以聚肌苷酸－聚胞苷酸為主的佐劑的製作方法

2023-05-08 06:08:26

專利名稱:以聚肌苷酸－聚胞苷酸為主的佐劑的製作方法
技術領域：
本發明主要關於佐劑組合物以及使用這些佐劑組合物來促進免疫反應的方法，它特定關於用以促進抗原的免疫原性(immunogenicity)的組合物、疫苗和方法。它更特定關於聚核苷酸佐劑組合物、含有該聚核苷酸佐劑組合物的疫苗，以及利用所述聚核苷酸佐劑組合物和疫苗來促進宿主體內的免疫反應的方法。
發明背景1.相關技術的敘述免疫系統具有產生特異性和非特異性免疫力。一般而言，B和T淋巴細胞在他們的細胞表面上有針對特定抗原的特定受體，能產生特異性免疫。該免疫系統會對各抗原以二種方式特異免疫反應1)體液免疫反應，涉及刺激B細胞產生抗體或免疫球蛋白、抗原提呈細胞(APCs)功能及輔助性T細胞(Th1和Th2)功能，以及2)細胞免疫反應，一般涉及T細胞、包括細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)和其它涉及CTL反應的產生例如，Th1和/或Th2細胞以及APCs。
非特異性免疫包含多種細胞作用機制，例如巨噬細胞(macrophages)或顆粒細胞(granulocytes)的吞噬作用(phagocytosis)以吞噬外來顆粒或抗原，以及天然殺傷細胞(NK細胞)活性等。非特異性免疫力依賴是原來的免疫機制，且不會展現出特異性和記憶性的獲得性特性，該獲得性特性是特異性免疫反應的典型特點。特異性和非特異性免疫之間的關鍵性差異是前者由淋巴細胞介導識別特異性抗原基序，具有記憶功能；而後者沒有此功能。因此接種疫苗(涉及免疫特異性和記憶性)是一種保護機體以對抗有害病原體的有效機制。
佐劑是增強機體對抗原的免疫反應或改變免疫反應類型的物質，當它和抗原共同給予時(與該抗原相混合，或在給予該抗原以前或後給予)會促進或改變對於該特定抗原的免疫反應及免疫反應的類型。
常見促進免疫反應的典型佐劑包括鋁化合物(該佐劑常被通稱為鋁佐劑″Alum″)、水包油乳劑(完全弗氏佐劑CFA是一種水包油乳劑，含有經乾燥和熱殺滅的結核桿菌)、皂甙(從皂質樹QuillajaSaponoria皮分離而來，該佐劑活性成份被稱為Quile A)、CpG ODN(合成寡去氧核苷酸，含有去甲基化的CpG二聚核苷酸)、MPL(從明尼蘇達Re595沙氏桿菌(Salmonella minnesota Re595)的脂多醣衍生而來)、脂質體(通常由如磷脂等可生物降解性材料製成)以及可生物降解性聚合微球體(由如PLGA、聚膦腈(polyphosphazene)和聚酐等多種聚合物製成)。這些物質的佐劑性質已經過評估各有優缺點。
將佐劑應用在人用疫苗，特別是兒童用常規疫苗的最大挑戰在於大多數佐劑配方產生毒性和不良反應或者佐劑效果不顯著。在疫苗研發所運用的新技術正朝向純化、亞單位或合成抗原發展，這些抗原本身具有較弱的免疫原性。開發新佐劑以改善免疫原性/有效性並減低不良副作用是疫苗研發麵對的一個主要挑戰。
聚核苷酸複合物已在試驗用作佐劑等多種用途上。雙鏈RNAs(dsRNAs)是非常有效的生物修飾因子，可在毫微摩爾濃度下對細胞引起明顯作用。dsRNA的調控效應包括在分子和細胞水平上廣泛的作用。
在分子水平上，dsRNAs可誘導如幹擾素(interferon)的合成、蛋白質激酶的產生、增進組織兼容性抗原以及抑制代謝作用等生物效應。在細胞水平上，dsRNA可激發如熱原性(pyrogenicity)、細胞分裂(mitogenicity)、巨噬細胞活化、活化細胞免疫以及引發抗病毒等生物效應。dsRNAs的巨大前景在於抗微生物治療上的免疫調控效應。美國專利第4,124,702號提出dsRNAs在活的動物細胞中誘導幹擾素產生。美國專利第3,906,092號提出含有聚核苷酸或聚核苷酸複合物的佐劑型疫苗抗體產生增強。Houston等人建立PICLC(聚肌苷酸聚胞苷酸poly-L-賴氨酸-羧甲基纖維素複合物)作一種有效的佐劑，藉此增加初級抗體反應而無需其它佐劑的輔助(參見Houston et al.，Infection andImmunity，14318-9，1976C)。黴病毒型dsRNA(Mycoviral dsRNA)被發現能顯著地增進凝血抗體對於綿羊紅血球細胞的反應(參見Wrightand Adler-Moore，Biochemical and Biophysical Research Communications，131949-45，1985)。
PIC(聚肌苷酸-聚胞苷酸)用於動物時，在一定劑量下會引起嚴重的毒性反應，例如，Phillips等人報導在2.0mg/kg劑量下亞慢性給予狗PIC會引起嚴重的毒性作用。毒性的表現為自發性活動減低、協調不良、厭食、嘔吐、體重下降，血液變化反映在降低造血功能、鹼性磷酸酶和轉胺酶活性升高、胸腺退化、骨髓破壞、肝臟的小葉中心區竇狀毛細血管擴張、肝細胞壞死、肝結構崩解以及全身性關節炎(參見Phillips et al.，Toxicology and Applied Pharmacology，18220-30，1971)。
作為被研究最多的聚核苷酸複合物中的一種，PIC在用於猴和人體時並不有效，這是因為PIC在進入靈長類(包括人)體內後，會很快被靈長類以上動物體內的核酸酶降解。因此許多方式用來改進PIC的不足，例如，由PIC與poly-L-lysine hydrobromide複合物對於胰核糖核酸酶水解的抵抗性較原PIC高約5至15倍，又例如PIC與polyL-lysincarboxymethylcellulose複合物(簡稱PICLC)被發現是非常有效的抗病毒或抗腫瘤劑。PICLC是一種包含有聚核苷酸和聚核糖胞苷酸的合成dsRNA。雖然PICLC是一種有前景的免疫調控劑，在抗微生物與抗癌治療有很好潛能，但在人體試驗中產生嚴重不良副作用，特別是反覆高劑量用藥時。有報導的不良副作用包括發熱、低血壓、白血球減少(leucopenia)、肢體倦痛(myalgia)、血小板減少(thrombocytopenia)以及多關節痛(polyarthralgia)。因此該產品不能用於人體，該產品的毒性和穩定性問題必須被克服。以使得PICLC能使安全用於用人體。此外PICLC的治療有效性受限於其在活體內的穩定性。
一種包含有聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、卡那黴素(kanamycin)和鈣離子(該複合物簡稱Av-PICKCa)的抗病毒藥物被用於治療病毒感染。已證實Av-PICKCa在機體誘導發乾擾素與白介素-2的產生。單獨給予Av-PICKCa作為抗病毒藥物會刺激非特異性免疫反應，例如Av-PICKCa直接刺激下非針對特定抗原幹擾素的產生。此種抗病毒反應非常不同於當佐劑與抗原共同給予時所產生的抗原特異性免疫反應。
更重要的是本案發明人發現到Av-PICKCa具有佐劑的性質，也就是當與抗原共同給予時增強特異性免疫反應的能力。本案發明人發現當與狂犬病及出血熱病毒抗原共同免疫時，Av-PICKCa是一種有效的佐劑。
Lin等人敘述，Av-PICKCa可用作一種佐劑(參見Lin，et al.，A newimmunostimulatory complex(PICKCa)in experimental rabiesantiviraland adjuvant effects，Arch Virol，131307-19，1993；中國專利93105862.7號)。中國專利第93105862.7號提供由PIC、卡那黴素和鈣離子所構成的複合物(簡稱PICKCa)在人和哺乳動物作為疫苗佐劑用途。
Av-PICKCa樣品在分子大小和重量上是異質的。在文獻中，Av-PICKCa是以沉降係數單位(Svedbergs)S所表示的沉降係數值的平均值或範圍來敘述。在一個實施例中，抗病毒藥劑Av-PICKCa存在於5S至8S之間劑(來源A)，請參見Zhung J.C.，Research recollectionof polyinosinic-polycytidylic acid(PIC).The paper of fifth Chineseinterferon conference in clinical application and theory，Xian 1985，pp23-28。在其它的實施例中，Av-PICKCa的沉降係數是4S至12S，具有一平均值為6S劑(來源B)，或者沉降係數是5S至12S，具有一平均值為7S劑(來源C)，或者沉降係數是8S至10S劑(來源D)，請參見Hu Q.G，Tianjin Av-PICKCa’s laboratory research and clinicalapplication，Fujian Medical Journal，1983.12；(6)28-30以及Hu Q.GChinese Medical and Pharmaceutical Industry Journal，1983(9)3134。
利用換算公式mw＝1,100xS2.2(參見Su B.X.et al；Introduction ofBiochemical Technology，1st Edition，Zhongshan University，1978，356-357)，Av-PICKCa中的異質分子的沈降係數可換算成對等的分子量(mw，以道爾頓Daltons表示)。下表顯示換算成道爾頓的結果表AAv-PICKCa的特性
*參考文獻中沒有提出的數據Lin等人將一個樣品用於以Av-PICKCa作為佐劑的原始研究中，該樣品的分子具有和來源A相類似的特性，也就是它的沉降係數是5S至8S，該沉降係數對等於位在38,000道爾頓至107,000道爾頓範圍內的分子的分子量。(參見Lin et al.，同前)。
一般相信，所有形式的PICKCa均是對等地安全且有效，因為Av-PICKCa基本上是PICKCa的一種形式，且Av-PICKCa在過去已被用作為抗病毒藥劑。但事實卻不是如此。本案發明人所進行的研究顯示，當PICKCa和抗原組合而被用作為一佐劑時，PICKCa的有效性和毒性事實上會隨著分子量的不同而有變化。本案發明人發現Av-PICKCa作為佐劑時不能提供最佳的有效性/安全性狀態，且PICKCa在某些情況下確實會引起令人無法接受的不良副作用。因此，業界仍然需要一種更適於人類使用並且能提供所需免疫反應的安全且有效佐劑。本發明能滿足這個需求並提供其它優點，參照後述詳細說明即可明暸。
2.文獻相關參考資料列示於下JP 1093540A2；美國專利第4,124,702號美國專利第3,692,899號美國專利第3,906,092號美國專利第4,389,395號美國專利第4,349,538號美國專利第4,024,241號美國專利第3,952,097號Houston et al.，Infection and Immunity，14318-9，1976CWright and Adler-Moore，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，131949-45，1985Phillips et al.，Toxicology and Applied Pharmacology，18220-30，1971Lin，et al.，A new immunostimulatory complex(PICKCa)inexperimental rabiesantiviral and adjuvant effects，Arch Virol，131307-19，1993中國專利第93105862.7號Zhung J.C.，Research recollection of polyinosinic-polycytidylic acid(PIC).The paper of fifth Chinese interferon conference in clinicalapplication and theory，Siam 1985，pp23-28Hu Q.G，Tianjin Av-PICKCa’s laboratory research and clinicalapplication，Fujian Medical Joumal，1983.12；(6)28-30Hu Q.G Chinese Medical and Pharmaceutical Industry Journal，1983(9)3134.
Su B.X.et al；Introduction of Biochemical Technology，1st Edition，Zhongshan University，1978，356-357Gupta R.K.et al.，Adjuuvants-a balance between toxicity andadjuvanticity，Vaccine，11293-306，1993Arnon，R.(Ed.)Synthetic Vaccines 183-92，CRC Press，Inc.，BocaRaton，Fla.，1987Sela，M.，Science 1661365-1374(1969)U.S.Pat.No.6,008,200Ellouz et al.，Biochem.Biophy.Res.Comm.，591317，1974美國專利第4,094,971號美國專利第4,101,536號美國專利第4,153,684號美國專利第4,235,771號美國專利第4,323,559號美國專利第4,327,085號美國專利第4,185,089號美國專利第4,082,736號美國專利第4,369,178號美國專利第4,314,998號美國專利第4,082,735號美國專利第4,186,194號美國專利第6,468,558號New Trends and Developments in Vaccines，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，Md.，USA，1978Klein，J.，et al.，Immunology(2nd)，Blackwell Science Inc.，Boston(1997)Gupa R.K.and Siber G.R.，Adjuvants for human vaccines-currentstatus，problems and future prospects，Vaccine，13(14)1263-1276，1995Richard T Kenney et al.Meeting Report-2nd meeting on noveladjuvants currently in/close to human clinical testing，Vaccine 202155-2163，2002Laboratory Techniques in Rabies Edited by F X Meslin，M M Kaplan，H Koprowski 4th Edition ISBN 92 4 1544 1
發明內容
本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物以及用以誘導免疫反應的方法。本發明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物和抗原(例如此二種成份位於一疫苗內)。本發明的佐劑組合物具有特定的物理性質(例如分子量、濃度和pH)，這些性質能符合於提供一種誘導增強免疫反應和改變免疫反應類型的有效且安全的佐劑。本發明更提供這些佐劑組合物的使用方法，特別是誘發對於抗原物的免疫反應。
在實施例中，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid)(PIC)、一抗生素以及一陽離子，其中該抗生素可為卡那黴素，且該陽離子可為一個二價離子，例如鈣。本發明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物以及抗原或疫苗。
本發明藉由界定一種可安全且有效地用作為一佐劑的新穎組合物，以增進及/或改變一動物或人類宿主體內的免疫反應，從而促進知識的提升。雖然先前技術顯示抗病毒藥劑Av-PICKCa可用以作為一種佐劑，但是此種形式的PICKCa和抗原共同給予時，被觀察到僅能引起有限的特異性免疫反應。此外，PICKCa被發現在某些情況下會引起令人無法接受的不良副作用。
本發明藉由提供一種佐劑組合物來因應這些問題，該組合物在此簡稱為「PIKA」，其可作為一佐劑而最有效且安全地給予動物，包括人類。
PIKA是一種組合物，包含一聚核苷酸、一抗生素以及一陽離子，該組合物已被特定地研發成為一種佐劑。本發明包括數種組合物，這些組合物具有特殊的產物特性，使這些組合物特別適合使用作為在免疫原組成物內的佐劑，以給予動物及/或人類。
具體上說，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含一聚核苷酸、一抗生素以及一陽離子，其中該聚核苷酸可為聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)；該抗生素是卡那黴素、蒽環黴素(Anthracycline)、硫酸丁醯苷菌素(butirosin sulfate)、慶大黴素(gentamicin)、潮黴素(hygromycin)、丁胺卡那黴素(amikacin)、雙去氧卡那黴素(dibekacin)、暗黴素(nebramycin)、美它醯胺(metrzamide)、新黴素(neomycin)、嘌呤黴素(puromycin)、鏈黴素或鏈脲黴素(streptozocin)；以及該離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
詳細地說，本發明提供包含有一聚核苷酸、一抗生素以及一陽離子的組合物的規格，包括分子量、濃度和pH，該組合物能滿足對於引起最大所需免疫反應並安全佐劑的需要。
本發明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物以及抗原或疫苗。
在某些實施例中，本發明呈現一種組合套裝(KIT)的形式，包含該聚核苷酸佐劑以及一免疫原性物質。
此外，本發明提供方法，藉由將該免疫原組成物給予一宿主，以促進對於抗原物質的免疫反應。該宿主可為人類或動物。該給予過程可經由如肌肉內、腹腔內、靜脈內或皮下注射等注射或是藉由經呼吸道吸入來完成。在其它實施例中，該免疫原組成物可經由直腸、陰道、鼻、口、眼、局部、透皮或皮內來傳輸。
據此，本發明提供可安全地使用於人體或動物體的一種佐劑以及一種免疫原組成物。
據此，在一方面，本發明的特點是一種聚核苷酸佐劑組合物，包含一聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一抗生素以及一陽離子，其中該組合物含有在分子量上為異質的佐劑分子，該分子的分子量為約66,000至1,200,000道爾頓。
在相關實施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子在分子量上是異質的，其中該分子量為約300,000至1,200,000道爾頓，或是約66,000至660,000道爾頓，或是約300,000至660,000道爾頓，或是約300,000至2,000,000道爾頓，或是約300,000至to 4,000,000道爾頓，或是約500,000至1,000,000道爾頓，或是約1,000,000至1,500,000道爾頓，或是約1,500,000至2,000,000道爾頓，或是約2,000,000至2,500,000道爾頓，或是約2,500,000至3,000,000道爾頓，或是約3,000,000至3,500,000道爾頓，或是約3,500,000至4,000,000道爾頓，或是約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。
在相關實施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子具有一平均分子量，該平均分子量等於或高於150,000道爾頓，或是等於或高於250,000道爾頓，或是等於或高於350,000道爾頓，或是等於或高於500,000道爾頓，或是等於或高於650,000道爾頓，或是等於或高於750,000道爾頓，或是等於或高於1,000,000道爾頓，或是等於或高於1,200,000道爾頓，或是等於或高於1,500,000道爾頓，或是等於或高於2,000,000道爾頓。
據此，在一態樣中，本發明的特點是一種聚核苷酸佐劑組合物，包含一聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、一抗生素以及一陽離子，其中該組合物含有在分子大小上呈異質的佐劑分子，這些佐劑分子的沈降係數單位(Svedbergs)為約6.43S至24.03S。
在相關實施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子在分子大小上是異質的，其中該分子大小為約12.8S至24.03S，或是約6.43至18.31S，或是約12.8至18.31S，或是約12.8S至30.31S，或是約12.8S至41.54S，或是約13.5S至18.31S，或是約13.5S至24.03S，或是約16.14至22.12S，或是約22.12S至26.6S，或是約26.6S至30.31S，或是約30.31S至33.55S，或是約33.55S至36.45S，或是約36.45S至39.1S，或是約39.1S至41.54S，或是約41.54S至43.83S，或是約43.83S至45.95S。
在其它相關實施例中，該聚核苷酸佐劑組合物具有一平均沉降係數單位(Svedbergs)，該平均沈降係數高於9，或是高於12，或是高於13.5，或是高於15，或是高於16，或是高於17，或是高於18，或是高於19，或是高於20，或是高於21，或是高於22，或是高於25，或是高於30。
在一相關實施例中，該組合物中的抗生素是卡那黴素、新黴素、蒽環黴素、硫酸丁醯苷菌素、慶大黴素、潮黴素、丁胺卡那黴素、雙去氧卡那黴素、暗黴素、美它醯胺、嘌呤黴素、鏈黴素或鏈脲黴素。
在另一相關實施例中，該佐劑組合物更包含一種鈣離子。
在另一相關實施例中，該組合物中的陽離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。該陽離子可呈無機鹽或有機複合物的形式。
鈣離子來源可為例如氯化鈣、碳酸鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣。
在一個特別相關方面，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣，其中該組合物包括在分子量上呈異質的佐劑分子，這些佐劑分子的分子量為約66,000至1,200,000道爾頓。
在相關實施例中，該聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣分子的分子量為約300,000至1,200,000道爾頓，或是約66,000至660,000道爾頓，或是約300,000至660,000道爾頓，或是約300,000至2,000,000道爾頓，或是約300,000至4,000,000道爾頓，或是約500,000至1,000,000道爾頓，或是約1,000,000至1,500,000道爾頓，或是約1,500,000至2,000,000道爾頓，或是約2,000,000至2,500,000道爾頓，或是約2,500,000至3,000,000道爾頓，或是約3,000,000至3,500,000道爾頓，或是約3,500,000至4,000,000道爾頓，或是約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。
在其它相關實施例中，該佐劑的聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣分子組合物在分子量上呈異質，這些分子具有一平均分子量，該平均分子量等於或高於150,000道爾頓，等於或高於250,000道爾頓，或是等於或高於350,000道爾頓，或是等於或高於500,000道爾頓，或是等於或高於650,000道爾頓，或是等於或高於750,000道爾頓，或是等於或高於1,000,000道爾頓，或是等於或高於1,200,000道爾頓，或是等於或高於1,500,000道爾頓，或是等於或高於1,500,000道爾頓。
在一個特別相關方面，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣，其中該組合物包括在分子大小上呈異質的佐劑分子，這些佐劑分子的沈降係數單位(Svedbergs)為約6.43S至24.03S。
在相關實施例中，該組合物中的聚核苷酸佐劑組合物分子在分子大小上是異質的，其中該分子大小為約12.8S至24.03S，或是約6.43至18.31S，或是約12.8至18.31S，或是約12.8S至30.31S，或是約12.8S至41.54S，或是約13.5S至18.31S，或是約13.5S至24.03S，或是約16.14至22.12S，或是約22.12S至26.6S，或是約26.6S至30.31S，或是約30.31S至33.55S，或是約33.55S至36.45S，或是約36.45S至39.1S，或是約39.1S至41.54S，或是約41.54S至43.83S，或是約43.83S至45.95S。
在其它相關實施例中，該聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣組合物具有一平均沉降係數，該平均沈降係數高於9，或是高於12，或是高於13.5，或是高於15，或是高於16，或是高於17，或是高於18，或是高於19，或是高於20，或是高於21，或是高於22，或是高於25，或是高於30。
在一些實施例中，本發明供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣，其中該組合物較佳為排除某些組合物分子，特別是在這些被排除的分子不具有顯著的免疫原效應的程度上，其中被排除的組合物分子的分子量為大約或低於30,000道爾頓，大約或低於40,000道爾頓，大約或低於50,000道爾頓，大約或低於60,000道爾頓，大約或低於70,000道爾頓，大約或低於80,000道爾頓，大約或低於90,000道爾頓，大約或低於100,000道爾頓，大約或低於150,000道爾頓，大約或低於200,000道爾頓，大約或低於250,000道爾頓，大約或低於300,000道爾頓，大約或低於350,000道爾頓，大約或低於400,000道爾頓，大約或低於450,000道爾頓，大約或低於500,000道爾頓，大約或低於600,000道爾頓，大約或低於700,000道爾頓，大約或低於800,000道爾頓，大約或低於900,000道爾頓，大約或低於1,000,000道爾頓。
在一些實施例中，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣，其中最好為排除該組合物某些分子，特別是在這些被排除的分子不具有顯著程度的免疫原效應的，其中被排除的分子的分子大小為大約或低於4.49S，大約或低於5.12S，大約或低於5.67S，大約或低於6.16S，大約或低於6.6S，大約或低於7.02S，大約或低於7.4S，大約或低於7.77S，大約或低於9.34S，大約或低於10.64S，大約或低於11.78S，大約或低於12.8S，大約或低於13.73S，大約或低於14.59S，大約或低於15.39S，大約或低於16.14S，大約或低於17.54S，大約或低於18.81S，大約或低於19.99S，大約或低於21.09S，大約或低於22.12S。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進抗原物的抗原性的免疫原組合物，包含該聚核苷酸佐劑的組合物。
在相關實施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑以及抗原。
在相關實施例中，抗原來源是一種人類抗原、一種非人類動物抗原、一種植物抗原、一種細菌抗原、一種真菌抗原、一種病毒抗原、一種寄生蟲抗原或是一種癌腫抗原。
在相關實施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物以及一狂犬病抗原。
在某些實施例中，抗原可從一天然來源純化出，藉由固相合成法來合成出或是可藉由重組遺傳技術而獲得。抗原可包含一個蛋白質片段，該蛋白質片段含有該分子的一或多個免疫原區。抗原亦可藉由活的、減毒的、或截短的或被殺死的完整細胞或微生物(例如完整病毒顆粒)來提供。
在其它的實施例中，抗原包括一或多種成分，源自於感染物、植物抗原、癌腫、過敏性成分以及例如會導致自體免疫疾病的其它人類抗原。在其它的實施例中，抗原包括一或多種感染物，源自於病毒、細菌、分枝桿菌(Mycobacterium)、真菌及寄生蟲中的任一種。
本發明的聚核苷酸佐劑組合物亦可用於促進免疫反應，該免疫反應是針對運用DNA疫苗所產生的抗原。這些疫苗中用以編碼抗原的DNA序列可以是″裸露的″，或是被容納在一個如脂小體的載體系統內。
在其它的相關實施例中，狂犬病抗原是選自於人類雙倍體細胞疫苗(HDCV)，或是倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病疫苗(HKC-IPRV)，或是倉鼠腎細胞滅活粗製型狂犬病疫苗(HKC-ICRV)，或是純化型Vero細胞狂犬病疫苗(PVRV)，或是純化型雞胚細胞(PCEC)，或是純化型鴨胚疫苗(PDEV)，或是倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA) 或是倉鼠腎細胞滅活粗製狂犬病抗原(HKC-ICRA)。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進抗原物的抗原性的免疫原組成物，包含能誘導抗原特異性細胞免疫反應的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進抗原物的抗原性的免疫原組成物，包含能誘導抗原特異性B細胞免疫反應的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進抗原物的抗原性的免疫原組成物，包含能同時誘導T細胞和B細胞對抗原特異性免疫反應的聚核苷酸佐劑組合物。
在一個特別相關方面方面，本發明提供一種用以促進一物質的抗原性的免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物以及一倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該狂犬病抗原的存在應達到一最低量，例如超過1個國際單位(IU)。
在相關實施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物以及倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該狂犬病抗原的存在應達到一最低量，例如超過0.25個國際單位，超過0.5個國際單位，超過1.2個國際單位，超過1.4個國際單位，超過1.6個國際單位，超過1.8個國際單位，超過2.0個國際單位，超過2.2個國際單位，超過2.4個國際單位，超過2.6個國際單位，超過2.8個國際單位，超過3.0個國際單位，超過3.2個國際單位，超過3.4個國際單位，超過3.6個國際單位，超過3.8個國際單位，或是超過4.0個國際單位。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進一物質的抗原性的免疫原組成物，它包含該聚核苷酸佐劑組合物以及倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該佐劑和狂犬病抗原呈現約1比1的比例。
在相關實施例中，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物以及倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原，其中該佐劑和狂犬病抗原呈現低於1比10，約1比9，約1比8，約1比7，約1比5，約1比4，約1比3，約1比2，約2比1，約3比1，約4比1，約5比1，約6比1，約7比1，約8比1，約9比1，約10比1，或是大於10比1的比例。
在一個特別相關方面，本發明提供一種佐劑組合物或免疫原組成物，其中該免疫原組成物，或是被包含在該免疫原組成物的佐劑組合物，是呈現一固體或液體形態或是位於溶液或懸浮液內。
在一個特別相關方面，本發明提供一種佐劑組合物或包含一佐劑組合物的免疫原組成物，其中該佐劑組合物或免疫原組成物能被冷凍乾燥。
在相關實施例中，本發明提供一種組合套裝(KIT)，包含該佐劑組合物以及抗原物質。
在一個特別相關方面，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物的用途，以製備促進宿主的免疫反應的藥劑。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進對於抗原物的免疫反應的方法，包括將一用以促進抗原物的抗原性的免疫原組成物給予宿主，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物。
在相關實施例中，將該免疫原組成物給予一宿主的方法可選自下列方法中的任一個方式，該方法包括有胃腸道外注射、肌肉內注射、腹腔內注射、靜脈注射、皮下注射、經呼吸道吸入、直腸傳輸、陰道傳輸、經鼻傳輸、經口傳輸、經眼傳輸、局部傳輸、透皮傳輸或皮內傳輸。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進對於抗原物的免疫反應的方法，包含將一用以促進抗原物的抗原性的免疫原組成物給予一宿主，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物，其中該宿主是動物。
在一個特別相關方面，本發明提供一種用以促進對於抗原物的免疫反應的方法，包含將一用以促進抗原物的抗原性的免疫原組成物給予一宿主，該免疫原組成物包含該聚核苷酸佐劑組合物，其中該宿主是人類。
通過後續的詳細敘述內容以及所附圖式，本發明的上述特點和其它優點將會變得明顯。
第1圖顯示Av-PICKCa和PIKA樣品的相對分子量。
第2圖顯示PIKA疫苗誘導特異性產生伽瑪幹擾素細胞因子的劑量依賴性生成。
具體實施方式本發明可藉由後續對於本發明某些具體描述以及其中所包括的實施例的詳細內容而更容易被了解。
本中請案在整篇內容中參照公開文獻，這些公開文獻的內容被併入本申請案中作為參考，以充分地敘述本發明所屬技術領域：
的水準。
在進一步敘述本發明之前，應明暸本發明不會被局限於所述特定實施例中，因為這些實施例必然是多樣的。亦應明暸本說明書中所使用的用語僅是為了闡述特定實施例，而非作為限制，因為本發明的範圍將會被界定在所附申請專利範圍中。
除非另行界定，本說明書中所使用的所有技術和科學用語均和本案所屬技術領域：
中具有通常知識的人士所普遍明暸的意義相同。現在就實施本發明的較佳方法和材料加以敘述，但是和本說明書中所述方法和材料類似或等效的任何方法和材料均可用以實施或測試本發明。本說明書中所提到的所有公開文獻均被併入於此作為參考，以揭示並說明所述公開文獻中的方法及/或材料。
應注意，如本案說明書和申請專利範圍中所使用的用語，除非前後文意指明另有其它意義，否則單數形用語「a」、「and」和「the」包括複數形用語。因此，例如提及「一個文句」即包括此文句的複數形式，提及「該片段」即包括提及一或多個片段以及熟習於本領域技術人士所知悉的等效體等等。此外應注意，申請專利範圍可被撰寫成排除任何可選擇性成分。因此，此一說明是要作為使用例如「僅有(solely)」、「只有(only)」等排除性用語於申請專利範圍構成要件的相關載述內容時或是使用「負向」限制(「negative」limitation)時的前述基礎(antecedentbasis)。
名詞定義在陳述本發明的詳細內容之前，應當了解被使用於本說明書中的數個用語。
使用於此處的「佐劑」此用語是指增加或改變宿主對於抗原物的免疫反應的任何物質或物質混合物。特定地說1.「PICKCa」此用語是一般性地指稱一個由PIC、卡那黴素和鈣所構成的組合物，而組合物無特定的物理和免疫原性特性。
2.「Av-PICKCa」是指PICKCa在商業上被使用作為抗病毒藥劑的形式。
3.「PIKA」是指本發明組合物，包含PIC、一抗生素(例如卡那黴素)以及一陽離子(例如鈣)，其中所述PIKA的特徵在於物理特性(例如本說明書中所敘述的分子量、大小等)，以使得PIKA在給予後可展現出一個佐劑的特性，且具有相較於以PICKCa為例更低的不良副作用(例如毒性降低)以及相較於以Av-PICKCa為例更高的效力強度(例如誘導增進的免疫反應)。
「含PIC分子」或「含PIC物」是非限制性地指稱PIC，它可選擇性地通過複合或組合以上所述含PIC分子的組合物中的一抗生素(例如卡那黴素)以及一陽離子(例如鈣)中的至少一者或二者。
在本發明佐劑組合物的前後文中所使用的「異質」此用語是指該組合物的成份(例如含PIC分子)在分子量、大小或此二者的物理特性上不是均一的。
「動物」此用語包括人類及所有畜養和野生的動物及禽鳥，其非限制性地包括牛、馬、乳牛、豬、綿羊、山羊、狗、貓、兔、鹿、貂、雞、鴨、鵝、火雞、鬥雞等。
「抗體」此用語包括多株及單株抗體以及這些抗體的抗原物結合片段，包括Fab、F(ab』)2、Fd、Fv片段，以及這些抗體和片段的單鏈衍生物。此外，「抗體」此用語包括天然發生的抗體以及非天然發生的抗體，包括例如嵌合型(chimeric)、雙官能型(bifunctional)和擬人化(humanized)抗體，以及相關的合成異構形式(isoforms)。
如本說明書中所使用，「抗原物」此用語是指可在適當情形下被免疫系統所辨識(例如結合至抗體或被加工，以誘導細胞免疫反應)的任何物質。
「抗原」是指一種物質，包括呈現疫苗形式的組成物，其中該疫苗本身包含抗原物，且可以包含或可以不包含除了PIKA以外的佐劑，當經由適當途徑(例如胃腸道外)給予時，該抗原會引起例如形成抗體等免疫反應，包括特定地結合該抗原的抗體。抗原的兩個特性在於它們的免疫原性以及它們的抗原性，免疫原性也就是它們在活體內引起免疫反應的能力，抗原性也就是它們被抗原誘導產生的抗體所具有的選擇性辨識能力。
「細胞免疫(cell-mediated immunity)」和「細胞免疫反應(cell-mediated immune response)」等用語是指淋巴細胞所提供的免疫防禦力，例如T淋巴細胞在靠近受害細胞時所提供的防禦力。一個細胞免疫反應通常包括淋巴細胞的增殖。當測量「淋巴細胞的增殖」時，會測量淋巴細胞因應一特定抗原的增殖能力。淋巴細胞增殖是指B細胞、T-輔助細胞或細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)的細胞增殖。
「抗原物有效量」是指抗原物的用量將會致使個體產生針對該抗原物的一個特異性免疫反應，該抗原物可選擇性地和一佐劑組合。
「增加免疫反應」此表達方式或類似表達方式的意思是，相較於先前的免疫反應狀態，免疫反應被提高、改善或上升，而對宿主有利，所述先前的免疫反應狀態是例如給予本發明的免疫原組成物之前的免疫反應狀態。
「體液免疫力(humoral immunity)」和「體液免疫反應(humoralimmune response)」等用語是指因應抗原刺激而產生抗體分子的免疫形式。
「免疫反應」此用語是指一脊椎動物個體的免疫系統對於抗原物的任何反應。典型的免疫反應包括但不限於細胞和局部及系統性體液免疫反應，例如包括CD8+CTLs的抗原特異性誘導作用在內的CTL反應、包括T-細胞增殖反應和細胞因子釋出作用在內的輔助型T-細胞反應，以及包括抗體反應在內的B-細胞免疫反應。
本說明書所使用的「誘導免疫反應」此用語是一般性地包含一免疫反應的誘導及/或增效(induction and/or potentiation)。
「產生免疫反應」此用語是指刺激、起始或引起一個免疫反應。
「增強(potentiating)免疫反應」是指一個既存的免疫反應被改善、助長、補充、擴增、促進、增加或延長。
「聚I:C」或「PIC」等用語是指一個含有聚核糖肌苷和聚核糖胞苷核酸的組合物，亦分別稱作為聚肌苷酸-聚胞苷酸。
「免疫原量」此用語是指，相較於沒有聚核苷酸佐劑時所觀察到的免疫反應，抗原物加入本發明的組合物共同給予時足以刺激免疫反應抗原用量。
「免疫增效量(immunopotentiating amount)」此用語是指，相較於沒有聚核苷酸佐劑時所觀察到的抗體效價及/或細胞免疫反應，當佐劑和抗原物在本發明組合物內共同給予時，致使抗體效價及/或細胞免疫反應增加所需的佐劑量。
如本說明書中所使用，「混合」此用語包括用以組成組合物的成份的任何方法；這些方法包括但不限於摻合、分配、溶解、乳化、凝集、懸浮或將組合物的組成份合理地加以組合的其它方法。
″藥學上可接受的鹽″的化學物意指該鹽是藥用上可接受的，且擁有母化合物的所需藥理活性。這些鹽包括(1)合成鹽的酸，例如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸共同形成鹽；或是和例如乙酸、丙酸、己酸、環戊丙酸、乙二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯醯基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、葡萄糖甲酸、4，4′-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、三級丁基乳酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、麩胺酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、粘康酸等有機酸等共同形成鹽；或是(2)當母化合物中所存在的酸性質子被一如鹼金族金屬離子、鹼土族金屬離子或鋁離子等金屬離子所置換，或是配位有如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、胺基丁三醇(tromethamine)、葡甲胺(N-methylglucamine)等有機鹼時，所形成的鹽。
「治療」此用語涵蓋對於脊椎動物(特別是人類)體內的疾病的任何處理，且包括(i)預防一可能有罹病傾向但尚未診斷出罹病的個體發生疾病；(ii)遏制疾病，例如阻止該疾病的發展；或是(iii)舒緩疾病，例如致使該疾病消退。
本說明書中所使用的「單位劑型」此用語是指數個在實體上呈分離的單位，適合作為使用於人類和動物個體的單位劑量，各個單位含有一預定量的本發明組合物，該預定量經計算後呈現一個足以和藥學/藥理上可接受的稀釋劑、載劑或載體共同產生所需效應的用量。
發明總論本發明關於用在人類、動物或細胞培養物中促進免疫反應的組合物和方法，該免疫反應可為體液及/或細胞免疫反應。一般而言，該組成物包含一種含有一佐劑的免疫原組成物。該佐劑的存在會促進或改變免疫反應。因此，該體液及/或細胞免疫反應因該佐劑的存在而更加有效。此外，該佐劑可藉由影響免疫球蛋白和細胞因子的數種亞型(異構型)的產生而改變免疫反應的品質。
該佐劑的關鍵特性在於它能誘導所需的免疫反應水平和種類而不會引起相應不良副作用的能力。目前僅有少數經過批准供人類使用的佐劑具有此種特性組合。免疫原物質(特別指疫苗)的安全標準是嚴格且嚴厲執行的。因此，研發出一種成功佐劑的主要限制在於研發出一種足以誘導一適當免疫反應的有效產品，而不會引起相應不良副作用。
本發明的較佳實施例是一種聚核苷酸佐劑，其中該聚核苷酸是聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)。PIC已單獨地顯示為一種有效的佐劑，但會展現出令人無法接受的安全性特質，且在人類和靈長類動物體內不穩定。本發明提供一種由PIC和一抗生素及陽離子相組合而成的組合物，它能促進一佐劑的所需免疫原特性，並改善安全性和穩定性特質。
本發明的進一步基礎是來自於發現佐劑組合物的PIKA分子的物理和生物特性會影響免疫反應和不良副作用。本案發明人在研發期間意外地發現，以後述方式來調整該聚核苷酸佐劑的某些特性，它在就會或多或少地變得有效及/或者或多或少地變得具有毒性。因此，從物理特性的角度來界定該佐劑組合物，即有可能更正確地描述該佐劑組合物在提供較佳免疫原性反應和較佳安全性/穩定性特質上的特性。
因此，在此被簡稱為PIKA佐劑的本發明佐劑完全地被它的化學組成加上構成該佐劑的分子的基本物理特性的組合所界定。因此，展現出優越免疫原性質且同時能安全使用於動物或人類的PIKA的特定形式被最適當地由一或多個通常是呈組合的特定特質所界定，包括組成、分子量、分子大小、濃度和pH。
PIKA通常包含一聚核苷酸、一抗生素以及一陽離子，其中該聚核苷酸可為聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)，且該抗生素是胺基糖苷(例如卡那黴素、鏈黴素、泰百黴素(tobramycin)、新黴素、蒽環黴素、硫酸丁醯苷菌素、慶大黴素、潮黴素、丁胺卡那黴素、雙去氧卡那黴素、暗黴素、美它醯胺、嘌呤黴素或鏈脲黴素)，以及該離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
「胺基糖苷」抗生素是指該抗生素在結構上含有藉由糖苷鍵而接合至一個胺基環醇環(己糖核心)的胺糖。胺基糖苷抗生素是從多種鏈黴菌(Streptomyces)和小單孢菌(Micromonospora)衍生而來，或是合成生產。例如，卡那黴素是一種得自於土壤細菌SteptomycesKanamycetics的胺基糖苷抗生素，用於治療多種感染，特別是由格蘭式陰性細菌(Gram-negative bacteria)所導致的感染。
PIKA組合物是經由在一個具有pH6至pH8的pH值的氯化鈉/磷酸鹽緩衝液內，將聚肌苷酸、聚胞苷酸、一抗生素和一陽離子來源加以混合而製成。聚肌苷酸和聚胞苷酸的濃度通常為0.1至10mg/ml，較佳為0.5至5mg/ml且更佳為0.5 to 2.5 mg/ml。增色值(hyperchromicityvalue)應高於10％，較佳為高於15％且更佳為高於20％。PIC的製備以及和卡那黴素和鈣的組合最好是在符合於國際優良製程規範的品質標準下進行。
在本發明的某些實施例中，聚核苷酸佐劑組合物內的卡那黴素可和一或多種抗生素共同使用或被一或多種抗生素所取代，這些抗生素選自於包括泰百黴素、蒽環黴素、硫酸丁醯苷菌素、慶大黴素、潮黴素、丁胺卡那黴素、雙去氧卡那黴素、暗黴素、美它醯胺、新黴素、嘌呤黴素、鏈黴素和鏈脲黴素所構成的群組中。本發明聚核苷酸佐劑組合物內的抗生素(例如卡那黴素等)的濃度通常為約10至100,000單位/ml，較佳為約100至10,000單位/ml，且更佳為約500至5,000單位/ml。
在本發明的某些實施例中，該聚核苷酸佐劑組合物更包含一個陽離子(陽離子)，通常是一個二價陽離子，且通常是一個鹼金族金屬的一個陽離子。在本發明的組合物內，該陽離子一般被用作為一個陽離子的來源，例如一種鹽或複合物，例如一種有機或無機鹽或複合物，且通常是一種無機鹽或有機複合物。典型的陽離子包括但不必然限於鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅。
本發明的組合物內可配有陽離子(例如鈣)，該陽離子的濃度位在約10umol至10mmol/ml的範圍內，較佳為約50umol至5mmol/ml，且更佳為約100umol至1mmol/ml。
如前所述，陽離子可以呈任何適當的鹽或有機複合物的形式，包括但不必然限於氯化物、氟化物、氫氧化物、磷酸鹽或硫酸鹽。例如，當該陽離子是鈣時，則該離子可呈碳酸鈣、氯化鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣的形式。
當本發明佐劑組合物中的陽離子是鈣時，則它可和其它陽離子相組合或被其它陽離子所取代，這些陽離子包括鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅，其中這些離子可呈無機鹽或有機複合物的形式。
所得的組合物經由一個額外的製造過程而被進一步轉變成為PIKA，這個額外的製造過程涉及分離具有所界定的分子大小及/或重量的分子。利用過濾、層析、熱處理、離心分離、電泳以及已經成為標準過程的類似方法來分離出具有特定特性的聚核苷酸分子，是熟習於本領域技術人士所知悉的。
在本發明的某些實施例中，該聚核苷酸佐劑組合物進一步藉由分子量的物理特性來界定。在研發期間，本案發明人意外地發現聚核苷酸佐劑組合物的分子量和有效性之間存在有正相關性。一個含有該聚核苷酸佐劑組合物的免疫原組成物被觀測到的效力強度水平，包括誘導免疫球蛋白和細胞因子產生的能力，會隨著聚核苷酸佐劑組合物的分子量增加而上升。聚核苷酸佐劑的分子量可藉由實施例1所述瓊脂糖凝膠電泳來測定。
如後續實施例部分所述，本案發明人已發現，含有一個多樣化分子量的PIKA佐劑的疫苗組成物在分子量和抗原特異性保護效力強度之間會展現出直接的關聯(參見實施例2)。類似地，本案發明人已發現，當PIKA佐劑組合物和一狂犬病抗原組合給予宿主時，PIKA佐劑組合物的分子量和誘導伽瑪型幹擾素產生的能力之間存在直接的關聯(參見實施例3)。
本案發明人於1996年在中國所進行的人體試驗期間，利用一種帶有佐劑的狂犬病疫苗而該佐劑包含極高分子量規格的PICKCa，本案發明人進一步鑑定出，所得組合物意外地顯示出具有令人無法接受的不良副作用水平。在1996年臨床試驗所得到的結果在先前未被公開，現在顯示於實施例4中。對於分子量的研究則顯示於實施例5和6中。該試驗是在中國衛生部食品藥物管理部門的管轄下進行。因此，若基於當時的知識已經可以預期到這些不良副作用，則該佐劑將不會在一個受監管的臨床環境中給予人體實驗。
本案發明人已發現，在臨床前試驗中分子量達到1.0×106的本發明PIKA佐劑組合物，以及含有分子量達到5.5×105的PIKA佐劑組合物的疫苗組成物，在特定毒性試驗中顯示出寬廣的安全性範圍(參見實施例7)。具有最高分子量為1.2×106的PIKA已被成功地使用在臨床前研究中(參見實施例3)。本案發明人所進行的進一步研究顯示PIKA和一個抗原物合併成疫苗形式時的安全性(參見實施例8)。
本案發明人於2002年在中國所進行的一項後續實驗結果亦顯示，應用PIKA可提供一種安全且有效的人用佐劑。此實驗的結果先前未被公開，現在顯示在實施例9中。
因此，以前述觀察為基礎，PIKA的較佳實施例中所包含的分子在分子量及/或大小上具有物理特性，這些物理特性能夠增加效力強度和有效性的益處，同時提供一個適當的安全性範圍以不引發任何不良副作用。在Av-PICKCa內所存在的分子，位在分子量範圍的較低端，可有效地作為一種抗病毒合成物，但在一免疫原組成物內使用作為佐劑時，顯著地較PIKA的分子組成低效。此外，PIKA已顯示具有較PICKCa更佳的安全性表現。
因此，本發明的一個關鍵方面是本發明組合物PIKA的分子量。
PIKA的創作性組成一般包含一組或一群分子，其中這些分子在例如分子量及/或大小上具有物理特性，這些物理特性在誘導免疫反應上提供所需的效應，且更好地減低或避免不良副作用(例如給予PICKCa時所並發的不良副作用)。一般而言，PIKA的分子在分子量及/或大小上是異質的。
除非另外指明，否則本說明書中所通稱的本發明佐劑組合物PIKA包括PIC，該PIC可和一抗生素(例如卡那黴素)以及一陽離子(例如鈣)相複合。PIKA內的分子在分子量(例如以道爾頓來估算)或是大小(例如以沉降係數來估算)上是異質的。
當使用一個範圍來描述PIKA分子的異質特性(例如分子量或大小)時，此一範圍的描述在本說明書中是指PIKA分子在組合物內的分子量或大小的概略下及上限，而不是暗示或指出該組合物具有代表該範圍內的每一分子量或大小的PIKA分子。因此，例如分子量範圍為約66,000至1,200,000道爾頓是指約66,000道爾頓至約1,200,000道爾頓的PIKA分子被包含在組合物內，但88,000道爾頓的PIKA分子不必然存在於組合物內(雖然此分子確實可以存在)。
當以分子量範圍來界定本發明組合物內的PIKA分子的物理特性時，這些PIKA分子在分子量上是異質的，其中該分子量範圍為約300,000至660,000道爾頓，約300,000至1,200,000道爾頓，約66,000至660,000道爾頓，或是約66,000至1,200,000道爾頓。
本發明亦思及具有在分子量上呈異質的PIKA分子的組合物，其中該分子量範圍為約300,000至2,000,000道爾頓，約300,000至4,000,000道爾頓，約500,000至1,000,000道爾頓，約1,000,000至1,500,000道爾頓，約1,500,000至2,000,000道爾頓，約2,000,000至2,500,000道爾頓，約2,500,000至3,000,000道爾頓，約3,000,000至3,500,000道爾頓，約3,500,000至4,000,000道爾頓，約4,000,000至4,500,000道爾頓，或是約4,500,000至5,000,000道爾頓。位在這些範圍的上和下限處以及位在這些範圍內的PIKA分子均存在於組合物內。
當以平均分子量來界定本發明組合物內的PIKA分子的物理特性時，該PIKA分子的平均分子量可等於或高於150,000道爾頓，等於或高於250,000道爾頓，等於或高於350,000道爾頓，等於或高於500,000道爾頓，等於或高於650,000道爾頓，等於或高於750,000道爾頓，等於或高於1,000,000道爾頓，等於或高於1,200,000道爾頓，等於或高於1,500,000道爾頓，或是等於或高於2,000,000道爾頓。
當以沉降係數來界定本發明組合物內的PIKA分子的物理特性時，沉降係數是分子量和大小的一個度量，該PIKA分子的沈降係數(S)可為高於9S或高於約12S或高於約13.5S，或高於15S，或高於16S，或高於17S，或高於18S，或高於19S，或高於20S，或高於21S，或高於22S，或高於25S，或高於30S。
在一些實施例中，本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、卡那黴素和鈣，其中該組合物排除一可測得數量的分子，這些分子的分子量大約或低於30,000道爾頓，大約或低於40,000道爾頓，大約或低於50,000道爾頓，大約或低於60,000道爾頓，大約或低於70,000道爾頓，大約或低於80,000道爾頓，大約或低於90,000道爾頓，大約或低於100,000道爾頓，大約或低於150,000道爾頓，大約或低於200,000道爾頓，大約或低於250,000道爾頓，大約或低於300,000道爾頓，大約或低於350,000道爾頓，大約或低於400,000道爾頓，大約或低於450,000道爾頓，大約或低於500,000道爾頓，大約或低於600,000道爾頓，大約或低於700,000道爾頓，大約或低於800,000道爾頓，大約或低於900,000道爾頓，或大約或低於1,000,000道爾頓。在此實施例中，在這些被排除的分子不具有顯著的免疫原效應的程度上排除這些較低分子量分子是特別有利的。
本案發明人已在特定毒性測試中顯示，包含分子量達到1.0×106道爾頓的分子的PIKA對於動物是安全的(參見實施例7)。包含有最高分子量為1.2×106道爾頓的分子的PIKA已安全地使用在臨床前測驗中(參見實施例3)。當PIKA使用於一免疫原組成物時亦顯示具有安全性(參見實施例8)。PIKA的組成在有效性上提供了優點。包含有分子量低至6.6×105道爾頓的分子的PIKA在使用於人類及動物時也會誘導有效的免疫反應，且具有廣寬範圍的安全性。將所需要的最小分子的分子量提高至6.6×105道爾頓，且較佳為提升至3.0×105道爾頓，可改善佐劑的有效性，而無需在安全性標準上妥協。
本案發明人已進一步發現，聚核苷酸佐劑組合物的濃度可能會影響到該組合物內所含分子的分子量。PICKCa的分子量已顯示會隨著佐劑組合物的濃度的上升而增加(參見實施例5)。本案發明人已觀察到，聚核苷酸佐劑濃度上升會造成PICKCa分子的聚結(或稱凝集)，而使得分子具有較高的分子量。這個過程已被顯示為不可逆。因此，聚核苷酸佐劑組合物後續稀釋於一適當媒質中不會造成佐劑分子分子量的降低。如實施例6中所觀察，當聚核苷酸佐劑組合物的濃縮大分子形式和狂犬病抗原相組合時，結果得到一個保留有高分子量範圍的組合物。以這個方式所形成的一種狂犬病疫苗在人體臨床試驗中顯示出不良副作用(參見實施例4)。
本發明的PIKA組合物可被配入任何生理上可接受的緩衝液內，但以磷酸鹽緩衝液為佳。亦可使用如乙酸鹽、三羥甲基氨基甲烷(tris)、碳酸氫鹽、碳酸鹽等其它可接受的緩衝液作為磷酸鹽緩衝液的取代品。
水溶液成份的pH值在4.0和10.0之間較佳，但更佳是將該系統的pH值調整至6至8.5，這pH值不會顯著降低其它組成份的穩定性，且不至於在生理上不兼容。在某些實施例中，該免疫原組成物的水分是緩衝化的生理鹽水。欲以胃腸道外方式給予這些組成物時，較佳是將這些溶液製成張力(即滲透壓)基本上和正常生理體液相同，以避免組成物因組成物和生理體液之間的差異性離子濃度而在給予後組織膨脹或快速吸收。
緩衝化生理鹽水在這些組成物內的用量是將組成物數值達成整數所需的用量。也就是說，足夠的緩衝化生理食鹽水用量將會和其它成份相混合而達成100％，以使組成物達到所需體積。
在某些實施例中，抗原可從一天然來源被純化而得、由固相合成而得，或是由基因重組技術而獲得。抗原可包含一個蛋白質片段，該蛋白質片段含有該分子的一或多個免疫原區。抗原亦可從活的、減毒的、或截短的或被滅活的完整細胞或微生物(例如完整病毒顆粒)來提供。
在其它的實施例中，抗原包括一或多種成分，源自於感染性微生物、植物抗原、癌腫、過敏性物質以及例如會引發自體免疫疾病的其它人類抗原。在其它的實施例中，抗原包括一或多種感染性微生物，源自於病毒、細菌、分枝桿菌、真菌及寄生蟲中的任一種。
本發明的聚核苷酸佐劑組合物亦可用於促進免疫反應，該免疫反應是針對運用DNA疫苗所產生的抗原。這些疫苗中用以抗原編碼的DNA序列可以是″裸露的″，或是被容納在一個如脂質小體的載體系統內。
在某些實施例中，該聚核苷酸佐劑組合物可和疫苗組合使用。疫苗是可含有其他佐劑或不含其他佐劑。所包括的疫苗種類為抗感染疾病、抗癌、抗過敏、抗自體免疫以及免疫避孕。
本發明亦思及本發明聚核苷酸佐劑和任何適合的狂犬病抗原的組合應用。
在某些實施例中，狂犬病抗原可為如倉鼠腎細胞滅活粗製狂犬病抗原(HKC-ICRA)等滅活粗製狂犬病抗原，或是倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)等滅活純化型狂犬病抗原。
在某些實施例中，該聚核苷酸佐劑組合物可和一狂犬病疫苗共同使用。適合的狂犬病疫苗是商業上可購得的或是仍在研發中，包括滅活型、亞單位型、基因重組型和多肽型疫苗，例如人類雙倍體細胞疫苗(HDCV)，或是倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病疫苗(HKC-IPRV)，或是倉鼠腎細胞滅活粗製狂犬病疫苗(HKC-ICRV)，或是純化型Vero細胞狂犬病疫苗(PVRV)，或是純化型雞胚細胞(PCEC)，或是純化型鴨胚疫苗(PDEV)。但是，這些狂犬病疫苗並非都能夠誘導在暴露前和暴露後免疫法中具有重要性的細胞免疫反應。當聚核苷酸佐劑組合物(例如PIKA)和狂犬病疫苗共同給予時，被引起的免疫反應包括非-特異性反應(例如巨噬細胞功能上升)、體液反應(例如增進特異性抗體的產生)以及細胞免疫反應(例如產生細胞因子，包括幹擾素及白介素-2)。
在某些實施例中，本發明提供一種組合套裝(KIT)，包含該聚核苷酸佐劑以及抗原物。
一種包括有PIKA的免疫原組成物能夠以二種方式來引起特異性免疫反應i)體液免疫反應，涉及刺激B細胞產生抗體或免疫球蛋白(其它細胞亦涉及產生抗體反應過程，例如抗原-呈示細胞(APCs，包括巨噬細胞)及輔助性T細胞(Th1和Th2)，以及ii)細胞免疫反應，一般涉及T細胞、包括細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)和其它涉及CTL反應的產生例如，Th1和/或Th2細胞以及APCs。業界已熟知用以評估一個體內的體液及/或細胞免疫反應的方法(參見實施例10、11、12及13)。
此外，該聚核苷酸佐劑組合物可藉由影響所產生的免疫球蛋白亞型(異構型)(對人類IgGs而言是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；對小鼠IgGs而言是IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)以及它們的親和力，來改變免疫反應的性質。
在鼠體中，被Th1細胞所調控的反應會產生IgG1、IgG2a、IgG2b以及較少的IgG3，亦有利於針對抗原產生細胞免疫反應。若對於抗原的IgG反應是被Th2型細胞所調控，則其主要為增進IgGI and IgA的產生。
利用一種由PIKA佐劑和倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原所構成的組成物來進行的NIH效力實驗意外地顯示出，該組成物的免疫力強度需要一最少量的狂犬病抗原的存在(參見實施例14)。該組成物的效力強度相對於超過1 IU抗原量的額外狂犬病抗原的存在而迅速增加。因此，經觀察，該組成物在效力強度上的增加速率是在組成物存在有約1.5IU至2.5IU的狂犬病抗原時達到最高點。該NIH效力實驗被描述在Laboratory Techniques in Rabies，Edited by F X Meslin，M MKaplan H Koprowski，4th Edition，ISBN 92 4 1544 1。
利用一種由PIKA佐劑和倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原所構成的組成物來進行的試驗顯示，該組成物的免疫力強度隨著佐劑體積超過抗原體積量而增加。當PIKA對於倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原的比例增加時，該效力強度會增加，且較佳體積比例為高於3∶1。(參見實施例15)
本發明思及將本發明聚核苷酸佐劑和抗原共同使用的方法，以例如誘導機體內的抗原特異性體液反應及/或特異性T細胞免疫反應。所誘導的免疫反應可為在之前沒有免疫的個體中對於抗原的反應，或是可用以促進一之前已有的免疫反應(例如加強劑)。
在某些實施例中，PIKA佐劑組合物以及一種包含PIKA佐劑和抗原物的免疫原組成物可被冷涷乾燥，以呈固體形式長時穩定保存。冷涷乾燥法是熟習本領域技術人士所知悉的。將含PIKA和抗原物的免疫原組成物凍乾物加水溶解顯示其維持原有的有效性水平(參見實施例16)。
該免疫原組成物可被製備成為一種可注射型溶液、懸浮液或乳劑。所需免疫原組成物配方的製備被一般性地敘述在New Trends andDevelopments in vaccines，edited by Voller et al.，University Park Press，Baltimore，Md.，USA，1978。本發明的免疫原組成物可以用作以下劑型，例如膠囊、溶液、乳劑、懸浮液或酏劑等形式來胃腸道給予，任何無活性媒介物可供優選使用，例如生理食鹽水，或磷酸鹽緩衝化生理食鹽水，或是能適當溶解本發明方法所使用的化合物以供本發明方法應用的任何媒介物。
本發明的免疫原組成物可利用多種熟知的方法給予機體。在某些實施例中，免疫原組成物可藉由胃腸道外途徑給予，例如肌肉、腹腔、靜脈、皮下注射等注射方式，或是經呼吸道吸入。在其它實施例中，該免疫原組成物可經直腸、陰道、鼻、口、眼、透皮或皮內局部來給予。被囊封的抗原物當給予形式是注射時，會停留在注射部位長達兩周，從而提供一個在活體內產生持續式釋放或脈衝式釋放的抗原儲釋點。這個傳輸系統可針對需要多次注射才能誘導免疫反應的抗原物製成單次注射型免疫原配方。
例如，對於以水溶液進行胃腸道外給予而言，該溶液在必要時應該被適當地緩衝化，且先以足量的生理食鹽水或葡萄糖來稀釋以使其呈現等張。這些特定的水性溶液特別適用於靜脈和腹腔內給予。關於這點，熟習本領域技術人士將可參照本案揭示內容而知悉可供使用的無菌水性媒媒物。可供本發明使用的典型注射媒介物包括含有或不含有分散劑及/或防腐劑的緩衝液，以及食用油、礦物油、鱈魚肝油、角鯊烯(squalene)、一-、二-或三酸甘油酯，以及這些成份的混合物。
這些組成所需的精確用量是隨著個體不同，依據個體的物種、年齡、體重及一般狀態，被治療或預防的疾病、感染或病況的嚴重性，所使用的特定物質及它的給予形式等而有所變化。熟習於本領域技術人士得知本說明書的教示內容後，可僅僅利用例行實驗而決定適當的用量。初次給予後，個體可再接受一或多次適當間隔的追加免疫。
以上所述內容是一般性地敘述本發明。以下描述實施例將可協助了解本發明。這些實施例僅以例示說明為目的，而非意圖對於本發明的範圍加以限制。當情勢所趨或為因時制宜時，當可思及本發明在形式上的變化和等效性取代。雖然本說明書使用特定的用語，但是這些用語是意圖供說明之用，而不是以限制為目的。
實施例實施例1.測定PIKA和AV-PICKCA的分子量這個實施例說明PIKA佐劑的測定方式，並和Av-PICKCa作比較。
瓊脂糖凝膠電泳已為熟習於本領域技術人士所知悉，因此本說明書僅敘述本發明的特點。本發明所使用的瓊脂糖凝膠具有1.5％瓊脂糖的濃度。分子標記是100bp至1000bp的100bp DNA梯狀譜帶，對應於6.6×104至6.6×105道爾頓的分子量範圍。4ul加載樣品的濃度是1mg/ml。第1圖顯示參照本段落的教示內容所得到瓊脂糖凝膠樣品結果的一個代表圖。五個(5)不同批次的測驗顯示它們的分子量分布的寬廣範圍。它們的分子量上限是位在Av-PICKCa為2.3×105道爾頓至PIKA為5.28×105道爾頓的範圍內。
實施例2.PIKA和AV-PICKCA的免疫有效性的比較這個實施例顯示最高分子量為230,000道爾頓的Av-PICKCa和最高分子量為528,000道爾頓的PIKA樣品在效力強度上的差異。
將三批不同分子量的PIKA佐劑，以及一批具有對應於Av-PIKA分子量的分子量的分子，和倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)相組合。隨後，令所得組成物接受NIH效力試驗。
該NIH效力試驗是一個嚴格且大量試驗比較性研究，以比較受檢狂犬病疫苗和標準型狂犬病疫苗。以一個活狂犬病病毒品系來感染接種疫苗後的小鼠，並測量它們的存活率。將不同稀釋程度的狂犬病疫苗給予不同群組的小鼠。將被暴露於實驗性及標準型疫苗的小鼠群組之間的存活率加以比較，而測定出實驗性疫苗的效力強度(LaboratoryTechniques in Rabies，Edited by F X Meslin，M M Kaplan H Koprowski，4th Edition，ISBN 92 4 1544 1)。
將各個受檢驗的組合了PIKA佐劑的疫苗的有效性相對疫苗標準品予以規格化，其中疫苗標準品的有效性被標定為1，且將相對有效性標定成受檢組合型疫苗的有效性較非組合型標準品增加的倍數。表1概述這些結果。如表1所示，PICKCa佐劑的分子量愈高，增加狂犬病疫苗效價所得的有效性就愈高。
表1.分子量對於狂犬病疫苗效力強度的效應
實施例3.PIKA和Av-PICKCA之間的幹擾素產生比較這個實施例顯示，具有分子量上限為230,000道爾頓的Av-PICKCa樣品和具有分子量上限為1,200,000道爾頓的PIKA樣品之間在誘導幹擾素產生的能力上的差異。
將二批具有分子量上限為1.2×106道爾頓及4.6×105道爾頓的PIKA，和一批具有分子量上限為2.3×105道爾頓的Av-PICKCa作比較。
令PIKA及Av-PICKCa組合物和倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)相組合。將這些組成物經皮下注射於小鼠。兩小時後，測量每隻小鼠的幹擾素血清中含量量。測量幹擾素的一般過程是熟習於本領域技術人士所知悉。簡單來說，在一個96孔培養板中，在0.15ml/孔的量下被接種約30,000個L929細胞。三天後，當細胞生長至融合孔底的程度，將血清樣品以1∶20至1∶640的比例來稀釋，以血清0.1ml/孔加入孔內。各稀釋樣品均以三個復孔試驗。將這些培養板在37℃下培育至隔日。將血清樣品洗去。使用皰疹性口炎病毒VSV顆粒來檢測幹擾素的產生效價。表2顯示被這些混合物所誘導產生的幹擾素效價。如表2所示，PIKA樣品的分子量愈高，被誘導產生的幹擾素就愈多。
表2.分子量和幹擾素產生之間的關係
實施例4.1996年人用疫苗臨床試驗(具有毒性副作用)這個實施例顯示PICKCa佐劑和一疫苗相組合會在給予人體免疫後產生一個令人無法接受的不良副作用水平。
這個研究的目的在於評估一種狂犬病疫苗的安全性及免疫反應，該狂犬病疫苗包含濃度為11.95mg/ml及分子質量為69,700(請注意分子質量在此例中不等於道爾頓，參見實施例5)的PICKCa佐劑，以及倉鼠腎細胞滅活粗製狂犬病抗原(HKC-ICRA)。上述臨床試驗的結果和結論從未公開。
40位參與臨床試驗的病人被分成二個20人的群組。各群組在第1天、第3天、第7天、第14天及第30天經肌肉接受五次2ml的劑量注射。一組接受具有PICKCa佐劑的狂犬病抗原，且另一組接受具有鋁佐劑的狂犬病抗原。
從安全性的觀點，在各次注射後24小時、48小時及72小時就體溫、局部和全身性症狀進行觀察。下列觀察是表3.注射具有鋁佐劑或PICKCa的HKC-ICRA之後的不良副作用
全身性不良副作用包括發熱(1例)、起疹(2例)、關節痛(2例)、淋巴節重大(1例)、喉部腫脹(1例)。局部性不良反應包括注射部位皮膚變紅(6例)。
本案發明人的後續研究將所觀察到的副作用歸因於佐劑內分子的分子量和大小(參見實施例5及6)。
實施例5.PICKCA濃度及它的分子量之間的關係這個實施例顯示增加PICKCa佐劑的濃度造成組成物的分子量增加。
可將PICKCa製成具有不同的濃度。假設PICKCa被製成不同濃度時是一種可以不同形式存在的聚合複合物。實驗目的可使用雷射散射技術來達成。雷射散射技術已廣泛地用以測定重量平均分子質量(Mw)以及迴轉半徑(Rg)。儀器為商業上可購得且測量過程是熟習於本領域技術人士所知悉的。表4顯示出，由雷射散射技術所觀察到的PICKCa分子量和它的濃度相關。
表4.由雷射散射技術所觀察到的分子量
實施例6.PICKCA的前濃度和疫苗分子量之間的關係這個實施例顯示PICKCa佐劑分子量的增加和所得組成物的分子量之間的關係，該所得組成物含有PICKCa佐劑以及倉鼠腎細胞滅活粗製狂犬病疫苗。
PICKCa樣品的組合前濃度亦被懷疑會影響疫苗內的抗原。將數個PICKCa樣品和一種倉鼠腎細胞滅活粗製狂犬病疫苗相組合。實驗目的可使用雷射散射技術來達成。雷射散射技術已廣泛地用以測定重量平均分子質量(Mw)以及迴轉半徑(Rg)。儀器為商業上可購得且測量過程是熟習於本領域技術人士所知悉的。表5顯示PICKCa的組合前濃度增加致使狂犬病疫苗的Mw增加。
表5.PICKCa的組合前濃度和狂犬病疫苗的Mw之間的關係
實施例7.PIKA毒性測驗這個實驗顯示PIKA佐劑在限制最高分子量時的安全性特質。
依據中國國家藥品標準的規定(WS1-XG-050-2000)進行一個毒性測驗。簡單來說，以0.5毫升/小鼠的量，將含0.3毫克具有分子量上限為約525,000至約1,000,000道爾頓的PIKA佐劑的氯化鈉溶液靜脈注射至五隻(5)體重約18-22克的小鼠。觀察經注射的小鼠7天，並在觀察結束後稱重。表6概述其結果，顯示PIKA佐劑的分子量可高達1.0×106道爾頓，而不具有明顯的毒性。
表6.PIKA佐劑毒性測驗
實施例8疫苗組成物內的PIKA的毒性研究這個實驗的目的在於確認PIKA佐劑的安全性。
將PIKA佐劑(分子量66,000道爾頓至660,000道爾頓)和倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)以PIKAHKC-IPRA為4∶1的比例相組合。
將由PIKA和HKC-IPRA所構成的疫苗組成物和一種商業上可購得的滅活純化型狂犬病疫苗(IPRV)作比較，該滅活純化型狂犬病疫苗(IPRV)含有一個鋁佐劑。
將五劑(5)疫苗組成物在第0天、第3天、第7天、第14天及第28天時給予小鼠。給予的劑量相當於進行正常人類狂犬病免疫法的成人劑量的約300倍。
毒性觀察的結果顯示在下表7表7給予狂犬病疫苗後的安全性觀察
釋義(觀察到的發生次數)/(總數)
得到結論是該PIKA/HKC-IPRA組合較商業上可購得的IPRV更安全。
實施例9PIKA佐劑在人體的安全使用在2002年，利用一個由PIKA組成物(分子量66,000至660,000道爾頓)和倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)所構成的組成物來免疫五位(5)志願者。將該疫苗組成物在第0天、第3天、第7天、第14天及第30天時給予志願者。
任何一位病人在各次接種疫苗後，都沒有被觀察到局部或系統性副作用。
利用標準NIH效力試驗來測量疫苗的效力強度，結果顯示在下表8表8狂犬病疫苗的效力強度觀察
上述結果指出由PIKA和HKC-IPRA所構成的疫苗組成物誘導特異性免疫反應並誘導了保護性中和抗體的產生。
實施例10.暴露後試驗(細胞免疫反應)暴露後試驗是疫苗能夠從受感染後的宿主身體根除病原的最明確證明。因此，它是疫苗誘導細胞免疫反應的一個指標。
在暴露後檢驗中，以狂犬病病毒的一個野生型品系來感染小鼠，隨後接種以組合有PIKA佐劑(分子量範圍從1.65×105至1.2×106道爾頓)的倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)，或是組合有氫氧化鋁佐劑(鋁佐劑)的HKC-IPRA，一商業上可購得的狂犬病疫苗(PVRV)，或是磷酸鹽緩衝溶液(PBS)。結果顯示出PIKA佐劑增進了存活率，參見表9。
表9.暴露後攻毒測驗9.1治療後的死亡率
9.2疫苗治療後的存活率
被皮下注射活狂犬病病毒所感染的小鼠在注射後第6小時、第1天、第2天及第3天以疫苗治療。
實施例11.抗原特異性細胞免疫反應伽瑪型幹擾素的產生伽瑪型幹擾素的產生是細胞免疫活性的一個指標。
在這個實驗中，從二位試驗組病人及二位對照組個體中採得血液樣品。這些志願病人已被接種以PIKA狂犬病疫苗，該PIKA狂犬病疫苗含有PIKA(分子量範圍位在66,000至660,000道爾頓)以及倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)。在收集血液樣品之前2.5年接種疫苗。
第2圖中的結果顯示出，相較於對照組個體，二位試驗組病人所產生的伽瑪型幹擾素有顯著的差異。
將從血液樣品中分離出來的PBMCs和原來免疫中所使用相同的HKC-IPRA共同培育。1天後，以ELISPOT方法，檢測特異性產生伽瑪型幹擾素的細胞數量。觀察到一個劑量相依性效應。
上述觀察所得到的結論是含有本發明PIKA佐劑的狂犬病疫苗具有特異性引起伽瑪型幹擾素產生的能力，且意味著可以誘導特異性細胞免疫反應。(也就是說，該反應是針對狂犬病抗原)，而不同於非特異性反應。
實施例12PIKA的有效性試驗這個實驗的目的在於顯示PIKA在誘導伽瑪型幹擾素及白介素12(IL-12)的產生上的能力。
在乾淨的環境中，將取自正常健康小鼠分離的脾細胞樣品在不同濃度PIKA(分子量範圍位在66,000至660,000)的存在下培育。培育三天後，利用IL-12(p40)和伽瑪型幹擾素特異性抗體，以ELISA試驗來分析上清液內的細胞因子水平。實驗結果顯示在下表10表10細胞因子產生的活體外試驗
上述實驗所得到結論是，PIKA誘導淋巴細胞劑量相依性產生伽瑪型幹擾素及IL-12細胞因子。。
在進一步的實驗中，四隻(4)小鼠經由腹腔注射被給予500ug/小鼠的PIKA(分子量範圍位在66,000至660,000)。使用磷酸鹽緩衝液作為負對照組試驗。注射後5小時，取出血液樣品並製備血清。利用IL-12(p40)和伽瑪型幹擾素特異性抗體，以ELISA試驗來檢測血清裡的細胞因子水平。實驗結果顯示在下表11
表11細胞因子產生的活體內試驗
上述實驗所得到結論是PIKA提示促進抗原提呈細胞功能，誘導細胞免疫功能。
實施例13PIKA和滅活純化型Vero細胞狂犬病抗原的共同使用這個實驗的目的在於評估組合有滅活純化型Vero細胞狂犬病疫苗(PVRV)的PIKA的有效性。
將具有66,000至660,000道爾頓的分子量範圍的PIKA和PVRV相組合，以形成一種狂犬病疫苗。使用NIH效力試驗來評估所得疫苗組成物的效力強度。結果顯示在下表12表12對於PIKA及滅活純化型Vero細胞狂犬病疫苗的NIH試驗結果
得到的結論是PIKA會促進滅活純化型Vero細胞狂犬病疫苗的效力強度。
實施例14.抗原劑量這個實驗顯示需要具有最低量的倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)和PIKA佐劑(分子量範圍從66,000至660,000道爾頓)共同存在於組成物中，以引起具有實質增進水平的特異性免疫反應。
將遞增量的狂犬病抗原加入定量0.1mg的PIKA佐劑。用NIH標準狂犬病疫苗效力試驗來檢測其效力強度。在可預測到的原始效力強度增加之後，以及在如預期般達到效力強度穩定之前，隨著抗原量的增加觀察到一個明顯且戲劇性的效力強度增加(參見表13)。
表13增量的倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原的疫苗效力強度
在HKC-IPRA抗原達到一IU後，觀察到增加少量的HKC-IPRA，PIKA誘導疫苗效力強度明顯增加。
得到的結論是在顯著免疫反應被誘導之前必須存在最低的抗原量。過度的抗原量到某一點後，抗原量增加僅會回饋以些微增加的效力強度。
實施例15.抗原佐劑的比例這個實驗顯示出倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)和PIKA佐劑(分子量範圍位在66,000至660,000)的最佳混合量。
利用不同劑量抗原和不同劑量佐劑相混合，加入PBS以確保總體積的恆定。利用NIH效力試驗來測定所得疫苗的效力強度。結果顯示在表14。
試驗結果的綜合考量指出，最佳的疫苗組合是PIKA對於抗原的比例落在至少3比1的範圍內。
表14各種抗原和佐劑比例下的狂犬病疫苗效力強度
實施例16.PIKA以及組合有狂犬病疫苗的PIKA的冷凍乾燥保存這個實驗顯示PIKA在冷凍乾燥形式下是穩定的。
冷凍乾燥技術已被使用在長期保存狂犬病疫苗，可達三年以上。本案發明人想要試驗PIKA(分子量範圍從66,000至660,000)以及含有PIKA的狂犬病疫苗在冷凍乾燥保存是否有利。下列組成物被使用在冷凍乾燥保存試驗中i)未被冷凍的PIKA，加入經復原的冷凍乾燥型倉鼠腎細胞滅活純化型狂犬病抗原(HKC-IPRA)中，ii)經復原PIKA加HKC-IPRA的冷凍型乾燥組成物，iii)經復原的冷凍乾燥型市售狂犬病疫苗(未加入PIKA)，以及iv)未被冷凍的狂犬病疫苗標準品。表15顯示出，經冷凍乾燥的PIKA以及含有PIKA的狂犬病疫苗對於長期保存狂犬病疫苗是理想的。
表15.冷凍乾燥保存對於狂犬病疫苗效力強度的影響
雖然本發明是參照特定實施例而被描述，但應明了這些實施例是作例示性說明用，本發明的範圍不僅限於此。對於本發明所屬技術領域：
中具有一般知識的人士來說，本發明的選擇的具體示例是很明顯的。這些選擇的實施例落在本發明的精神和範圍內。因此，本發明的權利範圍是由所附申請專利範圍來載述，且能為前述揭示內容所支持。
權利要求
1.一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及陽離子，其中該組合物含有在分子量或大小中呈異質的聚核苷酸佐劑組合物分子，其中該分子量介於約66,000至1,200,000道爾頓的分子量範圍內，且該大小介於約6.4S至24.0S的分子大小範圍內。
2.如權利要求
1所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的分子量範圍是從約300,000至1,200,000道爾頓，或該分子大小範圍是從約12.8S至24.0S。
3.如權利要求
1所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的分子量範圍是從約66,000至660,000道爾頓，或該分子大小範圍是從約6.4S至18.3S。
4.如權利要求
1所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的分子量範圍是從約300,000至660,000道爾頓，或該分子大小範圍是從約12.8S至18.3S。
5.一種聚核苷酸佐劑組合物，包含聚核糖肌苷-聚核糖胞苷酸(PIC)、抗生素以及陽離子，其中該聚核苷酸佐劑組合物具有等於或高於150,000道爾頓的平均分子量，或是具有等於或高於9.3S的平均分子大小。
6.如權利要求
5所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的平均分子量等於或高於250,000道爾頓，或是該平均分子大小等於或高於11.8S。
7.如權利要求
5所述的佐劑組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物的平均分子量等於或高於350,000道爾頓，或是該平均分子大小等於或高於15.3S。
8.如權利要求
1至7項中任一項所述的佐劑組合物，其中該抗生素是卡那黴素、新黴素、蒽環黴素、硫酸丁醯苷菌素、慶大黴素、潮黴素、丁胺卡那黴素、雙去氧卡那黴素、暗黴素、美它醯胺(metrzamide)、嘌呤黴素、鏈黴素或鏈脲黴素。
9.如權利要求
1至8項中任一項所述的佐劑組合物，其中該陽離子是鈣、鎘、鋰、鎂、鈰、銫、鉻、鈷、氘、鎵、碘、鐵或鋅；且其中該陽離子呈無機鹽或有機複合物的形式。
10.如權利要求
1至9項中任一項所述的佐劑組合物，其中該陽離子來源是氯化鈣、碳酸鈣、氟化鈣、氫氧化鈣、磷酸鈣或硫酸鈣。
11.如權利要求
1至7項中任一項所述的佐劑組合物，其中該抗生素是卡那黴素硫酸鹽，且該陽離子是由氯化鈣所提供。
12.一種組合套裝中，包含如權利要求
1至11項中任一項所述的佐劑組合物以及抗原物。
13.一種免疫原組合物，包含如權利要求
1至12項中任一項所述的聚核苷酸佐劑組合物以及抗原。
14.如權利要求
13所述的免疫原組合物，其中該抗原是人類抗原、非人類動物抗原、植物抗原、細菌抗原、真菌抗原、病毒抗原、寄生蟲抗原或是癌腫抗原。
15.如權利要求
14所述的免疫原組合物，其中該抗原是狂犬病抗原。
16.如權利要求
15所述的免疫原組合物，其中該抗原是滅活純化型狂犬病抗原。
17.如權利要求
16所述的免疫原組合物，其中存在的該倉鼠腎細胞的滅活純化型狂犬病抗原大於1個國際單位。
18.如權利要求
16任一項所述的免疫原組合物，其中該聚核苷酸佐劑組合物與倉鼠腎細胞的滅活純化型狂犬病抗原的比例大於3比1。
19.如權利要求
1至18任一項所述的免疫原組合物，其中該免疫原組合物包括能夠同時引發增強的特異體液和/或細胞介導的免疫應答的佐劑。
20.如權利要求
1至19任一項所述的佐劑組合物或免疫原組合物，其中該免疫原組合物或該免疫原組合物中包含的該佐劑組合物是呈固體形式或液體形式或存在於溶液或懸浮液中。
21.如權利要求
1至20任一項所述的佐劑組合物或免疫原組合物，其中該佐劑組合物和/或該免疫原組合物被冷凍乾燥。
22.一種用以增強對抗原物的免疫響應的的方法，該方法包含將如權利要求
1至21項中任一項所述的組合物給藥於宿主。
23.如權利要求
22所述的方法，其中該免疫原組合物可以通過選自包括下列途徑的群組中的一個途徑給藥，該途徑包括胃腸道外注射給藥、肌肉注射、腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、經呼吸道吸入、直腸給藥、陰道給藥、經鼻給藥、經口給藥、經眼給藥、局部給藥、透皮或皮內給藥。
24.如權利要求
1至23任一項所述的聚核苷酸佐劑組合物在製備用於增強宿主的免疫響應的藥物中的用途。
25.如權利要求
1至24任一項所述的方法，其中該宿主是人類。
26.如權利要求
1至25任一項所述的方法，其中該宿主是動物。
專利摘要
本發明提供一種聚核苷酸佐劑組合物以及引發免疫反應的使用方法。本發明亦提供一種免疫原組成物，包含該聚核苷酸佐劑組合物和抗原(例如此二種成份位於一疫苗內)。本發明的佐劑組合物具有特定的物理性質(例如分子量、濃度和pH)，這些性質能符合所需的一種誘導增強免疫反應和改變免疫反應類型的有效且安全的佐劑。本發明更思及這些佐劑組合物的使用方法，特別是誘導對於抗原複合物的免疫反應。
文檔編號A61K39/39GK1997391SQ20058001509
公開日2007年7月11日 申請日期2005年6月8日
發明者林海祥 申請人:申益皮卡生物技術有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan