一種施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養方法及其應用與流程
2023-12-12 21:56:02 1
本發明屬於環境微生物領域，具體涉及一種施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養方法及其應用。
背景技術：
來源於石油、化工、醫藥和化肥等行業的鹽含量高於1%的高含鹽廢水普遍含有較高的COD，廢水中汙染物不斷排放到環境中會引起嚴重的汙染問題。淡水資源的缺乏問題日益嚴重，廢水的處理及其回收利用更受到人們的重視。
物理或化學法處理高含鹽廢水中的COD，成本高並且可能會造成二次汙染。傳統生物法在處理低鹽度廢水時有很大優勢，但在高鹽、高酸鹼、高溫或低溫逆環境中，微生物的降解能力就會受到抑制。耐鹽菌技術正是基於工程領域的問題和急需而產生，通過科學方法馴化出處理高含鹽廢水的優勢耐鹽菌，該類菌體以其獨特的細胞結構和物質組成能夠在較高含鹽度的環境中生長。耐鹽菌處理高含鹽廢水具有普通活性汙泥法無可比擬的優勢，且比物理化學法成本低，會產生較為明顯的經濟效益和社會效益，可以為相關廢水處理達標排放提供技術支撐。
施氏假單胞菌可用於廢水中總氮脫除、COD脫除等多個領域。在採用施氏假單胞菌進行COD脫除領域：CN201110322523.4涉及到一種包含施氏假單胞菌、惡臭假單胞菌、穿孔假單胞菌和枯草芽孢桿菌的應用於特異性有機物降解的複合菌劑，對滷代烴類、苯酚類、苯酸類、芳香烴類、多環芳烴類、雜環化合物、鄰苯二甲酸酯等有毒有害有機汙染物具有特異降解能力。CN201210573242.0涉及到一種包含惡臭假單胞菌RW10S2、施氏假單胞菌、惡臭假單胞菌DN6和惡臭假單胞菌BIRD-1的應用於苯系物降解的複合菌劑。CN200910303045.5涉及到一種降解高分子多環芳烴（BAP，BGP，PAHs）效率較高的施氏假單胞菌MT-5。CN201310746598.4涉及到一種應用於提高厭氧產沼效率和汙泥有機質分解率的施氏假單胞菌KY-02。CN201310680417.2涉及到一種應用於好氧反硝化的施氏假單胞菌JH-1，保藏號為CCTCC NO：M2013488，其可同步脫除有機廢水中60-80%的COD。CN201110118549.7涉及到一種應用於兼性厭氧反硝化的施氏假單胞菌LZ-14，保藏號為CCTCC NO：M2011119，其可同步去除有機廢水中的COD。
目前，已知篩選獲得的施氏假單胞菌存在不具有耐鹽性能或耐鹽性能不佳等問題，不適用於高含鹽廢水的處理。特別是上述篩選獲得的菌株大多是在無菌環境下培養獲得，在長期開放式培養環境中，容易受到其他雜菌等的汙染，這些雜菌在培養液中生長、繁殖，當其數量達到一定密度時，即對優勢菌的生長繁殖造成影響，輕者不利於再擴大培養，重者會導致培養的失敗。因此，在開放式培養體系中，如何有效地防止雜菌對培養體系的不利影響，是提高優勢菌處理效果的關鍵因素。雖然有些在培養過程中採用了殺菌方法，如採用物理法過濾或者酸化法殺菌，或者在培養過程中添加抗生素等。但是，過濾的方法比較麻煩，處理不乾淨；酸化法在殺滅雜菌的同時優勢菌本身的生長也受到了抑制；投加抗生素的方式，對優勢菌也具有殺害作用，進而影響處理效果。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明提供一種施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養方法及其應用。本發明根據施氏假單胞菌FSTB-5的菌體特性，在採用含鹽含COD廢水開放式培養施氏假單胞菌FSTB-5過程中，投加特定的殺菌劑，可以顯著降低雜菌汙染，不會影響施氏假單胞菌FSTB-5的生長繁殖和廢水處理效果。
本發明施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養方法，包括如下內容：在施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養過程中，投加殺菌劑；所述施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5，已於2015年6月1日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCCNo.10940；所述殺菌劑為林可黴素、二甲胺四環素、利福黴素SV、醋竹桃黴素、萬古黴素、氨曲南、萘啶酸等中的一種或幾種。
本發明中，所述的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）FSTB-5菌株，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號：CGMCC No.10940；保藏日期：2015年6月1日。
本發明中，所述的施氏假單胞菌FSTB-5的主要形態特徵為：菌落顏色為淺薑黃色，菌株個體為杆狀；生理生化特徵為：革蘭氏陰性，氧化酶陰性，接觸酶陽性，具有硝酸鹽還原性能，可水解利用多種碳源。該菌株可應用於鹽含量1.0wt%-10.0wt%的含鹽廢水中COD的高效脫除，而且能夠在40℃高溫下生長。
本發明中，所述的開放式培養是指在敞開式容器中進行，所有進入反應器的氣體或者補加的料液都不進行無菌處理。
本發明中，培養施氏假單胞菌FSTB-5的生長環境儘管具有持續性的高鹽選擇壓力，但在長期開放式培養時仍可能會有少量的其它幹擾菌株生長，為防止幹擾菌持續性繁殖生長成為優勢菌，定期採樣稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-2相似菌落的百分比，當相似百分比接近50%時投加殺菌劑，所述殺菌劑為林可黴素、二甲胺四環素、利福黴素SV、醋竹桃黴素、萬古黴素、氨曲南、萘啶酸等中的一種或幾種。由於施氏假單胞菌FSTB-5可以耐受上述殺菌劑，因此不會受到影響，可以穩定生長繁殖。本發明中，所述殺菌劑的投加濃度為0.01-100mg/L，持續投加2-7個培養周期。
本發明中，所述的施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養包括菌株活化、液體種子液培養、曝氣培養、純菌株檢測和優勢菌株維護等五個階段，具體過程如下：
（1）菌株活化：將施氏假單胞菌FSTB-5接種到FSTB固體培養基的斜面或者平板中，25-40℃培養24-48小時，然後保存於4℃冰箱中。
（2）液體種子液培養：配製FSTB液體培養基，分裝於三角瓶中，滅菌並冷卻至室溫後，無菌環境下挑取斜面或平板中活化的菌株接種到三角瓶中，25-40℃培養24-72h。所述FSTB液體培養基為：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白腖10g/L，pH值範圍4.5-8.5，優選為5.0-8.0。FSTB固體培養基是在液體培養基中加入20g/L的瓊脂。
（3）曝氣培養：在設有曝氣裝置的開放式反應器中加入FSTB-5液體培養基或者含鹽含COD的廢水，按照反應器體積比0.5%-25%的比例接種液體種子液，pH值控制在5.0-8.0，曝氣培養48-96小時，之後進行周期性的補料和排料操作，排料量佔反應器體積的5%-90%，補料量佔反應器體積的5%-90%，也可補加少量的碳源、氮源和微量元素物質，培養24-48小時為1個培養周期，之後按照上述比例排出對應體積的培養液，由此得到含有高濃度施氏假單胞菌的濃菌液產品。
（4）純菌株檢測：採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比，當相似菌落百分比接近50%時投加殺菌劑，所述殺菌劑為林可黴素、二甲胺四環素、利福黴素SV、醋竹桃黴素、萬古黴素、氨曲南、萘啶酸等中的一種或幾種，投加濃度為0.01-100mg/L，持續投加2-7個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程。
（5）採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比，相似百分比達到65%以上，施氏假單胞菌FSTB-5成為優勢菌。
本發明中，所述的施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養可以採用FSTB液體培養基，也可以含鹽含COD的廢水。所述含鹽含COD的廢水可以是經過預處理的化工合成廢水、煤化工廢水，也可以是煉油工藝、煤化工工藝及化工合成工藝等產生的廢水經過反滲透減量化單元產生的濃鹽水，優選採用環氧氯丙烷廢水。所述廢水的鹽含量為0.5wt%-8.0wt%，優選1.0wt%-5.0wt%，COD（Cr法，下同）含量為200-20000mg/L。
本發明開放式培養獲得施氏假單胞菌FSTB-5可以應用於各種含鹽含COD廢水的處理中，如可應用於鹽含量1.0wt%-10.0wt%的含鹽廢水中COD的高效脫除，COD的去除率可達90%以上。或者當廢水系統出現異常，可以直接投加上述培養獲得的濃菌液產品，投加量按照每小時所處理廢水體積的0.01%-3%進行投加。
本發明所述的耐鹽施氏假單胞菌FSTB-5是一株在高含鹽水體中具有較好COD脫除性能的菌株，耐鹽能力強，處理效果好，可以直接用於含鹽廢水的處理，也可以投加到現有含鹽廢水處理系統中，提高廢水處理效果。本發明方法根據施氏假單胞菌FSTB-5的菌體特性，在採用含鹽含COD廢水開放式培養施氏假單胞菌FSTB-5過程中，投加特定的殺菌劑，可以顯著降低雜菌汙染，不會影響施氏假單胞菌FSTB-5的生長繁殖和廢水處理效果。本發明採用含鹽含COD廢水開放式培養施氏假單胞菌FSTB-5，極大的維持耐鹽菌劑的生長特性和耐受特性，並降低耐鹽菌劑的培養成本，不會影響菌體的生長和脫COD效果。
具體實施方式
下面結合實施例進一步說明本發明的效果，但不因此限制本發明。
本發明實施例所採用的含鹽含COD廢水的水質為：COD濃度為2000mg/L，鹽含量為2.8wt%。所述的開放式培養是指在敞開式容器中進行，所有進入反應器的氣體或者補加的料液都不進行無菌處理。
實施例1
本發明施氏假單胞菌FSTB-5的開放式培養方法包括菌株活化、液體種子液培養、曝氣培養、純菌株檢測和優勢菌株維護五個階段，具體過程如下：
（1）菌株活化：將施氏假單胞菌FSTB-5接種到含有FSTB固體培養基的平板中，35℃環境下培養48小時，然後保存於4℃冰箱中待用。所述FSTB固體培養基為：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白腖10g/L，瓊脂20g/L，pH值7.8。
（2）液體種子液培養：配製FSTB液體培養基，分裝於三角瓶中，滅菌並冷卻至室溫後，無菌環境下用接種環挑取斜面中活化後的菌株接種到三角瓶中，35℃條件下培養48小時。所述FSTB液體培養基為：FeSO4•7H2O 25mg/L，NH4NO3 286mg/L，KCl 929mg/L，CaCl2 2769mg/L，NaCl 21008mg/L，牛肉膏5g/L，蛋白腖10g/L，pH值7.8。
（3）曝氣培養：在開放式反應器中加入含鹽廢水，反應器需配備曝氣裝置，並可進行進水、調酸、調鹼、補料和排水排料操作，按照體積百分比10%的比例接種液體種子液，開啟培養過程後，培養過程中採用酸鹼自動控制系統將培養液pH值範圍控制在5.0-8.0，曝氣培養72小時之後進行周期性的補料和排料操作，排料為反應器體積的50%的培養液，補料為反應器體積50%的含鹽廢水，培養24小時為1個培養周期，之後按照上述比例排出對應體積的培養液，由此得到含有較高濃度施氏假單胞菌的濃菌液產品。
（4）純菌株檢測：採集上述培養完畢的濃菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比，當相似菌落百分比接近50%時投加殺菌劑，所述殺菌劑為林可黴素，投加濃度為10mg/L，持續投加5個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程，繼續培養3個周期後結束。
（5）採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
實施例2
處理工藝及操作條件同實施例1，不同之處在於：步驟（4）投加利福黴素SV，投加濃度為5mg/L，持續投加5個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
實施例3
處理工藝及操作條件同實施例1，不同之處在於：步驟（4）投加二甲胺四環素，投加濃度為25mg/L，持續投加5個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
實施例4
處理工藝及操作條件同實施例1，不同之處在於：步驟（4）投加萬古黴素，投加濃度為20mg/L，持續投加5個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
實施例5
處理工藝及操作條件同實施例1，不同之處在於：步驟（4）投加醋竹桃黴素，投加濃度為5mg/L，持續投加5個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
實施例6
處理工藝及操作條件同實施例1，不同之處在於：步驟（4）投加萘啶酸，投加濃度為30mg/L，持續投加5個培養周期，上浮的微生物在排水排料時排出，之後恢復正常的開放式培養操作流程。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
比較例1
處理工藝及操作條件同實施例1，不同之處在於：不投加殺菌劑。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
比較例2
處理工藝及操作條件同實施例3，不同之處在於：不投加殺菌劑。採集上述培養完畢的菌液，稀釋後塗布到含有FSTB固體培養基的平板中，對長出的菌落進行計數並統計與FSTB-5相似菌落的百分比。
將實施例1-6投加殺菌劑的5個培養周期和比較例1-2不投加殺菌劑的5個培養周期的處理效果進行比較，同時對投加殺菌劑結束後繼續培養3個周期後的效果進行比較。投加殺菌劑前的相似百分比均為50%，每個周期結束後取樣檢測培養液中的優勢菌相似百分比、COD去除率和菌體濃度變化（以600nm時的吸光度數值OD600表示菌體濃度），效果如表1所示（表中0周期表示菌體培養的初始狀態）。
表1施氏假單胞菌FSTB-5開放式培養效果
表1可知，本發明根據施氏假單胞菌FSTB-5的菌體特性，在採用含鹽含COD廢水開放式培養施氏假單胞菌FSTB-5過程中，投加特定的殺菌劑，可以顯著降低雜菌汙染，不會影響施氏假單胞菌FSTB-5的生長繁殖和廢水處理效果。