口服疫苗的製作方法

2023-06-14 13:56:51 2

專利名稱:口服疫苗的製作方法
本發明涉及通過將抗原施用於黏膜而引起血清和分泌抗體的特異刺激反應。
哺乳動物中的許多感染對它們相當有害，人們有理由為它們接種特異抗原以防止這些感染。因此，就制定了接種疫苗的方案，使哺乳動物受到一種抗原的刺激，從而產生免疫反應，並賦於動物免疫特性。
給哺乳動物施用抗原，可以通過許多常規的方法進行，包括肌肉注射(i.m.)、皮下注射(s.c.)、或通過口服給藥(peros)。抗原的肌肉注射和皮下注射有一些不利之處，它需要比較專業化的技術、難於大規模進行、費用昂貴，而且無論對於免疫抗原還是對注射劑中的乳化劑都會發生若干付作用。疫苗的口服相比之下沒有什麼問題，但就目前為止用於口服的一些抗原來看，這種方法需要比較大的抗原量，因為實際吸收並且能刺激有效免疫反應的藥量通常是很低的。因此，進行口服免疫所需的抗原量通常要遠遠超過體注射誘導免疫反應所需要的量。口服大量抗原以產生抗體反應還有一個主要的缺點，那就是服用大量的抗原常常導致產生身體的耐受性。(Tomasi，1980;Mowat，1985;Mowat和Parrot，1983;Ngan和Kind，1978;Hanson等人1979;Richman等人，1978;Rothberg等人，1973)迄今為止的證據表明，總的來說，抗原在口服後被小腸吸收的機制，主要是藉助於對腸腔內容物的非特異性選擇進行的，這種選擇是通過復蓋在集合淋巴結(Peyer′s Patches)和其他GALT(與腸結合的淋巴組織)的淋巴結上面的「M」細胞完成的。(Bland和Britton 1984)。局部淋巴細胞群落隨後的致敏體作用導致產生局部IgA的免疫反應及IgG阻遏細胞的致敏，並因此抑制了血清IgG的反應(Tomasi，1980;Mowat，1985;Mowat和Parrot，1983;Ngan和Kind，1978;Hanson等人，1979;Richman等人，1978;Rothberg等人，1973)。
因此，很顯然，抗原吸收的部位(不論它是通過集合淋巴結或是絨毛上皮)以及很可能抗原的服用量決定了口服抗原產生的免疫反應的形式。問題是除了霍亂毒素外是否還有任何其他的抗原，它們在口服後能夠特異性地啟動黏膜免疫系統和/或刺激體液的免疫反應，這些反應取決於所用劑量，而不誘發身體的耐受性以及不需要過多的抗原劑量。
考慮到這一點，我們決定研究某些粘連分子可能的潛力，它們與一些腸道病原的最初附著有關係，口服時能夠刺激免疫反應。這些表面抗原使一些產腸毒的大腸桿菌菌株(ETEC)具有粘連性質，它們已被確定為是非鞭毛的絲狀蛋白質附屬物或纖毛(Gaastra和de Graaf，1982)。其例子包括人類ETEC菌株的CFAI和CFAII以及動物ETEC菌株的K88，K99，F41和987P纖毛(Gibbons等人，1975;Evans和Evans，1978;Levine等人，1980;Morgan等人，1978;de Graaf和Roorda 1982)。此外，我們還檢查了其他一些蛋白質的能力，這些蛋白質在口服後對於免疫系統的啟動沒有明顯的作用。這些抗原包括一些外源凝集素，S.typhimurium(i型鞭毛)的一種血清型抗原，沒有活性的流感病毒和S.typhimurium內毒素(LPS)。將口服引起的反應與完全肌肉注射(i.m.)產生的反應相比較。
因此，這些研究的目標是要提供一種方法，改進腸胃道黏膜對免疫原或抗原的吸收，以致於有可能通過免疫原的低劑量口服產生血清和分泌抗體，從而避免大量口服導致的耐受性。
因此，本發明描述了一組分子(黏膜免疫原)，它們在服用後產生的抗這些蛋白的血清抗體，能與通過肌肉注射獲得的抗體水平相比擬。而且，更大量地服用這些抗原時，還同時產生抗這些免疫分子的黏膜抗體。
本發明另一方面還描述了一種方法，依靠這種方法，對口服分子產生的抗體反應可以通過同時食用一些規定食物的分子而擴大或改變。
在本發明的另一方面，描述了一個可將半抗原或蛋白質粘連到黏膜免疫原上的方法，服用這種複合物時，會導致對這種半抗原或粘連蛋白質產生抗體。
縮寫1.Ab 抗體2.BSA 牛血清清蛋白3.ConA 伴刀豆球蛋白A4.DNP 二硝基苯基5.ELISA 酶連接免疫吸附劑測定法6.ETEC 產腸毒素大腸桿菌7.GALT 腸連結的淋巴組織8.HA 羥磷灰石9.i.m. 肌肉內10.LHRH 促黃體釋放激素
11.LPS 脂多糖12.LT-B 產腸毒大腸桿菌的熱不穩定毒素13.O/N 隔夜14.Per oS 口服15.PS 多糖16.RT 室溫17.SC 皮下的18.SDS-PAGE SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳19.TCA 三氯乙酸首先，本發明提供了一種複合物，它包括一個與一種載體分子相連的免疫原，這種載體分子能夠與脊椎動物宿主的黏膜上皮發生特異的相互作用;在這種複合物中，基本上保留了免疫原的免疫活性和載體分子與脊椎動物宿主黏膜上皮發生特異的相互作用的能力，而且所說的複合物能夠誘導該脊椎動物宿主的全身、細胞和/或黏膜的免疫反應。
符合本發明的較好的免疫原包括一種激素、治療藥劑、抗原、或半抗原的全部、部份、其類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。這些免疫原包括像LHRH(促黃體素釋放激素)、FSH、HGH和抑制素等激素;還包括變應原如禾本植物(如大麥和匍匐冰草)的花粉、雜草花粉(例如三葉草、酸模草)、樹的花粉(例如桉樹、柏樹)，植物花粉(例如金雀花)、上皮(例如貓毛、狗毛、豬毛)和房間裡的灰塵、麥殼和木棉等。
用作疫苗對抗劑的免疫原包括流行性感冒、麻疹、風疹、天花、黃熱病、白喉、破傷風、霍亂、鼠疫、斑疹傷寒、卡介苗、流行性感冒嗜血桿菌(haemophilus influenzae)，卡他奈瑟菌(Neisseria catarrhalis)，Kelbsiella pneumonia，肺炎雙球菌(pneumococci)和鏈球菌(streptococci)尤其是鏈球菌突變體(S.mutans);以及由大腸桿菌、淋球菌、腦膜炎球菌、卡他、耶爾贊氏菌(Yersinia)、綠膿桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)、牛摩拉克氏菌(Moraxella bovis)、結狀類細菌(Bacteroides nodosus)，葡萄球菌(Staphylococci)、鏈球菌(Streptococci)以及球桿菌(Bordetella)產生的纖毛。
較好的載體分子包括如987P、K99、CFAⅠ、CFAⅡ、K88或K41這樣的細菌粘著物;從流行性感冒、麻疹、風疹、天花或黃熱病病毒得到的血凝集素;像LTB、蓖麻毒素、相思子毒素、白喉毒素、modecin、破傷風毒素和具有類似結構的其他毒素或其結合亞基;以及從植物或其他來源得到的外源凝集素、外源凝集素包括如伴刀豆球蛋白A.Pokeweed促細胞分裂劑、或者由Lens culinaris、Helix pomatia、Glycine max，Arachishypogea或Ulex europeus或相思子毒素、天門冬屬碗豆、寬豆、駱駝腳樹、蓖麻籽、Fava豆、綠海藻、茸毛野碗豆、馬吃的鷹咀豆(Horse gram)、馬靴酸蘋果(Horse shoe crab)、Jack豆、Japanese wisteria，Jequirity，Scotch laburnum，Lima bean，Limulin，Lotus，歐洲槲寄生(European mistletoe)、Mung bean、Osage橙、Pagoda樹、花園碗豆(Garden pea)，馬鈴薯、紅腎豆(Red kidney bean)，紅海藻(Red marine algea)，西伯利亞碗豆村(Siberian pea tree)，食用蝸牛(edible snail)，花園蝸牛(Garden Snail)、歐衛矛(Spindle tree)，甜碗豆(Sweet pea)、西紅柿、小麥芽或有翼碗豆(Winged pea)得到的外源凝集素。
在本發明的一個較好的實施方案中，提供了一個包括有促黃體釋放激素及LTB的複合物。
在另一方面，本發明提供了一個生產上述複合物的方法，該方法包括(a)使免疫原與載體分子反應形成所述複合物;
(b)對該免疫原進行化學修飾，使得它至少具有一個可以形成化學鍵的功能團，使該免疫原與載體分子反應形成所說的複合物。
(c)對該載體分子進行化學修飾，使得它至少具有一個可以形成化學鍵的功能團，使該免疫原與載體分子反應形成所說的複合物。
(d)對免疫原和載體分子進行化學修飾，使得它們具有可以形成化學鍵的功能團，使該免疫原與載體分子反應形成所說的複合物。
(e)使該免疫原與至少一種鍵合劑反應，使該免疫原與載體分子反應形成所說的複合物。
(f)使該載體分子與至少一種鍵合劑反應，使該免疫原與該載體分子反應形成所說的複合物。
(g)使該免疫原和載體分子與至少一種鍵合劑反應，並使該免疫原與載體分子反應形成所說的複合物。
(h)任何一種上述方法中各步驟的組合。
在另一方面，本發明提供這樣一個方法，該方法包括提供一個DNA重組分子，該分子包括一個在表達時為免疫原胺基酸序列編碼的第一DNA序列，一個在表達時為載體分子胺基酸序列編碼的第二DNA序列以及載體DNA;用所說的DNA重組分子轉化一個宿主，使所說的宿主能夠表達一個含有所述複合物的雜化蛋白質產品;培養所說的宿主來實現所說的表達並收集所說的雜化蛋白質產品。
另一方面，本發明還提供了另一種生產複合物的方法，該方法包括(a)化學合成免疫原和/或載體分子，並通過化學反應形成複合物;或(b)合成一個含有免疫原和載體分子胺基酸序列的雜化肽，肽最好是由固相合成、酶合成或人工合成製備的。
在本發明的一個較好的方案中，人工合成的免疫原或載體分子雖然束縛在固相肽合成裝置的樹脂上，但也分別被偶聯到載體分子或免疫原上。
在本發明的另外一個方案中，提供了一個用DNA重組分子轉化的轉化株宿主，該DNA重組分子包括一個表達時為免疫原的全部、部份、它們的類似物、同系物、衍生物或其組合物的胺基酸序列編碼的第一DNA序列;一個表達時為該載體分子的全部、部份、它們的類似物、同系物、衍生物或它們的組合物的胺基酸序列編碼的第二DNA序列，及載體DNA。
在本發明的一個較好的方案中，這種轉化宿主是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌、酵母、黴菌或一種較高級的真核細胞。在本發明的一個較好的方案中，所說的宿主是大腸桿菌。屬於本發明範圍之內的一種轉化微生物培養物已寄存在美國典型培養物收集中心(ATCC)其編號為
在另一個方案中，本發明提供了一個DNA重組分子，它包括一個在表達時為免疫原胺基酸序列編碼的第一DNA序列;一個在表達時為載體分子胺基酸序列編碼的第二DNA序列和載體DNA。
在本發明這種方案的較好的實施例中，載體DNA是質粒DNA，但是其他一些載體也被視為在本發明範圍之內，它們包括病毒、噬菌體和柯氏質粒(Cosmids)。在本發明的一個較好的方案中，提供了質粒pBTAK66，用它轉化一個宿主細胞時，可以產生包含落在本發明範圍之內的多肽的蛋白質產品。
在本發明的另一個方案中，提供了一個多核苷酸序列，該序列包括為一種融合產品編碼的第一雜交多核苷酸序列，該融合產品包含了與載體胺基酸序列融合的免疫原的胺基酸序列;包括一個與所述第一雜交多核苷酸序列充份相關以至能與所述雜交多核苷酸序列雜交的一個多核苷酸序列;一個由於突變、包括單個或多個鹼基的置換、缺失、插入和倒位，而與所述第一雜交多核苷酸序列相關的多核苷酸序列，或者一個在表達時為一種多肽編碼的多核苷酸序列，這種多肽具有與所述融合產品相似的生物學或免疫學活性。
這種多核苷酸序列最好是這樣一種序列，其中的第一雜交多核苷酸序列是LHRH的全部、部份、它們的類似物、同系物、衍生物或其組合物的胺基酸序列的編碼序列，該LHRH與載體分子的胺基酸列序相融合，而載體分子最好是LTB。
在本發明的另一個方案中，提供了一種藥物，它包含一個本發明的複合物以及藥學上可允許的載體或稀釋劑，藥學上可允許的載體或稀釋劑包括像片劑、水溶液、碳酸氫鈉溶液這樣的典型載體和稀釋劑以及類似的、中和胃酸的或具有類似緩衝能力的稀釋劑、乙二醇、油、水包油型或油包水型乳化劑、並包括乳劑、凝膠體、膏劑和粘性膠體懸浮液形式的藥物，這些藥物可以製成膠囊、片劑、緩慢釋放或酏劑的形式，或者製成凝膠或膏劑，或也可以製成鼻用噴霧劑，這種形式的藥物中含有氣溶膠。而且該藥物還可以做成牲口的飼料或適於人類消耗的食品。
發明人還發現，一些特定食物的分子與本發明的複合物共同服用，可選擇性地調節對該複合物的免疫原產生的免疫反應的強弱和/或類型。
因此，本發明還提供了這樣一種藥物，它包括本發明的複合物以及一種能夠選擇性地調節該複合物的免疫原產生的免疫反應的強弱和類型的特定食物分子。
本發明所設想的特定食物分子包括鹼性的、中性的和酸性的胺基酸，如精氨酸、組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、門冬氨酸、穀氨酸;水溶性和非水溶性的維生素如硫胺素、核黃素、吡哆醛、氰鈷胺(維生素B12)、抗壞血酸(維生素C)、維生素D2、麥角甾醇、維生素E、維生素A、維生素K等;糖，包括單糖如半乳糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨醇、葡萄糖、木糖、阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、毛地黃毒素糖、赤蘚糖、果糖、來蘇糖、胞壁酸、丙酮酸、核糖、塔格糖、塔羅糖以及醯胺化的和N-乙醯化的衍生物;低聚糖例如乳糖、麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、纖維二糖、N，N聯乙醯殼二糖、龍膽二糖、異麥芽糖、乳糖酸、海藻糖、土冉糖;以及食用無機鹽和輔助因子例如錳、鎂、鋅、鈣和鐵。
本發明還提供了一個本發明複合物的施用方法，此方法包括將本發明的複合物與特定食物分子一道施用於黏膜，該食物分子能夠調節免疫原引起的免疫反應的強弱和類型。
本發明還給出了本發明藥物的口服用藥法，以便使宿主的活性分子產生反應。這樣一種反應在活性分子是抗原或半抗原時可以是身體的免疫反應和/或黏膜的免疫反應。在活性分子是LHRH或其衍生物、類似物、同系物、部份或其組合物時，這種反應將是對於宿主性腺功能的抑制。如果口服藥物中包含有符合本發明的一種特定食物分子，本發明則還提供了一種增強宿主對活性分子的反應的方法，該方法包括將這種口服藥物施用於宿主。
圖1顯示了987P纖毛素亞單位的N-末端胺基酸序列，與其他纖毛蛋白的N-末端胺基酸序列的對照。
材料外源凝集素是從Sigma化學公司購買的，失活的流感疫苗是從聯邦血清實驗室(澳大利亞)購買的。糖和維生素由以下來源獲得乳糖(AR級)-澳大利亞雪梨的Ajax化學公司;果糖D(-)，甘露糖D(+)，山梨醇和木糖D(+)(所有的都是AR級)-英格蘭、普爾的B.D.H化學有限公司;蜜二糖D(+)-密西西比州、聖路易斯Sigma公司;視黃醛(維生素A醛)-瑞士Fabrik Buchs，Fluka AG化學公司;鹽酸硫胺素(維生素B1)，核黃素(維生素B2)，吡哆醛(維生素B6)，氰鈷銨(維生素B12)，L-抗壞血酸(維生素C)，麥角甾醇(前維生素D)以及dl-a-生育酚(維生素E)-密西西比州聖路易斯Sigma化學公司。
細菌菌種和培養基實驗中所用的大腸桿菌K99，987P和LTB菌種例於表1中，它們是由SuSan Clark博士(澳大利亞生物工程研究所分子生物學實驗室)慷慨贈送的。培養物是在37℃(除非特別指出)如所指出的那樣(表1)，在具有或不具有1mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的盧麗亞肉湯培養基(LB)中搖晃下生長的。沙門氏桿菌(Salmonella Typhimurium)是在37℃在加入了0.2%甘油的LB培養基中搖晃下生長的。
表1菌株 遺傳標記 菌株起源 表型BTA 595 p BTA 193 RB 791 LTB＊BTA 604 P BTA 201 MC 1061 987PBTA 262 P BTA 106 EO 8654 K99＊包括了
1mM IPTG抗原的純化纖毛的製備用放射性標記的抗血清檢測到的表達被克隆的纖毛的大腸桿菌，在對數生長期時進行收集。把培養物加熱到60℃保持三十分鐘，在這之後，生物體通過離心(3，000xg，30min，4℃)進行沉澱。利用改進的Laemmli的方法(Laemmli，1970，Salit等人1980)，用12.5%的SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)檢查上清液中的纖毛含量。
K99的提純培養物上清液用10N的氫氧化鈉調整PH值到9.7，並在室溫下攪拌十分鐘，用離心法(3，000xg，30min，4℃)回收含有纖毛的沉澱，並再次懸浮在PH7.2的100毫升蒸餾水(dH2O)中，將該步驟重複兩次。
987P的純化除了使纖毛通過用冰醋酸將pH調節到3.9而進行沉澱外，所採取的步驟與上面具體描述的相同。
羥磷灰石色譜法使羥磷灰石(HA)(DNA級，Bio-Gel HTP，Bio-Rad)慢慢地在過量的蒸餾水中溶脹，在短時間後(小於2分鐘)輕輕倒出漂浮的微粒。再重新加入蒸餾水，使凝膠慢慢地懸浮，並再次傾倒出漂浮微粒。這樣的過程重複好幾次。用近似30%的HA懸浮液裝柱(30×5釐米)，並通過重力作用使之沉澱。用蒸餾水以16毫升/小時的流速通過該柱，從而使柱體壓緊，直到膠床表面穩定為止。將K99或987P(100毫升)的樣品以不超過每小時30毫升的流速上柱，然後用蒸餾水洗柱直到過柱液在280nm下檢測不到蛋白質為止。用pH為7.5的15到250mM的磷酸鈉的線性梯度以30毫升/小時的流速洗脫纖毛，收集各組份並用SDS-PAGE檢查，回收纖毛峰，並將各峰組分合併。
離子交換色譜法將從HA色譜法收集的K99和987P纖毛合併組份分別用NaOH(pH9.7)或冰醋酸(pH3.9)再沉澱，在離心後(3000xg，10分鐘)，把含有纖毛的沉澱重新懸浮在pH5.5，50mM的檸檬酸緩衝液(K99)和pH8.5，50mMTris-HCl(987P)中，然後加到已用同樣的緩衝液平衡過的離子交換柱上，K99和987P以100毫升/小時的流速分別加到羧甲基纖維素(CM)和二乙胺基乙基(DEAE)柱上，用二倍體積的上柱緩衝液洗柱，並用含有10mM到0.5M的NaCl線性梯度的平衡緩衝液洗脫纖毛，按照Tsai和Frasch(1982年)的方法用SDS-PAGE檢查組份的蛋白質含量和LPS汙染。
LTB的純化3升的LTB上清液用蒸餾水稀釋至6升，用冰醋酸把pH值調至6.5，並以1.2升/小時的流速加到用pH為6.5的10mM磷酸鹽緩衝液平衡的快速流動的羧甲基-瓊脂糖膠柱(5×30cm)上，然後用400毫升pH為6.5的10mM磷酸鹽緩衝液洗柱，並用含有10-500mM NaCl的線性梯度的pH為6.5、10mM磷酸鹽洗脫結合的蛋白質。收集洗脫組份並用SDS-PAGE進行分析，合併LTB峰。
鞭毛的分離用離心法(3000xg，15min，4℃)使指數後期生長的細菌培養物沉澱。將這些細胞重新懸浮在鹽水中，並加熱到60℃保持30分鐘，接著進行離心分離(3000xg，10min，4℃)，在上清液中加入100%的三氯醋酸(W/V)，使其最終濃度為10%(W/V)而產生沉澱，在1500xg4℃下離心10分鐘，把沉澱物重新懸浮在少量的pH為8.8的1M Tris中，用超聲波處理直到成為溶液。加入最終濃度為80%(V/V)的乙醇，並在4℃下以2000xg，10分鐘離心沉澱鞭毛。把沉澱物懸浮在丙酮中，用超聲波處理使其成為懸浮液，由離心分離(5000xg)再次沉澱。最後，使沉澱物在10%SDS，50mMEDTA，10mM Tris-HCl，pH8.0中沸騰使之溶解，然後上Sephacyl S-200的層析柱。
鞭毛的純化在沸騰15分鐘後，在Beckman半敞開小室微形分離器中離心分離5分鐘，除去不溶物質以淨化鞭毛，把上清液加到用pH為8.8的20mM Tris、0，1%SDS和10mM EDTA平衡過的Sephacryl-S200柱(2.5×80cm)上(Pharmacia，Fine Chemicals)，並用同樣的緩衝液洗脫。收集組份並用SDS-PAGE進行分析。最後合併鞭毛峰組份，並用10%(最終濃度)TCA進行沉澱。離心，再如前所述的那樣，用乙醇和丙酮洗滌，把最終的沉澱物重新懸浮在蒸餾水中。
脂多糖(LPS)的純化S.typhimurium的過夜培養物用溶解在20%(V/V)乙醇中的0.5M CaCl2萃取(30分鐘，在室溫下)，該乙醇中含有pH3.0的100mM檸檬酸鹽和5%的Zwittergent3.12(W/V)(Calbiochem)。用離心法(3000xg，10min，4℃)沉澱細菌，把沉澱物重新懸浮在pH8.0的50mM EDTA中，室溫下強烈攪動該懸浮液30分鐘。離心除去細菌後，在上清液中加入乙醇至最終濃度為75%，沉澱蛋白質物質並繼續加入乙醇，使其上清液含90%乙醇。用丙酮洗滌形成的沉澱顆粒，再沉澱最後重新懸浮在蒸餾水中。用蒽酮試劑(Herbert等人，1985)測定糖含量。並用SDS-PAGE檢查是否有雜蛋白的存在。市售的大腸桿菌LPS(Sigma公司)在二個檢測中都可以作為標準，按照Tsai和Frasch(1982)的方法，用銀染色法對凝膠中的LPS進行染色。
多糖(PS)的製備將S.typhimurium LPS製劑與1M冰醋酸一起加熱至100℃保持2-5小時，從而從LPS上分解下來A類脂。然後在4℃以3000xg離心10分鐘除去A類脂。
純化抗原的說明對純化的K99和987P纖毛製品進行SDS-PAGE分析表明，在還原條件下，分別有一個泳動至17500和20，000分子量處的單帶(圖1)。這與Isaacson及其他人(Isaacson和Richter，1980;Morris等人1980;de Graaf等人，1981;Fusco等人1978)發表的數據一致。這些蛋白質在pH9.7和3.9(分別對於K99和987P來說)容易沉澱，表明這兩種蛋白質的pI值是在這些值域附近(見Isaacson和Richter 1981;de Graaf等人，1981)。這些製劑的銀染色顯示他們很少含有(小於1微克/100微克蛋白質)或沒有LPS雜質。確定987P氨基末端的序列。
氨基末端的小型序列分析是由南澳大利亞Adelaide，S.A.Pty有限公司的生物工程研究所為我們進行的。對100毫微摩爾如上所述純化的987P樣品進行測定，將987P的氨基末端序列與發表的K99序列進行比較，表明這二個分子之間沒有同源區的存在(圖1)(Gaastra和Graaf，1982)。
並發現純化的LTB和S.typhimurium鞭毛沒有雜質LPS，在還原條件下用SDS-PAGE檢查時，分別以表觀分子量為12500和52000的單帶泳動。
對純化的LPS的SDS-PAGE凝膠進行銀染色，沒有檢測到蛋白質雜質。由蒽酮反應測定的複合物糖含量是2毫克/毫升。沒有多糖的A類脂也發現含有2毫克/毫升的多糖。它在SDS-PAGE中不能泳動(用銀染色法進行檢測)表明它沒有雜質類脂。
抗原的二硝基苯基化按照Little和Eisen(1967)的方法，對K99、LTB和外源凝集素進行二硝基苯基化，簡單地說，使載體(在pH9.5的0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中)與0.1M的DNFB溶液(在丙酮中)於室溫下反應過夜。蛋白質然後在偶聯緩衝液中進行充份滲析。我們以前的研究表明，987P並沒有曝露的可偶聯的游離氨基基團，所以雙氨基的間隔基團首先如下述鍵合到蛋白質的游離羧基部份上。10毫克提純的987P加入冰醋酸在pH3.9下沉澱。纖毛通過在4℃以3000xg離心10分鐘除去，把沉澱物重新懸浮在蒸餾水中，並用1N的NaOH使pH上升至6.5，然後使纖毛溶液與1-乙基-3-(3-二甲基氨苯基)碳化二亞胺-HCl(EDAC，Bio Rad實驗室，加裡福尼亞州Richmond)在有20mM1，2-二氨乙烷(BDH化學公司，英格蘭Poole)存在下反應到0.5mM的最終濃度，在室溫下(20-23℃)過夜。將氨基取代了的987P更換兩次pH值為9.5，0.1M的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液滲析24小時，再在下列各有關步驟中使用。外源凝集素結合部位在它們與DNFB反應時通過加入外源凝集素特異糖而被保護起來。因此把50mM的D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙醯基-D-半乳糖胺、D-半乳糖、N-乙醯基-D-半乳糖胺、D-半乳糖(1-3)-D-半乳糖N-Ac，和L-巖藻糖的溶液分別加到如下的外源凝集素中伴刀豆球蛋白A、Pokeweed促細胞分裂劑、Lens Culinaris、Helix Pomatia、PhaseolusVulgaris、Glycino max、Arachis hypogea和Ulex eruopeus。
抗原的施用雌性C57BL/6J小鼠(18至22克)是從動物資源中心(西澳大利亞Perth)得到的，所有的小鼠在口服或肌肉注射(i.m.)抗原之前均經受3-4小時的飢餓，用一個專門製作的飼餵針將在pH9.5的0.5毫升的0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中具有適當濃度的抗原餵給小鼠。將同樣劑量的，在滅菌生理鹽水中的抗原通過肌肉注射到左後腿上。口服或肌肉注射接受抗原的5隻小鼠的小組，在第0天和第14天給於兩次同樣的抗原劑量。在第14天和第21天從眼巢後叢抽取血樣(約0.5毫升)，然後用頸部脫位法處死小鼠，並以下述方法清洗小腸小心地取出小腸，並用一個鈍頭的飼餵針將小量的清洗緩衝液(1.0ml，30mM Tris-HCl、PH8.8;0.9%NaCl、50mM EDTA加1.0%吐溫20)加到腸腔中，輕輕地搓揉腸子後，用食指和大拇指擠出內容物，立刻離心這樣得到的腸洗液以除去碎屑，並貯藏在-20℃以用於分析。在除去血樣中的血清並在-20℃下貯存之前允許血樣在4℃下凝結。
酶連接的免疫吸附劑測定(ELISA)用於確定抗體效價的ELISA，如前所述，用Russell-Jones等人(1984)的方法進行。
實例1黏膜免疫原活性分子的鑑別檢查了一些在口服後能附著於小腸黏膜並能刺激產生免疫反應的分子的可能的潛力，將由這些分子產生的反應與相似地餵給沒有黏膜附著功能的其它分子後看到的反應進行比較。
從表1，1中可看出，在這些實驗中，檢測到三大類的蛋白質一引起血清和腸的反應的小蛋白質，K99，987P，LTB，流感疫苗和各種外源凝集素(第一類)(這些在以後將稱為黏膜免疫原)，僅僅引起血清反應的那些蛋白質(LPS)(第二類)，以及在試驗劑量下既沒有血清反應又沒有腸反應的蛋白質(鞭毛，BSA和PS)(第三類)。在第一類抗原中，987P與LTB(12.2±4.4)或K99(3.2±4.9)相比，是IgA抗體(ab)(48.5±1.8)的極為有效的刺激劑。此外987P也比K99(3.0±5.3)或LTB(1.0)在更大的程度上刺激腸胃的IgG(10.8±1.76)，而且只有987P能夠刺激血清IgA的形成(10.8±8.8)。所有四種第一類抗原以相似的程度刺激血清IgG(表1.1)。第二類抗原，LPS激發小量的血清IgG反應(12.1±1.0)而沒有IgA或腸胃的刺激活性。最後，BSA，鞭毛和LPS的多糖部份-第三類抗原-既不誘發血清的、也不誘發腸的IgG或IgA形成。所有三類有代表性的樣品，K99，987P，LTB，LPS和鞭毛以肌肉注射方式給藥，並檢測是否同時有血清的反應和腸的反應(表1，2)。第一類和第二類抗原產生相似的血清IgG反應，但沒有產生血清IgA反應或腸的IgG/IgA反應。用肌肉注射免疫原時，只有抗-LPS的血清IgG反應得到很大的改善。在口服和肌肉給藥後進一步研究987P，K99和LTB對於劑量的反應。從表1，3和1，4中可以看出，不管給藥的方式如何，987P無論是比K99或是比LTB總是產生更高的效價。很有意義的是，第一類抗原-LTB-顯示出一個鍾型的劑量反應關係，在10與50微克之間具有一個平穩的最大值，沒有其他的第一類抗原所產生這樣的效果，LTB在肌肉給藥時也沒有這種效果。口服所有的第一類抗原(Ag)都在很寬的試驗劑量範圍上引起更高水平的腸IgA抗體的形成(S-IgA)。
這兩種給藥方式之間的比較表明，雖然肌肉注射始終產生較高的效價，但對黏膜免疫原進行口服施用所產生的抗體水平，可與肌肉注射第一類和第二類抗原10至100微克所產生的抗體水平相比擬。
表1.1口服抗原的免疫反應用於免疫的抗原免疫反應＊第21天血清的 腸的(20微克的劑量) IgG IgA IgG IgAK99 968±120 ＜4 3.0±5.2 3.2±4.9987P 776±64 10.8±8.8 10.9±1.7 48.5±1.88LTB 1351±211 ＜4 ＜4 12.2±4.4流感疫苗 179±34 ＜4 ＜4 ＜4鞭毛 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4LPS 12.1±1.0 ＜4 ＜4 ＜4pS ＜4 ＜4 ＜4 ＜4BSA ＜4 ＜4 ＜4 ＜4ConA＊＊666±84 ＜4 未測未測FW-mitogen＊＊641±119 ＜4 未測未測L.culinaris＊＊954±48 ＜4 未測未測
H.pomatia＊＊591±127 ＜4 未測未測p.vulgaris＊＊1378±110 4.8±2.3 未測未測G.max＊＊1529±65 3.1±6.9 未測未測A.hypogea＊＊1276±242 ＜4 未測未測U.europeus＊＊1583±94 ＜4 未測未測＊在37℃45分鐘後給出ELISA讀數0.5的抗血清稀釋液的倒數。每個數值代表了由5隻小鼠獲得的平均值±1個標準誤差。
＊＊每種外源凝集素，其ELISA效價代表了抗DNP的反應，是通過與DNP-BSA反應而測得的，它們是用4個DNP分子/摩爾的外源凝集素取代的。
表1.2肌肉注射抗原的免疫反應用於免疫的抗原免疫反應＊第21天(20μg的劑量) 血清的 腸的IgG IgA IgG IgAK99 1024±94 ＜4 ＜4 ＜4987P 1552±112 ＜4 ＜4 ＜4LTB 1782±100 ＜4 ＜4 ＜4鞭毛 1595±227 ＜4 ＜4 ＜4LPS 388±58 ＜4 ＜4 ＜4＊見表1.1表1.3口服抗原的劑量反應抗原免疫反應＊，第21天，每種劑量(μg)0.1 1.0 10 50 100 1000血清IgGK99 1.0 4.0 28 675 1351 4096987P 4.0 14 84 588 1024 3104LTB 9.0 194 1351 1331 891 891血清IgAK99 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4987P ＜4 ＜4 ＜4 9.6 18.3 32LTB ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4腸IgGK99 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4987P ＜4 ＜4 ＜4 4.0 4.0 8.0LTB ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4腸IgAK99 ＜4 ＜4 ＜4 4.0 16.7 87987P ＜4 ＜4 9.1 54 84 147LTB ＜4 ＜4 ＜4 4.0 4.0 8.0＊見表1.1
表1.4肌肉注射抗原的劑量反應抗原免疫反應＊，第21天時，每種劑量(μg)0.1 1.0 10 50 100 1，000血清IgGK99 256 445 776 1351 1776 5104987P 256 891 1024 3104 4096 18820LTB 64 588 1176 2702 4096 8192血清IgATK99 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4987P ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4LTB ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4小腸IgGK99 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4987P ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4LTB ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 7.0 16小腸IgAK99 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 4.6987P ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 4.0 6.0LTB ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 16.0 11.1＊見表1.1
實例 2特定食物分子對口服黏膜免疫原後的免疫反應的效應。
我們實驗室用異系交配的瑞士雄鼠所做的最初的研究表明，在口服抗原時同時飼餵某些特定食物分子，有可能改變免疫反應。因此，將黏膜免疫原K99，987P和LTB等與一些食物糖類和維生素一起飼餵給小鼠。我們推測，由於已知多種不同的抗原能附著於小腸上皮表面的不同分子上，並由於已知整個腸腔中的糖蛋白和糖脂的分布以及吸收細胞的分布有變化，因此，將抗原與這些細胞經常吸收的特定食物分子一同施用，則有可能促進這些細胞對附著分子的吸收。從此論點進一步推測下去，我們還認為對於不同的抗原來說，刺激分子可能有不同的結構。
表2.1、2.2和2.3給出的結果證明，儘管大多數維生素和糖類在調節K99、987P和LTB的免疫反應中都有些影響，但某些特定食物分子對於它所能夠影響的黏膜免疫原來說仍然具有選擇性，而且，對於究竟是首先誘導分泌或是血清反應也具有選擇性。因此，與維生素B12或蜜二糖一起施用時，K99所誘導的血清抗體反應得到顯著增加(P＜0.05)，與維生素B2、維生素D、維生素E、果糖或甘露糖一起施用時沒有什麼變化，而與維生素A、維生素B1、維生素B6、維生素C、乳糖、山梨醇和木糖等一起施用時則有不同程度的降低(表2.1)。
與此不同，將987P與維生素B6、維生素B12、維生素C、維生素E、果糖或甘露糖等一起施用時，血清抗體反應得到提高(表2.2)，與維生素A，維生素B1、維生素B2、乳糖、蜜二糖、山梨醇和木糖等一起施用時沒有什麼變化，有維生素D存在時則降低。另一方面，在共同飼餵的特定食物分子對血清抗體水平的影響中，LTB表現出獨特的性質。表2.3的結果清楚地表明，有維生素A，維生素B2、維生素D、果糖、甘露糖和木糖存在時，LBT抗血清的效價增大。使用維生素B1、維生素B12、維生素C或密二糖則很少或沒有變化，而用維生素B6、維生素E、乳糖、蜜二糖和山梨醇時則幾乎完全抑制了反應。使用維生素B6、乳糖、蜜二糖和山梨醇時觀察到的這種免疫反應的抑制是可以預料的，因為這些化合物與半乳糖的結構相似，而半乳糖被認為是能夠結合LTB的GM1神經節苷脂上的特異性糖決定子。從這些結果可以大致認為，K99、987P和LTB能夠和微絨毛上皮的分散細胞結合併被其吸收。
劑量反應實驗(表2.4、2.5和2.6)表明，只要在口服黏膜免疫原中簡單地加入特定食物分子，就有可能促進免疫系統的分泌臂，而並不同時刺激血清抗體，或者與此相反，加強血清反應而不影響分泌抗體的水平。這樣，K99與大劑量的維生素B12或蜜二糖的共同飼喂，導致血清抗體分別上升兩倍到八倍，而很少同時導致分泌抗體的上升。相反，增加維生素D的共同飼餵劑量，導致血清抗體的下降和分泌抗體的上升。另一方面，某些特定食物分子也能同時促進分泌抗體和血清抗體的效價，如所表明的那樣，共同飼餵維生素C和987P可使血清抗體上升八倍，使血清IgA上升1000倍。
用黏膜免疫原和維生素或糖類一起作肌肉注射的實驗表明，這種注射對免疫反應很少有-如果有一點的話-什麼效應，這證明與黏膜免疫原一起飼餵這些分子而導致的反應變化一定是在這些分子的吸收部位或其附近發生的，而不是直接作用於免疫系統(表2.7)。
表2.1特定食物分子對口服K99(20μg)＊後的免疫反應的影響。
抗體反應特定食 劑量 血清 小腸物分子 IgG IgA IgG IgA對照 - 968±120 ＜4 3.0±5.2 3.2±4.9VitA 20μg 278±184 3.4±4.7 1.5±1.1 5.4±3.0VitB1″ 117±107 1.5±2.0 2.7±1.0 2.1±0.9VitB2″ 604±216 ＜4 2.3±1.7 2.0±0.6VitB6″ 14±50 ＜4 2.0±1.5 3.5±8.2VitB＊＊12″ 3377±1266 4.0±3.0 ＜4 ＜4VitC＊＊″ 318±255 2.0±2.8 32±1.1 98±70VitD＊＊″ 1921±640 ＜4 ＜4 6.3±2.7VitE ″ 512±128 ＜4 ＜4 4.4±2.1果糖 50mM 1782±966 8.4±3.7 2.9±1.6 34.7±14.2乳糖 ″ 84±204 ＜4 ＜4 22.9±6.7甘露糖 ″ 1176±411 2.6±3.4 10.2±3.4 21.1±40.3蜜二糖 ″ 1840±208 1.2±1.4 3.2±2.0 4.4±3.7山梨醇 ″ 77±179 ＜4 1.3±0.4 20.5±3.4木糖 ″ 328±217 ＜4 1.9±1.1 2.8±1.3＊在免疫後21天，在37℃保溫45分鐘後，ELISA的讀數為0.5的稀釋抗體血清的倒數。每個數值是5隻小鼠的平均值±1個標準差。
＊＊每個數值是15隻小鼠的平均值±1個標準差。在劑量反應實驗中也做了這些分子的實驗。
表2.2特定食物分子對口服987P(20μg)＊後的免疫反應的影響。
特定食 劑量 血清 抗體反應 小腸物分子 IgG IgA IgG IgA對照 - 776±64 10.8±8.8 10.9±1.7 48.5±1.8VitA＊＊20μg 648±40 29.0±20 8.4±3.1 20.5±24.6VitB1″ 891±127 12.1±3.6 9.4±1.5 14.7±5.5BitB2″ 1082±271 31.1±11.9 17.8±7.6 21.1±11.9VitB6″ 1782±509 23.6±8.7 32.8±9.3 39.9±7.1VitB12″ 3983±1307 48.5±16.0 35.7±3.4 91.7±31.9VitC＊＊″ 4521±1046 54.2±19.2 10.8±6.9 84.1±14.3VitD＊＊″ 398±89 18.8±11.0 13.1±4.9 34.7±8.1VitE ″ 3468±776 9.18±2.6 11.1±4.2 19.9±3.9果糖 50 2048±894 10.8±3.6 15.1±4.7 23.5±3.2乳糖 ″ 1128±662 15.3±2.9 19.6±2.5 21.7±6.1甘露糖 ″ 4970±2270 24.9±11.7 14.3±1.9 16.9±26.4蜜二糖＊＊″ 1243±474 30.3±7.7 91.7±10.9 124.5±22.6山梨醇 ″ 1389±307 38.8±19.1 22.9±4.6 91.7±18.6木糖 ″ 1024±941 6.2±1.9 19.6±7.1 21.4±5.4＊見表2.1＊＊見表2.1
表2.3特定食物分子對口服LTB(20μg)＊後的免疫反應的影響。
抗體反應特定食 劑量 血清 小腸物分子 IgG IgA IgG IgA對照 - 1351±211 ＜4 ＜4 12.2±4.4VitA 20μg 4705±676 ＜4 ＜4 21.1±7.6VitB1″ 1782±309 ＜4 ＜4 16.0±2.1VitB2″ 3565±908 ＜4 ＜4 16.0±3.7VitB＊＊6″ 9.18±1.1 ＜4 ＜4 ＜4VitB12″ 1024±116 ＜4 ＜4 24.2±11.9VitC ″ 337±206 ＜4 ＜4 16.1±5.0VitD ″ 4097±74 ＜4 ＜4 13.9±2.2VitE ″ 194±64 ＜4 ＜4 18.4±3.6果糖 50mM 6208±1192 ＜4 ＜4 10.5±3.3乳糖＊＊″ 5.0±1.0 ＜4 ＜4 ＜4甘露糖 ″ 4096±658 ＜4 ＜4 24.2±8.1蜜二糖 ″ 512±76 ＜4 ＜4 8.0±4.0山梨醇 ″ 8.0±1.2 ＜4 ＜4 ＜4木糖 ″ 5404±2211 ＜4 ＜4 21.1±9.2＊見表2.1＊＊見表2.1
表2.4口服施用特定食物分子對口服抗原(K99)＊的免疫反應的影響特定食物分子 第21天的免疫反應，每種劑量(μg～，mM+)0.1 1.0 10 50 100 500 1000血清IgGVitB12256 675 1176 1552 2352 未測 2352VicC 512 891 588 675 1024 未測 891VitD 588 588 776 891 1782 未測 891蜜二糖 128 256 675 4096 9410 256 未測血清IgAVitB12＜4 ＜4 4.0 5.2 ＜4 未測 ＜4VitC ＜4 ＜4 4.0 16.0 16.0 未測 16.0VitD ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測 ＜4蜜二糖 ＜4 ＜4 ＜4 4.0 4.0 4.0 未測小腸IgGVitB12＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測 ＜4VitC ＜4 4.0 16.2 32.0 36.1 未測 38.0VitD ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測 ＜4蜜二糖 ＜4 ＜4 ＜4 4.0 4.0 4.5 未測小腸IgAVitB12＜4 ＜4 ＜4 ＜4 5.2 未測 13.9VitC ＜4 ＜4 4.0 16.0 36.7 未測 73.5
VitD ＜4 ＜4 4.0 8.0 13.9 未測 24.2蜜二糖 5.2 40 4.0 4.0 9.2 4.0 未測～.維生素的劑量單位為μg;+，糖類的劑量單位為mM＊見表2.1表2.5口服施用特定食物分子對口服抗原(987P)的免疫反應的影響。
每種劑量(μg～，mM+)，第21天的免疫反應特定食物分子 0.1 1.0 10 50 100 500 1000血清IgGVitA 512 675 388 891 675 未測 588VitC 891 1351 4096 8192 8192 未測 9410VitD 2352 2048 256 73 147 未測 1351蜜二糖 512 481 463 1250 1006 1292 未測山梨醇 873 1133 1024 1400 2123 85 未測血清IgAVitA ＜4 ＜4 16.0 30.0 36.0 未測 64.0VitC 4.0 4.0 32.0 66.0 73.1 未測 86.7VitD 64 16.0 16.0 16.0 28.0 未測 38.1蜜二糖 未測 未測 未測 未測 未測 未測 未測山梨醇 未測 未測 未測 未測 未測 未測 未測小腸IgGVitA ＜4 ＜4 4.6 17.2 16.1 未測 16.0VitC ＜4 ＜4 16.0 6.0 5.2 未測 16.0VitD ＜4 ＜4 ＜4 12.2 14.6 未測 14.0蜜二糖 5.0 27 75 76 38.3 4.3 未測山梨醇 50 74 64 93 294 257 未測小腸IgAVitA ＜4 ＜4 4.0 26.9 32.1 未測 16.0VitC ＜4 4.6 55 337 1024 未測 776VitD ＜4 ＜4 16.0 147 25.2 未測 36.7蜜二糖 7.6 39 65 159 58.0 16.0 未測山梨醇 52 51 67 111 178 180 未測～ 維生素劑量單位為μg;+，糖類劑量單位為mM＊見表2.1表2.6口服施用特定食物分子對口服抗原(LTB)＊的免疫反應的影響。
每種劑量(μg～，mM+)，第21天的免疫反應特定食物分子 0.1 1.0 10 50 100 500 1000血清IgGVitB62352 5048 55.7 10.5 4.6 未測 4.0乳糖 1782 1782 73.5 6.9 4.0 4.0 未測山梨醇 1024 256 18.3 13.9 4.0 4.0 未測血清IgAVitB6＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測 ＜4乳糖 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測山梨醇 ＜4 1.4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測小腸IgGVitB6＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測 ＜4乳糖 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測山梨醇 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測小腸IgAVitB65.6 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測 ＜4乳糖 4.0 4.0 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測山梨醇 4.0 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未測～維生素劑量單位為μg;+，糖類劑量單位為mM＊見表2.1表2.7共同施用不同劑量的特定食物分子對肌肉注射抗原K99，987P＊後的免疫反應的影響所用抗原 特定食 第21天的免疫反應物分子血清IgG (μg) 0.1 1.0 10 50 100 1000K99 VitB121121 1468 1572 2328 4766 2109
K99 VitD 1024 1272 1168 1372 1489 1315987P VitC 1687 1529 1707 1700 1662 1891血清IgG (mM)0.1 1.0 10 50 100 500K99 蜜二糖 1024 1176 1057 1392 1262 989987P 蜜二糖 1583 1622 1701 1519 1666 1621987P 山梨醇 1670 1577 1548 1632 1711 1651+.沒有測定血清IgA，小腸IgG或小腸IgA＊.見表2.1實例 3前面的兩個實施例表明，小劑量口服黏膜免疫原能夠顯著誘導血清IgG效價，而同時有或沒有IgA分泌抗體水平的平行上升。而且已經表明，共同施用特定食物分子能夠控制免疫反應。用於最初研究的外源凝集素具有啟動抗DNP反應的載體的功能，這一發現提示我們，至少某些黏膜免疫原具有作為其它抗原的載體的潛力，因而能夠提高大多數較難吸收的抗原穿越小腸上皮的能力。
下述研究是為了探明是否存在這樣一種載體潛力，並確定它的一些參數，以至於能夠成功地利用它作為構成新的和更有效的口服疫苗和/或口服藥物的手段。
材料和方法抗原與黏膜免疫原的結合載體的二硝基苯基化使DNFB與外源凝集素的載體如上述進行反應。
脂多糖(LPS)和多糖(PS)的結合如前述(見有關實施例)純化S.typhimurium的LPS和PS。用過碘酸鹽法(Avrameus和Ternynck，1971)使LPS和pS偶聯到MI上。
戊二醛的偶聯利用Avrameus等人(1978)的戊二醛兩步法，將促黃體釋放激素(LHRH)、牛血清清蛋白(BSA)(來自Sigma化學公司，密西西比州，聖路易斯)和S.typhimurium鞭毛分別單獨偶聯到MI上。簡而言之，使所需要的蛋白與0.2%的戊二醛在室溫下反應兩小時。讓蛋白質在ph9.5的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中透析過夜，然後根據需要加入不同摩爾比率的MI，抗原MI為5、10、20和40∶1，並在室溫下反應24小時。最後，加入最終濃度為0.1M的乙醇胺(Sigma公司產品)(1小時，在室溫下)，然後，在pH9.5的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中於4℃下透析過夜。
與過氧化物酶結合的外源凝集素與外源凝集素Glycine max.Ara.chis hypogea Tetragonolobus purpureas和伴刀豆球蛋白A結合的過氧化物酶製劑是從Sigma公司購買的。
LHRH結合物的化學合成利用上面概述的戊二醛法使LHRH與LTB相結合。以LHRH∶LTB為20∶1的比例，向LTB中加入戊二醛活化的LHRH，並使其在室溫下過夜結合。在使用之前，使所得到的結合物在ph9.5、0.1M的碳酸鹽/碳酸氫鹽衝洗中充分透析。對照由用戊二醛單獨處理的LHRH或LTB組成。
表3.1DNP修篩的黏膜免疫原的抗體反應免疫原劑量免疫反應＊(μg) 抗-DNP 抗-載體血清IgG 小腸IgA 血清IgG 小腸IgAK99 20 ＜4 ＜4 875±62 3.9±5.1K99 100 ＜4 ＜4 1351±128 16.7±2.3DNP6.K99 20 21±10.5 ＜4 64±7.2 ＜4DNP18.K99 500 1024±77 42±9.6 128±27.4 76±12.9DNP1.8.K99 500 1176±164 28±14.4 3565±192 88±21.0987P 20 ＜4 ＜4 891±76 27.8±13.6987P 100 ＜4 ＜4 1024±89 84±22.4DNP6.987P 20 24±3.1 ＜4 147±12.2 ＜4DNP25.987P 500 1024±244 14±3.1 111±34.1 68±19.2DNP2.5.987P 500 1351±196 7±1.4 2048±166 128±38.4LTB 20 ＜4 ＜4 1351±211 12.2±4.4DNP2.3.LTB 20 24.3±5.6 ＜4 445±35 ＜4LTB 100 ＜4 ＜4 891±56 4.0DNP6BSA 20 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4DNP6BSA 100 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
伴刀豆球蛋白A＊＊20 666±84 ＜4 未測未測PW-mitogen＊＊20 641±119 ＜4 未測未測L.culinaris＊＊20 954±48 ＜4 未測未測H.pomatia＊＊20 591±127 ＜4 未測未測p.vulgaris＊＊20 1378±110 4.8±2.3 未測未測G.max＊＊20 1529±65 3.1±6.9 未測未測A.hypogea＊＊20 1276±242 ＜4 未測未測U.europeus＊＊20 1583±94 ＜4 未測未測＊在37℃保溫45分鐘後ELISA的讀數為0.5的抗血清稀釋液的倒數。每個數值為5隻小鼠的平均值±1個標準差。
＊＊每個外源凝集素用4個DPN基團取代。
表3.2K99作為多種抗原的載體的能力克分子 免疫反應免疫原 比率 劑量 抗原 載體(μg) 血清IgG 小腸IgA 血清IgG 小腸IgAK99 - 20 ＜4 ＜4 875±62 3.9±5.1K99 - 100 ＜4 ＜4 1351±94 16.7±2.8BSA-K99 1∶4 20 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4BSA-K99 1∶5 500 ＜4 ＜4 73.5±11.2 ＜4BSA-K99 1∶10 500 ＜4 ＜4 147±48.2 ＜4BSA-K99 1∶20 500 222±47 126±29.2 3809±226 84±16.6BSA-K99 1∶40 500 73±19.6 44±7.5 3176±391 64±11.9Flag-K99 1∶5 20 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4
LPS-K99 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4PS-K99 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 299±101 5.2±2.6BSA - 20 ＜4 ＜4 - -鞭毛 - 20 ＜4 ＜4 - -IPS - 20 12.1±2.7 4 - -PS - 20 ＜4 4.2±0.4 - -＊見表3.1＊＊重量比率表3.3987P作為各種抗原的載體的能力免疫反應克分子 劑量 抗原 載體免疫原 比率 (μg)血清IgG 小腸IgA 血清IgG 小腸IgA987P - 20 ＜4 ＜4 891±76 27.8±13.6987P - 100 ＜4 ＜4 1024±83 84±26.7BSA-987P 1∶4 20 ＜4 ＜4 84±2.6 ＜4BSA-987P 1∶5 500 ＜4 ＜4 256±49 ＜4BSA-987P 1∶10 500 29.8±7.4 4.6±2.2 675±110 ＜4BSA-987P 1∶20 500 306±88 122±47.6 4263±408 194±38.6BSA-987P 1∶40 500 124±47 110±38.4 4705±521 156±55Flag-987P 1∶5 20 1552±361 ＜4 - -LPS-987P 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 194±28.6 ＜4PS-987P 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 337±96 5.2±6.8
BSA - 20 ＜4 ＜4 - -鞭毛 - 20 ＜4 ＜4 - -LPS - 20 12.1±2.7 ＜4 - -PS - 20 ＜4 4.2 0.4 - -＊見表3.1＊＊重量比率表3.4取代載體的劑量改變對免疫反應的影響劑量免疫反應(血清IgG)＊抗原 (μg) 抗-BSA 抗-載體BSA0.03.K99 70 13.9±4.4 776±148BSA0.03.K99 140 36.7±14.6 1782±174BSA0.03.K99 280 73.5±22.1 1989±215BSA0.05.987P 70 36±2.6 891±109BSA0.05.987P 140 168±23.7 1552±176BSA0.05.987P 280 337±43.7 2042±180＊見表2.1
表3.5化學鍵結合的LHRH-LTB對雌鼠生殖器的影響用藥 劑量 卵巢 佔體重結合物 偶聯方式 途徑 (μg)編號 體重 +子宮 的%LHRH-LTB 足量 OS/OS 20 5 21.19 0.03 0.17%LHRH-LTB 足量 OS/OS 50 5 21.16 0.04 0.23%LHRH 足量 OS/OS 50 6 20.13 0.11 0.62%LTB 足量 OS/OS 50 3 18.18 0.14 0.76%LHRH-LTB 足量 im/im 50 6 20.16 0.16 0.97%LHRH，LTB 混合 OS/OS 50 7 27.32 0.15 0.55%LHRH，LTB 混合 im/im 50 7 30.07 0.26 0.73%LTB - OS/OS 50 7 28.26 0.24 0.87%- - OS/OS - 5 19.19 0.16 0.82%＊動物在0和14天接受抗原，第28天將鼠處死，將其生殖器稱重。
OS口服;im肌肉注射表3.6遺傳建成的LHRH結合物對雌鼠生殖器的影響佔體重的%劑量 卵巢卵巢+子宮結合物 給藥途徑(μg) 體重 +子宮/總體重＊B-gal-(LHRH)3.5 im/im 20 19.47 0.10 0.49B-gal-(LHRH)3.5 im/im 20 18.44 0.10 0.56B-gal-(LHRH)3.5 im/im 50 19.39 0.10 0.54
LTB-(LHRH)3.5 OS/OS 20 19.35 0.08 0.39LHRH OS/OS 20 19.34 0.10 0.44LHRH im/im 20 19.39 0.15 0.76- im/im - 17.74 0.08 0.46- OS/OS - 18.63 0.11 0.60用於肌肉注射的所有抗原都是在Montanide中使用的，而Im/im的對照則注射Montanide/鹽水的混合物。
＊動物在0和14天接受抗原，在第28天將鼠處死，將它們的生殖器稱重。
LHRH與β-半乳糖苷酶和LTB的遺傳融合一種質粒載體的建成一種融合的LTB/LHRH雜交多肽的表達1、含有LTB編碼序列的DNA片段從含有克隆的LTB基因的pBR322質粒中(Leong等人，1985)，從修飾過的大腸桿菌RC411菌株的NP307質粒中(Dallus等人，1979)，得到了Hind Ⅲ片段，該片段是在標準條件下，利用LTB的終止密碼附近的SpeⅠ位點，然後用綠豆核酸酶降解得到的。(除非加以特別說明，用於DNA重組技術的標準條件和限制性核酸酶如《分子克隆-實驗手冊》中所述，Maniatis、Fritsch和Sambrook編，Cold Spring Harbour Laboratory，1982)。這樣就去掉了通常位於LTB中第123胺基酸之後的終止密碼子，去掉了DNA的9個鹼基對，並偶然產生了一個如下所示的Hind Ⅲ位點Hind Ⅲ部位Hind Ⅲ部位 Ile Ser Met LysLBT編碼序列 ATC AGT ATG AAA GCTT121 122大小＝573鹼基對在標準條件下，對pUC13載體質粒進行HindⅢ降解的磷酯酶處理，然後使此片段與該載體相連接(Messing，1983)。這樣做是為了pUC13中剩下的聚合連接物區位於含有LTB序列的DNA插段的下遊，該聚合連接物區中包括PstⅠ、SalⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、SstⅠ和EcoRⅠ等的位點。
2、編碼LHRH的合成的寡聚核苷酸的產生設計兩個長度為30鹼基對寡聚核苷酸，具有下面所示的A和B的序列，它們如C所示形成重迭的雜交雙螺旋，這樣形成的雙螺旋編碼激素LHRH肽段的10個胺基酸的完全線性重複(Schally和Coy，1983，《肽和蛋白質在生殖控制中的作用》，MaCann和Dhindsa主編，Elsevier Science Publishing公司，89-110頁)。在此序列中，穀氨酸替換了通常位於N-端的焦穀氨酸。
A.5′ GAG CAC TGG TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG 3′
使寡聚核苷酸在40℃下，在50mM NaCl 10mM Tris pH7.5中一起退火一小時，用Klenow進行末端填充，然後，利用常規方法，使混和物與M13、mp18的SmaⅠ切口相連接。分離含有DNA插段的M13噬菌體，用雙脫氧法確定插段的DNA序列。一個被定名為P29的重組體，被選來用作融合產物的生成。下面給出了插段中SmaⅠ位點區域的DNA序列，以及它所編碼的胺基酸序列。
β-半乳糖苷酶的N末端，α片段Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Leu ArgATG ACC ATG ATT ACG AAT TCG AGC TCG GTA CCC CTT CGAEcoRⅠPro Gly Glu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro GlyCCC GGG GAG CAC TGG TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG←1→Clu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Glu His TrpGAG CAC TGG TCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG GAG CAC TGG←2→←Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly Gly Asp Pro Leu Glu Ser ThrTCC TAC GGC CTT CGA CCC GGG GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC-3→ HincⅡ上面的DNA序列證實，來自合成的寡聚核苷酸的DNA插段在編碼系統中插入了大約3.5個重複的LHRH編碼序列(34個胺基酸)。LHRH的完整編碼區已用箭頭標出。
用EcoRⅠ和HincⅡ降解P29的複製DNA(它在上面的DNA序列中標出了降解位點)，利用標準條件進行末端填充。通過聚丙烯醯胺凝膠電泳分離140鹼基對的小片段。
3、LTB/LHRH融合載體的構建將含有插入Hind Ⅲ部位的LTB編碼序列的pUC13質粒(見上述第1部分)，在標準條件下用SalⅠ進行降解、填充末端並用磷酯酶進行水解。然後，再把載體DNA連接到來自p29，已填充末端的EcoRⅠ/HincⅡ片段上(見上述第2部分)。該融合體有下列胺基酸序列。
胺基酸1-122(lys)-ala-trp-ala-ala-gly-arg-asn-ser-ser-ser-val-pro-LTB編碼序列leu-arg-pro-gly-〔glu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly〕3-LHRHgly-asp-pro-leu-glu-ser-arg-leu在位於LHRH序列24鹼基的上部有一個終止密碼子，它限定一個具有122個胺基酸的LTB，34個胺基酸的LHRH重複序列和接鄰區域的20個胺基酸的總長為176個胺基酸多肽的表達。
通過用EcoRⅠ降解少量DNA製品和尋找帶有較大的EcoRⅠ片段的質粒，篩選出正確的建成質粒。為了表達由pUC13的乳糖啟動子驅動所產生的多肽，進一步篩選假定正確的質粒。將細菌抽提物用聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析，然後轉移到硝化纖維素薄膜上，用抗LTB和LHRH接合物的兔抗血清進行Western印跡法測試。兩種抗血清都可檢測到所需大小的肽。
4、表達質粒K66和表達菌株BTA1185的構建通過瓊脂糖凝膠層析，分離3中所述的帶有LTB-LHRH融合序列的pUC13質粒中的573鹼基對的EcoRⅠ片段，此片段含有完整的LTB-LHRH融合產物的編碼區域，並把它接到用磷酯酶水解過的表達顆粒pKK223-3(pharmacia公司產品)的Eco RⅠ切口上。所得到的表達質粒PBTA K66使融合蛋白的表達置於tac啟動子的控制下，此處的表達是由IPTG所誘導的。將質粒轉化到大腸桿菌宿主菌株JM101中(SupE，thi，(lac-proAB)IF′traD36，pro AB lacIqZM15)，從而得到宿主-載體表達系統BTA1185。
5、用於動物試驗的LTB/LHRH融合蛋白的生產和純化按前述方法培養LTB(LHRH)3.5生產菌株，用IPTG誘導2小時後，通過離心(3000xg，10分鐘，4℃)使細菌沉澱。然後，把細菌再懸浮在蒸餾水中，在French Press中溶菌。通過離心(18，000xg，10分鐘，4℃)除去細菌碎片後，把上清液加到agthio-半乳糖柱(Sigma)中。再用0.5M半乳糖溶液洗脫融合蛋白，並用pH9.5的0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液進行透析。
抗原的施用以及免疫反應的測定所有的口服方法，抗體的收集以及ELISA的測定都如前述。
結果黏膜免疫原載體潛力之論證所有測試過的黏膜免疫原都顯示出具有有效地運載共價結合的半抗原DNP通過腸黏膜的能力，並且在飼餵二硝基苯基化的黏膜免疫原後，引起血清的抗-DNP抗體的反應。然而，在測試的濃度下，DNP修飾的BSA完全不能產生抗-DNP或抗-BSA反應(表3.1)。初期試驗時，將K99和987P與比DNP大得多的分子複合後，不能產生對黏膜免疫原或對與它連接的分子的免疫反應(表3.2和3.2)，這可能是由於纖毛與黏膜上皮的結合受到了立體幹擾。因此，便決定改變抗原與黏膜免疫原(MI)的比例。在進行BSA∶纖毛的不同比例試驗中，發現當飼餵的BSA∶纖毛的比例大於1∶20時，即使劑量為500ug，也不可能產生抗-BSA或抗-纖毛的反應，這就說明複合物不可能有效地與黏膜上皮結合，進而產生免疫反應。但是，當使用的比例為1∶20或1∶40時，則可以觀察到產生了對BSA和纖毛的有效反應(表3.2和3.3)。免疫反應的強弱很容易隨著所飼餵的複合物的劑量而改變(表3.4)。
口服結合了LTB的LHRH，不論是服用20或50ug LHRH-LTB，都會使雌鼠子宮和卵巢的總重量顯著減少(P＜0.05)(表3.5，3.6)。單獨服用LHRH或LTB或兩者一起服用，或肌肉注射LHRH-β-半乳糖苷酶，LHRH-LTB或游離LHRH，都看不到重量的減少。在發育過程中，當卵巢中的成熟卵泡完全沒有了時，也看到了重量減少的效果，這就意味著，這些動物被有效地「閹割」了。當老鼠服用遺傳構建的LTB-(LHRH)融合蛋白時，生殖器官的重量只有少量減少(表3.6)，而在本試驗中，在試用的劑量下，這種減少是微不足道的。
實例4口服抗原後細胞中介免疫性的誘導通過測定血清和腸內抗體的產生，表明服用黏膜免疫原，能有效地產生黏膜反應。然而，尚不得知是否同時刺激了對黏膜免疫原的細胞中介的免疫(CMI)反應。
下面所設計的試驗就是把通過口服黏膜免疫原與通過經典的皮下(S.C.)注射弗氏完全佐劑(Complete Freund′s adjuvant)(CFA)中的抗原所產生的CMI作個比較。
方法通過飼餵在pH為9.65，0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液中的20ug抗原和皮下注射在CFA中的20ug抗原對雄性C57Bl/6J鼠進行免疫。對照只接受緩衝液和佐劑。免疫七天後，給左後爪墊注射在20ul生理鹽水中的10ug抗原，同時給右後爪墊只注射20ul生理鹽水。24小時後，用測微計測定左後和右後爪墊厚度的不同。
結果表4.1所顯示的結果說明，口服987P或LTB黏膜免疫原後產生了有效的細胞免疫反應。實際上，這種反應的強度是令人驚異的，因為它只比用CFA皮下注射抗原有輕微的減少。
表4.1口服黏膜免疫原所產生的細胞中介的免疫反應免疫方法抗原 對照 口服 皮下注射987P 11±2 31±6.6 38±5LTB 5±4.5 14±3.7 26±5.8＊結果說明了用抗原免疫後爪墊厚度的增加。結果是5個鼠的平均值±標準誤差。
工業上的應用本發明的工業應用包括施用給脊椎動物宿主之口服藥物的製備。
可能作為口服疫苗的疫苗變應原各種草類花粉大麥，茅草雜草花粉車軸草，去毛尾樹木花粉梣樹，Cyprus植物花粉金雀花上皮貓毛，狗毛，豬毛其他室內塵埃，麥糠，木棉激素LHRH，FSH，HGH，抑制素疫苗血球凝集素來自流行性感冒，麻疹，風疹，天花，黃熱病，白喉，破傷風，霍亂，鼠疫，斑疹傷寒，卡介菌，流感嗜血桿菌，黏膜炎奈瑟氏菌，肺炎桿菌，肺炎球菌，鏈球菌特別是鏈球菌變種。
纖毛來自大腸桿菌，淋病奈瑟氏球菌，N.meningitis，
黏膜灰奈 氏菌，耶爾森氏菌種，綠膿假單胞菌，假單胞菌種，牛摩拉克氏菌，Bacteroides nodosus，葡萄球菌種，鏈球菌種，博代氏桿菌種。
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補正 86103835文件名稱 頁 行 補正前 補正後權利要求
書 7 7 ATCC ATCC67114說明書 44 10 3.2和3.2 3.2和3.權利要求
1.一種含有與載體分子相連接的免疫原之複合物，該載體分子能特異地與脊椎動物宿主的黏膜上皮相互作用，其特徵在於免疫原的免疫學活性及載體分子與脊椎動物宿主的黏膜上皮發生特異的相互作用的能力能基本保留，並且上述複合物能誘發脊椎動物宿主的全身的，細胞的和/或黏膜的免疫反應。
2.根據權利要求
1的複合物，其特徵在於上述的免疫原選自一種激素、治療劑、抗原或半抗原的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
3.根據權利要求
1的複合物，其特徵在於上述的複合物能誘發脊椎動物宿主全身的或細胞的免疫反應。
4.根據權利要求
1的複合物，其特徵在於上述的複合物能誘發脊椎動物宿主的黏膜免疫反應。
5.根據權利要求
1到4中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是一個抗原或半抗原的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
6.根據權利要求
1到5中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是一個激素的全部、部分、類似物、衍生物或它們的組合物。
7.根據權利要求
1到6中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是促黃體釋放激素的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
8.根據權利要求
1到6中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是FSH、HGH、抑制素。
9.根據權利要求
1到5中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是一個變應原。
10.根據權利要求
9的複合物，其特徵在於變應原是草類花粉、雜草花粉、樹木花粉、植物花粉、貓毛、狗毛、豬毛或其他的上皮或室內塵埃、麥糠或木棉。
11.根據權利要求
1到4中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是一種表面蛋白質，來源於流行性感冒，麻疹，風疹，天花，黃熱病，白喉，破傷風，霍亂，鼠疫，斑疹傷寒或卡介菌等致病劑，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，黏膜炎奈瑟氏菌(Neisseria catarrhalis)，肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)，肺炎球菌(pneumococci)和鏈球菌(streptococci);或是一種纖毛，來源於大腸桿菌，淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)，N.neningitidis，黏膜炎奈瑟氏菌(N.catarrhalis)，耶爾森氏菌種(Yersinia spp.)，綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，假單胞菌種(Pseudomonas spp)，牛摩拉克氏菌(Moraxella bovis)，Bacteroides nodosus，葡萄球菌種(Staphylococci spp)，鏈球菌種(Streptococci spp)和博代氏桿菌種(Bordetella spp)。
12.根據權利要求
1到4中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是一種表面多糖，來源於白喉，破傷風，霍亂，鼠疫，斑疹傷寒或卡介菌等致病劑，流感嗜血桿菌，黏膜炎奈瑟氏菌，肺炎桿菌，肺炎球菌和鏈球菌;或是一種纖毛，來源於大腸桿菌，淋病奈瑟氏菌，N.neningitidis，黏膜炎奈瑟氏菌，耶爾森氏菌種，綠膿假單胞菌，假單胞菌種，牛摩拉克氏菌，Bacteroides nodosus，葡萄球菌種，鏈球菌種和博代氏桿菌種。
13.根據權利要求
1到4中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是一種分泌產物，來源於白喉，破傷風，霍亂，鼠疫，斑疹傷寒或卡介菌等致病劑，流感嗜血桿菌，黏膜炎奈瑟氏菌，肺炎桿菌，肺炎球菌和鏈球菌;或是一種纖毛，來源於大腸桿菌，淋病奈瑟氏菌，N.neningitidis，黏膜炎奈瑟氏菌，耶爾森氏菌種，綠膿假單胞菌，假單胞菌種，牛摩拉克氏菌，Bacteroides nodosus葡萄球菌種，鏈球菌種和博代氏桿菌種。
14.根據權利要求
11到13中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於表面蛋白質，多糖或分泌產物來源於鏈球菌變種(Streptococcus mutans)。
15.根據權利要求
1到14中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於載體分子是一種細菌粘著物、病毒血球凝集素、一種毒素或它的結合亞單位、或來源於植物或其他來源的外源凝集素的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
16.根據權利要求
15的複合物，其特徵在於載體分子是產腸毒大腸桿菌熱變性毒素的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
17.根據權利要求
15的複合物，其特徵在於載體分子是一種細菌纖毛的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
18.根據權利要求
17的複合物，其特徵在於細菌纖毛是大腸桿菌的K99或987P纖毛。
19.根據權利要求
17的複合物，其特徵在於細菌纖毛是CFAI，CFAII，K88或F41。
20.根據權利要求
15的複合物，其特徵在於載體分子是一種外源凝集素的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
21.根據權利要求
20的複合物，其特徵在於外源凝集素是伴刀豆球蛋白A(Conconvlin A)，綠藜蘆促細胞分裂劑(Pokeweed mitogen)或是Lens culinaris，Helix pomatia，Glycine max，Arachis hypogea或Ulex europeus等的外源凝集素。
22.根據權利要求
20的複合物，其特徵在於外源凝集素是相思豆毒素，天門冬碗豆，蠶豆，白花洋紫荊(Camels foot tree)，蓖麻子，Fava bean，綠海藻，毛野豌豆，雙花扁豆，馬蹄鱟，刀豆，多花紫藤，相思豆，蘇格蘭金鍊花屬，利馬豆，Limulin，牛角花屬，歐洲槲寄生，綠豆，Osage orange，Pogada tree，庭園豌豆，馬鈴薯，紅菜豆，紅海藻，西伯利亞豌豆樹，食用蝸牛，庭院蝸牛，衛茅屬喬木樹，香豌豆，西紅柿，小麥胚芽或翼狀豌豆外源凝集素。
23.根據權利要求
15的複合物，其特徵在於載體分子是一種病毒血球凝集素的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
24.根據權利要求
23的複合物，其特徵在於病毒血球凝集素是一種來自流行性感冒，麻疹，風疹，天花或黃熱病病毒的血球凝集素。
25.根據權利要求
1到4中任意一個權利要求
的複合物，其特徵在於免疫原是LHRH的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物，而載體分子是LTB的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
26.一個生產權利要求
1到25中任意一個權利要求
之複合物的方法，其特徵在於(a)使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物。(b)對免疫原進行化學修飾，至少提供一個能形成化學鍵的功能團，並且使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物;或(c)對載體分子進行化學修飾，至少提供一個能形成化學鍵的功能團，並且使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物;(d)對免疫原和載體分子進行化學修飾，以提供能形成化學鍵的功能團，並且使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物;(e)使免疫原與至少一種連接劑反應，並且使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物。(f)使載體分子與至少一種連接劑反應，並且使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物。(g)使免疫原和載體分子與至少一種連接劑反應，並且使免疫原與載體分子相互反應，構成上述的複合物。(h)上述方法步驟的任意組合。
27.一個生產權利要求
1到25中任意一個權利要求
之複合物的方法，其特徵在於提供一個DNA重組分子，該DNA重組分子包含有一個為表達免疫原的胺基酸序列編碼的第一DNA序列，一個為表達載體分子的胺基酸序列編碼的第二DNA序列以及載體DNA;用上述的DNA重組分子轉化宿主，使上述的宿主能表達含有上述複合物的雜交蛋白質產品;培養上述的宿主以得到上述的表達;收集上述的雜交蛋白質產品。
28.一個生產權利要求
1到25中任意一個權利要求
之複合物的方法，其特徵在於(a)化學合成免疫原和/或載體分子，並且按照權利要求
26的方法，通過反應形成複合物;或(b)合成一個含有免疫原和載體分子胺基酸序列的雜交肽。
29.根據權利要求
28的方法，其特徵在於肽是通過固相，酶或人工的肽合成方法進行製備的。
30.根據權利要求
29的方法，其特徵在於肽是通過固相肽合成的方法進行製備的。
31.根據權利要求
30的方法，其特徵在於合成的免疫原或載體分子，在固定到固相肽合成物的樹脂上時，分別與載體分子或免疫原連接。
32.根據權利要求
28到31中任意一個權利要求
的方法，其特徵在於合成肽是LHRH的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物。
33.根據權利要求
26的方法，其特徵在於載體分子是LTB，而連接劑是戊二醛。
34.根據權利要求
1到25中任意一個權利要求
的複合物，是用權利要求
26到31中任意一個權利要求
的方法製得。
35.一個轉化宿主的表達產品，它含有權利要求
1到25中任意一個權利要求
的複合物。
36.一種用DNA重組分子轉化的宿主，該DNA重組分子包含有一個為表達免疫原的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物的胺基酸序列編碼的第一DNA序列，一個為表達載體分子的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物的胺基酸序列編碼的第二DNA序列，以及載體DNA。
37.根據權利要求
30的轉化宿主，其特徵在於上述的宿主是革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、酵母、真菌、或高等真核生物細胞。
38.根據權利要求
36或權利要求
37的轉化宿主，其特徵在於上述的宿主是大腸桿菌。
39.定名為ATCC的轉化微生物的培養物。
40.一種DNA重組分子，它含有一個為表達免疫原的胺基酸序列編碼的第一DNA序列，一個為表達載體分子的胺基酸序列編碼的第二DNA序列以及載體DNA。
41.根據權利要求
40的DNA重組分子，其特徵在於上述的載體DNA是質粒DNA。
42.質粒pBTAK66。
43.根據權利要求
40的DNA重組分子，其特徵在於上述的載體DNA是病毒、噬菌體或柯氏質粒(cosmid)DNA。
44.一個多核苷酸序列，它包含一個第一雜交多核苷酸序列，該第一雜交多核苷酸序列為含有與載體分子的胺基酸序列融合的免疫原胺基酸序列的融合產品起編碼作用，還含有一個與上述的第一雜交多核苷酸足夠相關的序列，以至於它能夠與上述第一雜交多核苷酸序列雜交，一個由於突變，包括單個或多個鹼基置換、缺失、插入和倒位等與上述第一雜交多核苷酸序列或其雜交序列相關的多核苷酸序列，或一個為表達具有與上述融合產品類似的生物學或免疫學活性的多肽編碼的多核苷酸序列。
45.根據權利要求
44的多核苷酸序列，其特徵在於第一雜交多核苷酸序列為一個與載體分子的胺基酸序列融合的抗原或半抗原的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物的胺基酸序列起編碼作用。
46.根據權利要求
44的多核苷酸序列，其特徵在於第一雜交多核苷酸序列為與載體分子的胺基酸序列融合的LHRH的全部、部分、類似物、同系物、衍生物或它們的組合物的胺基酸序列起編碼作用。
47.一種含有權利要求
1到25中任意一個權利要求
的複合物和一個藥學上可以接受的載體或稀釋劑的藥物。
48.一種如同權利要求
47的藥物，使其適宜於口服。
49.一種如同權利要求
47的藥物，使其適宜於鼻腔使用。
50.根據權利要求
47到49中任意一個權利要求
的藥物，其特徵在於上述的藥物是膠囊、片劑、緩慢釋放的、酏劑、凝膠、軟膏或鼻腔噴霧劑形式。
51.根據權利要求
47到50中任意一個權利要求
的藥物，它還含有一種特定食物分子，該食物分子能選擇性地調節藥物抗原免疫反應的強弱和/或類型。
52.根據權利要求
51的藥物，其特徵在於特定食物分子選自胺基酸、維生素、單糖和寡糖。
53.根據權利要求
51或52的藥物，其特徵在於特定食物分子選自維生素A，維生素B1，維生素B2，維生素B6，維生素B12，維生素C，維生素D，維生素E，果糖，乳糖，甘露糖，蜜二糖，山梨醇或木糖。
54.一個將權利要求
1到25中任意一個權利要求
的複合物提供給脊椎動物宿主的方法，其特徵在於施用權利要求
47到51中任意一個權利要求
的藥物於黏膜上。
55.一個將權利要求
1到25中任意一個權利要求
的複合物提供給脊椎動物宿主的方法，其特徵在於口服權利要求
47，48，50和51中任意一個權利要求
的藥物。
56.一個將權利要求
1到25中任意一個權利要求
的複合物提供給脊椎動物宿主的方法，其特徵在於鼻腔施用權利要求
47，49，50或51中任意一個權利要求
的藥物。
57.一個抑制哺乳動物性腺功能的方法，其特徵在於施用權利要求
47到51中任意一個權利要求
的藥物於黏膜上。
58.一個選擇性調節權利要求
1到25中任意一個權利要求
複合物的免疫原的免疫反應之強弱和/或類型的方法，其特徵在於給宿主脊椎動物施用權利要求
51的藥物於黏膜上。
59.一個選擇性調節權利要求
1到25中任意一個權利要求
複合物的細胞免疫反應的方法，其特徵在於通過黏膜施用權利要求
45的藥物，以特異性地加強或削弱脊椎動物宿主對複合物的細胞免疫反應。
60.根據權利要求
58或59的方法，其特徵在於施用權利要求
47到50中任意一個權利要求
的藥物及特定食物分子。
61.一種在前面的有關實例中已進行過實質性描述的複合物。
62.一種誘導或調節宿主免疫反應的方法，實質上如同前面有關實例所述。
63.一個載體分子，實質上如同前面有關圖片所示。
專利摘要
本發明提供了一種具有載體分子的免疫原之複合物。將免疫原施用於宿主脊椎動物的黏膜上皮，在宿主脊椎動物中引起全身的、細胞的和/或黏膜的對該複合物的免疫反應。本發明還提供了生產該複合物的方法以及含有該複合物的藥物和還含有特定食物分子的藥物。特定食物分子提供了選擇性地調節該藥物複合物免疫反應的強弱和/或類型的手段。本發明提供了抑制哺乳動物性腺功能的手段，以及選擇性地調節細胞對本發明複合物的免疫反應的方法。
文檔編號A61K39/385GK86103835SQ86103835
公開日1987年4月8日 申請日期1986年5月15日
發明者格雷戈裡·約翰·拉塞爾-瓊斯, 亨利·詹姆斯·德·艾斯普魯阿, 彼得·豪基思·諾曼·蘭德 申請人:澳州生物科技公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan