一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因及其非融合表達產物、生產方法和應用的製作方法
2024-02-24 20:36:15 1
專利名稱：一種重組人鹼性成纖維細胞生長因子基因及其非融合表達產物、生產方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程應用領域。本發明涉及一種修改後的人鹼性成纖維細胞生長因子的基因，含有該基因的表達載體和原核表達系統。本發明還涉及該修改後基因的非融合表達產物及其該產物在製備治療神經系統損傷等疾病藥物方面的應用。
背景技術：
鹼性成纖維細胞生長因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)是成纖維細胞因子家族中的一種。成纖維細胞生長因子(FGF)最初是作為對balb/c3T3細胞具有生長促進活性的因子，從牛腦垂體組織中分離的(D.Gospodarrowicz，Nature 249123，1974)。該因子對酸和溫度敏感，具有高的(鹼性)等電點，pI＝9.3-9.6。
bFGF可以選擇性地激發包括中胚層細胞和神經外胚層細胞在內的許多細胞的生物學反應，這些細胞包括內皮細胞、平滑肌細胞、腎上腺皮質細胞、成肌細胞及成骨細胞。bFGF除可以刺激細胞生長外，還可刺激許多類型的細胞以非有絲分裂方式發生不同的反應，例如促進細胞向受傷部位遷移(趨化因子活性)、促進新的血管生成、調節神經退化和存活性(神經營養活性)、調節內分泌功能以及刺激或抑制特異性細胞蛋白質表達、細胞外基質產生及細胞存活等(Baird，A.and Bohler，P.，Handbook of Exp.Pharmacol.，95(1)369-418，1990)。這些性質為使用bFGF製備用來加速傷口癒合、神經組織修復、預防和治療腦和心肌局部缺血(側枝血管生成)的藥物提供了基礎。
人鹼性成纖維細胞生長因子(human basic Fibroblast Growth Factor，hbFGF，下稱hbFGF)由於其胺基酸序列與人體天然的hbFGF完全一致，因此應用於人體治療不會產生免疫反應，可以廣泛應用於包括神經系統損傷、燒燙傷、創傷、各類潰瘍方面疾病的治療。因此有極高的開發價值。
自1986年Abraham等首次克隆bFGF的cDNA以來，bFGF基因的克隆和表達研究取得了重大的進展，使人們不再依賴組織提取來進行基礎研究。細菌、酵母、病毒等bFGF表達體系的構建極大地方便了bFGF的研究。但若要採用這些表達體系大規模生產hbFGF，則由於其表達量不足而限制了其使用。
在國內，暨南大學生物工程研究所構建了bFGF表達載體，並成功開發出牛bFGF產品(專利申請號96114279.0)。在hbFGF表達研究方面，採用融合蛋白方法表達的可取得較高的表達量。也有採用信號肽OmpA序列重組分泌型表達載體，在周質中獲得的hbFGF蛋白可佔總周質蛋白的15％。但融合hbFGF由於其含有的這一段融合蛋白而極大地限制了其應用。而照常規方法構建胞內型表達載體表達非融合rhbFGF，表達率均不高，未有超過15％的報導。
翻譯起始區(translation initiation region，下簡稱TIR)是指mRNA上影響到翻譯起始的一段mRNA序列。一般意義上認為mRNA起始密碼子附近的70個鹼基對翻譯的順利起始非常重要，包含了翻譯起始的大部分重要信息。因此翻譯起始區的二級結構被認為對翻譯的順利起始具有非常重要的意義。mRNA一般情況下會形成各種各樣的二級結構，例如各種髮夾結構。在能量較低的情況下，這些二級結構有時會通過形成假結(pseudoknot)結構，從而形成更複雜的各種三級結構。一般而言，過於穩定的mRNA二級結構會嚴重地影響核糖體RNA對TIR區內重要位點的識別，例如SD區等。翻譯的起始階段，當核糖體16S亞基開始識別SD序列並開始結合到mRNA時，必須先打開發夾之類的二級結構，如果這些二級結構很難打開，翻譯將不能起始。故理論上認為當二級結構越不穩定時，翻譯的起始效率也會越高。
有實驗證明mRNA中G+C含量的減少時，一般情況下會減小TIR區二級結構的穩定性。鹼基G和鹼基C分別都含有三個成氫鍵基團。而鹼基A和鹼基U只含有二個成氫鍵基團。因此G+C含量增高時，形成的二級結構更穩定，故理論上認為序列具有更大的自由能降，從而降低mRNA的翻譯起始效率。
另外，密碼子系統的選擇採用對於翻譯的順利也意義重大。大多數胺基酸由於密碼子的簡併性而具有不只一種密碼子，它們對應tRNA的豐度在不同表達系統中會有很大差異，相應地造成在密碼子偏好性上的巨大差異，因此不同的表達系統均有密碼子偏好性的不同。因此外源基因在某一表達系統中表達時，採用該表達系統偏好的密碼子比例高的其mRNA翻譯速度快，而稀有密碼子比例高的mRNA翻譯速度慢。而當mRNA中具有較多的稀有密碼子時，往往會造成外源基因表達效率很低或不表達的嚴重的後果。
發明內容
本發明的目的是提供一種能在原核表達體系中高效表達的hbFGF非融合基因；本發明的另一目的是提供一種含有這種hbFGF非融合基因的表達載體；本發明的另一目的是提供一種能高效表達hbFGF非融合蛋白的原核表達系統；本發明的另一個目的是提供一種依據該原核表達系統翻譯表達產生的具有人鹼性成纖維細胞生長因子活性的非融合型多肽；本發明的另一個目的是提供生產上述基因表達產物的方法；本發明的另一個目的是提供上述非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子在製備治療神經系統疾病的藥物中的應用。
本發明的能在原核表達體系中高效表達的hbFGF非融合基因，是在不改變天然hbFGF胺基酸序列的情況下，將該基因的翻譯起始區經過適當的修改，使具有較高的密碼子偏好性，較低的G+C含量。這種hbFGF基因通過適當的載體可以在原核表達系統中有較高的翻譯起始效率，從而提高表達率，而且可溶性蛋白的表達較高，大大節省了中下遊發酵、純化條件的優化時間及生產成本，也可以同時簡化下遊的蛋白產物純化工藝和提高hbFGF的生物活性。該hbFGF基因具有如序列表所示的核甘酸序列。
本發明的含有這種hbFGF非融合基因的表達載體，該載體具有能在原核表達體系中翻譯表達這種hbFGF基因的能力。其中，優選的一種載體是基於pET-3c克隆構建的。
本發明的能高效表達hbFGF非融合蛋白的原核表達系統，該系統包含上述含有hbFGF的載體，而且能夠有效地防止本底表達。其中優選的原核表達系統是大腸桿菌表達系統，特別優選的是BL21(DE3)plySs。
根據上述提供的hbFGF基因、表達載體和原核表達系統，本發明提供一種依據該原核表達系統翻譯表達產生的具有人鹼性成纖維細胞生長因子活性的非融合型多肽，該非融合hbFGF多肽具有如序列表所示的胺基酸序列，具有17.2KD的分子量，且等電點為9.3-9.6。
根據上述提供的hbFGF基因、表達載體和原核表達系統，本發明生產該基因表達產物的方法包括(1)設計合適的PCR引物，通過PCR擴增，得到適當地修改過的編碼具有非融合hbFGF的DNA序列；(2)將經過修改的DNA序列與適當的克隆表達載體相連接，得到重組表達載體；根據優選的實施方案，其中所說的重組表達載體為基於pET-3c構建的pET-JN系列；(3)用所說的重組表達載體轉化適當的原核宿主細胞並篩選所得到的被轉化的重組工程菌株；根據優選的實施方案，其中所說的原核宿主細胞為大腸桿菌細胞，其中最優選的是BL21(DE3)plySs(4)在適於表達所說的具有成纖維細胞生長因子活性之多肽的條件下發酵培養所說的被轉化的工程菌，收集菌體，破碎離心，分別從離心的上清和沉澱產物中分離並純化所說的多肽；(5)純化的步驟依次為離子交換層析-親合層析-凝膠層析，產物純度達到98％以上。
本發明上述非融合hbFGF還可以在製備治療神經系統疾病的藥物中進行應用。該應用含有按本發明方法生產的非融合hbFGF作為必要的活性成分外，還可含有適當量的以及醫藥上可接受的載體或賦形劑。該藥物組合物用於製備預防或治療神經系統損傷等藥物，特別是用於製備治療神經組織損傷如外周神經損傷、神經性耳聾、急性缺血性腦中風、腦外傷等方面的藥物。
以下詳細描述本發明的技術方案首先，用本領域技術人員熟知的方法，設計適當的引物若干對，以我所保存的人鹼性成纖維細胞生長因子基因作為模板(基因序列見中國專利96114279.0之附圖2)，PCR擴增，將hbFGF基因的TIR即將ATG起始密碼子開始的前0-30個密碼子進行修改，如此獲得的修改後的hbFGF基因再用限制性內切酶進行酶切，在T4連接酶的作用下將所得到的基因連接到適當的質粒載體，再藉助CaCl2法或電穿孔法等常規方法將所得到的重組載體導入宿主細胞例如大腸桿菌中，再基於所用質粒載體所攜帶的抗生素抗性或其他抗性標誌選擇轉化體。例如可使用pET-3c/3b/3c作為克隆載體，將修改了TIR的hbFGF基因克隆其中，轉化大腸桿菌DH5α或JM109的情況下，可在含有氨苄青黴素(Ampicillin，下簡稱AMP)的LB培養基(1％胰蛋白腖、0.5％醇母提取物，1％NaCl，pH7.2，下略)平皿上培養該轉化的細胞，得到相應的菌落。
對獲得的菌落，需進一步鑑定其是否為重組子。可以採用雙酶切的方法進行初步鑑定。如在使用大腸桿菌作為宿主細胞的情況下，可以用常規方法從重組體大腸桿菌細胞中抽取質粒，用限制性酶消化所得到的質粒，溴乙錠(EB)染色，DNA瓊脂糖電泳進行鑑定，如在紫外光下可見清晰的酶切片斷，則可初步證實修改後的hbFGF基因已克隆入表達載體。為進一步證實，可以將初步鑑定確定的含有該克隆表達載體的宿主菌直接交由專業測序公司進行測序，將測序結果進行比較，以進一步證實基因序列是否與預期的一致，可推知胺基酸序列是否與預期完全相同。
然後將含有這種修改過TIR的hbFGF基因的重組表達載體進一步轉化到適當的表達宿主細胞內。在適於表達具有hbFGF活性蛋白的通用條件下，培養所得到的轉化體細胞。例如在分別使用pET-3c或pET-35b+和大腸桿菌BL21(DE3)或BL21(DE3)plySs作為質粒載體和宿主時，可在含有100μg/ml AMP的LB培養基中將轉化體培養過夜。培養後收穫細胞，用超聲波破碎細胞，離心分離細胞的可溶性部分並從中分離和純化所需的hbFGF。
這裡應特別強調指出的是，在本發明中是由於利用突變了TIR區域的hbFGF基因從而大大提高了hbFGF的表達效率，特別是增加了從細胞可溶性部分中獲得的表達產物的比例(因為從包含體中分離純化表達產物時往往因使用破碎包含體的變性劑而導致產物的活性效率很低或失活)。
經發酵和層析純化後獲得的hbFGF可按照本領域已知的噻唑藍(MTT)法(ArmelinHA.，Pituitary extracts and steroid hormones in the control of 3T3 cell growth，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702702-2706，1973)，以提取的非融合hbFGF作為試驗樣品，以細胞最大半數增殖濃度(ED50)標定本發明的具有hbFGF之生物學活性。
可以使用多種常規層析技術純化依照本發明提供方法培養的轉化體細胞和/或培養基中具有hbFGF活性的多肽。例如可在破碎細胞後溶解所需的多肽，溶胞物離心後對所得上清層析分離。所使用的層析方法包括但不只限於離子交換層析，疏水相互作用層析，凝膠過濾層析和親合層析。其中親合層析包括但不只限於金屬螯合例如銅或鋅鉻合的親合柱層析和結合有對hbFGF有高度親合力之硫酸肝素柱層析。
用於本發明的疏水柱層析介質是可共價連接正(異)丁基、辛烷基和苯基等的瓊脂糖樹脂，例如可以是購自Phamacia Co.Sweden的Butyl Sepharose phenyl sepharose 4L-4B等。可以使用本領域已知的方法通過1-氯-2，3-環氧丙烷或2，3-二溴丙醇作為間隔臂，將上述基團共價結合到Sepharose固相基質上。在以疏水相互作用層析分離hbFGF時，可以使用等度或梯度冼脫，但較好是使用選自磷酸鹽緩衝液、Tris-Hcl緩衝液，硝酸鹽緩衝液的緩衝鹽溶液，以50-600cm/小時的流速進行洗脫。使用的濃度梯梯度一般為3.5M-0M，洗脫液的pH範圍為6-9。
為進行金屬螯合物親合層析，可以使用偶聯有Zn+、Cu2+、Fe3+、Mn2+等金屬離子固相樹脂，但較好是偶聯Zn2+的Sepharose或Sephadex，羧甲基纖維素樹脂柱(例如購自Pharmacia Co.，Swedem的Chelating Sepharose Fast Flow)。可在大約pH7-9條件下，以大約250-370cm/小時的流速進行洗脫。可使用含有NaCl緩衝液的洗脫液洗脫。
用於分離hbFGF的最重要的層析基質是攜帶共價交聯的硫酸多糖，或瓊脂糖、藥聚糖或纖維素的基質，例如按前述方法製得的或購自Phramacia Co.，Sweden的產品名為Sepharose 6 FastFlow，或Hyperp的親合層析樹脂。可用含有NaCl的緩衝液梯度洗脫。
進行離子交換層析是根據不同蛋白質電荷性質不同而將其分離。層析介質是採用X-連接瓊脂或X-連接右旋糖苷為樹脂基。通常通過加大反荷離子的濃度來進行分離。最常使用為Nacl溶液進行步進式或梯度式洗脫，使用濃度梯度為0-1M，洗脫液的範圍為pH6-9。
凝膠層析介質為X-鏈葡聚糖或雙丙烯醯胺。例如選擇Pharmacia公司的Sgphacryl S-100。可根據蛋白質分子大小不同達到分離的效果。可用一般的緩衝體系或含低濃度鹽緩衝體系緩衝體系進行洗脫，而通常選用磷酸鹽緩衝液。洗脫液的pH範圍為6-9。
我們依次使用疏水相互作用層析-金屬螯合物親合層析-硫酸多糖親合層析純化或依次使用離子交換層析-親合層析-凝膠層析等方法來製備的hbFGF，產物純度達到98％以上。
在本表達系統中，所表達的hbFGF還有部分是在重組體的菌胞中是以可溶性包含體的形式積聚的。在這種情況下，可以回收並用變性劑(例如尿素)溶解後，除去變性劑以使hbFGF重新摺疊並恢復其原有活性，然後再基本上按前述方法進行層析處理，以得到具有所需的非融合hbFGF多肽。
本發明還涉及含有非融合hbFGF的藥物組合物，這些藥物組合物可應用於治療神經系統損傷如外周神經損傷、神經性耳聾、急性缺血性腦中風、腦外傷等方面的治療。可以按照本發明所述方法製備的非融合hbFGF作為主要成分，與藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑，以及其他輔助成分混合，製成適於臨床治療應用的藥物組合物。可以按照醫藥工業領域已知的方法將本發明的藥物組合物配製成可供靜脈內、肌肉內、腹腔內、腦脊髓腔內注射的注射液。
特別是在使用本發明的非hbFGF作為基本活性成分的情況下，可以使用選自聚乙二醇、羧甲基纖維素、硫酸多糖、肝素、多聚賴氨酸等高分子化合物，以及可與hbFGF分子中的半胱氨酸形成二硫鍵的穀胱苷肽作為穩定劑，用以防止hbFGF分子在溶液中或病人血流中被迅速降解，或在儲存期間發生分子多聚化而減少或喪失其生物學活性。
最後還應指出的是，根據使用目的的不同，本發明的藥物組合物中除含有作為主要成分的非融合hbFGF外，還可含有其他相關的生物學活性蛋白質，例如表皮因子(EGF)、神經生長因子(NGF)及腦衍生的神經生長因子(BDNF)，這些活性因子可與hbFGF協同作用，提高本發明藥物組合物的治療效果。
以下通過具體實施例和
對本發明作進一步的詳細說明。
附件顯示非融合hbFGF基因序列及胺基酸序列圖1顯示重組表達載體pET-JN的構建。
圖2顯示重組表達載體pET-JN的酶切鑑定瓊脂糖電泳圖。標記如下MDNA分子量標記之λ/Hind III；M*DNA分子量標記之φ174/Hae III；C對照，未酶切的pET-JN表達質粒；Lanel-10pET-JN表達質粒的BemH I+Nde I酶切圖3、圖4顯示在還原條件下SDS-PAGE對pET-JN系列誘導表達hbFGF的情況分析。除pET-JN系列的七株菌株外，還以克隆了未修改過TIR的hbFGF基因的pET-Yb菌株同時誘導表達作為對照，進行表達情況分析。
標記說明如下M蛋白質標準分子量標記；1*/2*/3*/4*/5*/6*/7*誘導表達後pET-JN1/2/3/4/5/6/7的上清；1/2/3/4/5/6/7誘導表達後pET-JN1/2/3/4/5/6/7的沉澱；C*對照菌株pET-Yb誘發表達後的上清；C對照菌株pET-Yb誘發表達後的沉澱。圖5顯示在還原條件下SDS-PAGE對pET-JN1的大規模表達hbFGF的結果分析。標記說明如下Lanel破碎後沉澱；Lane2破碎後上清Lane3蛋白質標準分子量標記圖6顯示對hbFGF的離子交換層析(步驟1，脈衝梯度洗脫方式)。平衡液0.1mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液0.3mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)和0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
圖7顯示對hbFGF的親合層析(步驟2，脈衝梯度洗脫方式)。平衡液0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液1.2mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)和2.0mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
圖8顯示對hbFGF的凝膠層析(步驟3，等度洗脫方式)。洗脫液0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。
圖9顯示使用純化後的hbFGF-與人抗hbFGF單克隆抗體所作Western-blotting分析的結果。標識說明如下C對照，hbFGF標準品Lane1、2待檢測的非融合hbFGF。
圖10顯示hbFGF生物活性檢測曲線圖。其中數字標識為1表示4-1，2表示4-2，......，7表示4-7，以此類推。
具體實施例方式
以下提供具體實施例並參照附圖進一步深入描述本發明，這些實施例並不以任何方式限定本發明待批權利要求所要求的保護的範圍。
實施例1TIR區域修改的hbFGF基因的製備設計上遊引物如下F1GAA GCT GCT AGT ATT ACG ACA CTG CCG GCT CTG CCG GAA GAT GGTGGT AGC GGT GCTF2GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACG ACG CTG CCG GCC CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCAF3GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACT ACA CTG CCG GCC CTG CCG GAA GAT GGTGTT AGC GGT GCGF4GAA GCT GCT GGT AGT ATT ACT ACG CTG CCG GCT CTG CCG GAA GAT GGTGGT AGT GGT GCG
F5GAA
GCT GCT GGT AGC ATT ACA ACT CTG CCG GCA CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCCF6GAA
GCT GCT GGT AGT ATT ACA ACT CTG CCG GCA CTG CCG GAA GATGGT GGT AGT GGT GCAF7GAA
GCT GCT GGT AGC ATT ACG ACC CTG CCG GCG CTG CCG GAA GATGGT GAT AGT GGT GCT設計下遊引物如下RGACA
TTA TCA GCT CTT AGC AGA CAT TGG方框內的鹼基序列為酶切位點。
以F1和R，F2和R，......F7和R組合分別進行PCR擴增。
將合成的PCR引物作適當稀釋。在潔淨的Eppendof管中加入以下成分
充分混勻後，按以下反應程序進行PCR擴增95℃，4min→[95℃，30」→52℃，30」→72℃，45」]×30→72℃，10min，然後冷卻至室溫。PCR反應結束後，瓊脂糖電泳檢測擴增PCR產物，在紫外燈下切膠回收PCR產物，用QG-PCR產物純化試劑盒(Qiagen公司出品)純化，純化後的PCR產物，用Bgl II和Nde I酶切後電泳，再次用QG試劑盒純化。取少量酶切後的純化產物電泳進行定量，-20℃保存備用。
實施例2pET-JN的構建及重組子的酶切將經酶切、純化後的載體質粒DNA pET-3c/Nde I /BamH I和hbFGF/Nde I /Bgl II的DNA片段按照常規方法，在16℃的恆溫水浴鍋中連接30min，連接反應終了時，轉化DH5α感受態細胞，取100μL轉化液塗AMP抗性LB平板，37℃恆溫箱中培養12-16h。構建過程見圖1分別用無菌牙籤挑取每個抗性平板上生長的菌落3-5個，分別接種到加有100μg/mLAMP的5mL液體LB培養基的試管中，37℃、200rpm/min振蕩培養12-16h後，用鹼法小量抽提質粒法，抽提質粒作BamH I+Nde I雙酶切酶切，電泳鑑定，選出重組子。
從圖中可以看出，重組質粒雙酶切均產生一約440bp的小片段，說明7個hbFGF的基因均已經克隆到pET-3c載體質粒上，將篩選出的重組子命名為pET-JN.則由7對引物分別PCR擴增構建的重組子分別稱為pET-JN1、pET-JN2，...，pET-JN7。見圖2實施例3非融合hbFGF蛋白質的表達分析將含有經過酶切鑑定的重組質粒pET-JN系列的DH5α細胞在含100μg/ml AMP的5mL LB液體培養基中擴增，按鹼法小量方法抽提質粒，轉化BL21(DE3)pLysS細胞，塗布於含有100μg/mlAMP和氯黴素(Chloromycetin，下稱CHL)雙抗的LB培養平皿上培養，於37℃下培養過夜。挑取陽性菌落並接種於加入100μg/ml AMP和100μg/ml CHL的50ml LB試管中作表達試驗，37℃培養至OD600為0.8，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導4小時。
為分析所得的菌株表達非融合hbFGF的更詳細情況，將得到的有表達的菌株進一步擴大培養、誘導後，收集菌體，於8倍的破碎緩衝液中超聲波破碎，離心，取上清和沉澱，分別進行還原型SDS-PAGE電泳，分析其產物表達情況。試驗結果見圖3。
對表達的7株菌株，進一步送測序公司測序(以T7啟動子序列作為測序引物)，測序結果與預期構建的結果一致，推測出的胺基酸序列與天然的一致。
實施例4非融合hbFGF蛋白的大規模培養和純化取pET-JN1工程菌株，進一步於10L的發酵罐中擴大培養，收集如此得到的培養液，於4℃以8000-15000rpm離心收穫細胞。按10ml/g溼重的量向收穫的細胞中加入菌體裂解緩衝液(每升含0.1M NaCl、10mM EDTA和20mM PB，pH7.0)，使用超聲波破碎儀或高壓勻漿儀裂解細胞。4℃下，8000-18500rpm離心30min，收集上清液，進行SDS-PAGE蛋白電泳，試驗結果見圖4、圖5。
將所得上清液分別進行如下層析離子交換層析採用脈衝梯度洗脫方式；平衡液0.1mol/LNaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液0.3mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。再進行親合層析採用脈衝梯度洗脫方式，平衡液0.6mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)；洗脫液1.2mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)2.0mol/L NaCl+0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。最後進行凝膠層析採用等度洗脫方式，洗脫液0.02mol/L PBS(pH＝7.0)。以上配製的層析用溶液均於4℃保存。結果分別見圖6、圖7、圖8。
實施例5非融合hbFGF的免疫印跡檢測和體外生物活性檢測。
為了證實如此純化的非融合hbFGF蛋白的均質性，對洗脫物樣品Western-blot印跡分析。按前述方法製備分離膠，在非還原條件下以10mA恆定電流電泳3小時，電泳後以大約8mA/cm2的穩定電流將電泳分離的樣品電轉移到硝酸纖維素膜上並用封閉緩衝液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween 20+1％BSA)處理30分鐘，然後加入溶於漂洗緩衝液的鼠抗hbFGF單克隆抗體(由Promega生產)，37℃下反應2小時。用漂洗液(10mM PBS(pH7.4)+0.5％Tween20)洗3次後(10分鐘/次)後，再加入溶於封閉緩衝液中，再用過氧化物酶偶聯的抗鼠IgG(由Promega生產)37℃下保溫2小時。保溫後將濾膜用漂洗液洗3次(10分鐘/次)。然後加入緩衝液(0.1M PBC(pH60)+1mg DAB+10ul H2O)，直到顯現出清晰的條帶後加入50mM EDTA終止反應。
免疫印跡試驗結果見圖9。
採用本領域技術人員已知的MIT法對hbFGF進行測活。取傳代3T3細胞，用含10％小牛血清的DMEM培養基按5×104個細胞/mL的密度稀釋3T3細胞，分別加入到兩塊96孔細胞培養板中，每孔100μL，培養24h，更換含1％小牛血清的DMEM培養基(維持培養基)繼續飢餓培養24h。然後在兩塊板的第一行分別加入含有bFGF參比品的維持培養基，調節bFGF的濃度至終濃度400ng/mL，之後的各行，分別用維持培養基倍比稀釋，同時取不含細胞的維持培養基和含有細胞但不含bFGF的維持培養基作空白對照，繼續培養48h後，每孔加入濃度為1mg/mL的MTT50μL，與細胞結合4～5h後，吸出含MTT的培養基，每孔加入100μL酸性異丙醇，振蕩10～20min，570nm與630nm雙波長測定吸光值，並以不含細胞的空白維持培養基的吸光值為零，繪製相關曲線，確定bFGF生物學活性。計算公式如下， 根據公式計算比活1.09×106AU/mg；得出ED50＝0.92ng/ml。
活性檢測結果見圖9。
實施例6非融合hbFGF在製備預防、治療局灶性腦缺血藥物中的應用
1、材料和方法1.1實驗動物與分組選用正常成年SD大鼠70隻，體重300-400g，雌雄不拘，隨機分7組腦缺血3小時後再灌流或同時給予hbFGF低、中、高劑量各一組、生理鹽水組、假手術組和正常對照組，每組10隻。
1.2大鼠腦缺血及再灌流模型製作 採用Nagasawa’s法加以改良。分離、暴露左側頸總動脈，結紮之，並分離結紮左側頸外動脈根部，分離左側頸內動脈，分離結紮翼顎動脈，於左側頸總動脈距末端約2mm處剪一小口，將一單股尼龍細絲插入頸總動脈，經分叉部進到頸內動脈，繼續沿頸內動脈輕輕推送入顱腔，插入深度共約22～25.0mm，缺血達3小時時撒出細絲即行再灌流，hbFGF組和生理鹽水組即在再灌流同時股靜脈滴注hbFGF和生理鹽水，hbFGF低、中、高劑+生理鹽水組顯著減少，說明高、中、低劑量的hbFGF均能阻止腦梗塞範圍的擴大，且中劑量組較低劑量組的腦梗塞體積百分數明顯減少，而高中劑量組之間、高低劑量組之間無明顯差異。說明hbFGF在中劑量(50ug/kg體重)以下，存在劑量-效應相關關係，即隨著hbFGF劑量由5ug-＞50ug/kg體重逐漸增加，腦梗塞體積百分數逐漸減少。而再加大劑量，如hbFGF250ug/kg體重，其效應與50ug/kg體重沒有明顯差異，即當hbFGF濃度增加到一定量時，再加大hbFGF劑量就不再出現效應增加。結果顯示實驗中選擇的三個劑量，hbFGF50ug/kg體重功效最佳。
實施例7非融合hbFGF在製備治療外周神經損傷藥物中的應用1、材料入選對象340例患者，男190例，女150例，年齡4個月至76歲，病因以跌傷、擊傷、墜傷、車禍為主；同時選擇年齡、病情相近的300例為對照。
2、治療方法(1)採用直流電導入法即導入部位為損傷神經的體表投影部位，hbFGF用量為4ug/ml至10ug/ml，共5ml，均勻撒布在100-200cm2的正極電極墊濾紙或紗布上，陰極置於對側，電流6-15mA，每日一次，30天為一療程，對照組則給予溫熱療法和各種低、中、高頻電療等物理治療。二組治療前後均進行運動神經傳導速度(縮寫為MNCV)的檢測。
(2)周圍神經損傷導致的肌肉萎縮患者可在肌萎縮部位多點注射。
3、治療效果如下表
4、結論hbFGF直流電導入或肌萎縮處多點注射法治療周圍神經損傷引起的活動功能障礙，感覺異常等有明顯療效。
實施例8非融合hbFGF在製備治療神經藥物中的應用1、材料入選對象280例神經性耳聾患者，其中男性152例，女性128例，年齡最小10個月，最大64歲，病程1年內為28例，1-10年為190例，11年以上為62例，病因多為藥物中毒、腦膜炎、外傷和突聾等造成。聽力損失多在70-95分貝。
2、治療方法hbFGF配製成4ug/ml，聽宮、聽會等穴位注射，每日一次，4周為一個療程。
3、療效評定痊癒聽力恢復到25分貝以內，頭痛消失，耳鳴消失；顯效聽力提高30分貝；有效聽力提高15分貝無效聽力未提高，耳鳴頭痛未消失。
4、治療結果見下表
典型病例王某，男，7歲，三歲因高燒用鏈黴素導致耳聾，左耳聽力損失在95分貝，由於極重聾，患兒不會說話，經用hbFGF穴位注射，二個療程聽力提高40分貝，正常談話的聲音已能聽見，現說話基本正常。
一來自四川的一歲半男孩，因應用慶大黴素致聾，腦幹誘發電位檢查為右耳110dB，左耳全聾，經hbFGF聽宮、聽會等穴位注射，每日一次，每次4ug/1ml，，一個療程後，聽力提高為雙耳70dB，配助聽器可學習說話。
5、結論從實驗結果可以分析得到，hbFGF具有修復內耳毛細胞和聽神經的既成病變的功能。
hbFGF SEQUENCE LISTING110 Jinan University120 nonfusion hbFGF160
170 Patentln version 3.2210 1211 468212 DNA213 Unknown220
223 The translation initiation region of human basic fibroblastgrowth factor was mutated220
221 CDS222 (1)..(468)220
221 misc_feature222 (15，54)223 Y＝T or C220
221 misc_feature222 (21，24，33，60)223 n is a，c，g，or t400 1atg gct gct ggt agy att acn acn ctg ccg gcn ctg ccg gaa gat ggt48Met Ala Ala Gly Xaa Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15ggt agy ggt gcn ttc ccg ccg ggc cac ttc aag gac ccc aag cgg ctg96Gly Xaa Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30tac tgc aag aac ggg ggc ttc ttc ctg cgc atc cac ccc gac ggc cga 144Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45gtg gac ggg gtc cgc gag aag agc gac cca cac atc aaa cta caa ctt 192Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60caa gca gaa gag aga ggg gtt gtg tct atc aaa gga gtg tgt gca aac 240Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn65 70 75 80
cgt tac ctt gct atg aaa gaa gat gga aga tta cta gct tct aaa tgt 288Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95gtt aca gac gag tgt ttc ttt ttt gaa cga ttg gag tct aat aac tac 336Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110aat act tac cgg tca agg aaa tac acc agt tgg tat gtg gca ctg aaa 384Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125cga act ggg cag tat aaa ctt gga tcc aaa aca gga cct ggg cag aaa 432Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140gct aga ctt ttt ctt cca atg tct gct aag agc tga 468Ala Arg Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 155210 2211 155212 PRT213 Unknown220
221 misc_feature222 (5，18)223 The』Xaa』at location 5 stands for Ser.
220
223 The translation initiation region of human basic fibroblastgrowth factor was mutated400 2Met Ala Ala Gly Xaa Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly1 5 10 15Gly Xaa Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu20 25 30Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg35 40 45Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu50 55 60Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys85 90 95Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr100 105 110Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys115 120 125Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys130 135 140Ala Arg Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser145 150 15權利要求
1.一種非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子的基因，其特徵是其5』端的前60個鹼基序列為ATG GCT GCT GGT AGY ATT ACN ACN CTG CCG GCN CTG CCG GAA GATGGT GGT AGY GGT GCN，其中Y＝T或C，N＝A或T或C或G。
2.一種質粒載體，其特徵是含有如權利要求1所述的基因。
3.如權利要求2所述的質粒載體，其特徵是以pET-3c載體為基礎構建的。
4.一種原核表達系統，其特徵是含有如權2或3所述的載體。
5.如權利要求4所述的原核表達系統，其特徵在於是由大腸桿菌表達系統。
6.如權利要求5所述的原核表達系統，其特徵在於所述的大腸桿菌為BL21(DF3)plysS。
7.一種非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子，其特徵是由權利要求4或5或6所述的原核表達系統翻譯表達產生的。
8.製備如權利要求7所述重組人鹼性成纖維細胞生長因子的方法，其步驟為(1)設計合適的PCR引物，通過PCR擴增，得到修改過的編碼具有非融合人鹼性成纖維細胞生長因子的DNA序列；(2)將經過修改的DNA序列與適當的克隆表達載體相連接，得到重組表達載體；(3)用所說的重組表達載體轉化適當的原核宿主細胞並篩選所得到的被轉化的重組工程菌株；(4)在適於表達所說的具有成纖維細胞生長因子活性之多肽的條件下發酵培養所說的被轉化的工程菌，收集菌體，破碎離心，分別從離心的上清和沉澱產物中分離並純化所說的多肽；(5)純化的步驟依次為離子交換層析-親合層析-凝膠層析，產物純度達到98％以上。
9.權利要求7所述的非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子在製備治療神經系統疾病的藥物中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特徵在於神經系統疾病為外周神經損傷、急性缺血性腦中風或神經性耳聾的。
全文摘要
本發明屬於基因工程應用領域。本發明涉及一種非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子的基因，該基因的翻譯起始區經過修改後有較高的密碼子偏好性和較低的G+C含量。本發明還提供含有該基因的載體和原核表達系統。該基因在本發明提供的原核表達系統中有較高的表達效率。本發明還涉及一種非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子。本發明還涉及該非融合重組人鹼性成纖維細胞生長因子在製備治療神經系統損傷等疾病的藥物中的應用。
文檔編號A61K38/18GK1513991SQ0310888
公開日2004年7月21日 申請日期2003年4月3日 優先權日2003年4月3日
發明者陳小佳, 孫奮勇, 林劍, 洪岸, 謝秋玲, 張玲, 汪炬, 李志英 申請人:暨南大學