一種水稻冷害基因及應用的製作方法

2024-03-01 21:54:15

專利名稱：：一種水稻冷害基因及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及植物生物
技術領域：
。本發明利用T-DNA標籤(T-DNAtagging)技術從水稻低溫感突變體中鑑定並克隆了一種新的水稻冷害相關基因OsGPAT1，該基因失活可以導致水稻耐低溫能力降低，同時該基因還影響水稻的正常生長發育，該突變體表現為稍矮，分櫱減少，育性下降。對該基因編碼的胺基酸序列分析證明該基因所編碼的蛋白是一個甘油-3-磷酸轉醯酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase，GPAT)，該酶在植物抵抗低溫脅迫的反應中起重要的作用。本發明提供了這個基因的核酸序列，以及其蛋白序列，同時還涉及該基因在水稻耐寒育種中的用途。低溫脅迫實驗表明，OsGPAT1基因在水稻的抗凍反應中起很重要的作用。OsGPAT1基因可以應用於水稻的抗凍育種，提高水稻優良品種的適應性，擴大其種植範圍，促進其穩產、高產。
背景技術：
：植物在生長過程中會受到諸多環境因素的影響。溫度是限制植物分布和作物產量的重要環境因素，低溫會導致農作物的大規模減產。按照低溫程度和受害情況，可分為冷害(chillinginjury，零上低溫對植物的傷害)和凍害(freezinginjury，零下低溫對植物的傷害)兩大類，這兩種情況都會對農作物的生產產生重大的影響。因此培育耐低溫的農作物品種一直是農業科學技術研究的主要目標之一。近年來對植物耐冷性分子機理進行了很多的研究，隨著研究的不斷深入，主要在以下4個方面取得了比較清楚的認識1)植物的冷敏感性可以通過調節膜脂的不飽和脂肪酸水平得到調控，調節的途徑是通過醯脂去飽和酶和甘油-3-磷酸醯基轉移酶的作用；2)利用轉基因技術在植物中超量表達抗氧化酶的基因，如編碼超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbateperoxidase，APX)、穀胱甘肽還原酶(glutathionereductase，GR)等基因，可望提高耐冷性；3)植物低溫逆境信號轉導的研究表明，ABA不僅是重要的低溫逆境信號，而且可調節冷害下基因的表達，Ca2+是一個主要的第二信使，蛋白激酶途徑也參與了植物冷害的信號轉導；4)低溫誘導的蛋白或酶類主要有脫水蛋白和熱穩定蛋白。植物對溫度逆境的適應之一主要在於生物膜特別是質膜和類囊體膜的特性。植物的冷敏感性可以通過調節膜脂的不飽和脂肪酸水平得到調控，調節的途徑是通過醯脂去飽和酶(acyl-lipiddesaturases)和甘油-3-磷酸醯基轉移酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase，GPAT)的作用。例如編碼氨基磷脂移位酶的ALA1基因的表達導致重組酵母膜泡中氨基磷脂的轉移增加，產生膜脂的非對稱，使酵母突變體drs2的冷敏感性降低，同時擬南芥中表達反義ALA1則會使其冷敏感性增加。(王國莉等，植物耐冷性分子機理的研究進展，植物學通報，2003，20(6)671～679)。大量的研究表明植物生物膜中磷酯醯甘油(phosphateacyltransferase，PG)分子的飽和程度與植物耐低溫能力密切相關，通過對甘油-3-磷酸轉醯酶(glycerol-3-phosphateacyltransferase，GPAT)的研究已經弄清了GPAT酶是磷酯醯甘油(PG)生物合成過程中的第一個醯基酯化酶，通過催化甘油-3-磷酸的Sn-1位的醯基化來起動甘油酯的合成，其對底物的選擇性對決定PG分子中的不飽和程度起著關鍵性作用(Murata等，Compositionandpositionaldistributionoffattyacidsinphospholipidsfromleavesofchillingsensitiveandchillingresistantplants.PlantCellPhysiol.1982，231071-1079；Frentzen等，Specificitiesandselectivitiesofglycerol-3-phosphateacyltransferaseandmonoacylglycerol-3-phosphateacyltransferasefrompeaandspinachchloroplasts.EurJBiochem.1983Jan1；129(3)629-36.)。不同耐低溫植物中的GPAT酶對底物醯基具有不同的選擇性，即耐低溫強的植物其GPAT酶優先選擇油酸，而對低溫敏感的植物中的GPAT酶對棕櫚酸和油酸具有相同的選擇性。GPAT酶對底物的這種選擇性差異，影響著植物生物膜中PG分子的飽和程度，從而決定了植物的耐低溫性。把耐低溫植物擬南芥中的GPAT基因轉到對低溫敏感的菸草中，得到了耐低溫的菸草植株(Wolter等，ChillingsensitivityofArabidopsisthaliahawithgeneticallyengineeredmembranelipids.EMBOJ，1992.114685～4692)。將擬南芥的甘油-3-磷酸轉醯酶cDNA轉化水稻，轉基因水稻提高了磷酸甘油非飽和脂肪酸的含量，也提高了低溫下的光合速率和生長速率(Yokoi等，MolecularmarkersforresistancetoHeteroderaglycinesinadvancedsoybeangermplasm.MolBree，1998，4(3)269～275；Ariizumi等，AnIncreaseinUnsaturationofFattyAcidsinPhosphatidylglycerolfromLeavesImprovestheRatesofPhotosynthesisandGrowthatLowTemperaturesinTransgenicRiceSeedlings.PlantCellPhysiol，2002，43(7)751～758)。因此對GPAT基因進行遺傳操作，對提高植物的耐寒性具有很重要的作用。水稻(Oryzasativa)是最重要的糧食作物之一，是全球近一半人口賴以生存的基本食糧，在我國有很大的種植面積，培育耐低溫水稻品種對提高種植的適應性、擴大栽種面積、增加產量具有重要意義。
發明內容本發明的目的是在於提供一種水稻冷害基因OsGPAT1，該基因失活可以導致水稻耐低溫能力降低，同時該基因還影響水稻的正常生長發育，該基因的突變體表現為稍矮，分櫱減少，育性下降。該基因可以應用於水稻抗凍育種，可以有效的提高水稻品種的抗凍性。本發明提供了這個基因的核苷酸序列和胺基酸序列，如SEQIDNO1所示的DNA序列，也包括與SEQIDNO1所示的DNA序列至少有50％同源性的基因序列；也包括在添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產生的突變體等位基因或衍生物，還含具有相同功能並能達到本發明目的的基因序列。本發明中的SEQIDNO2所示的蛋白質屬於甘油-3-磷酸轉醯酶，其中進行一個或幾個胺基酸的替換、插入或缺失胺基酸可以獲得功能類似物。因此，本發明也包括與SEQIDNO2所示的胺基酸序列至少60％同源性的序列。本發明的另一個目的在於提供一種水稻冷害基因在水稻耐寒育種中的應用。通過提高植物體內的OsGPAT1基因表達量來進行植物耐低溫育種，以此來使植物的適宜種植範圍擴大。通過調節本發明所描述的基因OsGPAT1的表達，可以改變植物對冷的敏感性，這種方法切實可行。具體應用可以使用T-DNA插入的方法，或者使用其他使基因失活的方法來降低OsGPAT1的表達，以此來提高植物的對低溫敏感性。通過超表達OsGPAT1也可以提高OsGPAT1的表達，以此來提高植物的耐低溫的能力。為了實現上述目的，本發明採用了以下技術措施。一、水稻冷敏突變體Osgpat1的獲得和鑑定。本發明是使用T-DNA標籤的技術進行基因的分離和克隆。使用農桿菌介導的遺傳轉化(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，1994，PlantJournal6271-282)得到了大量的有T-DNA插入標籤的水稻品種中花11號株系，轉化使用的載體是pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35(3)418-27.)，然後通過田間種植篩選得到了水稻突變體Osgpat1。該株系的T0代種子經過浸種、催芽後栽種到大田，得到T1代植株，T1植株按5寸×8寸的間距種植，按常規的水稻種植方法(王維金等，作物栽培學.1998，76-127.)進行田間管理。該突變體在田間正常條件下種植時表現為植株半矮、分櫱較少的性狀，如圖1所示。遺傳學實驗表明Osgpat1是一個符合單基因控制遺傳規律的隱性突變體。使用TAIL-PCR(Liu等，ThermalasymmetricinterlacedPCRAutomatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromP1andYACclonesforchromosomewalking.Genomics1995，25，674-681.)的方法分離得到了這個株系T-DNA側翼基因組序列，採用BLAST分析方法(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)進行序列分析表明這個株系的T-DNA插入在水稻第1染色體，插入位點所在片斷在公共核苷酸資料庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中的登陸號為AP003442.2，日本晴BAC克隆OSJNBa0022K06含有AP003442.2的部分核苷酸片斷，通過序列分析發現，該株系中T-DNA的插入造成了一個甘油-3-磷酸醯基轉移酶(GPAT)基因的失活。此基因的核苷酸即為SEQIDNo1所示的核苷酸，其蛋白質序列即為SEQIDNo2所示的蛋白質序列。根據分離得到的側翼序列在基因組中設計引物，所設計的引物位於插入位點兩側，通過PCR(polymerasechainreaction)檢測驗證了這個T-DNA插入位點序列和突變表型是共分離的，從而確定了就是這個基因的失活造成了這種突變表型的出現。二、OsGPAT1基因的功能鑑定。取插入位點附近3kb的基因組序列進行BLAST(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)分析，發現OsGPAT1基因編碼的蛋白質與甘油-3-磷酸醯基轉移酶(GPAT)基因有較高的同源性。將這個基因的序列在日本全長cDNA文庫(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中進行搜索，找到了這個基因的全長cDNA，克隆編號是AK070880，這個全長cDNA有3618bp，功能預測是一個甘油-3-磷酸醯基轉移酶(GPAT)基因。由於GPAT基因在植物對低溫反應中起很重要的作用，因此對OsGPAT1基因的突變體進行了冷脅迫處理，此突變體相對於對照對冷害表現出了很高的冷敏感性。由此證明了此突變體正是由於OsGPAT1基因的突變造成的。為了更進一步的對OsGPAT1基因的功能進行分析，將OsGPAT1基因在水稻中進行了超量表達，發現OsGPAT1基因超量表達的植株耐寒性得到了很好的增強，冷脅迫實驗表明，與對照相比，超表達的植株在冷處理後存活率提高了59.2％。OsGPAT1基因可以應用於水稻育種，通過使用組成型啟動子在水稻品種中超量表達OsGPAT1基因，可以得到抗寒性提高的水稻新品種，擴大水稻優良品種的種植面積和種植時間，為水稻的穩產、高產打下良好的基礎。本發明的優點有OsGPAT1基因在植物對冷凍反應中起很重要的作用，該基因的克隆對研究植物對冷害反應的機理有很重要的作用。同時通過應用基因工程技術調控此基因的表達可以調控植物對溫度的適應性、培育耐低溫的農作物品種。可以將本發明應用於水稻育種方面，例如通過超表達等方法提高OsGPAT1基因在植物體內的表達量，可以得到耐低溫的水稻新品種。圖1.水稻突變體Osgpat1的表型圖。左邊是野生型，右邊是突變體。圖2.OsGPAT1基因的結構和T-DNA插入位點示意圖。起始密碼(ATG)和終止密碼(TGA)已經標出，黑色方框表示osGPAT1基因的編碼區，白色方框表示了5』非翻譯區和3』非翻譯區。方框之間的線條表示內含子，T-DNA插入在第5個內含子內。a，b，c分別表示用來驗證共分離的引物。圖3.檢測基因型的結構示意圖。a表示在T-DNA插入位點下遊設計的引物，b表示在插入位點T-DNA上遊設計的引物，c表示根據T-DNA末端序列設計的引物。在T1代植株中，若為T-DNA插入位點純合單株，由於T-DNA片段為10Kb以上，因此a與b配對的PCR擴增為陰性，但b和c配對可以擴增得到一個0.8Kb的產物。若擴增位點為沒有T-DNA的插入的野生型單株，由於沒有c引物結合的位點，則只有a和b配對是可以得到一個1.0kb的產物。而對於T-DNA插入位點雜合單株，則在b和c配對以及a和b配對時都可以擴增得到產物。圖4.20株T1代植株的檢測結果圖。泳道1、2、17是T-DNA插入位點純合突變體，而泳道3、4、6、7、8、9、10、12、13、15、16、18、19、20為T-DNA插入位點雜合體。植株5、11、14為野生型。圖5.低溫脅迫試驗圖。將Osgpat1突變體和野生型種子浸種、催芽後在水稻土中種植約20天，待水稻秧苗長到3葉期，將其放到12℃處理3個小時，左邊4株是野生型，右邊4株是突變體。圖6.超表達實驗所用pU1301載體圖。具體實施例方式實施例11、水稻材料水稻(Oryzasativa)突變體osgpat1，原始野生型材料為「中花11號」粳稻品種。此突變體的獲得是使用農桿菌介導的遺傳轉化得到了大量的有T-DNA插入標籤的中花11號株系，轉化使用的載體是pFX-E24.2-R15(Wu等，Developmentofenhancertraplinesforfunctionalanalysisofthericegenome.PlantJ.2003，35(3)418-27.)，轉化子通過篩選得到。轉化植株當代為T0代，T0代種子經過浸種、催芽後種植得到T1代植株，將此植株按5寸×8寸的間距種植於水稻田，按常規的水稻種植方法進行田間管理。通過篩選得到了表型穩定的水稻突變體Osgpat1，該突變體表現為略矮，分櫱少，同時對低溫非常敏感。2、T-DNA插入側翼序列的分離。使用TAIL-PCR的方法分離得到了這個突變體的T-DNA側翼序列。具體操作步驟如下使用CTAB法抽提osgpat1突變體的總DNA，然後進行PCR反應。根據轉化載體pFX-E24.2-R15的T-DNA左側末端設計的嵌套式特異引物序列和引物在載體上對應的位置如下(後面的數字表示在載體上的位置)LSP25』-GAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC-3』6701-6677；LBT25』-ATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCAT-3』6550-6524；LBT35』-CCAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGAAT-3』6447-6420。用於分離側翼序列的簡併引物及其序列為AD2a5』-(AGCT)GTCGA(GC)(AT)GA(AGCT)A(AT)GAA-3』。反應體系為第一輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP2.0μl；25mMMgCl22.0μl；10μMLSP20.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaqTakara公司)1U；加ddH2O至20μl。第二輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP2.0μl；25mMMgCl22.0μl；50％甘油2.0μl；10μMLBT20.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaqTakara公司)1U；加ddH2O至20μl。第三輪DNA模板1.0μl；10×PCRbuffer2.0μl；2mMdNTP1.5μl；25mMMgCl21.2μl；50％甘油2.0μl；10μMLBT30.2μl；100μMAD2a0.2μl；Taq酶(rTaqTakara公司)1U；加ddH2O至20μl。反應程序按照Liu的方法進行。反應完成後，取第三輪反應產物5μl在0.8％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測。挑出有有效擴增的剩餘產物5μl用去磷酸化酶(SAP，Takara公司)和核酸外切酶(ExoI，NEB公司)消化，消化產物取2μl使用美國PerkinElmer公司的測序試劑盒(BigDyeKit)進行測序反應，反應產物使用DNA自動測序儀進行序列測定(ABI377Sequencher)，測序引物序列和在載體上的位置為NTLB55』-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3』6437-6418，具體操作按操作手冊進行(PE公司)。得到序列後，採用BLAST分析方法(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)將這條側翼序列與公共核苷酸資料庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色體位置的水稻基因組序列進行比較分析，定位結果發現這條側翼序列定位於水稻1號染色體，所在片斷在GenBank中的登陸號為AP003442.2，插入位點在這一段核酸序列中是150976，日本晴BAC克隆OSJNBa0022P13含有此部分核甘酸片斷，取插入位點附近的10kb核甘酸採用BLAST分析，發現這個T-DNA的插入造成了一個甘油-3-磷酸醯基轉移酶(GPAT)基因的失活。這個基因的核苷酸即為SEQIDNo1所示的核苷酸，其蛋白質序列即為SEQIDNo2所示的蛋白質序列。所得到的側翼序列tggccgttattagtacattaaaaacgtccgcaatgtgttattaagttgtctaagcgtcaatttatttacacggcatctctgcattaccgcatggaggaaaggaagaaagaaagggaaagcaagggccaccgtgggtctggcaggcacagacagcaccagctctgacgttttacgcgccagacgggcgatctccttcaatgcggccgggacaaggcttgaattctcaccaaacaaccgtaaataatggagccagccagccggccggacggactgactcgaccgtggcatactggcatgagtgaatccacgcattcaatccggcgggccacgggcgagtaaaaaccatcggcttccttccatgctctggctctgcccgcctccagattccttttcttatctttcgaccgagctttgcagttgttaagcttcaggtgaggatctagtatgtgcgacgtagacgttttgtgagttctgataatgaccttgatccttattattagtttactgattaaggatgttggtggaacagagcgacccggtcagtgcaggaagcttaaactgggtttcgcataatgggctgagcacatctacagatcagtgtcataaatggcctgacatgactatacacccatgctgatcgcgtgctcgaccactgtgcatactctactctgatctgaatcactctactctgatctgaaactctgcatgatcgtcagatgcagattatagtagcggtgtcattgcgtcgaact3、T-DNA插入側翼序列與突變表型的共分離檢測。為了研究T-DNA的遺傳分離，將T-DNA標記的水稻T1代植株進行田間種植，並且進行了基因型的檢測。從總共20株T1代的幼嫩葉中提取的基因組DNA(CTAB法)用作基因型分析，以確定它們的純合或雜合性。PCR反應條件先94℃3分鐘變性，然後94℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃1.5分鐘，總共進行35個循環，最後72℃7分鐘延伸。下述引物a、b和c用於PCR反應。引物a(OsGPAT1基因特異性反向引物)5』-CCCATTATGCGAAACCCAGT-3』引物b(OsGPAT1基因特異性正向引物)5』-CGCCATGTACGCCAAACCTA-3』引物c(T-DNA邊緣特異性反向引物)5』-AATCCAGATCCCCCGAATTA-3』如圖2的示意圖所示，引物b是位於OsGPAT1基因內含子的正向引物，引物a是來源於OsGPAT1基因內含子的反向引物。引物c是位於T-DNA區域的末端引物。T1代純合植株只有引物b和c組合可以得到一個0.7kb的PCR片段，這是因為通過引物a和b組合擴增由於片段太大而不能擴增DNA片段(10Kb以上)(圖3)。野生型植株由於在基因組中沒有T-DNA插入，因此能夠利用引物a和b的組合來得到一個0.9kb的PCR片段，而不能有引物b和c組合的PCR片段。雜合的T1代植物則可以分別通過bc和ab的組合來得到0.7kb和0.9kb的PCR擴增物。實驗結果如圖4所示。在基因型的檢測中發現，泳道1、2、17是T-DNA插入位點純合單株，而泳道3、4、6、7、8、9、10、12、13、15、16、18、19、20為是T-DNA插入位點雜合單株，植株5、11、14為不含T-DNA插入的野生型單株。在進行田間種植時發現，T-DNA插入位點純合單株，也就是1、2、17這幾個單株在田間出現了半矮，分櫱少的田間表型，而其他的植株都表現出正常的表型。這個結果證明T-DNA插入與突變表型共分離，而且突變體是由於這個T-DNA插入造成的單位點隱性突變。將T1代植株的子代種植得到T2代，將T2代植株再次種植到田間進行表型與T-DNA共分離的分析，分析發現T1代純合突變體的子代(T2代)不再分離，表型一致，T1代雜合突變體的子代(T2代)出現了正常植株和突變植株，正常植株和突變植株的比例是3∶1，使用同樣的方法進行PCR檢測，檢測結果表明T-DNA的插入與突變表型仍然是共分離的。由此證明，這個突變體是由於這個T-DNA插入造成的單位點隱性突變。4、基因的分析。根據BLAST(Altschul等，GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms.NucleicAcidsRes.1997，253389-3402)分析結果，發現OsGPAT1基因編碼的蛋白質與甘油-3-磷酸醯基轉移酶(GPAT)基因有較高的同源性。將這個基因的序列在日本全長cDNA文庫(http//cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中進行搜索，找到了這個基因的全長cDNA，克隆編號是AK070880，這個全長cDNA有3618bp，功能預測是一個甘油-3-磷酸醯基轉移酶(GPAT)基因。這個全長cDNA的序列如下GGCGGACCCAACTAGGGCGGCACGCCGCCGGCCGCCCCAAGGGCCAAGAGGCTTCCTCCGCGAGTCCGCCTCCGCCTCTCTCCTCCTCGGCCGGCAACACGCCATGATGACGCCAACACGACGGCGGCCGACCAATCTACACTCGGAGTCCGGCGAGTTCGTGTAGATTTCTATTGGGGGATGCAGAACCACTATTCCTTTCCTCTATGGTACTGGCCTGCTCATATTTATTCACCCTGAACCTGCAAGTTTTCAGTAATCAGTTTGCACGATTACTAAGACTTGTTTTAATTGTTATGCTGGTGCAACCTAGACCTGGTATATATGTTGCCCAACAATCATGTCATAACTGTGACATGTAAAGAGTGTCCATTATGAACTGCTTAATTTGTCAGCATGATAACGAAATTTTGTTTTCTTCCCAACAAAAAGTTGGGGGCGTCACTCTTTTTCCAGTTTCTTCACTGCCAAGGAGCAGAGTTAAAGGTAGACTTGGAAATTGACAGTGACATATCAGAATTCAGAGCATAAATCCAAACAGCAATATTTATTATGGTTGTTGAATGGGTGCTGATGTGGAACTAAAGCAAACGATGCCATTAGAAGAACTACAAAAATATCTATTAGTTTCTTTTCAAAGAATTCACAATACTGTTGCTGCGGTGATTGAGAATTGGGGCAATGTTCAGAACAGATGGCCTTGATCATGTTTGAATGGAGACGTCGATTCATCTCCCAGCTTCTCAACTGACTACATGGCTTCGATAATGTTCGAAGATGGGATCCATAGAGGCGCACCATCGTGTATCAGACATGTTGGATATTACTAAGAAGATAATAGGAGCAGTATTGCAAATTTGCCACATCGAACCAAGTACTGCTGTAAAATTTCTATCTTCATTCTGCCGTATGTTAAAAAATACTCTATCTTGCAGAATAAACACAAATACGCAACTCAAGCAGGTAAGTTGTAAGAGTTTCCCTTTCTGGTGGAGAGTAAACTTTTGCAGAGGTTCAACTATACCATATTTTCTATCATGCGGTTCTTCAGATTTCAGTACAGTTGAAAGTTGCCAAAACACCACCAGAACATCAGAAACAACGACGGTTGTTGAATGAGACGTTGAAGTTTGCCTTTGTGCACATTCTGCCGCAAAGGATCTGTTCAGCCGCGAGACCTGTATGTTTTACTTATTTCAGCTTATGGAGGCCTATTCTTTTGAGCTAATCGTTGACGGATTCCCAAGATCCTAAATGCTGTCTGGTACTTGGTTGACTCTTGCACCTGCTCCATGACGAAGGTAACGAGTGGCTACGTACGCCGTGGCCGTGCTAATCAATGGGCGAGCTCTGTGAAGAAGCTAACTCCCAACCAACTATTCCAACTCGGTTATTAAAGCCAATGGTAATCGCCCAACGCTGCATGCTGCACTTTACCCTTGTAAAACTGTGAGCGTTTTCCTTTGGTGGATAGAACAGTTGGGATGCGATGCACGGGGAAAAGGGAATTGCAGACACGCCAGAAAGGCAGAGACATTGCCGGTATCTATCACGTGAAAATGTGATGCTGCAACTTGTCCGTCCCATGTATGAATTCAACATTTTGGGTGAGAAAACATGTTTTTGCTGTTGTTTACGTAGCTTACCGCAGGGATTACCTCCTGCGTGTTAGACTGCACCAGTCAAGAAAACCCACTACGTTACGTGAAGCTAGCAGCATCGATCGCACTAGTGTCGCTCTCTGGAAGTAATAGCCTCTTAAGTTAGCTGCGAGCTAAGCCTGCAATTATACACCGTCTCCGCCTCCCCTTCCCATGTCACAACCAACCTTGGATATATTAACTCCCTCTCCCGCTGCTCCACTCCACTCCCACACCATCAGCGAGCACCTAGCGGTCGCATCGCTAGCTGCCATCTCCTGGTGAGATCCATCGAGACGCCCGGCACGACGACGATGGTGTCGCGGAGGTTCAAGCCCGTGGAGGAGTGCAGCTCGGATGGGAGGTCGGAGCAGACGGTGGCCGCCGACTTCGACGGCACGCTGGTCAGGTCGCGGAGCGCCTTCCCGTACTACCTCCTCGTCGCGCTCGAGGCCGGCAGCGTGCTCCGCGCCGTCGTGCTGCTGCTGTCCGTGCCGTTCGTCTACGTGACCTACATTTTCTTCTCCGAGTCGCTGGCCATCAGCACGCTGGTGTACATCTCCGTGGCGGGGCTCAAGGTGAGGAACATCGAGATGGTGGCGCGGTCGGTGCTGCCCAAGTTCTACGCGGAGGACGTGCACCCGGAGAGCTGGAGGGTGTTCAACTCCTTCGGCAAGCGGTACATCATCACGGCGAGCCCCAGGATCATGGTGGAGCACTTCGCCAAGACGTTCCTCGGCGCCGACAAGGTGGTCGGGACGGAGCTGGAGGTCGGCAAGAACGGCAAGGCCACGGGGTTCATGGTGAAGCCCGGAGTGCTCGTGGGCGACCACAAGAGGCAGGCCGTCGTCAAGGAGCTACGCGACGCGGTGCCCGACGTCGGCTTGGGCGACAGGGAGACGGATTTCGACTTCATGTCCATATGCAAGGAGGCCTACCTCGTGACATCAAGGAAGTACAGCGCGGTGCCCAAGAACCAGCTGCTGAGCCCACTCATCCTCCACGACGGCCGCCTCGTGCAGCGTCCGACGCCGCTGGTGGCGCTCGTCACCTTCCTGTGGATGCCGTTCGGCTTCGCGCTCGCGCTCCTCCGCGTGTACGTCAACCTGCCACTCCCGGAGCGGATCGTCTTCTACACCTACAAGCTCATGGGCATCCGCCTCATCGTGAAGGGCAACCCGCCGCCTCCCCCCAAGAAGGGACATCCTGGCGTCCTCTTCGTCTGCAACCACCGCACCGTGCTCGACCCGGTTGAGGTCGCCGTGGCGCTGCGCCGCAAGGTCAGCTGCGTCACGTACAGCATCTCCAAGTTCTCGGAGCTCATCTCGCCGATCAAGGCCGTCGCGCTGTCGCGGGAGCGCGAGAAGGACGCCGAGAACATCCGGCGGCTGCTGGAGGAGGGCGACCTGGTGATCTGCCCCGAGGGCACCACCTGCCGCGAGCCGTTCCTGCTGCGGTTCAGCGCGCTCTTCGCCGAGCTCACCGACCGCATCGTGCCGGTGGCGATCAACACCAAGGAGAGCATGTTCCACGGCTCCACCGTGCGGGGCTTCAAGCTCATGGACCCCTACTTCTTCTTCATGAACCCGCGGCCGACGTACGAGATCACCTTCCTGAACCAGCTGCCCAAGGAGCTCACTTGCAGCGGCGGCAAGTCGCCCATCGAGGTGGCCAACTACATCCAGAAGACGCTCAGCGGCCAGCTCGGCTTCGAGTGCACCGCCATAACGCGCAAGGAGAAGTACAGCATACTCGCCGGGACCGACGGCCGCGTCCCTTCCAAGAACAAGGAGAAGGAAAAGAACTAGCGAGTCACAGCCTCCTATCGATCGGAGTACTCCGTATTCGCCCAGCCGACTAGTGTCACTCATGGCTTCTATCTATTGTTTACGATTTATTGTTGTTTTTCAAGAAGTTGGTAAATTACATATTGTTTCCGAGAAGGATCTCCTTGGAAAGAATTCTTTTGCACTTCTTT實施例2突變體與對照苗期低溫脅迫試驗將Osgpat1突變體和野生型種子於25℃浸種3天、37℃催芽2天後在水稻土中種植約20天，待水稻秧苗長到3葉期，將其放到12℃處理3個小時，20株突變體中有17株出現了很明顯的變化，葉片捲曲，枯萎嚴重，而野生型20個單株則沒有什麼變化(圖4)。這說明OsGPAT1基因的突變對植物抗凍性方面產生了很重要的影響。實施例3對Osgpat1基因的超表達進行超表達所用載體是我們實驗室構建的pU1301。pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，ageneconferringresistancetoXanthomonasoryzaepv.oryzaeinrice，encodingaLRRreceptorkinase-likeprotein.PlantJournal.37517-527)基礎上改建的(圖6)，攜帶具有組成型和超量表達特徵的玉米泛素啟動子的農桿菌介導的遺傳轉化載體。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室(CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)惠贈。設計PCR引物gpatoef和gpatoer把OsGPAT1基因的完整ORF從水稻基因組中擴增出來，在PCR引物上分別加上KpnI和BamHI的酶切位點。gpatoef和gpatoer的序列分別是gpatoefCGCGGTACCAGCTGCCATCTCCTGGTGAGgpatoerCTCGGATCCCTAGTCGGCTGGGCGAATACPCR反應體系的總體積為20μl，水稻基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應緩衝液、25mMMgCL21.2ul、2mMdNTP1.5ul、10uM引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司)，加ddH2O至20μl。反應程序為94℃變性3min，94℃1min、55℃1mins、72℃4min、35cycles，72℃延伸10min，擴10管，收集PCR產物於1.5ml離心管，加等體積24∶1氯仿異戊醇(v/v)，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加2倍體積95％乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5.2)，-20℃放置30分鐘，12000rpm離心20分鐘，棄上清，加500ul75％乙醇放置5min，12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾乾，加75ulddH2O溶解。把純化的PCR產物及pU1301載體分別進行雙酶切，酶切體系是總體積100ul，PCR產物或載體質粒75ul，限制性內切酶BamH130U(Takara公司)，限制性內切酶Kpn130U(Takara公司)，10XKbuffer5ul，ddH2O16ul，37℃酶切5小時。純化酶切產物，方法同上，最後加10ulddH2O溶解。連接反應10ul酶切產物全部用於連接反應，載體0.5ul，2UT4ligase(NEB公司)，5Xbuffer3ul，總15ul體積，連接24小時。取1ul連接產物，電壓18000V，電轉到大腸桿菌DH10B，加800ulLB，復甦45分鐘，取200ul塗於含卡那黴素的LA平板，37℃，過夜。挑單克隆，擴大培養抽質粒，按前面所述體系進行PCR檢測，挑取PCR陽性克隆，按前文所述方法進行雙酶切驗證，得到外源大小符合的質粒，將此質粒命名為pUGPATOE，這個質粒包含了完整的OsGPAT1基因的ORF區段。將這個質粒20ng通過電擊的方法轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)株系EHA105中。採用農桿菌介導的遺傳轉化方法(Hiei等，Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA，1994，PlantJournal6271-282)將超表達基因導入正常的中花11水稻品種。同時使用pU1301空載體按此方法轉化正常中花11水稻作為對照。農桿菌介導的遺傳轉化步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthaleneaceticacid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙醯丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮黴素)；DMSO(DimethylSulfoxide，二甲基亞碸)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)(2)組織培養的溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3)28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然後在20-25℃下定容至1000ml。2)N6min母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g在20-25℃下溶解並定容至1000ml。3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水並加熱至70℃，然後加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解後混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存備用。4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinicacid)0.1g維生素B1(ThiamineHCl)0.1g維生素B6(PyridoxineHCl)0.1g甘氨酸(Glycine)0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存備用。5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g氯化鈣4.4g在20-25℃下溶解並定容至1000ml。6)MSmin母液(100X)碘化鉀0.083g硼酸0.62g硫酸錳(MnSO4·4H2O)2.23g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.0025g氯化鈷(CoCl2·6H2O)0.0025g在20-25℃下溶解並定容至1000ml。7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃下保存。8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃下保存。9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，4℃保存備用。11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌後4℃保存備用。12)AS貯存液AS0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內，4℃保存備用。13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存備用。14)KT貯存液(1mg/ml)KT100mg.1ml1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然後加10ml蒸餾水溶解完全後定容至100ml，在20-25℃下保存。(3)培養基配方1)誘導培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。2)繼代培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸0.5gCH0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。3)預培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。4)共培養基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH0.2g蔗糖5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養基並加入5ml葡萄糖貯存液和250μlAS貯存液，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。5)懸浮培養基N6max母液(10X)5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X)1ml2，4-D貯存液0.2mlCH0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調節pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μlAS貯存液。6)選擇培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調節pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的潮黴素和400ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。7)預分化培養基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液50μlIAA貯存液50μlCH0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養基，加入250μl50mg/ml的潮黴素和400ppm頭孢黴素，分裝倒入培養皿中(25ml/皿)。8)分化培養基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X)10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液2mlNAA貯存液0.2mlIAA貯存液0.2mlCH1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到6.0。煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。9)生根培養基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X)5mlFe2+EDTA貯存液(100X)5ml維生素貯存液(100X)5ml蔗糖20gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節pH值到5.8。煮沸(100℃)並定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。10)LA培養基(LB培養基不含瓊脂粉)蛋白腖2.5g酵母粉1.25g氯化鈉2.5g瓊脂粉3.2g蒸餾水溶解定容至250ml，裝於500ml三角瓶，滅菌後20-25℃保存備用。(4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟4.1愈傷誘導(1)將成熟的水稻種子去殼，然後依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導培養基上；(4)置於黑暗處培養5周，溫度25-27℃。4.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於繼代培養基上黑暗下培養2周，溫度25-27℃。4.3預培養挑選緊實且相對乾燥的胚性愈傷，放於預培養基上黑暗下培養4天，溫度25-27℃。4.4農桿菌培養(1)在帶有卡那黴素的LA培養基上預培養含構建好載體的農桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農桿菌轉移至懸浮培養基裡，28℃搖床上培養2-3小時。4.5農桿菌侵染(1)將預培養的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內；(2)調節農桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；然後放置在共培養基上培養3天，溫度19-20℃。4.6愈傷洗滌和選擇培養(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢黴素的滅菌水中30分鐘；(3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸乾；(4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇2-3次，每次2周。(第一次頭孢黴素篩選濃度為400ppm，第二次以後為250ppm)4.7分化(1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上黑暗處培養5-7天；(2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照(2000lx)下培養，溫度26℃，5-7周。4.8生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時產生的根；(2)然後將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26℃。4.9移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分溼潤。在轉化過程中共得到了186塊轉pUGPATOE超表達基因的抗性愈傷組織，對這些抗性愈傷進行分化，最後有95塊長成水稻小苗，移栽後有86株得以成活。對這86株超表達植株進行PCR檢測，結果PCR陽性植株為72株。另外還得到了轉pU1301空載體的轉基因植株48株。從這70株PCR檢測陽性植株中取40株進行低溫脅迫實驗，同時取30株轉pU1301空載體的轉基因植物作為對照。低溫脅迫實驗按如下方案進行將生根得到的3葉期大小的超表達轉基因植株和對照都放置於8℃冰櫃中處理30小時，然後放於22℃恢復5小時後觀察植株對低溫處理的反應。觀察結果表明，在40株轉pUGPATOE陽性的水稻轉基因植株中有29株表形沒有發生明顯的變化，而在30株轉pU1301空載體的對照轉基因植株中有26株出現了葉片捲曲、枯萎的現象。與對照相比，超表達的植株在冷處理後存活率提高了59.2％。因此通過冷脅迫實驗表明，在OsGPAT1基因超量表達的植株中，水稻的抗寒性出現了很明顯的增強。SEQUENCELISTING110華中農業大學120一種水稻冷害基因及應用130一種水稻冷害基因及應用1602170PatentInversion3.121012117919212DNA213Oryzasativa220221CDS222(4809)..(5423)223220221CDS222(6871)..(7746)2234001tgcggacccaactagggcggcacgccgccggccgccccaagggccaagaggcttcctccg60cgagtccgcctccgcctctctcctcctcggccggcaacacgccatgatgacgccaacacg120acggcggccgaccaatctacactcggagtccggcgaggtaactaaaacccctagttgctc180ttccctctctcggtacaatctaacacggcaagttcgagccgcgttttccagatctcgatt240tttattttttttgaaaccgagccagactttgctgatgttttaagcagagagaaagttatt300tacagatctcgaattctcgattccctgctgaaatagtctaggcaatttgatggagtacta360gtaacttcaccggatactctcaccaatacggcaaagttttgtacggtcgcccgtttcgtt420tgcaagtactccacttgtcgcctagtatatgttttctgccgggtcggccgaaaggaacgg480cgaccaaatttcattaagatggggacgcctagtatatgtgaagcagtcatttttcaccaa540gtattagcatcccctagtcctctctagtccttgaaatgcgtatttgaatgtgtggttgcc600cttccgcttgattgtgaagcttttccgtgtttggaaaaaaaaatacatgttgaaatttgt660tgatcattctgattttctcaacctaactcttatgcaattgcccgtatgaactgcaaggtt720tagtcagggcgcctgcgcctcgtttccctgttagttacaccggcccacaacttgcttagt780ttccatgtgagaatttgcttgcgaaaaagtgaaagtccttttcctccctgcttttgcctt840tcatttccttgtgacgatagacaagattttttccagtcgtgtgcttgttttggattattg900caacttttgtggataataaagccgctacttgtaagtaaacgaaaaaaaaatgttggctca960gcatgaacacacgtttgttgttccttcaattttctttttgtaccaagatgtttcctgaag1020ttagcatggcaagtaggaaatactgatctgtcttgacgttgattcttctatgaacattgt1080atcgatgaacatccaggttgcctccaatctgtcgcctctaatctgtatgcatcatcttaa1140gcaaactatcacttctaatctttagctaaaatcgttaaaacgaccttttgttttctgtgt1200tctgtggaggcttcaggcttgtatagttgtatttaggaccactgatcttaaaatcttcat1260aacatatgtttatgagtacatttccttcattggaccaccaagcattaattttgataagct1320tttgcaatgcagtttttccatcactgtttctctataatttcattctcctatactacagaa1380actaccagctcattgagacaatgctaaagttatcctaaggagttgactgactagaaattt1440gtaatgtactacagttcgtgtagatttctattgggggatgcagaaccactattcctttcc1500tctatggtactggcctgctcatatttgtaagtatgctacaattcttagactagaagacat1560gtgcctttcaacattctcgtggcattgaagaatacttgtttcacaatatcaacatctaac1620aaactgtctaacaactcaaggaaagggtaaagcatttggctacgagaagtttctgtttgg1680agggtaatgtataagtgattctgtactaaaagaaaatagatcgtcgcgttgtttttcttt1740aaagttgctagagagtgactgaagatttagagatcctctcattaatgtggaaaaatgagt1800agcaaagttagatggattaacaagggctcagtagttcgttttcatctgcgactctgcgtc1860gggtggagtaatactaatagatatgcgtaggcactatggaggggtcaaaaagtactatta1920ttaggacctccaatataacgccaaatagactcattactcctaaggacaaatgaacataca1980aaagggataagcaaagcagaaatgatgggaaaaattacagtgagtgcgtaactcctgtat2040gtactcagaatttaatccttgctcagggttgagtcatttaattatgcatccttttgtgtt2100gcagattcaccctgaacctgcaagttttcagtaatcagtttgcacgattactaagacttg2160ttttaattgttatgctggtgcaacctagacctggtatatatgttgcccaacaatcatgtc2220ataactgtgacatgtaaagagtgtccattatgaactgcttaatttgtcagcatgataacg2280aaattttgttttcttcccaacaaaaagttgggggcgtcactctttttccagtttcttcac2340tgccaaggagca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