用於治療腫瘤的二氟穀氨酸與葉酸類化合物和抗葉酸劑的結合物的製作方法

2023-12-12 16:38:42

專利名稱：用於治療腫瘤的二氟穀氨酸與葉酸類化合物和抗葉酸劑的結合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及二氟穀氨酸與葉酸類化合物和抗葉酸劑的新的結合物，這些結合物在治療腫瘤方面的應用，以及用於上述結合物製備過程的中間體。
通過葉醯聚穀氨酸合成酶(folylpolyglutamate synthetase)的作用，葉酸類藥物和經典的抗葉酸劑(如MTX1)在細胞內轉變成聚(γ-穀氨醯)代謝物，
由於現在已知葉醯聚穀氨酸(folylpolyglutamates)對於葉酸代謝的正常運行是必需的，並且知道抗葉醯聚穀氨酸(antifolylpolyglutamates)與經典的抗葉酸劑(如MTX)的細胞毒性作用有連帶關係，因此葉醯聚穀氨酸合成酶已成為研究葉酸生物化學和生化藥理學的重要的酶。在這方面，已經廣泛研究了該種酶對蝶醯和L-穀氨酸酶底物的特異性。對於蝶醯酶底物，其雜環部分的結構可以明顯地不同，但是現在所有的報告均表明，末端的L-穀氨酸殘基對於酶底物活性是絕對需要的。引入的胺基酸的特異性是嚴格的，但不是絕對的。L-高磺基丙氨酸和D，L-疊同-或D，L-對映-4-氟穀氨酸都可以用作有效的代用酶底物，但是在每種情況下其摻入均會引起鏈終止。由4-氟穀氨酸非對映體所引起的鏈終止證明，在γ-穀氨醯基受體位點對L-穀氨酸具有嚴格的特異性。
應用〔3H〕Glu和氨甲蝶呤(4-NH2-10-CH3Pte-Glu)或四氫葉酸作底物時，F2Glu是聚(γ-穀氨醯化作用)(Poly(γ-glutamylation))的強有力的濃度依賴性抑制劑。申請人已經檢測了F2Glu作為可替代之底物的作用，但是與以前所特徵化的可替代之底物4-氟穀氨酸(McGuire和Coward，J.Biol.Chem.2606747(1985))相反，F2Glu並不終止聚穀氨酸鏈延長反應。換句話說，即F2Glu可促進鏈延長。因此，當與Glu存在下進行的同一反應進行比較時，在F2Glu存在下能夠以明顯高的速度從含有1個和2個附加胺基酸殘基的〔3H〕氨甲蝶呤得到合成產物，而對於多含2個殘基的產物來講，這種效果尤為明顯。增加加入的速度不只是起到連接F2Glu到內部Glu上或到以前摻入之F2Glu上的功能，因為連接Glu到4-NH2-10-CH3PtGlu-γ-(3，3-二氟穀氨酸)上的作用也增加了。上述結果與F2Glu在引入胺基酸(穀氨酸類似物)或在γ-穀氨醯基受體水平上增加聚(γ-穀氨酸)代謝產物的合成是一致的。因此，F2Glu是第一個穀氨酸類似物，它可增加由葉醯聚穀氨酸合成酶所催化的鏈延長。
應用化合物3，3-二氟穀氨酸(F2Glu)與某些葉酸類化合物和抗葉酸劑製備式1的結合物及其藥學上適用的鹽，
其中R1為-NH2、H或-CH3;
R2為-NH2或-OH;
R3為H、(C1～C4)烷基、烯丙基或炔丙基，並且X、Y和Z各自獨立地為氮原子或CH基團。
結構式1的結合物可用於治療腫瘤和牛皮癬。此外，化合物F2Glu和某些PABA-F2Glu化合物是用於製備式1化合物的中間體。
本發明化合物的二氟穀氨酸部分具有一個手性中心，因此本發明化合物存在立體化學異構體對。雖然相當於L-穀氨酸天然構型的對映體是較好的，但是申請人意圖是各別異構體和包括外消旋混合物在內的各個異構體混合物均包括在本發明的範圍內。除非另有說明，否則本申請的化合物是2個立體異構體的混合物。此外，其中Z為CH基團，R3不是氫的上述式1化合物有第2個手性位點。以第2個手性位置為基礎的立體化學構型不是很嚴格的，並且申請人再次指出，分離的異構體及其混合物均包括在本發明的範圍內。就上述第2個手性位點來說，異構體的外消旋混合物是較好的。
式1化合物含有2個羧酸部分，因此能形成1個或2個鹼或鹽。具體地說，這些鹽包括鹼金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽;鹼土金屬鹽，例如鈣鹽和鎂鹽，包括鋁在內的ⅢA族輕金屬鹽;有機伯胺、仲胺和叔胺鹽，例如包括三乙胺在內的三烷基胺，普魯卡因、二苄胺、1-乙胺、N，N′-二苄基乙二胺、二氫樅胺、N-(低級)烷基哌啶以及其他合適的胺鹽。其中優選的是鈉鹽。
式1化合物還可以與任一無毒的有機或無機酸一起形成藥學上適用的酸加成鹽。可形成合適鹽的具體的無機酸有鹽酸、氫溴酸、硫酸和磷酸，以及酸式金屬鹽，如磷酸一氫鈉和硫酸氫鉀。可以形成合適鹽的具體的有機酸有一、二和三羧酸。這樣的羧酸其實例有乙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸(如甲磺酸和2-羥基乙磺酸)。優選的是鹽酸鹽。
式1化合物可以從式2的葉酸或抗葉酸衍生物-其中R1、R2、R3、X、Y和Z定義同上述式Ⅰ化合物，與被合適保護的F2Glu的衍生物-如式3的叔丁基酯衍生物，F2Glu(OtBu)2，
反應，然後由其反應產物上除去保護基團而製得。
式2化合物與式3的受保護之F2Glu衍生物的偶聯可按照由胺和羧酸製備醯胺任何適當方法來實現。本申請人已使用磷醯氰酸二乙酯((EtO)2P(＝O)CN)實現了式2與式3化合物的偶聯。該反應按下法進行將合適的式2化合物的溶液慢慢地滴加到((EtO)2P(＝O)CN)和酸消除劑(如吡啶，或最好為三乙胺)的溶液中。使生成的混合物於0°～60℃(最好於室溫)下約反應1～10小時，最好反應2～5小時，直至式2化合物充分地與磷醯氰酸酯反應為止。然後向該混合物中加入F2Glu(OtBu)2溶液，使產生的反應於0°～60℃(最好於室溫)下進行約24～100小時，一般為約72小時。例如可通過蒸發溶劑，用水洗滌並乾燥等方法分離粗產物。然後用純的三氟乙酸處理粗產物，以便脫去叔丁基酯保護基。分離出所需的式1化合物，並進行純化，例如可用柱層析法純化。適用於上述偶聯反應的溶劑包括各種反應物在其中均可溶並且對反應無幹擾的任何溶劑，例如二甲基甲醯胺(DMF)是較好的。
其中Z為氮原子的式1化合物可以由另一方法製備，該方法包括使式4的使對氨基苯甲酸(PABA)衍生物-其中，R3與在上述式1化合物中的定義相同，與式3化合物(F2Glu(OtBu)2)反應，得到式5中間體化合物，
-其中，R3與在上述式1化合物中的定義相同。該偶聯反應可以按任一合適的方式進行，例如可以按McGuire等(Cancer Research 1989，49，4517～4525);Galican等(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1985，82，2598～2602);Piper和Montgomery(J.Org.Chem.，42(2)，208～211(1977));Taylor等(J.Med.Chem.28，913～921(1985));Taylor等(J.Med.Chem.28，1517～1522(1985));Jones等(J.Med.Chem.32，847～852(1989))所述的方法進行。
然後將式5中間體與式6的溴甲基衍生物縮合，得到叔丁氧基保護的化合物，例如用三氟乙酸水解，除去叔丁氧基保護基，即得到所需的式1化合物。
-其中R1、R2、X和Y與在上述式1化合物中的定義相同。該反應可以按下法進行使式5和式6化合物的混合物與二甲基乙醯胺(Me2NAc)於25°～80℃，最好在50～55℃下反應2～12小時，最好約4小時，然後將反應混合物於室溫下靜置6～24小時，最好為約12小時。再在減壓下除去Me2NAC，將粗產物置於冰浴中，並用三氟乙酸處理，在加入完成之後使混合物升溫至室溫。靜置1～6小時(一般為約4小時)之後，減壓下除去TFA，得到所需的式1的粗產物。該產物可以經層析法(DEAE-纖維素柱，用NH4HCO3梯度洗脫)純化。該縮合反應更詳細的敘述見前面所提到的參考文獻。
對具體保護基的選擇和應用是本技術領域內一般專業人員所熟知的。一般來講，應該選擇在接著進行的合成步驟中能充分保護所述氨基或羥基，並且在不引起所需產物降解的條件下容易脫去的保護基。合適的羥基保護基其實例有C1～C6烷基、四氫吡喃基、甲氧基甲基、甲氧基乙氧基-甲基、叔丁基、苯甲醯基和三苯基甲基。術語C1～C6烷基是指有1～6個碳原子的直鏈、支鏈或環狀結構的飽和烴基。苯甲醯化的衍生物可以在吡啶存在下由未被保護的化合物與苯甲醯氯反應生成。合適的氨基保護基的實例有苯甲醯基、甲醯基、乙醯基、三氟乙醯基、鄰苯二甲醯基、甲苯磺醯基、苯磺醯基、苄氧基羰基、取代的苄氧基羰基(例如對-氯、對-溴、對-硝基、對-甲氧基、鄰-氯、2，4-二氯和2，6-二氯衍生物)、叔丁氧基羰基(BOC)、叔戊氧基羰基、異丙氧基羰基、2-(對-聯苯基)-異丙氧基羰基、烯丙氧基羰基、環戊氧基羰基、環己氧基羰基、金剛烷氧基羰基、苯基硫代羰基和三苯基甲基。較好的氨基被保護的化合物包括苯甲醯基衍生物和乙醯基衍生物，它們可以分別由未被保護的化合物與苯甲醯氯反應或者未被保護的化合物與乙酸酐反應而製得。
本發明提供了治療患有腫瘤性疾病患者的方法，該方法包括給患者使用治療上抗腫瘤有效劑量的式1化合物。通過給患有腫瘤性疾病的患者使用治療上抗腫瘤有效劑量的式1化合物，可以得到抗腫瘤的效果。術語「患者」是指溫血動物，例如包括人的靈長目、羊、馬、牛、豬、狗、貓、大白鼠和小白鼠。
這裡所用的術語「腫瘤性疾病」是指異常的狀態或疾病，其特徵在於迅速增殖性細胞生長或腫瘤生成。根據本領域的技術人員熟知的一般實驗室實驗技術和方法，以及根據與已知的有效化合物進行對比的結果證明，式1化合物可用於治療患有通常是用或者可以用葉酸類藥物或抗葉酸劑(如氨甲蝶呤、氨蝶呤、5，10-二脫氮雜葉酸(5，10-dideazafolate)和甲醯四氫葉酸)治療之腫瘤的患者。上述腫瘤性疾病包括但不限於急性成淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、急性成髓細胞白血病和慢性髓細胞白血病;包括但不限於子宮頸癌、食管癌、胃癌、小腸癌、結腸癌和腫癌;包括但不限於骨細胞肉瘤、骨肉瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、血管瘤、血管肉瘤;無黑色素的黑素瘤和黑變病的黑素瘤;混合型的腫瘤，如淋巴系統癌肉瘤、濾泡網狀組織癌肉瘤、細胞肉瘤和何杰全氏疾病。當然，熟悉本技術領域的技術人員懂得，不是每個式1化合物對上述各種腫瘤都會有效，並且懂得，選擇最合適的化合物是屬於本技術領域技術人員能力範圍之內的事，並且可以根據包括在普通動物腫瘤模型上得到的結果在內的各種因素來選擇最合適的式1化合物。一般來講，目前用葉酸類藥物和抗葉酸劑治療的上述腫瘤性疾病均可用式1化合物進行治療。與未結合的葉酸類藥物或抗葉酸劑相比較，本發明的化合物預計將是更有效的，並且是更具有選擇性的。本發明化合物所增加的效果據信是由於這些化合物具有促進穀氨醯鏈延長的作用，從而可致使毒性葉酸和抗葉酸劑在細胞內的聚集。
術語「抗腫瘤有效的」和術語「治療腫瘤性疾病」是指控制腫瘤生長或增殖的效果，或者是指能延長患者的存活時間而超過不經該治療所能達到的預計存活時間。通過減慢、中斷、阻止或終止腫瘤的生長、增殖或轉移來控制腫瘤的生長和增生。因此術語「治療腫瘤性疾病」不一定表示腫瘤疾病全部消除。可以認為，延長患者的存活時間超過本來或自身所能夠達到的顯著有益的效果，也表示控制了該腫瘤疾病。
為了有效地治療患有上述腫瘤性疾病的患者，可在治療腫瘤性疾病的有效劑量下以生物可利用的任一方式服用式1化合物，包括口服和經胃腸道外途徑給藥。例如，式1化合物可以口服、局部給藥、皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、經皮膚給藥、鼻內給藥、直腸給藥等。通常優先選用口服給藥。根據所選用的化合物的具體特性、需治療的疾病、疾病的嚴重程度及其他有關的情況，本技術領域的專業人員可以很容易地選擇合適的給藥形式和方式。
這裡所用的術語「抗腫瘤治療上有效的劑量」是指抗腫瘤作用有效的式1化合物的量。作為本技術領域的專業人員，可應用已知技術並觀察在相同情況下所得到的結果，診斷醫生可以容易地確定抗腫瘤治療上有效的劑量。在確定抗腫瘤治療上有效的劑量中，主治的診斷醫生要考慮許多因素，這些因素包括但不限於哺乳動物的種類、其大小、年齡、一般健康情況、所患的特定疾病、疾病的嚴重程度和併發症、患者的個體反應性、所服用的具體化合物、給藥方式、所用製劑的生物可利用性、所選用的劑量、伴隨應用的藥物以及其他有關的情況。
式1化合物抗腫瘤治療上有效的劑量可預計在每天每公斤體重0.1毫克(mg/kg/天)～每天每公斤體重500毫克的範圍內變化。優選的劑量可預計在1～20mg/kg/天範圍內變化。上述範圍尤其與口服的有效劑量有關，但也與非胃腸道途徑給藥範圍有關。每天給藥1～4次，通常每次給予之活性化合物的劑量為5mg～100mg。
已將氨甲蝶呤和其他的葉酸類化合物及抗葉酸劑用於治療牛皮癬和以增加表皮細胞增殖速度為特徵的疾病。具有相同作用機理的式1化合物可望是治療牛皮癬有價值的新藥劑。抗牛皮癬的劑量與抗腫瘤的劑量是相同的，但式1化合物用於治療牛皮癬時最好是局部應用。
本發明的化合物可以單獨使用，也可以與藥用載體或賦形劑一起配成藥用組合物使用，所選用的載體或賦形劑的比例和性質可以根據所選用的化合物的溶解度和化學性質、選擇的給藥途徑以及一般的制醫經驗而定。雖然式1化合物本身是有效的，但為了提高其穩定性、便於結晶、增加溶解度等目的，可以將式1化合物以其藥學上適用的酸加成鹽的形式配製並給藥。
可以將式1化合物配製在組合物中，該組合物包含可檢測量的式1化合物，並將其與一種或多種惰性載體一起混合。所述組合物例如可用作為檢測標準品，整裝運輸的方便形式，或作為藥用組合物。式1化合物的可檢測量是指可以由本領域的專業人員用熟知的一般檢測方法和技術容易地測定出量。式1化合物的可檢測量通常可以為組合物重量的0.001%～75%。惰性載體可以是不降解，或不與式1化合物共價反應的任何物質。適用的惰性載體其實例包括水、含水緩衝液，如通常用於高效液相層析(HPLC)分析的含水緩衝液、有機溶劑如乙腈、乙酸乙酯、己烷等，以及藥學上適用的載體或賦形劑。可用本技術領域熟知的技術和方法，將式1化合物與惰性載體混合而製得這些組合物。
更具體地說，可以將式1化合物配製成藥用組合物，該組合物包括抗腫瘤治療上有效劑量的式1化合物，式1化合物與一種或多種藥用載體或賦形劑組成混合物，或式1化合物與一種或多種藥用載體或賦形劑結合。
可以按藥學領域已知的方法製備藥用組合物。載體或賦形劑可以是固體、半固體或液體物質，它們可以用作為有效成分的運載物或介質。合適的載體或賦形劑是本技術領域中已知的。藥用組合物可適於經口服或非胃腸道途徑給藥，並且可以以片劑、膠囊劑、栓劑、溶液劑、懸浮劑等形式給患者使用。
式1化合物可以口服給藥，例如可以與惰性稀釋劑或與可食的載體一起服用。可以將它們封在明膠膠囊中，或者壓製成片劑。為了口服給藥，可以將本發明的化合物與賦形劑一起混合，並且以片劑、錠劑、膠囊劑、馳劑、懸浮劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、口香糖劑等形式應用。上述製劑應該含有至少4%本發明化合物(作為活性成分)，但是可以根據具體的形式有所變化，並且活性成分通常可以佔組合物重量的4～70%。存在於組合物中的本發明化合物的量應達到合適的劑量。根據本發明的組合物和製劑，最好每一口服單位劑量含有5.0～300mg本發明的化合物。
片劑、小丸劑、膠囊劑、錠劑等還可以含有一種或多種下述的輔助劑粘合劑，如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠;賦形劑，如澱粉或乳糖;崩解劑，如藻酸、Primogel、玉米澱粉等;潤滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotex;助流劑，如膠體二氧化矽;並且可以加入甜味劑，如蔗糖或糖精，或矯味劑如薄荷，水楊酸甲酯或矯味橙汁。當劑量單位形式為膠囊劑時，除含有以上類型的物質之外還可以含有液體載體，如聚乙二醇或脂肪油。其他劑量單位形式可以含有改變該劑量單位之物理形式的其他各種物質，例如包衣材料。因此，片劑和小丸劑可以用糖、紫膠或其他腸包衣劑進行包衣。糖漿劑除含有本發明化合物之外還可以含有蔗糖作為甜味劑，以及某些防腐劑、染料、著色劑和調味劑。用於製備上述各種組合物的物質應該是藥學上純的，並且在所用量的範圍內應是無毒的。
為了經非胃腸道途徑給藥，可以將式1化合物加到溶液或懸浮液中。這些製劑應該含有至少0.1%的式1化合物，但是其重量可以在0.1～50%之間變化。存在於上述組合物中之本發明化合物的量應能達到合適的劑量。製備優選的根據本發明的組合物和製劑，以使經胃腸道外途徑給藥的劑量單位含有5.0～100mg本發明的化合物。
溶液劑或懸浮劑還可以包括一種或多種下述輔助劑無菌稀釋劑，如注射用水，鹽水溶液，固定的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑;抗菌劑，如苯甲醇或羥苯甲酸甲酯;抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑，如乙二胺四乙酸;緩衝劑，如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及調節體液滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。非胃腸道途徑給藥的製劑可以封裝在安瓿內，由玻璃或塑料製成的一次性注射管內或多倍劑量小瓶內。
具有特定的同類用途的任何一組結構上相關的化合物中，就其最終應用來說最好選用式1化合物的某些基團和構型。
申請人優先選用其中R1和R2各自為-NH2基團，X、Y和Z各自為氮原子，並且R3為甲基的式1化合物。申請人還優先用其中R1為-NH2基團，R2為OH基團，R3為氫，X和Z各自為CH基團，並且Y為氮原子的式1化合物。
實例1N-〔4-(〔(2，4-二氨基-6-蝶呤基)甲基〕甲氨基)-苯甲醯基〕-4，4-D-氟代穀氨酸將N-CH3PABA-F2Glu(OBu)2(0.201mmol)和2，4-二氨基蝶啶-6-溴甲基氫溴酸化物(75mg，0.223mmol)在Me2NAc(2.5ml)中的混合物於50～55℃攪拌4小時，然後在室溫下放置過夜。再在減壓下除去Me2NAc。將該粗製材料置於冰浴中，在攪拌下加入2ml三氟乙酸。10分鐘後，將反應混合物加溫至室溫並攪拌4小時。在減壓下除去三氟乙酸，得到粗產物。該粗產物經DEAE-纖維素層析純化，用NH4HCO3進行梯度(15～600mM)洗脫。含所需產物的柱流出物經冷凍乾燥，得到所需的純產物。
實例24-氨基-4-脫氧-10-甲基蝶醯〔D，L-疊(同)，對映-4，4-(二氟)穀氨酸〕(1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3)將2.5mlDMF，23μlEt3N(0.16mmol)和25μl(0.16mmol)磷醯氰酸二乙酯置於裝有乾燥管的15ml園底燒瓶中。然後加入二氨基蝶酸酯(1，R1，R2＝NH2;X，Y，Z＝N;R3＝CH3)(0.16mmol)，並在室溫下攪拌反應溶液。3小時後，加入另外的5μl(0.04mmol)磷醯氰酸二乙酯。將F2Glu(0.16mmol)溶於1mlDMF中，加到反應燒瓶內並在室溫下繼續攪拌72小時。真空下除去溶劑DMF，將殘餘物溶於35mlCHCl3中，並用1%NH4OH(2×20ml)洗滌以除去未反應的起始物質。有機層用20mlH2O洗滌，再經Na2SO4乾燥並在真空下蒸發，得到粗製的受保護基保護的產物。將該偶聯產物溶解於純淨的TFA(3ml)中並用TLC監測脫酯反應的進程。24小時後，用旋轉式蒸發儀除去溶劑TFA，並在真空下乾燥殘餘物。
將粗產物溶於20mlH2O中，用稀NH4OH調節PH至8。為了獲得足夠低的流速，在裝填DEAE-纖維素(Whatman DE-52)柱(30×1Cm)之前使樣品體積加到160ml。該柱用100ml水洗滌，用175ml 15mM NH4HCO3和175ml 500mM NH4HCO3進行線性梯度洗脫，得到所需的式1化合物。
實例3β，β-二氟穀氨酸雙-L-丁酯3a.2，2-二氟戊-4-烯醯胺將2，2-二氟戊-4-烯酸(27.2g，0.2mol)的己烷(200ml)溶液置於裝有回流冷凝器和氮氣進氣管的三頸燒瓶中，在攪拌下向其中加入DMF(20滴，催化劑)和草醯氯(20ml，0.23mol)。將混合物在室溫下攪拌2小時，此時不再看見氣體逸出。溶液在冰/鹽浴中冷卻，氮氣進氣管用空的CaCl2管代替(防止固體物質從燒瓶中被氣流衝出)，並向燒瓶中通入NH3氣。在開始的劇烈反應減緩後保持氣流30分鐘。然後將混合物倒入H2O(1l)和Et2O(0.5l)中。用H2O和Et2O洗滌玻璃儀器，並將洗滌液加入上述混合物中。加入硅藻土，並濾除不溶物。使水相和有機相分離。用鹽水將Et2O洗滌1次，經Na2So4乾燥並濃縮之。水相用CH2Cl2萃取2次。合併的萃取液用鹽水洗滌1次，經Na2So4乾燥，再與醚相殘餘物合併，並濃縮。殘餘物經蒸餾後得到標題醯胺化合物(20.6g，76%)，bp.100～110℃/10乇，為淡黃色油狀物，經冷卻後固化，mp.33～35℃。1HNMR(CDCl3)δ7.0～6.0(2H，br.d)，5.75(1H，ddt，J＝18，9，6Hz)，5.3(2H，m)，2.87(2H，dt，J＝6，17Hz)。19F NMR(δC6F6＝0)δ-56.0(t，J＝17Hz)。
元素分析，C5H7F2NO計算值C，44.45;H，5.22;N，10.37。實測值C，42.03;H，4.74;N，9.33。
3b.2，2-二氟戊-4-烯基腈將上述醯胺(3a)(20.6g，0.152mol)的無水吡啶(25ml，0.31mol)溶液置於冰/鹽浴中，在N2氣流下向其中滴加三氟乙酸酐(TFAA，23.5ml，0.166mol)，在1 1/2 小時內滴加完畢。反應混合物變成固體，並在室溫下放置4小時。然後將燒瓶裝成在N2氣流下的蒸餾裝置，並在油浴中加熱(最終為130℃)蒸餾。收集蒸餾液，得到17.7g無色油狀物，該油狀物在空氣中冒煙，bp.70～80℃/760乇。經NMR分析表明，蒸餾液的成分為腈∶TFAA∶吡啶＝80∶12∶8。因此腈的產率為0.116mol(76%)。1H NMR(CDCl3)6.0～5.5(1H，m)，5.4(2H，m)，2.93(2H，dt，J＝6，15Hz)。19F NMR(δC6F6＝0)δ-71.7(t，J＝15Hz)。
3c.4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺鹽酸鹽向鎂屑(5.47g，0.225mol)中加入1-丙烯基溴(27.22g，0.225mol)的THF(225ml)溶液，控制加入的速度，使混合物保持溫熱但不沸騰，製得溴化丙烯基鎂。加畢，將混合物攪拌20分鐘，然後用THF(300ml)稀釋並冷卻至-15℃。向該混合物中加入由實例3b製得的腈(0.116mmol)在THF(80ml)中的溶液，控制加入的速度，使反應混合物的溫度在-15＜T＜-10℃的範圍內。在該溫度範圍內將混合物再攪拌1小時，然後冷卻至-40℃。將NaBH4(6.4g，0.169mol)在MeOH(650ml)和水(30ml)中的冷卻溶液(-40℃)一次加入。除去冷卻浴並將混合物攪拌2小時，然後倒入6N HCl(800ml)中。經旋轉蒸發除去有機溶劑，將水溶液用CH2Cl2洗滌2次。然後用顆粒狀NaOH將溶液礆化至PH10(需要用冰冷卻)，並用NaCl飽和之。加入硅藻土，濾除析出的Mg(OH)2。固體殘餘物用CH2Cl2洗滌。濾液用CH2Cl2萃取3次，將萃取液和殘餘物洗滌液合併，經Na2So4乾燥，過濾，用Et2O/HCl酸化，經蒸發得到標題胺鹽化合物，其為淡黃色固體(3g)。這一步驟中不需要將該物質純化。
3d.N-(叔丁氧基羰基)-4，4-二氟辛-1，6-二烯-5-基胺將上述實例3c製得的粗製鹽(35g)溶於水(200ml)和二噁烷(200ml)中。加入固體KHCO3，得到對PH試紙呈中性的混合物，再向混合物中加入KHCO3(12g，0.12mol)和二叔丁基二碳酸酯(34g，0.156mol)。混合物在室溫下攪拌過夜，再用NaCl飽和。分離水相和有機相。水相用己烷萃取(x3)。萃取液和有機相合併，用水洗滌(x3)。合併的水洗滌液用己烷萃取1次。該萃取液和有機相合併，然後用鹽水洗滌，經Na2So4乾燥，濃縮，殘餘物經快速層析純化(用CH2Cl2/戊烷(1/1)洗脫)，得到標題化合物氨基甲酸酯(19g，65%)，Rf0.29，為油狀物，靜置後固化。1H NMR(CDCl3)δ6.0～5.5(2H，m);5.5～4.5(5H，m);2.67(2H，dt，J＝7，16Hz);1.73(3H，dd＊，J＝7，1Hz);1.47(9H，S)。19F NMR(δC6F6＝O)δ-53.2(m)。
3e.β，β-二氟穀氨酸鹽酸鹽向冰冷卻的KMnO4(52.56g，0.33mol)的水(1.2l)溶液中加入由實例3d製備的氨基甲酸酯(10.95g，0.042mol)的AcOH(160ml)溶液。混合物在室溫下攪拌過夜，在該期間析出棕色固體。加入固體焦性亞硫酸鈉使混合物脫色，隨後加入濃HCl，得到PH為2的溶液。該溶液用Et2O萃取(3×500ml)，然後用NaCl飽和，再用Et2O萃取2次。合併的有機相用鹽水洗滌1次並濃縮。殘餘物溶於1N HCl(500ml)中並濃縮。再次將殘餘物溶於1N HCl中，將混合物加溫，並加入活性炭。將混合物攪拌10分鐘，過濾並將濾液蒸發至幹。殘餘物用熱的異丙醇萃取，得到粗製的胺基酸(2.22g)再用EtOH進一步萃取異丙醇不溶的物質，沒有得到任何有用的物質。19F NMR(D2OδCF3CO2H＝O)δ+23(ddt，J＝280，S，21Hz)，+27(ddt，J＝280，22，9Hz);+28(t);積分比例5∶5∶3。
3f.β，β-二氟穀氨酸雙叔丁酯將由實例3e製得的粗製酸(2.22g)懸浮於叔乙酸叔丁酯(500ml)中，向混合物中加入HCl4(2.16ml70%的水溶液，25mmol)。混合物在室溫下攪拌48小時，然後用H2O萃取(2×200ml)。合併的萃取液用CH2cl洗滌(2×100ml)，再用4N NaoH礆化至PH10。該溶液用CH2cl2萃取(3×100ml)。合併的萃取液用鹽水洗滌，經Na2So4乾燥，並濃縮至其體積的 1/3 。該溶液不需作進一步處理即可用於下一步驟。蒸發比較徹底的樣品顯示出如下的核磁共振譜1H NMR(CDcl3)δ4.10(1H，t，J＝14Hz)，3.10(1H，t，J＝15Hz)，3.00(1H，t，J＝15Hz)，1.5(18H，2S);19F NMR(δC6F6＝0)δ-58.7(dt，J＝14，15Hz)。
實例4β，β-二氟穀氨酸鹽酸鹽向實例3之BOC-雙-酯(300mg，0.76mmol)的無水Et2O(10ml)溶液中加入飽和的Et2O/HCl(3ml)。混合物在室溫下攪拌6天(CaCl2管防護)。收集析出的白色固體並用Et2O洗滌。經TLC和NMR分析表明酯的裂解不完全。將該物質溶於1N HCl(5ml)中，並在室溫下攪拌過夜。反應仍不完全。加入幾滴濃HCl並將混合物攪拌3天。真空下除去水，殘餘物和ccl4一起經共沸蒸餾乾燥。加二異丙醚(x2)一起研磨，得到淡綠色粉末，收集並經P2O5乾燥，得到標題胺基酸化合物(175mg，100%)。1H NMR(D2O)分析表明，有溶劑的模糊信號。19F NMR(δ CF3CO2H＝0)δ+23(ddt，J＝280，5，21Hz)，+27(ddt，J＝280，22，9Hz)。MS(CI，NH3)m/e184(MH+，100%)，140(75%)，120(40%)，102(40%)。Rf(HoAc/H2O/BuOH 1/1/3)0.19。
元素分析，C5H7F2NO4·HCl計算值C，27.35;H，3.67;N，6.38。實測值C，28.13;H，3.58;N，6.52。
權利要求
1.下式化合物或其藥學上適用的鹽，
R2為-NH2或-OH，R3為H、(C1～C4)烷基、烯丙基或炔丙基，X、Y和Z各自獨立地為氮原子或CH基團。
2.權利要求1所述的化合物，其中R1和R2各自為-NH2基團，R3為甲基，並且X、Y和Z各自為氮原子。
3.權利要求1所述的化合物，其中R1為-NH2基團，R2為-OH基團，R3為H，X和Z各自為CH基團，並且Y為氮原子。
4.治療需要治療之腫瘤性疾病患者的方法，該方法包括給患者服用有效量的下式化合物或其藥學上適用的鹽，
R2為-NH2或-OH，R3為H、(C1～C4)烷基、烯丙基或炔丙基，且X、Y和Z各自獨立地為氮原子或CH基團。
5.權利要求4所述的方法，其中所述化合物的R1和R2各自為-NH2基團，R3為甲基，X、Y和Z各自為氮原子。
6.權利要求4所述的方法，其中所述化合物的R1為-NH2基團，R2為-OH基團，R3為H，X和Z各自為CH基團，並且Y為氮原子。
全文摘要
本發明涉及某些葉酸類化合物和抗葉酸劑與二氟穀氨酸的結合物，該結合物可用於治療患有某些腫瘤(包括白血病、黑素瘤、癌、肉癌和混合腫瘤)的患者。
文檔編號C07D239/88GK1057653SQ9110229
公開日1992年1月8日 申請日期1991年4月11日 優先權日1990年4月12日
發明者菲利蒲·貝, 詹姆斯·K·考華德, 約翰·J·莫古裡 申請人:健康研究公司, 默裡爾多藥物公司密執安大學董事會