固態發酵生產菊粉酶的方法

2023-05-15 09:12:06 1

專利名稱：固態發酵生產菊粉酶的方法
技術領域：
本發明涉及發酵生產菊粉酶的方法，特別涉及一種固態發酵生產菊粉酶 的方法。
背景技術：
菊粉(inulin)最早是從菊科植物中分離出來而得名，它主要儲存在菊芋 等作物的根部和塊莖中。菊粉是一種由呋喃構形的d—果糖經|3-2, l糖苷鍵 脫水聚合而成，且在還原性末端連有一個葡萄糖殘基。聚合度從2-60多種果 聚糖的混合物，是十分理想的功能性食品配料，同時也是生產低聚果糖、高 果糖漿、結晶果糖等產品的良好原料。
菊粉酶(inulinase )是能夠水解卩-2， 1 - d —果聚糖果糖苷鍵的一類水解 酶，學名卩-2， l-d—果聚糖酶，又叫卩一果聚糖酶或2， l-d—果聚糖水 解酶。分泌菊粉酶的微生物在自然界中分布很廣，土壤、水和動物消化道中 的多種微生物都能分泌。菊粉酶可以在一定的溫度條件下，通過一步酶法把 菊粉水解成高純度果糖或低聚果糖。而果糖或低聚果糖是比蔗糖更為優良的 甜味劑、功能性食品原料和添加劑，可見生產菊粉酶變得尤為重要。傳統上 一般採用液體發酵生產菊粉酶，但是採用深層液體發酵法生產的菊粉酶產量 低，產酶發酵周期較長並且涉及的生產設備要求較複雜，因此投資大，加工 成本高，不適於工業化生產，同時廢水的排放造成環境汙染比較嚴重。

發明內容
本發明的目的在於克服上述不足之處，針對目前液體深層發酵法生產菊 粉酶所存在的問題，提供一種以穀物為培養基主要原料的固態發酵生產菊粉 酶的方法，意在簡化其生產工藝，縮短發酵周期，提高菊粉酶產量，減小投 資，降低成本，益於生產應用並從根本上解決汙水排放問題，有利於環保。
為實現上述目的本發明所採用的技術方案是 一種固態發酵生產菊粉酶 的方法，即採用固態生物反應器發酵生產菊粉酶，包括如下步驟
(1)孢子懸液的製備將克魯維脆壁酵母菌種接種到由酵母粉-蛋白腖-
菊粉混合併按常規加瓊脂組成的斜面培養基上，所述斜面培養基組成包括
(g/L):酵母粉10,蛋白腖20，菊粉15, pH值自然；於30。C恆溫培養4-6 天，加入0.75% (W/W)的生理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子 含量為105-106個,待用；
(2 )上述菌懸液用於接種至滅菌後的固態培養基上培養成固態種子或再 次液態擴大培養成液體種子；液體種子培養基組成(g/L):酵母粉5-15,蛋 白腖15-30,菊粉10-20， pH值自然；將液體種子培養基於121°C、 20min滅 菌再冷卻；然後按照體積比4-6%的接種量將孢子懸液接入上述冷卻的液體種 子培養基中，於28-3(TC、轉速為150-200rpm的搖床上培養24h，得到液體種 子；
(3) 發酵獲得產物固態發酵培養基組成(g/L ):穀物200.0-400.0,玉 米漿1.0-5.0, KH2P042.0-5.0， MgS04.7H20 0.2-0.6, MnS04.7H20 0.02-0.04， ZnS04.7H20 0.02-0.03, CaCl2.7H20 0.03-0.05，餘量為水；初始pH值5.5-6.0, 將發酵培養基經121。C、20min滅菌再冷卻；然後在無菌條件下，按5-10ml/100g 固態培養基加入液體種子或按5-10mg/100g固態培養基加入固體種子，充分攪 拌混合後厚度0.5-3.0cm,溼度50%-80%,通入0.2-1.5V/ (V.min)的無菌空 氣，溫度為25-45。C,靜置發酵4-6天；
(4) 後處理用水將發酵結束後所得的產物按1 : 1比例進行稀釋，離 心收集含菊粉酶的上清液，即為粗酶液，將粗酶液進行酶活測定，酶活性達 100-200u/ml;按常規進行乾燥粉粹後製成菊粉酶製劑。
所述穀物包括小麥、大麥、燕麥、小米、大米、玉米。 本發明的有益效果是傳統上來說，液體深層發酵生產菊粉酶所需的周 期很長，並且菊粉酶的活性不穩定，汙水排放量很大，工業上操作起來很困 難。應用本發明方法，固態發酵有效提高菊粉酶的產量，縮短發酵周期，簡 化工藝設備，降低成本，益於工業化生產應用；釆用固態發酵生產菊粉酶， 大大減少液體發酵產生的汙水，從根本上有效解決汙水排放問題，非常有利 於環境保護。
具體實施例方式
以下結合較佳實施例，對依據本發明提供的具體實施方式
詳述如下
實施例1
(1 )將克魯維脆壁酵母菌種接種到由酵母粉-蛋白腖-菊粉混合併按常規
加瓊脂組成的斜面培養基上，瓊脂加入量為1.5-2%,於30。C恆溫培養4天， 加入0.75% (W/W)的生理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子含量 約為lxlS個，待用。所述斜面培養基組成包括(1L):酵母粉10g，蛋白腖 20g，菊粉15g, pH值自然(不需要調pH,保持自然狀態)。
(2 )取10ml菌懸液接入裝有100ml種子培養基的500ml搖瓶中。 搖瓶種子培養基(1L):酵母粉10g，蛋白腖20g,菊粉10g, pH值自然， 將液體種子培養基121°C、 20min滅菌再冷卻；於3(TC、轉速為150rpm的搖 床上培養24h，得到液體種子。
(3) 在無菌條件下，按5ml/100g固態培養基加入液體種子。固態發酵 培養基組成(lkg):穀物300.0g,玉米漿3.0g， KH2PO44.0g, MgS04.7H20 0.3g， MnS04.7H20 0.02g, ZnS04.7H20 0.02g， CaCl2.7H20 0.03g,餘量是水；初始 pH值5.5,將發酵培養基經121。C、 20min滅菌再冷卻至28。C;充分攪拌混合 後厚度1.5cm,溼度60%，通入1.0V/ (V.min)的無菌空氣，溫度為28°C， 靜置發酵4天。穀物的選擇包括小麥、大麥、燕麥、小米、大米、玉米。
(4) 後處理用水將發酵結束後所得的產物按l : 1比例進行稀釋，離 心收集含菊粉酶的上清液，即為粗酶液，將粗酶液進行酶活測定，酶活性可 達128.54u/ml。以下按常規乾燥粉粹後製成菊粉酶製劑。
實施例2
(1 )將克魯維脆壁酵母菌種接種到由酵母粉-蛋白腖-菊粉混合併按常規力口 瓊脂組成的斜面培養基上，於30。C恆溫培養5天，加入0.75% ( W/W)的生 理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子含量約為1.5xlS個，待用。所 述斜面培養基組成包括(1L):酵母粉10g,蛋白腖20g，菊粉15g， pH值自然。
(2)取8ml菌懸液接入100g固態培養基中。固態發酵培養基組成(lkg): 穀物350.0g,玉米漿2.0g, KH2PO42.0g， MgS04.7H20 0.3g, MnS04.7H20 0.03g， ZnS04.7H20 0.02g， CaCl2.7H20 0.03g,餘量為水；初始pH值5.5,將發酵培 養基經121。C、 20min滅菌再冷卻至30。C;充分攪拌混合後厚度1.5cm,溼度60%，通入1.2V/ (V.min)的無菌空氣，溫度為30°C，靜置發酵2天作為固 體種子。
(3) 在無菌條件下，按8g/100g固態培養基加入固體種子。固態發酵培 養基組成(lkg):穀物350.0g，玉米漿2.0g， KH2PO42.0g， MgS04.7H20 0.3g, MnS04.7H20 0.03g, ZnS04.7H20 0.02g， CaCl2.7H20 0.03g，餘量為水；初始 pH值5.5，將發酵培養基經121。C、 20min滅菌再冷卻至30。C;充分攪拌混合 後厚度2.0cm,溼度70%,通入1.0V/ ( V.min)的無菌空氣，溫度為30°C, 靜置發酵5天。穀物的選擇包括小麥、大麥、燕麥、小米、大米、玉米。
(4)後處理用水將發酵結束後所得的產物按1 : 1比例進行稀釋，離心 收集含菊粉酶的上清液，即為粗酶液，將粗酶液進行酶活測定，酶活性可達 137.26u/ml。經乾燥粉粹後製成菊粉酶製劑。
實施例3
(1 )將克魯維脆壁酵母菌種接種到由酵母粉-蛋白腖-菊粉混合併按常規加 瓊脂組成的斜面培養基上，於30。C恆溫培養5天，加入0.75% ( W/W)的生 理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子含量約為2.0xl0S個，待用。所 述斜面培養基組成包括(1L):酵母粉10g,蛋白腖20g,菊粉15g, pH值自然。
(2 )取5ml菌懸液接入裝有100ml種子培養基的500ml搖瓶中。搖瓶種 子培養基(1L):酵母粉10g，蛋白腖25g,菊粉15g, pH值自然。將液體種 子培養基121。C、 20min滅菌再冷卻；於30。C、轉速為200rpm的搖床上培養 24h,得到液體種子。
(3 )在無菌條件下，按10ml/100g固態培養基加入液體種子固態發酵培 養基組成(lkg):穀物350.0g，玉米漿4.0g， KH2PO43.0g, MgS04.7H20 0.4g, MnSO4.7H2O0.03g， ZnS04.7H20 0.02g, CaCl2.7H20 0.04g,餘量是自來水；初 始pH值6.0,將發酵培養基經121。C、 20min滅菌再冷卻至28°C;充分攪拌 混合後厚度1.5cm,溼度80%，通入1.5V/( V.min)的無菌空氣，溫度為28°C, 靜置發酵6天。穀物的選擇包括小麥、大麥、燕麥、小米、大米、玉米。
(4) 後處理用水將發酵結束後所得的產物按1 : 1比例進行稀釋，離 心收集含菊粉酶的上清液，即為粗酶液，將粗酶液進行酶活測定，酶活性可
達125.48u/ml。經乾燥粉粹後製成菊粉酶製劑。
實施例4
(1 )將克魯維脆壁酵母菌種接種到由酵母粉-蛋白腖-菊粉混合併按常規 加瓊脂組成的斜面培養基上，於30。C恆溫培養4天，加入0.75% ( W/W)的 生理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子含量約為1.0xlS個，待用。 所述斜面培養基組成包括(1L):酵母粉10g，蛋白腖20g，菊粉15g， pH值自然。
(2 )取10ml菌懸液接入100g固態培養基中。固態發酵培養基組成(lkg ): 穀物375.0g，玉米漿4.0g, KH2PO43.0g， MgS04.7H20 0.4g， MnS04.7H20 0.03g， ZnS04.7H20 0.02g， CaCl2.7H20 0.04g,餘量是自來水；初始pH值6.0，將發 酵培養基經121。C、 20min滅菌再冷卻至30。C;充分攪拌混合後厚度1.5cm, 溼度70%，通入1.2V/ (V.min)的無菌空氣，溫度為30。C,靜置發酵2天作 為固體種子。
(3) 在無菌條件下，按10g/100g固態培養基加入固體種子。固態發酵培 養基組成(lkg):穀物375.0g，玉米漿3.0g, KH2PO43.0g, MgS04.7H20 0.3g， MnS04.7H20 0.03g， ZnS04.7H20 0.02g， CaCl2.7H20 0.03g,餘量是自來水；初 始pH值6.0，將發酵培養基經121°C、 20min滅菌再冷卻至30°C;充分攪拌 混合後厚度2.0cm,溼度80%,通入1.5V/ ( V.min )的無菌空氣，溫度為30°C ， 靜置發酵5天。穀物的選擇包括小麥、大麥、燕麥、小米、大米、玉米。
(4) 後處理用水將發酵結束後所得的產物按1 : 1比例進行稀釋，離 心收集含菊粉酶的上清液，即為粗酶液，將粗酶液進行酶活測定，酶活性可 達132.94u/ml。經乾燥粉粹後製成菊粉酶製劑。
上述參照實施例對該固態發酵生產菊粉酶的方法進行的詳細描述，是說 明性的而不是限定性的，可根據所限定範圍例舉出若干個實施例，因此在不 脫離本發明總體構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範圍之內。
權利要求
1、一種固態發酵生產菊粉酶的方法，即採用固態生物反應器發酵生產菊粉酶，包括如下步驟:(1)孢子懸液的製備:將克魯維脆壁酵母菌種接種到由酵母粉-蛋白腖-菊粉混合併按常規加瓊脂組成的斜面培養基上，所述斜面培養基組成包括(g/L):酵母粉10，蛋白腖20，菊粉15，pH值自然；於30℃恆溫培養4-6天，加入0.75％(W/W)的生理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子含量為105-106個，待用；(2)上述菌懸液用於接種至滅菌後的固態培養基上培養成固態種子或再次液態擴大培養成液體種子；液體種子培養基組成(g/L):酵母粉5-15，蛋白腖15-30，菊粉10-20，pH值自然；將液體種子培養基於121℃、20min滅菌再冷卻；然後按照體積比4-6％的接種量將孢子懸液接入上述冷卻的液體種子培養基中，於28-30℃、轉速為150-200rpm的搖床上培養24h，得到液體種子；(3)發酵獲得產物:固態發酵培養基組成(g/L):穀物200.0-400.0，玉米漿1.0-5.0，KH2PO4 2.0-5.0，MgSO4.7H2O 0.2-0.6，MnSO4.7H2O 0.02-0.04，ZnSO4.7H2O 0.02-0.03，CaCl2.7H2O 0.03-0.05，餘量為水；初始pH值5.5-6.0，將發酵培養基經121℃、20min滅菌再冷卻；然後在無菌條件下，按5-10ml/100g固態培養基加入液體種子或按5-10mg/100g固態培養基加入固體種子，充分攪拌混合後厚度0.5-3.0cm，溼度50％-80％，通入0.2-1.5V/(V.min)的無菌空氣，溫度為25-45℃，靜置發酵4-6天；(4)後處理:用水將發酵結束後所得的產物按1∶1比例進行稀釋，離心收集含菊粉酶的上清液，即為粗酶液，將粗酶液進行酶活測定，酶活性達100-200u/ml；按常規進行乾燥粉粹後製成菊粉酶製劑。
全文摘要
本發明涉及一種固態發酵生產菊粉酶的方法，即採用固態生物反應器發酵生產菊粉酶，步驟如下(1)將克魯維脆壁酵母菌種接種到酵母粉-蛋白腖-菊粉瓊脂斜面上，於30℃恆溫培養4-6天，加入0.75％(W/W)的生理鹽水洗滌菌絲體，獲得菌懸液，懸液中孢子含量為105-106個；(2)上述菌懸液用於接種至滅菌後的固態培養基上培養成固態種子或再次液態擴大培養成液體種子；(3)按5-10ml/100g固態培養基加入液體種子或按5-10mg/100g固態培養基加入固體種子，充分攪拌混合後厚度0.5-3.0cm，溼度50％-80％，通入0.2-1.5V/(V.min)的無菌空氣，溫度25-45℃，靜置發酵4-6天；(4)將產物稀釋，離心收集含菊粉酶的上清液，乾燥粉粹製成菊粉酶製劑。本發明方法有效提高菊粉酶的產量，縮短發酵周期，且降低排汙，利於環保。
文檔編號C12N9/24GK101381711SQ20081015242
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月21日 優先權日2008年10月21日
發明者劉曉鷗, 華 國, 溪 孫, 孟繁君, 徐勇虎, 培 李, 李睿穎, 王永樂, 許勤虎 申請人:天津實發中科百奧工業生物技術有限公司