDNO1到42，61到69和74到97所示的序列。
表1-引物和探針中包含的分枝桿菌特異性序列



關鍵詞X1代表包含啟動子的核苷酸序列。適於用作NASBA P1引物的寡核苷酸具有通用的結構「X1-序列(X1-SEQ)」，其中「X1」代表包含啟動子的核苷酸序列，「序列(SEQ)」代表所附序列表中指定的靶特異性序列(SEQ ID NO)。如下所述，NASBA P1引物中必須包含啟動子序列但PCR引物中並不是必須的。在一個優選實施方式中，X1可以是包含T7啟動子的序列，最優選序列AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAGAAGG。
X2和X3代表螢光劑和淬滅劑，當將這兩部分保持在近距離時，該淬滅劑能基本上或完全地淬滅來自螢光劑的螢光。
nt-表示在相關cDNA序列上的位置。
本發明進一步提供表2列出的寡核苷酸，這些為加入特定啟動子序列的NASBA P1引物和加入結合通用檢測探針的序列的NASBA P2引物(見下)，用於採用NASBA檢測分枝桿菌屬的種系。然而，並不意味著本發明的範圍應該限制於這些特異性分子。
表2

本發明提供的寡核苷酸引物和探針可歸納為幾個類型。第一種寡核苷酸類型是NASBA P1引物，其一般為大約50個鹼基長的寡核苷酸，在3』端含有與靶mRNA一段區域互補的平均大約20個鹼基。表1中的「NASBA P1/PCR」表示適合用作NASBA P1引物的寡核苷酸。P1引物寡核苷酸的5』端(在此通常用術語X1代表)包含可被特異性RNA聚合酶識別的啟動子序列。因為噬菌體啟動子，例如T7、T3和SP6啟動子，僅依賴適當的RNA聚合酶的結合即可提供高水平的轉錄，優選將它們用於本發明的寡核苷酸中。在一個優選實施方式中，P1引物寡核苷酸的5』端序列可包含序列AATTCTAATACGACTCACTATAGGG。該序列包含一個T7啟動子，T7啟動子包含T7 RNA聚合酶的轉錄起始位點。在表1中以「NASBA P1/PCR」表示的分枝桿菌特異性序列適合在NASBA P1引物和標準PCR引物中使用。當使用這些序列作為NASBA P1引物的基礎時，它們具有通用的結構「X1-SEQ」，其中「X1」代表包含啟動子的序列，SEQ代表靶特異性序列。啟動子序列X1在NASBA P1引物中是必須的。然而，當使用同樣的序列作為標準PCR引物的基礎時，並不是必須包含X1。相應地，權利要求中使用的短語「序列號」也這樣理解。
為避免疑惑，短語「包含SEQ ID NO1的NASBA P1引物」理解為在SEQ ID NO1列出的分枝桿菌特異性序列的5』端要求存在X1序列，而短語「包含SEQ ID NO1的PCR引物」表示包含分枝桿菌特異性序列的任何合適的PCR引物，X1並不是PCR引物的本質特徵。
本發明提供的第二種寡核苷酸類型是NASBA引物2寡核苷酸，其一般包含與靶mRNA一段區域基本上相同的大約20個鹼基的序列。在表1中以「NASBA P2/PCR」表示的寡核苷酸序列適合在NASBA P2引物和標準PCR引物中使用。在特殊的但非限定的實施方式中，欲用作NASBA P2引物的寡核苷酸，在5』端進一步包含一段核苷酸序列，該核苷酸序列與靶mRNA無關但能夠與一個通用的檢測探針雜交。優選用螢光、發光或酶標記物標記該檢測探針。在一個實施方式中，可用ECLTM技術檢測的標記物標記檢測探針，但是應意識到本發明決不是限定於這個特定的檢測方法。在一個優選實施方式中，引物2寡核苷酸的5』端可含有序列GATGCAAGGTCGCATATGAG。該序列能夠與從OrganonTeknika商購的通用ECLTM探針雜交，該探針具有下列結構Ru(bpy)32+-GAT GCA AGG TCG CAT ATG AG-3』在另一個實施方式中，為了實時監測NASBA反應，可將引物2寡核苷酸與「分子標燈」技術結合，「分子標燈」技術是本領域已知的並由Tyagi和Kramer描述於如WO 95/13399，Nature Biotechnology，14303-308，1996中。
本發明提供的第三種寡核苷酸類型是靶特異性探針寡核苷酸(在表1表示為「探針」)。該探針寡核苷酸一般包含與靶mRNA一段區域基本上相同的大約20-25個鹼基的序列。該探針寡核苷酸可作為靶特異性雜交探針用於檢測NASBA或PCR反應的產物。就此而論，可將探針寡核苷酸與一個固體支撐物如順磁珠結合以形成捕獲探針(見下)。在一個優選實施方式中探針寡核苷酸的5』端可用生物素標記。生物素標記物的加入可促進探針通過生物素/鏈黴抗生物素或生物素/抗生物素蛋白的聯接結合於固體支撐物上。
本發明提供的第四種寡核苷酸類型(在表1表示為「MB探針」)是結合「分子標燈」技術的靶特異性探針，該技術是本領域已知的並由Tyagi和Kramer描述於如Nature Biotechnology，14303-308，1996和WO95/13399中。採用分子標燈技術可對擴增反應如NASBA或RT-PCR反應進行實時監測。
除靶特異性序列以外，分子標燈探針一般還包含可形成髮夾環結構的其它鹼基、螢光劑和淬滅劑，其中在本文中螢光劑和淬滅劑用符號X2和X3表示。熟知技術的讀者將意識到，選擇螢光劑和淬滅劑以使當將這兩部分保持在近距離時，例如不存在靶序列時，探針處於髮夾「關閉」構象時，淬滅劑能基本上或完全地淬滅來自螢光劑的螢光。表1中顯示的分子標燈探針在5』和3』末端加入互補的側翼序列，該側翼序列在分枝桿菌特異性序列的側翼並能夠雜交以形成莖雙鏈體。除了要求該側翼序列在探針不結合靶HPV序列時能形成莖雙鏈體外，其具體的核苷酸序列並不是本發明的實質。因此，熟知技術的讀者將意識到在不影響實質範疇內分子標燈探針的功能下，這些序列可以變化。可使用表1中表示為「探針」的任何序列加入合適的互補側翼序列和螢光劑及淬滅劑作為分子標燈探針的基礎。
本領域已知許多適合用於分子標燈探針的淬滅劑/螢光劑組合的例子(參見WO 95/13399，Tyagi和Kramer，ibid)。可使用許多不同顏色的螢光團，包括如5-(2』-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、螢光素、FAM和德克薩斯紅(參見Tyagi、Bratu和Kramer，1998，Nature Biotechnology，16，49-53)。使用不同顏色螢光團標記的探針可進行「多重」檢測，在單個反應管中檢測兩個或多個不同的探針。一個優選的淬光劑是苯甲酸4-(4』-二甲基氨苯氮基)苯甲酸(DABCYL)，其為非螢光發色團，用作大範圍螢光團的「萬用」淬光劑。螢光劑和淬光劑可以採用某種方向共價地結合到探針上，螢光劑在5』端或接近5』端、淬光劑在3』端或接近3』端或者反之亦然。本領域已知用於合成分子標燈探針的方法。Sanjay Tyagi等，(分子遺傳學系(Department of Molecular Genetics)，公共健康研究所(Public Health Research Institute)，455第一大街，紐約，NY 10016，美國)在一篇名為「分子標燈用於檢測均質溶液中核酸的雜交探針」的文章中提供了合成的具體方法，可通過PHRI網站在線獲得(www.phri.nyu.edu或www.molecularbeacons.org)。
可使用適當的引物1和引物2寡核苷酸分子的組合通過NASBA檢測靶mRNA。為了驅動NASBA擴增反應，引物1和引物2寡核苷酸必須能從mRNA的靶區域啟動雙鏈DNA的合成。為此，引物1和引物2寡核苷酸必須包含分別能與靶mRNA正義和反義鏈區域互補的靶特異性序列。
在NASBA擴增循環的第一個時期，所謂的「非循環」期，引物1寡核苷酸退火於靶mRNA的互補序列並且它的3』端在依賴RNA的DNA聚合酶(例如反轉錄酶)作用下延伸以合成第一鏈cDNA。隨後將得到的RNA:DNA雜合體的RNA鏈消化，如通過RNA酶H的作用，以釋放單鏈DNA。引物2寡核苷酸退火於該單鏈DNA 3』端的互補序列並且延伸它的3』端(通過反轉錄酶的作用)，形成雙鏈DNA。然後RNA聚合酶能從該雙鏈DNA中現在具有轉錄活性的啟動子序列轉錄大量的RNA拷貝。該RNA轉錄本，與原始靶mRNA反義，能作為NASBA反應進一步循環的模板，引物2可退火於此RNA並啟動第一條cDNA鏈的合成，並且引物1啟動第二條cDNA鏈的合成。本領域熟知NASBA反應的一般原理(參見Compton，J.Nature，35091-92)。
本文所述的靶特異性探針寡核苷酸也可與固體支撐物如磁性微珠結合併用作「捕獲探針」來固定NASBA擴增反應的產物(單鏈RNA)。本文所述的靶特異性「分子標燈」探針可用於實時監測NASBA反應。


參照下列實施例和附圖將進一步理解本發明，其中圖1闡明利用分子標燈探針的實時NASBA擴增反應，擴增結核分枝桿菌和牛分枝桿菌sodA mRNA的時間進程。X-軸螢光(相對單位)，y-軸時間(秒)。
具體實施例方式
實施例1細菌基因表達的誘導1)用氧處理將含有生長緩慢的分枝桿菌的樣本接種到液體培養基中。將細菌暴露於氧氣(起泡)10分鐘和60分鐘。
樣本由於收集的細菌數量不定，在轉移到裂解緩衝液中之前把樣本在培養用的液體培養基中稀釋。稀釋度1∶1和1∶100。
2)接種於生長培養基中將細菌樣本置於最適所檢測的細菌生長的培養基中37℃過夜。即使細菌沒有繁殖到相當多的程度，但對用於啟動NASBA擴增反應的基因的誘導是足夠的。
細菌的裂解·在2-8℃貯存裂解緩衝液(0.9ml，低pH值)。使用之前，必須將緩衝液加熱到37℃，並保持30分鐘以便溶解所有的結晶。
·將100ml細菌培養物加到0.9ml緩衝液中，混合均勻。
·將帶有細菌的裂解緩衝液在37℃溫育10分鐘。
·將裂解的細菌於-70℃貯存或立刻提取核酸。
3)從誘導的細菌樣本中提取DNA/RNA下面的步驟根據NuclisensTM，Organon Teknika的手冊進行操作·在每個樣品中加入50μl矽顆粒並在室溫下溫育10分鐘。每2分鐘混合試管。
·將樣品中的所有物質轉移到NuclisensTM提取儀中使用的柱子中。
·遵循手冊中的方法「1ml原生質的提取」。
檢測分枝桿菌屬的種中過氧化物歧化酶的引物的試驗將2×試劑球2×80μl稀釋液混合均勻，然後加入28μl依賴核酸序列的擴增用水(NASBA water)32μl氯化鉀(所有試劑來自於Organon Teknika提供的NuclisensTM系統)分到8個管中，每管27.5μl。以下列方式加入引物。(引物號與表2列出的引物對應)管號 引物1 1.25μl 4-85(SEQ ID NO70)1.25μl 4-86(SEQ ID NO71)2 1.25μl 4-85(SEQ IDNO70)1.25μl 4-98(SEQ ID NO73)3 1.25μl 4-97(SEQ ID NO72)1.25μl 4-86(SEQ ID NO71)4 1.25μl 4-97(SEQ ID NO72)1.25μl 4-98(SEQ ID NO73)5 1.25μl 4-115(SEQ ID NO53)1.25μl 4-116(SEQ ID NO54)6 1.25μl 4-115(SEQ ID NO53)1.25μl 4-122(SEQ IDNO56)7 1.25μl 4-121(SEQ ID NO55)1.25μl 4-116(SEQ IDNO54)8 1.25μl 4-121(SEQ ID NO55)1.25μl 4-122(SEQ IDNO56)樣本結核分枝桿菌和牛分枝桿菌在41℃進行擴增2.5小時。在Agilent生物分析儀上檢測產物。
結果如所預料的那樣，引物檢測到了來自結核分枝桿菌和牛分枝桿菌的序列。
實施例3從病人樣本中擴增結核分枝桿菌樣本1)培養物中生長的ATTC菌株(對照)2)病樣預混合反應液2試劑球2×80μl試劑球稀釋液在一管中混合，加入23μl依賴核酸序列的擴增用水(nasbawater)10μl引物1(4-122；SEQ ID NO56)10μl引物2(4-115；SEQ ID NO53)5μl分子標燈(4-125；SEQ ID NO41)32μl氯化鉀樣本電泳

結果，信號增加

實施例4用結核分枝桿菌的分子標燈進行NASBA擴增將2×試劑球2×80μl稀釋液1)加入
11.5μl水5μl引物4-115(SEQ ID NO53)5μl引物4-122(SEQ ID NO56)16μl氯化鉀2)也加入11.5μl水5μl引物4-121(SEQ ID NO55)5μl引物4-116(SEQ ID NO54)16μl氯化鉀將這兩種引物混合物分為4管(共8管)，每管29.5μl。
加入分子標燈每管0.63μl1a)4-118(SEQ ID NO34)1b)4-119(SEQ ID NO35)1c)4-124(SEQ ID NO40)1d)4-125(SEQ ID NO41)2a)4-118(SEQ ID NO34)2b)4-119(SEQ ID NO35)2c)4-124(SEQ ID NO40)2d)4-125(SEQ ID NO41)將2×酶在2×55μl稀釋液中稀釋試劑來自NucliSens，Organon Teknika樣本樣本2和24是結核分枝桿菌樣本7是牛分枝桿菌

在41℃擴增並在讀數器檢測2.5個時間段。結果，信號數倍地增大。認為增加1.5是陽性。

在所有樣本中均檢測到擴增-最好的檢測結果是預混合反應液1d。
採用下列引物和分子標燈的組合檢測到最佳結果引物24-115(SEQ ID NO53)引物14-122(SEQ ID NO56)分子標燈4-125(SEQ ID NO41)見圖1中擴增的圖解形式。
實施例5 結核分枝桿菌sodA引物的特異性樣本


預混合反應液2試劑球 2酶球2×80μl試劑球稀釋液 2×55μl酶稀釋液在一管中混合，然後加入23μl依賴核酸序列的擴增用水10μl引物1(4-122；SEQ ID NO56)10μl引物2(4-115；SEQ ID NO53)5μl分子標燈(4-125；SEQ ID NO41)32μl氯化鉀樣本電泳

結果信號增大倍數(陽性信號1.5以上)

結論引物是結核分枝桿菌或牛分枝桿菌特異性的，不與其它分枝桿菌或相關細菌如藤黃微球菌反應。
序列表SEQ ID NO57結核分枝桿菌sodA的核苷酸序列SEQ ID NO58結核分枝桿菌sodA的胺基酸序列SEQ ID NO59鳥分枝桿菌副結核亞種sod的核苷酸序列SEQ ID NO60鳥分枝桿菌副結核亞種sod的胺基酸序列SEQ ID NO98結核分枝桿菌pncA的核苷酸序列SEQ ID NO99結核分枝桿菌pncA的胺基酸序列序列表110挪其普公司120微生物中可誘導型基因的檢測130P03GB10236316099170PatentIn version 3.1210121120212DNA213人工序列220
223引物4001gaagcggcgg actaccatca 20210221120212DNA213人工序列220
223引物4002ctcgattgcc gacgtgtcca20210321120212DNA213人工序列220
223探針4003cattgcgtca gcggtactcc20
210421132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針4004cccgatcatt gcgtcagcgg tactccatcg gg 32210521134212DNA213人工序列220
223分子標燈探針4005gcccgatcat tgcgtcagcg gtactccatc gggc 34210621132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針4006ccgccgcatt gcgtcagcgg tactcccggc gg 32210721120212DNA213人工序列220
223引物4007accaaggact tccacatcga 20
210821120212DNA213人工序列220
223引物4008taccgaccac atcgacctca 20210921120212DNA213人工序列220
223探針4009attgcgtcag cggtactccc 202101021132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40010cgtcgtattg cgtcagcggt actcccacga cg322101121132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40011cgtcggattg cgtcagcggt actcccccga cg3221012
21132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40012aggcgtattg cgtcagcggt actcccacgc ct 322101321120212DNA213人工序列220
223引物40013gtgaccactt ctccggcaca202101421120212DNA213人工序列220
223引物40014gtgtaggcac cct tgtagaa202101521120212DNA213人工序列220
223探針40015gactattcct cgtcgtggcc 202101621132
212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40016cgcatggact attcctcgtc gtggcccatg cg 322101721130212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40017ccagcgacta ttcctcgtcg tggccgctgg302101821130212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40018tcgcggacta ttcctcgtcg tggcccgcga 302101921120212DNA213人工序列220
223引物40019ctgttttggg cgtcgatcca 202102021120212DNA
213人工序列220
223引物40020cagttggcgg ggacggctaa 202102121120212DNA213人工序列220
223探針40021attcccacta ccacgtccgg 202102221132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40022cgcatgattc ccactaccac gtccggcatg cg 322102321132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40023cctgcgattc ccactaccac gtccggcgca gg 322102421130212DNA213人工序列
220
223分子標燈探針40024gcgctattcc cactaccacg tccggagcgc302102521120212DNA213人工序列220
223引物40025ggcgtcgatc cactgcggga202102621120212DNA213人工序列220
223引物40026ggtgggcaag aagaagtcga202102721120212DNA213人工序列220
223探針40027gcccgctcca gcacctcctt202102821132212DNA213人工序列
220
223分子標燈探針40028cgcatggccc gctccagcac ctccttcatg cg 322102921132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40029ccgtcggccc gctccagcac ctccttcgac gg 322103021130212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40030cacgcgcccg ctccagcacc tccttgcgtg 302103121120212DNA213人工序列220
223引物40031ctccagcacc tccttggtca 202103221120212DNA213人工序列220
223引物40032ccaggctgat accacgtcta 202103321120212DNA213人工序列220
223探針40033acttcttctt gcccacccac 202103421132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40034cgcatgactt cttcttgccc acccaccatg cg 322103521132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40035ccgtcgactt cttcttgccc acccaccgac gg 322103621130212DNA213人工序列220
223分子標燈探針
40036cacgcacttc ttcttgccca cccacgcgtg 302103721120212DNA213人工序列220
223引物40037cctccttggt caattcgtta 202103821120212DNA213人工序列220
223引物40038aagtcaaccc tgctccatga 202103921120212DNA213人工序列220
223探針40039ttgcccaccc accccataga 202104021132212DNA213人工序列220
223分子標燈探針
40040cgcatgttgc ccacccaccc catagacatg cg322104121130212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40041cgctgttgcc cacccacccc atagacagcg 302104221130212DNA213人工序列220
223分子標燈探針40042cgcatttgcc cacccacccc atagaatgcg 302104321140212DNA213人工序列220
223引物40043gatgcaaggt cgcatatgag gaagcggcgg actaccatca402104421151212DNA213人工序列220
223引物40044
aattctaata cgactcacta tagggagaag gctcgattgc cgacgtgtcc a512104521140212DNA213人工序列220
223引物40045gatgcaaggt cgcatatgag accaaggact tccacatcga 402104621151212DNA213人工序列220
223引物40046aattctaata cgactcacta tagggagaag gtaccgacca catcgacctc a 512104721140212DNA213人工序列220
223引物40047gatgcaaggt cgcatatgag gtgaccactt ctccggcaca 402104821151212DNA213人工序列220
223引物40048aattctaata cgactcacta tagggagaag ggtgtaggca cccttgtaga a 51
2104921140212DNA213人工序列220
223引物40049gatgcaaggt cgcatatgag ctgttttggg cgtcgatcca 402105021151212DNA213人工序列220
223引物40050aattctaata cgactcacta tagggagaag gcagttggcg gggacggcta a 512105121140212DNA213人工序列220
223引物40051gatgcaaggt cgcatatgag ggcgtcgatc cactgcggga 402105221151212DNA213人工序列220
223引物40052aattctaata cgactcacta tagggagaag gggtgggcaa gaagaagtcg a 51
2105321140212DNA213人工序列220
223引物40053gatgcaaggt cgcatatgag ctccagcacc tccttggtca 402105421151212DNA213人工序列220
223引物40054aattctaata cgactcacta tagggagaag gccaggctga taccacgtct a 512105521140212DNA213人工序列220
223引物40055gatgcaaggt cgcatatgag cctccttggt caattcgtta 402105621151212DNA213人工序列220
223引物40056aattctaata cgactcacta tagggagaag gaagtcaacc ctgctccatg a 51
210572111321212DNA213結核分枝桿菌220
221CDS222(542)..(1165)223
40057gcttagt tggtgagattgcg aaagccgagg gtcgatcccc ggaggtgctc gacgcggccg60ctgatcgctt cggtcggcgg gttgaccgtg gtcactgttt tgggcgtcga tccactgcgg120gaattcccac taccacgtcc ggccggatca ccggcgactc gcggtgcacg gcccgctcca180gcacctcctt ggtcaattcg ttagccgtcc ccgccaactg cccagccgtc gacttcttct240tgcccaccca ccccatagac cttcgccaca cagcgccttc cgtccaccca acagcggtcc300gatgacggac ccccgacggg gacttcagcg accaggaacg cgcccataga cgtggtatca360gcctgggggc gtcctggtag cctatgccgt ccgccctggg gcatcgaccc caaggtcgtt420gttgcgacgc gagcggtcat ggagcagggt tgacttgtca agctagagcc agcccatcgc480gtgggaggca cccgcgcgaa aagaaacatc ggacgatcat ttcatcgaag gaaggaatgc540c gtg gcc gaa tac acc ttg cca gac ctg gac tgg gac tac gga gca ctg589Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu1 5 10 15gaa ccg cac atc tcg ggt cag atc aac gag ctt cac cac agc aag cac 637Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30cac gcc acc tac gta aag ggc gcc aat gac gcc gtc gcc aaa ctc gaa 685His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu35 40 45gag gcg cgc gcc aag gaa gat cac tca gcg atc ttg ctg aac gaa aag 733Glu Ala Arg Ala Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys50 55 60aat cta gct ttc aac ctc gcc ggc cac gtc aat cac acc atc tgg tgg 781Asn Leu Ala Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp65 70 75 80
aag aac ctg tcg cct aac ggt ggt gac aag ccc acc ggc gaa ctc gcc829Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95gca gcc atc gcc gac gcg ttc ggt tcg ttc gac aag ttc cgt gcg cag877Ala Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110ttc cac gcg gcc gct acc acc gtg cag ggg tcg ggc tgg gcg gca ctg925Phe His Ala Ala Ala Thr Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp Ala Ala Leu115 120 125ggc tgg gac aca ctc ggc aac aag ctg ctg ata ttc cag gtt tac gac973Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp130 135 140cac cag acg aac ttc ccg cta ggc att gtt ccg ctg ctg ctg ctc gac1021His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp145 150 155 160atg tgg gaa cac gcc ttc tac ctg cag tac aag aac gtc aaa gtc gac1069Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp165 170 175ttt gcc aag gcg ttt tgg aac gtc gtg aac tgg gcc gat gtg cag tca1117Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Ser180 185 190cgg tat gcg gcc gcg acc tcg cag acc aag ggg ttg ata ttc ggc tga1165Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Gln Thr Lys Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205ccccgctgcc gcaagcgtcg ggctcagtat tccggagtcg cgcatcacca tcgcccttat 1225cctggcctta tattgcagct ttgtgaacac ggccgcggtg gccgtgtcga gttgcagggc 1285gcgtaaacca cgcgcatgct tggttactcg agctac132121058211207212PRT213結核分枝桿菌40058Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Gly Ala Leu1 5 10 15
Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Leu His His Ser Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Ala Asn Asp Ala Val Ala Lys Leu Glu35 40 45Glu Ala Arg Ala Lys Glu Asp His Ser Ala Ile Leu Leu Asn Glu Lys50 55 60Asn Leu Ala Phe Asn Leu Ala Gly His Val Asn His Thr Ile Trp Trp65 70 75 80Lys Asn Leu Ser Pro Asn Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95Ala Ala Ile Ala Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110Phe His Ala Ala Ala Thr Thr Val Gln Gly Ser Gly Trp Ala Ala Leu115 120 125Gly Trp Asp Thr Leu Gly Asn Lys Leu Leu Ile Phe Gln Val Tyr Asp130 135 140His Gln Thr Asn Phe Pro Leu Gly Ile Val Pro Leu Leu Leu Leu Asp145 150 155 160Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Val Asp165 170 175Phe Ala Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Ser180 185 190Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Gln Thr Lys Gly Leu Ile Phe Gly195 200 205
21059211900212DNA213鳥分枝桿菌副結核亞種220
221CDS222(260)..(883)223
40059tcgcccgcgt ggaaccacag ctacagcgtc gcggcactgc gcgccggatt gatcgcactg60gcgctgctgg cggtattggc cctcatcgtc ttgtcttgaa gtcctgtctt gaaacaccgc120tgagcgggta tccgccttcc ggctcagcgg ggtcgttctt gcggtgcgcg cggtcatgga180gcagggttga taacgcccgg ccgccgcgag gtggcccgcg cgactgagcg tcaagacgac240aatcgaagaa aggaatgcc gtg gct gaa tac acc ctg ccc gac ctg gac tgg 292Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp1 5 10gac tat gca gcg ttg gaa ccg cac atc tcg ggg cag atc aac gag atc 340Asp Tyr Ala Ala Leu Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile15 20 25cac cac acc aag cac cac gcc acc tac gtc aaa ggc gtg aac gac gct 388His His Thr Lys His His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Val Asn Asp Ala30 35 40ctt gcc aag ctc gaa gag gcc cgc gcc aac gag gac cac gct gcg atc 436Leu Ala Lys Leu Glu Glu Ala Arg Ala Asn Glu Asp His Ala Ala Ile45 50 55ttc ctg aac gaa aag aac ctc gcc ttc cac ctg ggc ggc cac gtc aac 484Phe Leu Asn Glu Lys Asn Leu Ala Phe His Leu Gly Gly His Val Asn60 65 70 75cac tcg atc tgg tgg aag aac ctg tcg ccg gac ggc ggt gac aag ccc 532His Ser Ile Trp Trp Lys Asn Leu Ser Pro Asp Gly Gly Asp Lys Pro80 85 90acc ggc gag ctg gcc gcc gcg atc gac gac gcg ttc ggc tcc ttc gac 580Thr Gly Glu Leu Ala Ala Ala Ile Asp Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp95 100 105aag ttc cgg gcg caa ttc agc gcc gcc gcc aac ggc ctg cag ggc tcc 628Lys Phe Arg Ala Gln Phe Ser Ala Ala Ala Asn Gly Leu Gln Gly Ser
110 115 120ggc tgg gcg gtg ctg ggt tat gac acc gtg ggc agc cgg ttg ctg acc676Gly Trp Ala Val Leu Gly Tyr Asp Thr Val Gly Ser Arg Leu Leu Thr125 130 135ttc cag ctc tac gac cag cag gcc aac gtc ccg ctg ggc atc atc ccg724Phe Gln Leu Tyr Asp Gln Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ile Ile Pro140 145 150 155ctg ctg cag gtc gac atg tgg gag cac gcg ttc tac ctg cag tac aag772Leu Leu Gln Val Asp Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys160 165 170aac gtc aag gcg gat tac gtc aag gcg ttc tgg aac gtg gtc aac tgg820Asn Val Lys Ala Asp Tyr Val Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp175 180 185gcg gac gtg cag aag cgg tac gcc gcc gcc act tcc aag gcc caa ggc868Ala Asp Val Gln Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Lys Ala Gln Gly190 195 200ctg atc ttc ggc tga ctttcctctc gatcggc 900Leu Ile Phe Gly20521060211207212PRT213鳥分枝桿菌副結核亞種40060Val Ala Glu Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Leu1 5 10 15Glu Pro His Ile Ser Gly Gln Ile Asn Glu Ile His His Thr Lys His20 25 30His Ala Thr Tyr Val Lys Gly Val Asn Asp Ala Leu Ala Lys Leu Glu35 40 45Glu Ala Arg Ala Asn Glu Asp His Ala Ala Ile Phe Leu Asn Glu Lys50 55 60
Asn Leu Ala Phe His Leu Gly Gly His Val Asn His Ser Ile Trp Trp65 70 75 80Lys Asn Leu Ser Pro Asp Gly Gly Asp Lys Pro Thr Gly Glu Leu Ala85 90 95Ala Ala Ile Asp Asp Ala Phe Gly Ser Phe Asp Lys Phe Arg Ala Gln100 105 110Phe Ser Ala Ala Ala Asn Gly Leu Gln Gly Ser Gly Trp Ala Val Leu115 120 125Gly Tyr Asp Thr Val Gly Ser Arg Leu Leu Thr Phe Gln Leu Tyr Asp130 135 140Gln Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ile Ile Pro Leu Leu Gln Val Asp145 150 155 160Met Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Ala Asp165 170 175Tyr Val Lys Ala Phe Trp Asn Val Val Asn Trp Ala Asp Val Gln Lys180 185 190Arg Tyr Ala Ala Ala Thr Ser Lys Ala Gln Gly Leu Ile Phe Gly195 200 2052106121120212DNA213人工序列220
223引物40061gccgaataca ccttgccaga 20
2106221120212DNA213人工序列220
223引物40062cgtggtgctt gctgtggtga 202106321120212DNA213人工序列220
223探針40063caattcagcg ccgccgccaa202106421120212DNA213人工序列220
223引物40064acctggactg ggactacgga202106521120212DNA213人工序列220
223引物40065tcattggcgc cctttacgta2021066
21120212DNA213人工序列220
223探針40066aattcagcgc cgccgccaac 202106721120212DNA213人工序列220
223引物40067tggactggga ctacggagca 202106821120212DNA213人工序列220
223引物40068cgagtttggc gacggcgtca 202106921120212DNA213人工序列220
223引物40069aagttccggg cgcaattcag 202107021140
212DNA213人工序列220
223引物40070gatgcaaggt cgcatatgag gccgaataca ccttgccaga402107121151212DNA213人工序列220
223引物40071aattctaata cgactcacta tagggagaag gcgtggtgct tgctgtggtg a512107221140212DNA213人工序列220
223引物40072gatgcaaggt cgcatatgag tggactggga ctacggagca 402107321151212DNA213人工序列220
223引物40073aattctaata cgactcacta tagggagaag gcgagtttgg cgacggcgtc a512107421120212DNA
213人工序列220
223引物40074gcgccaagga agatcactca 202107521120212DNA213人工序列220
223引物40075ggcgacaggt tcttccacca202107621120212DNA213人工序列220
223探針40076gaatctagct ttcaacctcg202107721120212DNA213人工序列220
223引物40077caaggaagat cactcagcga202107821120212DNA213人工序列
220
223引物40078gtcaccaccg ttaggcgaca 202107921120212DNA213人工序列220
223探針40079atctagcttt caacctcgcc 202108021120212DNA213人工序列220
223引物40080agcgatcttg ctgaacgaaa 202108121120212DNA213人工序列220
223引物40081tgggcttgtc accaccgtta 202108221120212DNA213人工序列
220
223探針40082ggccacgtca atcacaccat 202108321120212DNA213人工序列220
223引物40083ttccagctct acgaccagca 202108421120212DNA213人工序列220
223引物40084ttggaagtgg cggcggcgta 202108521120212DNA213人工序列220
223探針40085aaggcggatt acgtcaaggc 202108621120212DNA213人工序列220
223引物40086ctctacgacc agcaggccaa 202108721120212DNA213人工序列220
223引物40087ctgcacgtcc gcccagttga 202108821120212DNA213人工序列220
223探針40088aagaacgtca aggcggatta 202108921120212DNA213人工序列220
223引物40089tacgaccagc aggccaacgt 202109021120212DNA213人工序列220
223探針
40090cacgtccgcc cagttgacca 202109121120212DNA213人工序列220
223探針40091gtacaagaac gtcaaggcgg 202109221120212DNA213人工序列220
223引物40092tcgagctgcc agtgtggtca 202109321120212DNA213人工序列220
223引物40093acgagaatgg aagggggaca 202109421120212DNA213人工序列220
223探針
40094aacagggtcg gatcggccta 202109521120212DNA213人工序列220
223引物40095ccagtgtggt catttccata 202109621120212DNA213人工序列220
223引物40096agggcaccac gagaatggaa 2021097211 20212DNA213人工序列220
223探針40097gcgcggaggt cgaaatggaa 2021098211561212DNA213結核分枝桿菌220
221CDS222(1)..(561)
223
40098atg cgg gcg ttg atc atc gtc gac gtg cag aac gac ttc tgc gag ggt 48Met Arg Ala Leu Ile Ile Val Asp Val Gln Asn Asp Phe Cys Glu Gly1 5 10 15ggc tcg ctg gcg gta acc ggt ggc gcc gcg ctg gcc cgc gcc atc agc 96Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ser20 25 30gac tac ctg gcc gaa gcg gcg gac tac cat cac gtc gtg gca acc aag 144Asp Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asp Tyr His His Val Val Ala Thr Lys35 40 45gac ttc cac atc gac ccg ggt gac cac ttc tcc ggc aca ccg gac tat 192Asp Phe His Ile Asp Pro Gly Asp His Phe Ser Gly Thr Pro Asp Tyr50 55 60tcc tcg tcg tgg cca ccg cat tgc gtc agc ggt act ccc ggc gcg gac 240Ser Ser Ser Trp Pro Pro His Cys Val Ser Gly Thr Pro Gly Ala Asp65 70 75 80ttc cat ccc agt ctg gac acg tcg gca atc gag gcg gtg ttc tac aag 288Phe His Pro Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ile Glu Ala Val Phe Tyr Lys85 90 95ggt gcc tac acc gga gcg tac agc ggc ttc gaa gga gtc gac gag aac 336Gly Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Phe Glu Gly Val Asp Glu Asn100 105 110ggc acg cca ctg ctg aat tgg ctg cgg caa cgc ggc gtc gat gag gtc 384Gly Thr Pro Leu Leu Asn Trp Leu Arg Gln Arg Gly Val Asp Glu Val115 120 125gat gtg gtc ggt att gcc acc gat cat tgt gtg cgc cag acg gcc gag 432Asp Val Val Gly Ile Ala Thr Asp His Cys Val Arg Gln Thr Ala Glu130 135 140gac gcg gta cgc aat ggc ttg gcc acc agg gtg ctg gtg gac ctg aca 480Asp Ala Val Arg Asn Gly Leu Ala Thr Arg Val Leu Val Asp Leu Thr145 150 155 160gcg ggt gtg tcg gcc gat acc acc gtc gcc gcg ctg gag gag atg cgc 528Ala Gly Val Ser Ala Asp Thr Thr Val Ala Ala Leu Glu Glu Met Arg165 170 175acc gcc agc gtc gag ttg gtt tgc agc tcc tga 561Thr Ala Ser Val Glu Leu Val Cys Ser Ser
180 18521099211186212PRT213結核分枝桿菌40099Met Arg Ala Leu Ile Ile Val Asp Val Gln Asn Asp Phe Cys Glu Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Ala Val Thr Gly Gly Ala Ala Leu Ala Arg Ala Ile Ser20 25 30Asp Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asp Tyr His His Val Val Ala Thr Lys35 40 45Asp Phe His Ile Asp Pro Gly Asp His Phe Ser Gly Thr Pro Asp Tyr50 55 60Ser Ser Ser Trp Pro Pro His Cys Val Ser Gly Thr Pro Gly Ala Asp65 70 75 80Phe His Pro Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ile Glu Ala Val Phe Tyr Lys85 90 95Gly Ala Tyr Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Phe Glu Gly Val Asp Glu Asn100 105 110Gly Thr Pro Leu Leu Asn Trp Leu Arg Gln Arg Gly Val Asp Glu Val115 120 125Asp Val Val Gly Ile Ala Thr Asp Hi s Cys Val Arg Gln Thr Ala Glu130 135 140Asp Ala Val Arg Asn Gly Leu Ala Thr Arg Val Leu Val Asp Leu Thr145 150 155 160
Ala Gly Val Ser Ala Asp Thr Thr Val Ala Ala Leu Glu Glu Met Arg165 170 175Thr Ala Ser Val Glu Leu Val Cys Ser Ser180 18權利要求
1.一種檢測待測樣本中微生物存在的方法，該方法包括將待測樣本暴露於能誘導所述微生物中至少一個基因表達的誘導物下並檢測從暴露於所述誘導物而被誘導的基因轉錄的mRNA的存在。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述的微生物是生長緩慢的細菌。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述生長緩慢的細菌選自疏螺旋體屬片球菌屬、枝原體屬或分枝桿菌屬。
4.如權利要求1至3任一項所述的方法，其中檢測從暴露於所述誘導物而被誘導的基因轉錄的mRNA存在的步驟包括進行擴增反應以擴增全長或部分mRNA並檢測擴增反應的特異性產物。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述的擴增反應是RT-PCR或依賴核酸序列的擴增。
6.如權利要求3至5任一項所述的方法，其中所述的誘導物是氧或過氧化氫，並且由於暴露於所述誘導物而被誘導的基因是編碼過氧化物歧化酶的基因。
7.如權利要求6所述的方法，其中檢測從編碼過氧化物歧化酶的基因轉錄的mRNA存在的步驟包括(a)組裝反應混合物，該混合物包含適用於通過NASBA擴增所述mRNA一段區域的NASBA P1和NASBA P2引物對、RNA指導的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體的RNA鏈而不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識別NASBA P1引物中存在的啟動子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸；(b)在允許NASBA擴增反應的反應條件下將所述反應介質與從懷疑含有微生物的待測樣本中分離的核酸製備物一起溫育；並且(c)檢測和/或定量測定NASBA擴增反應的任何特異性產物。
8.如權利要求7所述的方法，該方法用於檢測分枝桿菌屬，其中所述NASBA P1和NASBA P2引物對是下列中的一種包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO25的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO61的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO62的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO64的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO65的NASBA P2引物；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，優選引物4-85；引物4-92和包含SEQ ID NO64的NASBA P2引物，優選引物4-91；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，優選引物4-103；或引物4-122和包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，優選引物4-115。
9.如權利要求6所述的方法，其中檢測從編碼過氧化物歧化酶的基因轉錄的mRNA存在的步驟包括通過RT-PCR擴增部分mRNA。
10.如權利要求9所述的方法，該方法用於檢測分枝桿菌屬，其中使用一種下列引物對實施，通過RT-PCR擴增部分mRNA包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物；包含SEQ ID NO61的PCR引物和包含SEQ ID NO62的PCR引物；或包含SEQ ID NO64的PCR引物和包含SEQ ID NO65的PCR引物。
11.如權利要求3至5任一項所述的方法，其中所述的誘導物是異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷或吡嗪醯胺，並且由於暴露於所述誘導物而被誘導的基因是pncA基因。
12.如權利要求11所述的方法，其中檢測從pncA基因轉錄的mRNA存在的步驟包括(a)組裝反應混合物，該混合物包含適用於通過NASBA擴增所述mRNA一段區域的NASBA P1和NASBA P2引物對、RNA指導的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體的RNA鏈而不水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識別NASBA P1引物中存在的啟動子序列的RNA聚合酶以及核糖核苷三磷酸和脫氧核糖核苷三磷酸；(b)在允許NASBA擴增反應的反應條件下將所述反應介質與從懷疑含有微生物的待測樣本中分離的核酸製備物一起溫育；並且(c)檢測和/或定量測定NASBA擴增反應的任何特異性產物。
13.如權利要求12所述的方法，該方法用於檢測結核分枝桿菌，其中所述NASBA P1和NASBAP2引物對是下列中的一種包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物；引物4-2和包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，優選引物4-1；引物4-8和包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，優選引物4-7；或引物4-14和包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，優選引物4-15。
14.如權利要求11所述的方法，其中檢測從pncA基因轉錄的mRNA存在的步驟包括通過RT-PCR擴增部分mRNA。
15.如權利要求14所述的方法，該方法用於檢測結核分枝桿菌，其中使用一種下列引物對實施，通過RT-PCR擴增部分mRNA包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；或包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物。
16.一種用於檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的寡核苷酸引物，其中從可誘導型基因轉錄mRNA，所述寡核苷酸引物選自(i)包含SEQ ID NOs2、8、14、20、26、32、38、62、65、68、75、78、81、84、87、90、93或96中一條的NASBA P1引物；(ii)引物號為4-2、4-8、4-14、4-86、4-98、4-104、4-110、4-116或4-122的NASBA P1引物；(iii)包含SEQ ID NOs1、7、13、19、25、31、37、61、64、67、74、77、80、83、86、89、92或95中一條的NASBA P2引物；(iv)引物號為4-1、4-7、4-13、4-85、4-97、4-103、4-109、4-115或4-121的NASBA P2引物；(v)包含SEQ ID NOs1、2、7、8、13、14、19、20、25、26、31、32、37、38、61、62、64、65、67、68、74、75、77、78、80、81、83、84、87、88、89、90、92、93、95或96中一條的PCR引物。
17.一種用於檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的寡核苷酸探針，其中從可誘導型基因轉錄mRNA，所述寡核苷酸分子選自(i)包含SEQ ID NOs3、9、15、21、27、33、39、63、66、69、76、79、82、85、88、91、94或97中一條的探針寡核苷酸；(ii)SEQ ID NO4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41或42的分子標燈探針寡核苷酸。
18.一種用於通過NASBA檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的引物/探針組合，其中從可誘導型基因轉錄mRNA，所述引物/探針組合選自包含SEQ ID NO2的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO3的探針或者選自SEQ ID NOs4、5或6的至少一個分子標燈探針；包含SEQ ID NO8的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO9的探針或者選自SEQ ID NOs10、11或12的至少一個分子標燈探針；包含SEQ ID NO14的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO15的探針或者選自SEQ IDNOs16、17或18的至少一個分子標燈探針；引物4-2，包含SEQ ID NO1的NASBA P2引物，優選引物4-1，和或者包含SEQ ID NO3的探針或者選自SEQ ID NOs4、5或6的至少一個分子標燈探針；引物4-8，包含SEQ ID NO7的NASBA P2引物，優選引物4-7，和或者包含SEQ ID NO9的探針或者選自SEQ ID NOs10、11或12的至少一個分子標燈探針；引物4-14，包含SEQ ID NO13的NASBA P2引物，優選引物4-15，和或者包含SEQ ID NO15的探針或者選自SEQ ID NOs16、17或18的至少一個分子標燈探針；包含SEQ ID NO20的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO21的探針或者選自SEQ IDNOs22、23或24的至少一個分子標燈探針；包含SEQ ID NO26的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO25的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO27的探針或者選自SEQ IDNOs28、29或30的至少一個分子標燈探針；包含SEQ ID NO32的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO31的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO33的探針或者選自SEQ IDNOs34、35或36的至少一個分子標燈探針；包含SEQ ID NO38的NASBA P1引物，包含SEQ ID NO37的NASBA P2引物，和或者包含SEQ ID NO39的探針或者選自SEQ IDNOs40、41或42的至少一個分子標燈探針；NASBA P1引物4-86和包含SEQ ID NO61的NASBA P2引物，優選引物4-85；引物4-104和包含SEQ ID NO19的NASBA P2引物，優選引物4-103。
19.一種用於通過RT-PCR檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的引物組合，其中從可誘導型基因轉錄mRNA，所述引物組合選自包含SEQ ID NO2的PCR引物和包含SEQ ID NO1的PCR引物；包含SEQ ID NO8的PCR引物和包含SEQ ID NO7的PCR引物；包含SEQ ID NO14的PCR引物和包含SEQ ID NO13的PCR引物；包含SEQ ID NO20的PCR引物和包含SEQ ID NO19的PCR引物；包含SEQ ID NO26的PCR引物和包含SEQ ID NO25的PCR引物；包含SEQ ID NO32的PCR引物和包含SEQ ID NO31的PCR引物；包含SEQ ID NO38的PCR引物和包含SEQ ID NO37的PCR引物。
20.一種用於通過RT-PCR檢測在分枝桿菌屬的種中表達的mRNA的引物/探針組合，其中從可誘導型基因轉錄mRNA，所述引物/探針組合選自包含SEQ ID NO2的PCR引物、包含SEQ ID NO1的PCR引物和包含SEQ ID NO3的探針；包含SEQ ID NO8的PCR引物、包含SEQ ID NO7的PCR引物和包含SEQ ID NO9的探針；包含SEQ ID NO14的PCR引物、包含SEQ ID NO13的PCR引物和包含SEQ ID NO15的探針；包含SEQ ID NO20的PCR引物、包含SEQ ID NO19的PCR引物和包含SEQ ID NO21的探針；包含SEQ ID NO26的PCR引物、包含SEQ ID NO25的PCR引物和包含SEQ ID NO27的探針；包含SEQ ID NO32的PCR引物、包含SEQ ID NO31的PCR引物和包含SEQ ID NO33的探針；或包含SEQ ID NO38的PCR引物、包含SEQ ID NO37的PCR引物和包含SEQ ID NO39的探針。
全文摘要
本發明提供了通過誘導mRNA表達並檢測誘導的mRNA，來檢測微生物，特別是生長緩慢的細菌如分枝桿菌屬(Mycobacterium)細菌存在的方法。本發明還提供了用於檢測分枝桿菌屬的寡核苷酸引物和探針。
文檔編號C12Q1/68GK1514882SQ02809940
公開日2004年7月21日 申請日期2002年3月20日 優先權日2001年3月20日
發明者弗蘭克·卡爾森, 弗蘭克 卡爾森 申請人:挪其普公司