檢測間充質幹細胞的標記和採用該標記識別間充質幹細胞的方法
2023-06-14 03:04:06 4
專利名稱：檢測間充質幹細胞的標記和採用該標記識別間充質幹細胞的方法
技術領域：
本發明涉及檢測、分離識別間充質幹細胞、尤其是涉及在檢測、分離識別間充質幹細胞中使用的用於檢測間充質幹細胞的基因標記和多肽標記，以及採用所述標記檢測、識別間充質幹細胞的方法。
背景技術：
眾所周知，間充質幹細胞是存在於哺乳類的骨髓等處，分化為脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞的多能性幹細胞。由於其分化的多能性，間充質幹細胞作為以再生醫療為的目的多種組織的移植材料正受到人們關注(《基因醫學》第4卷第2期(2000)p58-61)。最近，發表了關於間充質幹細胞研究現狀與展望的綜述，作出了關於間充質幹細胞的收集與培養的報告(實驗醫學、第19卷第3期(2月號)2001、p350-356)。此外，已有報導間充質幹細胞也存在於脂肪組織中(Tissue Engineering，P.A.Zuk et al.，Multilineage cells from human adipose tissueimplications for cell-based therapies.7211-228，2001)。
近年，一些專利申請公開了關於間充質幹細胞的培養、分化等內容。例如，特表平11-506610號公報中公開了關於在無血清環境下維持人間充質前體細胞生存的組和物及其方法，在特表平10-512756號公報中公開了關於為了誘導間充質幹細胞的分化將其與由前列腺素、抗壞血酸、膠原細胞外基質等組成的骨誘導因子、分化付隨因子、軟骨誘導因子等生物活性因子相接觸的方法，在特開2000-217576號公報中公開了關於在催乳激素或其等效物共存下培養多能性間充質細胞，使間充質細胞分化成脂肪細胞的方法。
首先，本發明人公開了一種通過在基底膜細胞外基質存在條件下或是在含有成纖維細胞增殖因子(FGF)等物質的培養基中培養間充質幹細胞，使得間充質幹細胞得以顯著的增殖，並且發現能夠維持其分化能力，與以前的培養方法相比獲得了效果顯著的間充質幹細胞的培養方法(特開2003-52360號公報)。並且，公開了一種為了在採集間充質幹細胞時在採集母體以安全並且容易方式進行採集，從口腔組織中分離採集間充質幹細胞的方法(特開2003-52365號公報)。
近年，隨著再生醫療的進展，由於其分化多能性，人們正關注於將間充質幹細胞作為骨、軟骨、肌肉、脂肪、齒周組織等多種組織的再生醫療性的移植材料。為了在組織的再生醫療中利用間充質細胞，首先，從活體組織中採集所述幹細胞，使其增殖，尤其是必需使其分化增殖，從而進行組織的製備。間充質幹細胞存在於骨髓或骨膜中，為了能在組織再生醫療中實現實用化，首先，必須要開發出能夠安全地從所述組織中採集間充質幹細胞的方法。而且，為了間充質幹細胞在組織再生醫療中實現實用化，必須要開發出足以確保幹細胞數量的技術。為了實現上述目的，重要的是開發出仍能維持所採集的間充質幹細胞的分化能力的培養增殖技術。
通過上述內容，本發明人開發出一種實現在採集間充質幹細胞時從採集母體中以安全且容易的方式採集的分離採集的方法。尤其是，本發明人開發了一種通過在基底膜細胞外基質存在條件下或是在含有成纖維細胞增殖因子(FGF)等物質的培養基中培養間充質幹細胞，以維持其的分化能力的形式大量增殖間充質幹細胞的方法(特開2003-52360號公報)。但是，為了使增殖培養的間充質幹細胞在再生醫療中實用化，必須確認所培養的細胞是間充質幹細胞，必須開發出檢測、識別該間充質幹細胞的方法。以前，在間充質幹細胞中，無法對該細胞的特徵標記基因進行鑑定。因此、為了使間充質幹細胞在再生醫療中實現實用化解決的重要課題是必須要開發出鑑定間充質幹細胞的標記基因，從而檢測分離識別間充質幹細胞的方法。
本發明提供了用於檢測識別間充質幹細胞的間充質幹細胞檢測用基因標記和間充質幹細胞檢測用多肽標記，用於檢測該基因標記的PCR擴增用引物，以及採用該標記和該引物檢測、識別間充質幹細胞的方法。
本發明人為了發現檢測間充質幹細胞用的標記基因，對間充質幹細胞中的各種基因的表達進行了比較，對構成標記的基因進行研究，結果發現，與序列表所示的13個基因相關的間充質幹細胞與成纖維細胞之間的表達量存在差異，間充質幹細胞中特異表達，發現這些基因是間充質幹細胞檢測用的標記，從而完成本發明。本發明含有用於檢測該間充質幹細胞標記基因的探針，和在檢測該間充質幹細胞標記基因時用於擴增被檢細胞的該基因子的PCR所用引物。此外，本發明還含有本發明的間充質幹細胞標記基因表達的多肽構成的用於檢測間充質幹細胞的多肽標記、用於檢測該多肽標記的與該多肽標記特異結合的抗體。更優選本發明含有—種採用用於檢測間充質幹細胞標記基因的探針、與多肽標記特異結合的抗體的間充質幹細胞識別方法和分離方法。
下面對完成本發明的過程進行說明，在各種幹細胞中，間充質幹細胞在骨、軟骨、肌肉、脂肪、骨骼肌、心肌、血管、神經等許多組織中保持了分化能力，因此間充質幹細胞作為再生用細胞有很大前景。但是，迄今為止未有過對間充質幹細胞特徵標記基因鑑定的描述。因此，本發明人為了確定間充質幹細胞的特徵標記基因，進行了積極地研究。也就是，本發明人首次開發，通過在FGF等存在下培養間充質於細胞，採用仍維持其分化能力的快速增殖方法，增殖間充質幹細胞，在FGF等存在下培養由該方法獲得的間充質幹細胞與人成纖維細胞，從培養細胞中抽提mRNA，以該mRNA為模板，以DNA晶片(ィンサィト社insit公司)作為探針，通過DNA微陣列法對人源間充質幹細胞與成纖維細胞中表達的基因進行比較。
9400個基因中有63個基因在間充質幹細胞中顯著高表達，141個基因顯著低表達。其中87個基因表達量差別達3倍以上(29個基因在間充質幹細胞中高表達、58個基因低表達)。從來源於三個個體的間充質幹細胞以及來源於三個個體的成纖維細胞中抽提全RNA，以它們為模板，通過半定量的RT-PCR法對上述87個基因的表達量進行調查。其結果是大多數基因的表達量未發現差異。此外，由於不同個體的間充質幹細胞，或成纖維細胞之間也存在表達量的差異，認為由個體差異引起表達差異的情形也是很多的。
根據RT-PCR，經確認間充質幹細胞中高表達的是3個基因(組織因子途徑抑制劑2(tissue factor pathway inhibitor 2)，2類主要組織相容性複合體DRβ3(majorhistocompatibility complex class2 DR beta 3)，絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑)、經確認低表達的基因有10種(基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease)1，XV-α型膠原酶(collagenase type XV alpha)，CUG三聯體重疊RNA結合蛋白(CUG triplet repeat RNAbinding protein)，皮膚橋蛋白，蛋白質酪氨酸激酶7(蛋白tyrosine激酶7)，異檸檬酸脫氫酶2，Sam68樣磷酸酪氨酸蛋白(Sam68樣phosphotyrosine protein)，C-型凝集素超家族成員2，腎上腺髓質素，載脂蛋白D)。通過測定這13個基因的表達量，使得在短時間內便宜地對難以識別的間充質幹細胞進行鑑定成為可能。尤其是，本發明中，進行基因檢索的結果是，確認了在間充質幹細胞或成纖維細胞中表達量存在差異的許多基因。由於這些基因構成了用於檢測間充質幹細胞的基因表記物，其通過構建成檢測基因用探針，以微陣列或DNA晶片等形式能夠用於檢測間充質幹細胞。
發明內容
本發明具體的是由下列物質構成的用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其具有序列表1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示的鹼基序列的基因、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，其特徵在於其為整聯蛋白，ALPHA 6(ITGA6)基因，MRNA(NM_000210)；溶質載體家族20(PHOSPHATE TRANSPORTER)、成員1(NM_005415)基因；核糖核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)，MRNA(NM_001034)基因；濾泡素抑制素(FOLLISTATIN)(FST)，轉錄變異體FST317，MRNA基因(NM_006350)；SPROUTY(DROSOPHILA)HOMOLOG 2(SPRY2)，MRNA(NM_005842)；RAB3B，成員RAS ONCOGENE FAMILY(RAB3B)，MRNA(NM_002867)基因；溶質載體家族2(FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)(NM_006516)基因；白介素13受體，ALPHA2(IL13RA2)，MRNA(NM_000640)基因；絲氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA(NM_004217)基因；MINICHROMOSOME MAINTENANCE DEFICIENT(S.CEREVISIAE)5(CE)(NM_006739)基因；甲狀腺激素受體中間子INTERACTOR 13(TRIP13)，MRNA(NM_004237)基因；類驅動蛋白6(有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白)(K)(NM_006845)基因；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(CDK2-ASSOCIATEDDUAL(NM_005192)基因；染色體凝縮蛋白G(HCAP-G)，MRNA(NM_022346)基因；CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA(NM_001826)基因；胞質分裂蛋白質調節子1(PRC1)，MRNA(NM_003981)基因；細胞增殖周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA(NM_001786)基因；CDC20(細胞增殖周期20，釀酒酵母，同源基因)(CD)(NM_001255)基因；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONICLEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791)基因；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；細胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA(NM_001237)基因；胸苷激酶1，SOLUBLE(TK1)，MRNA(NM_003258)基因；和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(黑色素瘤，p16，抑制CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)(權利要求2)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，其特徵在於其為EGF-containing fibulin-like細胞外基質蛋白1(NM 018894)基因；人胰島素樣生長因子結合蛋白5(IGFBP5)mRNA(AU132011)基因；人克隆24775 mRNA序列(AA402981)基因；蛋白聚糖1，分泌顆粒(AV734015)基因；人胰島素樣生長因子結合蛋白5(AA374325)基因；溶質載體家族21(有機陰離子轉運蛋白)，成員3(AF085224)基因；穀氨醯胺轉移酶2(C多肽，蛋白質-穀氨醯胺-γ-谷醯基轉移酶)(AL552373)基因；抗血友病因子II(凝血酶)受體(M62424)；纖維蛋白溶酶原活化因子，鳥激酶NM_002658)基因；金屬蛋白酶3組織抑制劑(Sorsby fundus dystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基質Gla蛋白(BF668572)基因；B-cell CLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要組織相容性複合體的不變多肽，II類相關抗原)(BG333618)基因；內收蛋白(adducin)3(γ)(AL135243)基因；溶質載體家族16(一元羧酸傳送子)，成員4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂醯肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂醯肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜結合蛋白質(BE858855)基因；腦源性神經營養因子(X60201)基因；或者載脂蛋白E(BF967316)基因(權利要求3)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人WNT抑制因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ11175(FLJ11175)，MRNA(NM_018349)基因；人RHO GDP解離抑止劑(GDI)β(ARHGDIB)，MRNA(NM_001175)基因；人鉀中間體/少量電導的鈣活化(SMALL CONDUCTANCECALCIUM-ACTIVATE)(NM_021614)基因；人核因子(紅細胞衍生物2)-類似物3(NFE2L3)，MRNA(NM_004289)基因；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA(NM_021643)基因；人CDNA 3′端與糖蛋白相類似的MUC18(AA302605)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ21841(FLJ21841)，MRNA(NM_024609)基因；人鋅指蛋白185(LIM區域)(ZNF185)，MRNA(NM_007150)基因；細胞周期控制中涉及的SC1＝假定的轉移-活化因子[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH酶(輔酶Q)1α子複合體，8(19K)(NM_014222)基因；酵母YEAST MCM10的人同系物；假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)PRO2249(PRO2)(NM_018518)基因；人膠原，VII型，α1(大皰性表皮鬆解症，DYSTRO(NM_000094)基因；人自分泌運動因子受體(AMFR)，MRNA(NM_001144)基因；人克隆24421 MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP586E1621(源自DKFZP586E1621克隆)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因(權利要求4)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人RESERVED(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素結合酶E2C(UBE2C)，MRNA(NM_007019)基因；人CDNA FLJ10517FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G(AK001379)基因；人軟骨連接蛋白1(CRTL1)，MRNA(NM_001884)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP434F2322(由克隆DKFZP434F2322獲得)/CDS＝未知/GB(AL133105)；人，克隆MGC9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人GLIA成熟因子，γ(GMFG)，MRNA(NM_004877)基因人CDNAFLJ23095 FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA(NM_018410)基因；人IROQUOIS類同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA(NM_005853)基因；或者人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10540(FLJ10540)，MRNA(NM_018131)基因(權利要求5)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人MRNA；CDNA DKFZP434C1915(由克隆DKFZP434C1915獲得)基因；PARTIAL CDS/C(AL137698)；人微染色體維持缺陷型(釀酒酵母(S.CEREVISIAE))7(M)(NM_005916)基因；人動力蛋白，細胞質的，中間體多肽1(DNCI1)，M(NM_004411)基因；蛋白質基因產物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA(NM_006479)基因；人含有杆狀病毒IAP重複序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR(NM_001168)基因；人UDP-N-乙醯基-ALPHA-D-半乳糖胺多肽N-乙醯基GAL(NM_004482)基因；人細胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA(NM_031966)基因；人FLAP結構特異性內切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有絲分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-類似物1(MA)基因(NM_002358)；人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人與泛素結合酶類似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人細胞色素P450類維生素A代謝蛋白(P450RAI-2)基因，(NM_019885)；人NIMA(從未有絲分裂基因A)相關激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形態生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNAFLJ10674 FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/GI(AK001536)基因；或者人著絲粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA(NM_001809)基因(權利要求6)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記基因，特徵在於其是人MRNA；CDNA DKFZP564P116(FROM克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白質激酶(TTK)，MRNA(NM_003318)基因；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT 1，IMPORTINα1)基因(KPNA(NM_002266)；人聚合酶(DNA導向的)，θ(POLQ)，MRNA(NM_006596)基因；人ETS變異體基因5(ETS相關分子)(ETV5)，MRNA基因(NM_004454)；人含轉化酸性捲曲螺旋蛋白(TRANSFORMING，ACIDIC COILED-COILCONTAINING蛋白)3(TAC)(NM_006342)基因；人驅動蛋白類似物1(KNSL1)，MRNA基因(NM_004523)；人著絲粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆END＝3′/GB＝AI12(AI123815)基因；人DISTAL-LESS HOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓細胞性白血病病毒癌基因同系物類似物2基因(NM_002466)；或者人血清剝奪反應(磷脂醯絲氨酸結合PRO(NM_004657)基因(權利要求7)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI基因，大亞基(RNASEHI)，MRNA(NM_006397)；人ANILLIN(果蠅SCRAPS同系物)，肌動蛋白結合蛋白基因(NM_018685)；人H4組蛋白家族，成員G(H4FG)基因，MRNA(NM_003542)；人G蛋白連結受體37(內皮縮血管肽受體B型-(NM_005302)人泛素載體蛋白(E2-EPF)，MRNA基因(NM_014501)；人，類似於腫瘤差別表達1，克隆IMAGE3639252，(BC007375)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICALPROTEIN)MGC2577(MGC2577)，MRNA(NM_031299)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEXIN A3(ANXA3)，MRNA(NM_005139)基因；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，與核糖體蛋白L39類似，克隆MGC20168IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蠅)類似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)(權利要求8)、和用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人蛋白酶複合體(PROSOME，MACROPAIN)26S亞基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻譯起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氫嘧啶酶-LIKE 3(DPYSL3)基因，MRNA)(NM_001387)；人ADAPTOR相關蛋白複合體1，SIGMA 2亞基(AP1S2)基因(NM_003916)；人網蛋白1，中間絲結合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人異種核蛋白U(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I類多肽相關序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相關蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受體膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚穀氨酸結合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人幹擾素誘導的C型肝炎相關MICROTUBULARAG(NM_006417)基因；人蛋白激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亞基(NON-CATALYTIC SUBUN)基因(NM_002733)；人前膠原-脯氨酸，2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE(脯氨酸(NM_004199)；人血管內皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因產物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)(權利要求9)、和具有與權利要求1-9中任一記載的用於檢測間充質幹細胞的基因標記在嚴謹條件下雜交的DNA序列的用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針(權利要求10)、和由上述任一記載的鹼基序列的反義鏈的全部或者部分構成的權利要求10記載的用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針(權利要求11)、和用於檢測間充質幹細胞基因標記的微陣列或DNA晶片，特徵在於其固定有至少一個及一個以上的權利要求10或11記載的DNA(權利要求12)、和上述的用於檢測間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片，特徵在於其固定有具有序列表序列號1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示鹼基序列基因組、和檢測出權利要求2-9中任一記載的基因組的2個以上基因的探針(權利要求13)、和用於檢測間充質幹細胞的多肽標記，特徵在於其是具有序列表的序列3、5、8、13、16或18所示的胺基酸序列的多肽(權利要求14)、和一種抗體，特徵在於其受權利要求14記載的多肽誘導、與該多肽特異性結合(權利要求15)、和權利要求15記載的抗體，其特徵在於抗體是單克隆抗體(權利要求16)和權利要求15記載的抗體，其特徵在於抗體是多克隆抗體(權利要求17)。
此外，本發明還由下列物質組成識別間充質幹細胞的方法，特徵在於從被檢細胞中檢測出權利要求1-9中任一項記載的間充質幹細胞標記基因表達(權利要求18)、和權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用RNA印跡法檢測間充質幹細胞標記基因的表達(權利要求19)、和權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用用於檢測權利要求10或11記載的間充質幹細胞標記基因的探針對間充質幹細胞標記基因的表達進行檢測(權利要求20)、和權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用用於檢測權利要求12或13記載的間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片對間充質幹細胞標記基因的表達進行檢測(權利要求21)、和識別間充質幹細胞的方法，其特徵是權利要求18-21中任一記載的間充質幹細胞標記基因表達的檢測包括定量或半定量的PCR的使用(權利要求22)、和權利要求22記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是其使用的定量的或半定量的PCR是RT-PCR法(權利要求23)。
此外，本發明還由以下物質組成由具有序列表的序列號20所示的鹼基序列的正義引物以及具有序列表的序列號21所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號22所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號23所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號24所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號25所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號26所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號27所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號28所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號29所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號30所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號31所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號32所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號33所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號34所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號35所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號36所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號37所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號38所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號39所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號40所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號41所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號42所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號43所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號44所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號45所示的鹼基序列的反義引物構成的用於擴增間充質幹細胞的RT-PCR用引物(權利要求24)、和由具有序列表的序列號47所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號48所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號49所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號50所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號51所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號52所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號53所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號54所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號55所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號56所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號57所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號58所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號59所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號60所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號61所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號62所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號63所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號64所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號65所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號66所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號67所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號68所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號69所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號70所示的鹼基序列的反義引物構成的擴增間充質幹細胞標記基因的實時PCR所使用的引物(權利要求25)、和具有序列表的序列號71所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號72所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號73所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號74所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號75所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號76所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號77所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號78所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號79所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號80所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號81所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號82所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號83所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號84所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號85所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號86所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號87所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號88所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號89所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號90所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號91所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號92所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號93所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號94所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號95所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號96所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號97所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號98所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號99所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號100所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號101所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號102所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號103所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號104所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號105所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號106所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號107所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號108所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號109所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號110所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號111所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號112所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號113所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號114所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號115所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號116所示的鹼基序列的反義引物構成的用於擴增間充質幹細胞標記基因的RT-PCR所使用的引物(權利要求26)。
此外，本發明還由以下物質組成權利要求1-8記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用權利要求10或11中記載的間充質幹細胞標記基因檢測用探針對被檢細胞中的基因、用權利要求24-26其中之一記載的正義引物以及反義引物中至少一對以上的引物擴增的基因進行檢測(權利要求27)、和間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用權利要求15-17其中之一記載的抗體對被檢細胞中的間充質幹細胞標記多肽的表達進行檢測(權利要求28)、和間充質幹細胞的識別方法，其特徵是將被檢細胞中由序列表的序列號1、11和19構成的間充質幹細胞標記基因組成的組中一個以上基因的表達以及由序列表的序列號2、4、6、7、9、10、12、14、15和17構成的間充質幹細胞標記基因組成的組中一個以上基因的表達組合起來，進行評價(權利要求29)、和間充質幹細胞的識別分離方法，其特徵是採用權利要求10或權利要求11記載的間充質幹細胞標記基因檢測用探針和/或權利要求15-17中任一記載的抗體對被檢細胞中間充質幹細胞檢測用標記基因和/或間充質幹細胞檢測用標記多肽的表達進行檢測、對識別出的間充質幹細胞進行分離(權利要求30)、和權利要求30記載的間充質幹細胞的識別分離方法，其特徵是通過採用權利要求15-17中任一記載的抗體的螢光抗體法將被檢細胞中的間充質幹細胞進行標識、分離經標識的間充質幹細胞(權利要求31)、和用於識別間充質幹細胞的試劑盒，其中裝備有權利要求10或11記載的用於檢測間充質幹細胞標記基因的探針、固定有該探針的權利要求12或13記載的用於檢測間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片、和權利要求15-17中任一記載的抗體中至少一個以上的抗體(權利要求32)。
圖1.表示的是本發明的實施例中，由半定量RT-PCR法獲得的人間充質幹細胞或人成纖維細胞間由個體(的不同)產生差異很大的基因。
圖2.表示的是本發明的實施例中，由半定量RT-PCR法獲得的MSC中高表達的基因。
圖3.表示的是本發明的實施例中，由半定量RT-PCR法獲得的MSC中低表達的基因。
圖4.表示的是對於確認了間充質幹細胞中高/低表達的13個基因，從來源於7個個體的間充質幹細胞和來源於4個個體的成纖維細胞中抽提全部RNA，以其為模板通過RT-PCR法，對它們的表達量進行確認的結果。
圖5.表示的是本發明的實施例中，間充質幹細胞和成纖維細胞中本發明的標記基因表達狀況的試驗結果。
圖6.表示的是本發明的實施例中，間充質幹細胞和成骨細胞中各標記基因的差別基因表達的狀況。
圖7.表示的是本發明的實施例中，間充質幹細胞和成骨細胞中各標記基因的差別基因表達的狀況。
圖8.表示的是本發明的實施例中，間充質幹細胞和成骨細胞中各標記基因的差別基因表達的狀況。
圖9.表示的是本發明的實施例中，各個標記基因在間充質幹細胞和人成纖維細胞中基因的表達狀況。
圖10.表示的是本發明的實施例中，各個標記基因在間充質幹細胞和人成纖維細胞中基因的表達狀況。
圖11.表示的是本發明的實施例中，採用流式細胞儀對人細胞中間充質幹細胞DR的表達的測定結果。
圖12.表示的是本發明的實施例中，對在間充質幹細胞向成骨細胞分化誘導中各個基因的表達狀況的測定結果。
圖13.表示的是本發明的實施例中，各標記基因在骨分化誘導的第4天-28天之間基因表達的變化。
圖14表示的是本發明的實施例中，各標記基因在骨分化誘導的第4天-28天之間基因表達的變化。
圖15.表示的是本發明的實施例中，各標記基因在骨分化誘導的第4天-28天之間基因表達的變化。
圖16.表示的是本發明的實施例中，各標記基因在骨分化誘導的第4天-28天之間基因表達的變化。
具體實施例方式
本發明由對間充質幹細胞中的特異性表達的用於檢測間充質幹細胞的標記基因或用於檢測間充質幹細胞的標記多肽的表達進行檢測，識別間充質幹細胞構成。本發明中，用於檢測間充質幹細胞的基因標記構成的基因是具有序列表中序列號1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17或19所示的鹼基序列的基因。
此外，在本發明中用於檢測間充質幹細胞的多肽標記構成的多肽是具有序列表中序列號3、5、8、13、16或18所示胺基酸序列的多肽。
序列表中序列號1所示的基因是「絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑」基因，序列表中序列號2所示的基因是「腎上腺髓質素」基因，序列表中序列號4所示的基因是「載脂蛋白D(apolopoprotein D)」基因，序列表中序列號6所示的基因是「XV-α1型膠原酶(collagenase type XV alpha 1)」基因，序列表中序列號7所示的基因是「CUG三聯體重複RNA結合蛋白2(CUG triplet repeat RNA binding protein2)」基因，序列表中序列號9所示的基因是「皮膚橋蛋白」基因，序列表中序列號10所示的基因是「異檸檬酸脫氫酶2」基因，序列表中序列號11所示的基因是「2類主要組織相容性複合體DRβ3(majorhistocompatibility complex class2，DR beta 3)」基因，序列表中序列號12所示的基因是「蛋白質酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7)」基因，序列表中序列號14所示的基因是「Sam68樣磷酸酪氨酸蛋白(Sam68-like phosphotyrosine protein)」基因，序列表中序列號15所示的基因是「C-型凝集素超家族(C-type lectin superfamily)成員2」基因，序列表中序列號17所示的基因是「基質金屬酶1(matrix metalloprotease 1)」基因，和序列表中序列號19所示的基因是「組織因子途徑抑制劑2(tissue factor pathway inhibitor2)」基因，序列表中序列號46所示的基因是「主要組織相容性複合體DRα(major histocompatibilitycomplex DR alpha)」基因。
可以通過NCBI的基因資料庫中、各個登陸號AI133613(序列號1)、NM_001124(序列號2)、NM_001647(序列號4)、L01697(序列號6)、U69546(序列號7)、AW016451(序列號9)、AL545953(序列號10)、BF732822(序列號11)、AL157486(序列號12)、AA112001(序列號14)、XM_006626(序列號15)、NM_002421(序列號17)、AL550357(序列號19)、和BF795929(序列號46)獲得本發明的用於檢測間充質幹細胞的標記基因的DNA序列的信息。
進而，經確認本發明中，與成纖維細胞相比在間充質幹細胞中表達量更多的基因列舉為如下基因整聯蛋白，α6(ITGA6)，MRNA基因(NM_000210)；溶質載體家族20(PHOSPHATE TRANSPORTER)、成員1基因(NM_005415)；核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)，MRNA基因(NM_001034)；卵泡抑制素(FST)，轉錄變異型FST317，MRNA基因(NM_006350)；SPROUTY(果蠅)同源基因2(SPRY2)，MRNA基因(NM_005842)；RAB3B，成員RAS癌基因家族成員(RAB3B)，MRNA基因(NM_002867)；溶質載體家族2(FACILITATED GLUCOSE TRANSPORTER)基因(NM_006516)；白介素13受體，ALPHA 2(IL13RA2)，MRNA基因(NM_000640)；絲氨酸(或蘇氨酸)蛋白酶抑制劑12(STK12)，MRNA基因(NM_004217)；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)5(CE)基因(NM_006739)；甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA基因(NM_004237)；類驅動蛋白6(MITOTIC CENTROMERE-ASSOCIATED KINESIN)(K)基因(NM_006845)；細胞周期蛋白依賴性抑止劑3(細胞周期蛋白依賴性抑止劑3(CYCLIN-DEPENDENT KINASE INHIBITOR 3))(CDK2-ASSOCIATED DUAL基因(NM_005192)；染色體凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA基因(NM_022346)；CDC28蛋白激酶(CKS1)，MRNA基因(NM_001826)；胞質分裂的蛋白質調節子1(PRC1)，MRNA基因(NM_003981)；細胞分裂周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA基因(NM_001786)；CDC20(CDC20細胞分裂周期20，釀酒酵母同源基因)(CD)基因(NM_001255)；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINEZIPPER KINAS基因(NM_014791)；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)7(M)基因(NM_005916)；細胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA基因(NM_001237)；胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA基因(NM_003258)；或細胞周期蛋白依賴性激酶抑止劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A)(黑色素瘤，p16，抑止CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)。
含EGF的細胞微絲(fibulin)樣細胞外基質蛋白1基因(NM_018894)；人胰島素樣生長因子結合蛋白5(IGFBP5)mRNA基因(AU132011)；人克隆24775 mRNA序列基因(AA402981)；蛋白聚糖1，分泌顆粒(AV734015)；胰島素樣生長因子結合蛋白質5(insulin-like growth factor binding protein 5)基因(AA374325)；基因溶質載體家族21(有機陰離子轉運蛋白)，成員3(AF085224)；穀氨醯胺轉移酶2(C多肽，蛋白質-穀氨醯胺-γ-谷醯基轉移酶)(AL552373)基因；血友病因子II(凝血酶)受體基因(M62424)；纖維蛋白溶酶原活化因子，鳥激酶(NM_002658)基因；金屬蛋白酶組織抑制因子3(Sorsby fundus dystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基質Gla蛋白(BF668572)基因；B-cell CLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要組織相容性複合體的不變多肽，II類相關抗原)(BG333618)基因；內收蛋白3(γ)(AL135243)基因；溶質載體家族16(一元羧酸傳送子)，成員4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂醯肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂醯肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜結合蛋白質(BE858855)基因；腦源性神經營養因子(X60201)基因；或者載脂蛋白E(BF967316)基因。
人WNT抑止因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ11175(FLJ11175)，MRNA基因(NM_018349)；人RHO GDP解離抑止劑(GDI)β(ARHGDIB)，MRNA基因(NM_001175)；人鉀中間體/少量電導的鈣活化(SMALL CONDUCTANCE CALCIUM-ACTIVATE)基因(NM_021614)；人核因子(紅細胞衍生物2)-類似物3(NFE2L3)，MRNA基因(NM_004289)；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA基因(NM_021643)；人CDNA 3′END與糖蛋白相類似的MUC18基因(AA302605)；人假擬蛋白(HYPOTHETICALPROTEIN)FLJ21841(FLJ21841)，MRNA基因(NM_024609)；人ZINC FINGER蛋白185(LIM域)(ZNF185)，MRNA基因(NM_007150)；SC1＝假定的轉移-活化因子，細胞周期控制中涉及的[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH脫氫酶(輔酶Q)1α子複合體，8(19K)基因(NM_014222)；人酵母MCM10的同系物基因；假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)PRO2249(PRO2)(NM_018518)；人XV-α1型膠原酶(COLLAGEN，TYPE VII，ALPHA 1)(大皰性表皮鬆解症，DYSTRO基因(NM_000094)；人自分泌運動因子受體(AMFR)，MRNA基因(NM_001144)；人克隆24421 MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；CDNA DKFZP586E1621(FROM克隆DKFZP586E1621)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因。
人保留(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素結合酶E2C(UBE2C)，MRNA基因(NM_007019)；人CDNA FLJ10517 FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G基因(AK001379)；人骨連接蛋白1(CRTL1)，MRNA基因(NM_001884)；人MRNA；CDNA DKFZP434F2322(FROM克隆DKFZP434F2322)/CDS＝未知/GB(AL133105)基因；人，克隆MGC；9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人神經膠質成熟因子，γ(GMFG)，MRNA基因(NM_004877)；人CDNAFLJ23095 FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA基因(NM_018410)；人IROQUOIS類同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA基因(NM_005853)；或人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10540(FLJ10540)，MRNA基因(NM_018131)。
人MRNA基因；CDNA DKFZP434C1915(FROM克隆DKFZP434C1915)；PARTIALCDS/C(AL137698)；人微染色體維持缺陷型(釀酒酵母(S.CEREVISIAE))7(M)(NM_005916)基因；人動力蛋白，細胞質的，中間體多肽1(DNCI1)，M基因(NM_004411)；蛋白質基因產物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA基因(NM_006479)；人含有杆狀病毒LAP重複序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR基因(NM_001168)；人UDP-N-乙醯基-ALPHA-D-半乳糖胺多肽N-乙醯基GAL基因(NM_004482)；人細胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA基因(NM_031966)；人FLAP結構特異性內切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有絲分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-類似物1(MA)基因(NM_002358)；人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人與泛素結合酶類似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人細胞色素P450類維生素A代謝蛋白(P450RAI-2)，(NM_019885)基因；人NIMA(從未有絲分裂基因A)相關激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形態生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNA FLJ10674 FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/G基因I(AK001536)；或人著絲粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA基因(NM_001809)。
人MRNA基因；CDNA DKFZP564P116(來自克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白質激酶(TTK)，MRNA基因(NM_003318)；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT 1，IMPORTINα1)(KPNA基因(NM_002266)；人聚合酶(DNA導向的)，θ(POLQ)，MRNA基因(NM_006596)；人ETS變異體基因5(ETS相關分子)(ETV5)，MRNA基因(NM_004454)；人含轉化酸性捲曲螺旋蛋白(TRANSFORMING，ACIDIC COILED-COIL CONTAINING蛋白)3(TAC)基因(NM_006342)；人驅動蛋白類似物1(KNSL1)，MRNA基因(NM_004523)；人著絲粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆_END＝3′/GB＝AI12(AI123815)；基因人DISTAL-LESSHOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓細胞性白血病病毒癌基因同系物類似物2基因(NM_002466)；或人血清剝奪反應(磷脂醯絲氨酸結合PRO(NM_004657)基因。
用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI，大亞基(RNASEHI)，MRNA(NM_006397)基因；人ANILLIN(果蠅SCRAPS同系物)，肌動蛋白結合蛋白基因(NM_018685)；人H4組蛋白家族，成員G(H4FG)，MRNA基因(NM_003542)；人G蛋白連結受體37(內皮縮血管肽受體B型-(NM_005302)人泛素載體蛋白(E2-EPF)，MRNA(NM_014501)基因；人，類似於腫瘤差別表達1，克隆IMAGE3639252，(BC007375)基因；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC2577(MGC2577)，MRNA基因(NM_031299)；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEXIN A3(ANXA3)，MRNA基因NM_005139)；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，與核糖體蛋白L39類似，克隆MGC20168 IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蠅)類似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)。
同時，本發明中經確認的、與纖維母細胞相比較、在間充質細胞中不表達或表達量的基因是，如下列舉的基因
用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於人蛋白酶體(PROSOME，MACROPAIN)26S亞基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻譯起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氫嘧啶酶類似物3(DPYSL3)，MRNA)基因(NM_001387)；人ADAPTOR相關蛋白複合體1，σ2亞基(AP1S2)基因(NM_003916)；人網蛋白1，中間絲結合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人異種核蛋白U基因(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)；人假擬蛋白(HYPOTHETICAL PROTEIN)MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I類多肽相關序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相關蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受體膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚穀氨酸結合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人幹擾素誘導的C型肝炎相關MICROTUBULAR AG基因(NM_006417)；人蛋白質激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亞基(NON-CATALYTIC SUBUN)基因(NM_002733)；人前膠原-脯氨酸，2-氧代戊二酸鹽4-加雙氧酶(脯氨酸(NM_004199)基因；人血管內皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因產物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)本發明中，對本發明的間充質幹細胞標記基因表達進行的檢測中可以採用公知的基因表達檢測方法。例如，為了檢測本發明的間充質幹細胞標記基因的表達，可以採用RNA印跡法(northern blot)。此外，為了通過本發明的基因標記，檢測識別間充質幹細胞，可以採用具有與本發明的間充質幹細胞基因標記的DNA序列在嚴謹條件下雜交的DNA序列的探針。在採用該探針檢測間充質幹細胞中，可採用公知方法採取相應措施。例如，由序列表所示基因標記DNA序列製備出適應長度的DNA探針，給探針加上合適的螢光標記等標記，通過將其與被檢體雜交，從而對間充質幹細胞進行檢測。該DNA探針可以採用由序列表所示的本發明的基因標記的鹼基序列的反義鏈的全部或部分構成的用於檢測間充質幹細胞標記基因的探針。或者，也可以採用固定有至少1個以上所述探針的用於檢測標記基因的微陣列或DNA晶片。
此外，在製備上述DNA探針時，本發明的鹼基序列中，所謂「與用於檢測間充質幹細胞的標記基因的DNA序列在嚴謹條件下雜交」是指，例如42℃下的雜交，以及在42℃下通過含有1×SSC(0.15M NaCl、0.015M檸檬酸鈉)、0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩衝液進行衝洗，最為理想的是65℃下的雜交，以及在65℃下通過含有1×SSC、0.1％SDS的緩衝液進行衝洗。此外，影響雜交的嚴謹度的因素除上述溫度條件以外還存在各種因素，如果本領域技術人員對各種因素進行組合，就可能實現與上述列舉的雜交的嚴謹性等同的嚴謹度。
尤其是，本發明中檢測本發明的用於檢測間充質幹細胞的多肽標記時，可以使用由該蛋白質的多肽誘導，與該多肽特異性結合的抗體。該抗體可以是例如多克隆抗體和單克隆抗體。作為本發明的多肽標記的抗體，該抗體可以通過常規方法製得。採用本發明的抗體，在對被檢細胞中用於檢測間充質幹細胞的標記多肽的表達進行檢測中，可以實施採用公知抗體的免疫學測定法。所述免疫學測定法可以是例如RIA法、ELISA法、螢光抗體發等公知的免疫學測定法。
本發明可通過採用本發明的用於檢測間充質幹細胞的探針和/或本發明的用於檢測間充質幹細胞的抗體，對被檢細胞中用於檢測間充質幹細胞的標記基因和/或用於檢測間充質幹細胞的標記多肽的表達進行檢測，對識別出的間充質幹細胞進行分離得以實現。在對被檢細胞中用於檢測間充質幹細胞的標記基因檢測時，為了擴增被檢細胞的基因，可採用定量或半定量的PCR。所述PCR可採用RT-PCR(逆轉錄PCR)。進行所述PCR時，採用用於擴增用於檢測間充質幹細胞的標記基因的正義引物和反義引物組成的引物。
用於擴增本發明的用於檢測間充質幹細胞的標記基因的引物舉例如下具有序列表的序列號20所示的鹼基序列的正義引物以及具有序列表的序列號21所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號22所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號23所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號24所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號25所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號26所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號27所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號28所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號29所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號30所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號31所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號32所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號33所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號34所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號35所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號36所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號37所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號38所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號39所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號40所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號41所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號42所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號43所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號44所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號45所示的鹼基序列的反義引物。
尤其是，用於擴增本發明的用於檢測間充質幹細胞的標記基因的引物舉例如下由具有序列表的序列號47所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號48所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號49所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號50所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號51所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號52所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號53所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號54所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號55所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號56所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號57所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號58所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號59所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號60所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號61所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號62所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號63所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號64所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號65所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號66所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號67所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號68所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號69所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號70所示的鹼基序列的反義引物構成的擴增間充質幹細胞標記基因的實時PCR所使用的引物。
進而，用於擴增本發明的用於檢測間充質幹細胞的標記基因的引物列舉如下由具有序列表的序列號71所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號72所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號73所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號74所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號75所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號76所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號77所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號78所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號79所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號80所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號81所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號82所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號83所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號84所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號85所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號86所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號87所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號88所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號89所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號90所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號91所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號92所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號93所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號94所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號95所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號96所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號97所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號98所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號99所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號100所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號101所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號102所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號103所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號104所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號105所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號106所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號107所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號108所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號109所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號110所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號111所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號112所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號113所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號114所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號115所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號116所示的鹼基序列的反義引物構成的用於擴增間充質幹細胞標記基因的RT-PCR所使用的引物。
本發明中，對間充質幹細胞的識別是以下述方式進行在被檢細胞中以上述正義引物和反義引物的至少一對以上的引物進行擴增，採用用於檢測本發明的間充質幹細胞的標記基因的探針對擴增出的基因進行檢測。
本發明的用於檢測間充質幹細胞的標記基因是在間充質幹細胞中特異性高表達的基因和特異性低表達的基因，通過以組合方式檢測這些基因表達，能夠提高間充質幹細胞檢測的精確度。因此，作為在間充質幹細胞中特異性高表達的基因，可例舉為序列表的序列號1、11和19構成的間充質幹細胞標記基因，作為在間充質幹細胞中特異性低表達的基因，可例舉為序列號2、4、6、7、9、10、12、14、15、17和46構成的間充質幹細胞標記基因。進而，可以列舉出本發明中經證實的間充質幹細胞標記基因。因此，通過對各個基因的組合中的一個以上基因的表達進行組合，可以以更高的檢測精確度對間充質幹細胞進行識別。
在通過採用利用本發明的抗體的螢光抗體法，對被檢細胞中的間充質幹細胞標記多肽的表達進行檢測，從而識別分離間充質幹細胞的過程中可通過公知的方法對間充質幹細胞進行標記、分離。所述標記方法，可舉例為如螢光抗體法。在通過螢光抗體法對未分化的造血細胞進行標記中，對與本發明的用於檢測間充質幹細胞的多肽標記特異性結合的抗體進行螢光標記，通過與表達所述抗原的間充質幹細胞結合，標記間充質幹細胞(直接螢光抗體法)，或在表達抗原的間充質幹細胞與未標記的本發明的特異抗體結合後，對與標記的二次抗體結合的間充質幹細胞標記(間接螢光抗體法)、對所述經標記的間充質幹細胞分離，收集。
本發明的間充質幹細胞的檢測識別中所使用的用於檢測間充質幹細胞標記基因的探針，固定有該探針的用於檢測間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片以及本發明的用於檢測間充質幹細胞的抗體可以以裝備有上述物質的用於識別間充質幹細胞的試劑盒製品化形式存放。
下面，通過實施例更為具體地對本發明進行說明，本發明的技術範圍不受其實施例所舉例的內容限制。
實施例材料和方法(細胞)在Dalbecco’s modified Eagle’s medium(低葡萄糖)(Sigma公司製造)中添加了10％胎牛血清、1ng/ml bFGF的培養基中在37℃對人間充質幹細胞(human mesenchymal stemcell)和人成纖維細胞(human fibroblast)進行培養。
(DNA微陣列)用TRIZOL試劑(Invitrogen公司製造)從一個10cm皿的各個細胞中抽提全部RNA，用micro poly(A)purist(Ambion公司製造)提取mRNA，進行DNA微陣列(IncyteGenomics公司Kurabo Life Array analysis servis；Lot.No.KL01081)。並且，DNA微陣列分析委託Kurabo公司進行。
(半定量RT-PCR)用TRIZOL試劑(Invitrogen公司製造)從各個細胞中抽提全部RNA後，以各個1mg全部RNA為模板，採用用於RT-PCR的SuperScript first-strand合成系統(Invitrogen公司)，42℃下進行50分鐘逆轉錄反應從而合成cDNA。以合成的cDNA為模板採用Advantage 2 PCR enzyme system(Clontech公司製造)對各個基因進行擴增。94℃下變性30秒，68℃下1分鐘內退火30個循環。用於擴增各個基因的引物序列匯集在表1中。通過採用1％瓊脂糖凝膠的電泳分離擴增出的基因，通過溴乙錠染色進行檢測。
實施例檢測結果(DNA微陣列)DNA微陣列的結果表明，9400個基因中，與在成纖維細胞中相比63個基因在間充質幹細胞中的顯著表達更高，141個基因表達較低。此外，還看出了除這些基因之外的其它基因的顯著差異。其中，發現存在3倍以上差異的87個基因中，在間充質幹細胞中高表達的基因為29個基因，低表達的基因為58個基因。
(半定量RT-PCR)從源於3個個體的間充質幹細胞和源於3個個體的成纖維細胞中抽提全長RNA，以其為模板，通過半定量RT-PCR法就上述87個基因的表達量進行調查。其結果是表達量未發現差異的基因最多。此外，不同個體的間充質幹細胞或成纖維細胞間表達量存在差異，認為由個體不同產生的表達差異也很大(圖1)。
經RT-PCR證實在間充質幹細胞中高表達的基因是絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止劑(序列表的序列號1)、2類主要組織相容性複合體DRβ3(序列號11)、和組織因子途徑抑制物2(序列號19)這三個基因(圖2)。
此外，經證實低表達的基因是(序列號2)、載脂蛋白D(序列號4)、XV-α型膠原酶(collagenase type XV alpha 1)(序列號6)、CUG三聯體重疊RNA結合蛋白(CUGtriplet repeat RNA binding protein)(序列號7)、皮膚橋蛋白(序列號9)、異檸檬酸脫氫酶2(序列號10)、酪氨酸激酶7(序列號12)、Sam68樣磷酸酪氨酸蛋白(序列號14)、C-型凝集素超家族成員2(序列號15)、和基質金屬酶1(matrix metalloprotease 1)(序列號17)這10個基因(圖3)。並且，通過半定量RT-PCR法對這13個基因的表達量進行證實，所述半定量RT-PCR法是以從源於7個個體的間充質幹細胞和4個個體成纖維細胞中抽提的全長RNA作為模板的(圖4)。
實施例間充質幹細胞中各個基因的表達量的測定I以與實施例1相同方法，對本發明的基因標記在人間充質幹細胞和人成纖維細胞中的表達進行測定。所使用的RT-PCR和實時PCR的引物和實時PCR所用探針示於表2中。
間充質幹細胞和成纖維細胞中的mRNA水平的表達狀況示於圖5。此外，間充質幹細胞和成纖維細胞中相對的mRNA水平的表達狀況示於圖6、7、8。
實施例間充質幹細胞中各個基因的表達量的測定II以與實施例1相同方法，對本發明的各個基因標記在人間充質幹細胞和人成纖維細胞中的表達進行測定。所使用的RT-PCR的正義及反義引物如序列表的序列號71-116的序列所示。間充質幹細胞和成纖維細胞中的mRNA的表達狀況示於圖9和圖10。此外，間充質幹細胞/成纖維細胞的表達之比示於表3。
表3
實施例間充質幹細胞中各個基因的表達量的測定III以與實施例1相同方法，對本發明的各個基因標記在人源間充質幹細胞和人成纖維細胞中的表達進行測定。間充質幹細胞/成纖維細胞的表達之比示於表4。
(表4)(間充質幹細胞/成纖維細胞) (基因名稱)
實施例間充質幹細胞中各個基因的表達量的測定IV以與實施例1相同方法，對本發明的各個基因標記在人源間充質幹細胞和人成纖維細胞中的表達進行測定。間充質幹細胞/成纖維細胞的表達之比示於表5。表中的-表示的是在間充質幹細胞中基因不表達或極少量表達。
表5(間充質幹細胞/成纖維細胞) (基因名稱)
實施例人細胞中間充質幹細胞DR的表達的測定採用流式細胞儀測定人細胞中間充質幹細胞DR的表達。結果示於圖11中。
實施例8在間充質幹細胞的分化誘導中個基因的表達的變化以與實施例1相同方式進行RT-PCR，測定間充質幹細胞的分化誘導中各基因表達的表化。成骨細胞的分化誘導中各基因的表達示於圖12-16中。
產業上利用的可能性近年來，隨著再生醫療的發展，間充質幹細胞作為可用於多種組織的再生醫療的移植材料受到人們關注。為了將間充質幹細胞利用於組織的再生醫療中，必須要開發出確保間充質幹細胞有足夠數量的技術，同時還必須證實所培養的細胞是間充質幹細胞，重要的是檢測、分離該間充質幹細胞的方法。此外，採用抗體等從多種類型的細胞集團中分離間充質幹細胞也是有用的。根據本發明，通過對間充質細胞的特徵標記基因進行指示，就可能容易且確實地檢測識別間充質幹細胞，故而可期待為將間充質幹細胞在再生醫療中實用化作出重大貢獻。
序列表110獨立行政法人科學技術振興機構(Japan Science and Technology Agency)加藤幸夫(Yukio KATO)智再如股份公司(Two Cells Co.，Ltd.)120檢測間充質幹細胞的標記和採用該標記識別間充質幹細胞的方法130V320P006US(PCT)150JP2003-630771512000-03-10160116170PatentIn version 3.12101211652212DNA213人4001gaattgccaa ttccttgttt gtgcaaaatg gatttcatgt caatgaggag tttttgcaaa 60tgatgaaaaa atattttaat gcagcagtaa atcatgtgga cttcagtcaa aatgtagccg 120
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attattactc tgatagttaa actaactcga gattctcaga gtttatgccc ctatgattgg 120attggtttcc aaaacaaatg ctattatttc tctaaagaag aaggagattg gaattcaagt 180aaatacaact gttccactca acatgccgac ctaactataa ttgacaacat agaagaaatg 240aattttctta ggcggtataa atgcagttct gatcactgga ttggactgaa gatggcaaaa 300aatcgaacag gacaatgggt agatggagct acatttacca aatcgtttgg catgagaggg 360agtgaaggat gtgcctacct cagcgatgat ggtgcagcaa cagctagatg ttacaccgaa 420agaaaatgga tttgcaggaa aagaatacac taagttaatg tctaagataa tggggaaaat 480agaaaataac attattaagt gtaaaaccag caaagtactt ttttaattaa acaaagttcg 540agttttgtac ctgtctggtt aattctgctt acgtgtcagg ctacacataa aagccacttc 600aaagattggc aaaaaa 61640016Met Met Thr Lys His Lys Lys Cys Phe Ile Ile Val Gly Val Leu Ile1 5 10 15Thr Thr Asn Ile Ile Thr Leu Ile Val Lys Leu Thr Arg Asp Ser Gln20 25 30Ser Leu Cys Pro Tyr Asp Trp Ile Gly Phe Gln Asn Lys Cys Tyr Tyr
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ctcacagctt cccagcgact ctagaaacac aagagcaaga tgtggactta gtccagaaat 180acctggaaaa atactacaac ctgaagaatg atgggaggca agttgaaaag cggagaaata 240gtggcccagt ggttgaaaaa ttgaagcaaa tgcaggaatt ctttgggctg aaagtgactg 300ggaaaccaga tgctgaaacc ctgaaggtga tgaagcagcc cagatgtgga gtgcctgatg 360tggctcagtt tgtcctcact gaggggaacc ctcgctggga gcaaacacat ctgacctaca 420ggattgaaaa ttacacgcca gatttgccaa gagcagatgt ggaccatgcc attgagaaag 480ccttccaact ctggagtaat gtcacacctc tgacattcac caaggtctct gagggtcaag 540cagacatcat gatatctttt gtcaggggag atcatcggga caactctcct tttgatggac 600ctggaggaaa tcttgctcat gcttttcaac caggcccagg tattggaggg gatgctcatt 660ttgatgaaga tgaaaggtgg accaacaatt tcagagagta caacttacat cgtgttgcgg 720ctcatgaact cggccattct cttggactct cccattctac tgatatcggg gctttgatgt 780accctagcta caccttcagt ggtgatgttc agctagctca ggatgacatt gatggcatcc 840aagccatata tggacgttcc caaaatcctg tccagcccat cggcccacaa accccaaaag 900cgtgtgacag taagctaacc tttgatgcta taactacgat tcggggagaa gtgatgttct 960
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gatcttttcc agagtatgca actctgacgt tgatcccaga gagcagcttc agtgacaaac1800atatcctttc aagacagaaa gagacaggag acatgagtct ttgccggagg aaaagcagct1860caagaacaca tgtgcagtca ctggtgtcac cctggatagg caagggataa ctcttctaac1920acaaaataag tgttttatgt ttggaataaa gtcaaccttg tttctactgt ttt 197321018211469212PRT213人40018Met His Ser Phe Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Phe Trp Gly Val Val1 5 10 15Ser His Ser Phe Pro Ala Thr Leu Glu Thr Gln Glu Gln Asp Val Asp20 25 30Leu Val Gln Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly35 40 45
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223序列絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子正義引物40020ccaaactttg aaagccaagg tg 222102121121212DNA213人工系列220
223絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制因子反義引物40021tgcacttcaa agaccagcag g212102221121212DNA213人工序列220
223腎上腺髓質素正義引物40022
aggaatagtc gcgcaagcat c212102321122212DNA213人工系列220
223腎上腺髓質素反義引物40023cacgcattgc acttttcctc tt 222102421121212DNA213人工系列220
223載脂蛋白D正義引物40024tgaagccacc ccagttaacc t21
2102521123212DNA213人工系列220
223載脂蛋白D反義引物40025ggtcaacttc ctttgtgcgt ggt 232102621122212DNA213人工系列220
223a-1 XV型膠原蛋白正義引物40026accaaaccct atttcaagtg cc 222102721121212DNA
213人工系列220
223a-1 XV型膠原蛋白反義引物40027tagttatcca caaggcggac g212102821121212DNA213人工系列220
223CUG三聯體重複RNA結合蛋白2正義引物40028atgtttgtcg gacagatccc c212102921121212DNA213人工系列220
223CUG三聯體重複RNA結合蛋白2反義引物40029atgtgacaaa cgcacagcct c212103021120212DNA213人工系列220
223皮膚橋蛋白正義引物40030atttgaaccg gcaaggcttc 202103121121212DNA213人工系列220
223皮膚橋蛋白反義引物40031
aagtggttgt tgctcctcgg a212103221120212DNA213人工系列220
223異檸檬酸脫氫酶正義引物40032tgccatccag aagaaatggc 202103321119212DNA213人工系列220
223異檸檬酸脫氫酶反義引物40033aggcaaagat gctggcgat 19
2103421122212DNA213人工系列220
223MHC II類DRβ3正義引物40034tagctgtgga caaagccaac ct 222103521122212DNA213人工系列220
223MHC II類DRβ3反義引物40035ggcacacacc acgttctctg ta 222103621122212DNA
213人工系列220
223蛋白質酪氨酸激酶7正義引物40036tggaaccaga gcgtacgact gt 222103721119212DNA213人工系列220
223蛋白質酪氨酸激酶7反義引物40037tggctttgca gcgcttctt 192103821122212DNA213人工系列220
223類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質，T-STAR正義引物40038aggagaaggc aaggatgaag aa 222103921122212DNA213人工系列220
223類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質，T-STAR反義引物40039tgttaactcc tggagctgtg ct 222104021122212DNA213人工系列220
223C-型凝集素超家族成員2正義引物40040
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223C-型凝集素超家族成員2反義引物40041catccttcac tccctctcat gc 222104221125212DNA213人工系列220
223MMP(基質金屬蛋白酶)1正義引物40042cgactctaga aacacaagag caaga25
2104321125212DNA213人工系列220
223MMP(基質金屬蛋白酶)1反義引物40043aaggttagct tactgtcaca cgctt252104421117212DNA213人工系列220
223TFPI(組織因子途徑抑制物)2正義引物40044gtcgattctg cttttcc 172104521120212DNA
213人工系列220
223TFPI(組織因子途徑抑制物)2反義引物40045atggaatttt ctttggtgcg 20210462111045212DNA213人40046ctcccgagct ctactgactc ccaacagagc gcccaagcaa gaaaatggcc ataagtggag 60tccctgtgct aggatttttc atcatagctg tgctgatgag cgctcaggaa tcatgggcta 120tcaaagaaga acatgtgatc atccaggccg agttctatct gaatcctgac caatcaggcg 180agtttatgtt tgactttgat ggtgatgaga ttttccatgt ggatatggca aagaaggaga 240cggtctggcg gcttgaagaa tttggacgat ttgccagctt tgaggctcaa ggtgcattgg 300ccaacatagc tgtggacaaa gccaacctgg aaatcatgac aaagcgctcc aactatactc 360
cgatcaccaa tgtacctcca gaggtaactg tgctcacgaa cagccctgtg gaactgagag 420agcccaacgt cctcatctgt ttcatcgaca agttcacccc accagtggtc aatgtcacgt 480ggcttcgaaa tggaaaacct gtcaccacag gagtgtcaga gacagtcttc ctgcccaggg 540aagaccacct tttccgcaag ttccactatc tccccttcct gccctcaact gaggacgttt 600acgactgcag ggtggagcac tggggcttgg actgagcctc ttctcaagca ctgggaggtt 660gatgctccaa gcccgtctcc agagacttac gagacgtggt gtgtgccctg gggctgactg 720tgggtctggt cgggcttcct ttgggaccct ctttcatcat ccacggcgag tgcgccaaaa 780gcattgccca gaaacccagg gggccctctg taaggcctgt gcgggggcag aacggtccct 840taaaaagaag aacctcgtgg gcaaaacctg gegcaagacg tcatacaaag ggggggcata 900taacacgcgt gccccagaac gaccgcactc agggctcgcc gcctataaca ccccggtgtg 960gtacccccaa ggcgcgctaa aactaaacag cgcgcacata gtagctcagg cgatacacca1020ctcacatata taatagcacc gctaa 10452104721118
212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的腎上腺髓質素引物40047ggtttccgtc gccctgat182104821124212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的腎上腺髓質素引物40048gagcccactt attccacttc tttc 242104921122212DNA213人工系列
220
223用於RT-PCR的基質金屬蛋白酶1引物40049gatggacctg gaggaaatct tg 222105021124212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的基質金屬蛋白酶1引物40050ccgcaacacg atgtaagttg tact 242105121121212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的組織因子途徑抑制物2引物
40051ggcaacgcca acaatttcta c212105221126212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的組織因子途徑抑制物2引物40052caaactttgg gaactttttc tatcct 262105321123212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止因子引物40053tgggtggaga ataacacaaa caa 23
2105421122212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑止因子引物40054ccagataagt ggcagcatca aa 222105521128212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的蛋白質酪氨酸激酶7引物40055gggagttcct taatattctc aagttctg 282105621127
212DNA213人工系列220
223蛋白質酪氨酸激酶740056gctgtgtcct ctataatcct ggtctag 272105721120212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的膠原蛋白，XV型，α1引物40057ccagcaaccc acatcagctt 202105821123212DNA213人工系列
220
223用於RT-PCR的膠原蛋白，XV型，α1引物40058atgcagagca ggcttctcat aat 232105921129212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質引物40059tcacaacatc agacagtaca atcagtatc292106021122212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的類Sam68磷酸化酪氨酸蛋白質引物
40060acgggcaaga agagtggact aa 222106121123212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的載脂蛋白D引物40061tgagaagatc ccaacaacct ttg 232106221124212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的載脂蛋白D引物40062tgatctttcc gttttccatt agtg 24
2106321122212DNA213人工系列220
223主要組織相容性複合體DRβ40063ggctgaagtc cagagtgtcc tt 222106421118212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的主要組織相容性複合體DRβ引物40064gctgggcctg ctcttcct182106521119
212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的主要組織相容性複合體DRα引物40065gcccagggaa gaccacctt 192106621123212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的主要組織相容性複合體DR α引物40066cagtcgtaaa cgtcctcagt tga 232106721127212DNA213人工系列
220
223用於RT-PCR的C型凝集素引物40067atccattttc tttcggtgta acatcta 272106821123212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的C型凝集素引物40068catgagaggg agtgaaggat gtg 232106921124212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的CUG三聯體重複RNA結合蛋白2引物
40069catgaatgct ttacagttgc agaa 242107021119212DNA213人工系列220
223用於RT-PCR的CUG三聯體重複RNA結合蛋白2引物40070gcgctgcteg tggtagaga 192107121122212DNA213人工系列220
223整聯蛋白，α6(ITGA6)，MRNA40071gatgacagtg ttccccgata cc 22
2107221120212DNA213人工系列220
223整聯蛋白，α6(ITGA6)，MRNA40072tgtaagtcag ccacgccaaa 202107321121212DNA213人工系列220
223溶質運載蛋白家族20(磷酸鹽轉運)成員140073aatggagaag ctgacatggc c212107421121
212DNA213人工系列220
223溶質運載蛋白家族20(磷酸鹽轉運)成員140074ccaaacccac agaccaacac a212107521121212DNA213人工系列220
223核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)MRNA40075tccaaggaca ttcagcactg g212107621119212DNA213人工系列
220
223核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)MRNA40076atcgacgcaa aagaaccgg 192107721122212DNA213人工系列220
223卵泡抑制素轉錄變異型FST317，MRNA40077ggaagtccag taccaaggca ga 222107821119212DNA213人工系列220
223卵泡抑制素轉錄變異型FST317，MRNA
40078tggcattgtc actggcaca 192107921120212DNA213人工系列220
223SPROUTY(果蠅)同源基因2(SPRY2)，MRNA40079gccatccgaa acaccaatga 202108021122212DNA213人工系列220
223SPROUTY(果蠅)同源基因2(SPRY2)，MRNA40080tgccacagtc ctcacacctg ta 22
2108121121212DNA213人工系列220
223RAB3B，癌基因家族成員RAS，MRNA40081atgctgatga cacgttcacc c212108221122212DNA213人工系列220
223RAB3B，癌基因家族成員RAS，MRNA40082ggcctgcctt acactgatgt tc 222108321121
212DNA213人工系列220
223溶質運載蛋白家族2(利於葡萄糖轉運)40083gccttttcgt taaccgcttt g212108421119212DNA213人工系列220
223溶質運載蛋白家族2(利於葡萄糖轉運)40084tcctcgttgc ggttgatga 192108521121212DNA213人工系列
220
223白介素13受體，α2(IL13RA2)，MRNA40085tgaaggctat ttgaagtcgc c212108621119212DNA213人工系列220
223白介素13受體，α2(IL13RA2)，MRNA40086cttcgcttca atgcccttg 192108721121212DNA213人工系列220
223絲氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA
40087tggaaacgtg tacttggctc g212108821121212DNA213人工系列220
223氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA40088accagcc gaa gtcagcaatc t 212108921122212DNA213人工系列220
223微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)540089aagtttggcc tgactaccag ca 22
2109021122212DNA213人工系列220
223微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)540090ccagacgtgt ataccccaat gg 222109121122212DNA213人工系列220
223甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA40091cctgtgtaaa gcgttagccc ag 222109221122
212DNA213人工系列220
223甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA40092gtggcccaat gtactgcttg at 222109321122212DNA213人工系列220
223類驅動蛋白6(KINESIN-LIKE 6)40093ccagctttaa cgaagccatg ac 222109421122212DNA213人工系列
220
223類驅動蛋白6(KINESIN-LIKE 6)40094gcatttacca gaacctgtcc ca 222109521122212DNA213人工系列220
223細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物340095tcggtttatg tgctcttcca gg 222109621122212DNA213人工系列220
223細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物340096atcctcttag gtctcgcagg ct 22
2109721122212DNA213人工系列220
223染色體凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA40097gctcgccaga aattcgagtc ta 222109821122212DNA213人工系列220
223染色體凝集蛋白G(HCAP-G)，MRNA40098catgatcact ttcagagtcg gc 2221099
21121212DNA213人工系列220
223CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA40099gcccactacc caagaaacca a2121010021122212DNA213人工系列220
223CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA400100cataaatccg caagtcacca ca 2221010121120212DNA213人工系列
220
223胞質分裂的蛋白質調節子1(PRC1)，MRNA400101cccaagtgga attgatgcga 2021010221122212DNA213人工系列220
223胞質分裂的蛋白質調節子1(PRC1)，MRNA400102cccctcacac actgcttcat tt 2221010321121212DNA213人工系列220
223細胞分裂循環2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA
400103ctgattttgg ccttgccaga g2121010421122212DNA213人工系列220
223細胞分裂循環2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA400104ggatgattca gtgccatttt gc 2221010521121212DNA213人工系列220
223CDC20細胞分裂周期20，釀酒酵母，同源基因400105acagttcgcg ttcgagagtg a21
21010621121212DNA213人工系列220
223CDC20細胞分裂周期20，釀酒酵母，同源基因400106ttccactgag ccgaaggatc t2121010721122212DNA213人工系列220
223LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS400107tggctctctc ccagtagcat tc 22210108
21121212DNA213人工系列220
223LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONIC LEUCINE ZIPPER KINAS400108tcacttgcgg tcacatcttc c2121010921122212DNA213人工系列220
223微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)7400109agagaacaca aggattgccc ag 2221011021122212DNA213人工系列
220
223微染色體維持缺陷蛋白(啤酒酵母)7400110atgacaggag ctgagacttg gc 2221011121122212DNA213人工系列220
223細胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA400111ggcactgctg ctatgctgtt ag 2221011221121212DNA213人工系列220
223細胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA
400112tgaaggtcca tgagacaagg c2121011321119212DNA213人工系列220
223胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA400113ggcgcaatga gctgcatta 1921011421122212DNA213人工系列220
223胸苷激酶1，可溶性(TK1)，MRNA400114aaatggcttc ctctggaagg tc 22
21011521121212DNA213人工系列220
223細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物2A(黑素瘤，p16，inhibits CDK4)(CDKN2A)，mRNA400115tccccgattg aaagaaccag a2121011621122212DNA213人工系列220
223細胞周期蛋白依賴性激酶抑止劑2A(cyclin-dependent kinase inhibitor2A)(黑色素瘤p16，抑止CDK 4)(CDKN2A)，mRNA400 16aagagaagcc agtaaccccc ct 2權利要求
1.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是具有序列表的序列號1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19或46所示鹼基序列的基因。
2.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是整聯蛋白，ALPHA 6(ITGA6)，MRNA基因(NM_000210)；溶質載體家族20(磷酸鹽轉運)、成員1(NM_005415)基因；核糖核苷酸還原酶M2多肽(RRM2)，MRNA(NM_001034)基因；FOLLISTATIN(FST)，轉錄變異體FST317，MRNA(NM_006350)基因；SPROUTY(果蠅)同源基因G2(SPRY2)，MRNA(NM_005842)；RAB3B，成員RAS原癌基因(RAB3B)，MRNA(NM_002867)基因；溶質載體家族2(促進葡萄糖轉運蛋白)(NM_006516)基因；白介素13受體，ALPHA 2(IL13RA2)，MRNA(NM_000640)基因；絲氨酸/蘇氨酸激酶12(STK12)，MRNA(NM_004217)基因；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)5(CE)(NM_006739)基因；甲狀腺激素受體中間子13(TRIP13)，MRNA(NM_004237)基因；類驅動蛋白6(有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白)(K)(NM_006845)基因；細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(CDK2-ASSOCIATED DUAL(NM_005192)基因；染色體凝縮蛋白G(HCAP-G)，MRNA(NM_022346)基因；CDC28蛋白激酶1(CKS1)，MRNA(NM_001826)基因；胞質分裂蛋白質調節子1(PRC1)，MRNA(NM_003981)基因；細胞增殖周期2，G1→S→G2→M(CDC2)，MRNA(NM_001786)基因；CDC20(細胞增殖周期20，釀酒酵母，同源基因)(CD)(NM_001255)基因；LIKELY ORTHOLOG OF MATERNAL EMBRYONICLEUCINE ZIPPER KINAS(NM_014791)基因；微染色體維持缺陷蛋白(釀酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；細胞周期蛋白A2(CCNA2)，MRNA(NM_001237)基因；胸苷激酶1，SOLUBLE(TK1)，MRNA(NM_003258)基因；或細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(黑色素瘤，p16，抑制CDK4)(CDKN2A)，mRNA基因(NM_000077)。
3.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是含EGF的細胞微絲樣細胞外基質蛋白1基因(NM_018894)；人胰島素樣生長因子結合蛋白5(IGFBP5)mRNA基因(AU132011)；人克隆24775mRNA序列基因(AA402981)；蛋白聚糖1，分泌顆粒基因(AV734015)；人胰島素樣生長因子結合蛋白5基因(AA374325)；溶質載體家族21(有機陰離子轉運蛋白)，成員3基因(AF085224)；穀氨醯胺轉移酶2(C多肽，蛋白質-穀氨醯胺-γ-谷醯基轉移酶)(AL552373)基因；抗血友病因子II(凝血酶)受體(M62424)；纖維蛋白溶酶原活化因子，鳥激酶(NM_002658)基因；金屬蛋白酶組織抑制因子3(Sorsby fundusdystrophy，pseudoinflammatory)(W96324)基因；基質Gla蛋白(BF668572)基因；B-cellCLL/淋巴瘤1(Z23022)基因；CD74抗原(主要組織相容性複合體的不變多肽，II類相關抗原)(BG333618)基因；內收蛋白3(γ)(AL135243)基因；溶質載體家族16(一元羧酸傳送子)，成員4(NM_004696)基因；S蛋白(α)(NM_000313)基因；磷脂醯肌醇(4，5)二磷酸5-磷酸酶同系物；磷脂醯肌醇多聚磷酸5-磷酸酶IV型(AF187891)基因；孕酮膜結合蛋白質(BE858855)基因；腦源性神經營養因子(X60201)基因；或者載脂蛋白E(BF967316)基因。
4.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，其特徵在於其是為人WNT抑制因子-1(WIF-1)，MRNA(NM_007191)基因；人假擬蛋白FLJ11175(FLJ11175)，MRNA(NM_018349)基因；人RHO GDP解離抑止劑(GDI)BETA(ARHGDIB)，MRNA(NM_001175)基因；人鉀中間體/少量電導的鈣活化(NM_021614)基因；人核因子(紅細胞衍生物2)-類似物3(NFE2L3)，MRNA(NM_004289)基因；人GS3955蛋白(GS3955)，MRNA(NM_021643)基因；人CDNA 3′端與糖蛋白相類似的MUC18(AA302605)基因；人假擬蛋白FLJ21841(FLJ21841)，MRNA(NM_024609)基因；人鋅指蛋白185(LIM區域)(ZNF185)，MRNA(NM_007150)基因；細胞周期控制中涉及的SC1＝假定的轉移-活化因子[人，MRNA，24](S53374)基因；人NADH酶(輔酶Q)1α子複合體，8(19K)(NM_014222)基因；酵母MCM10的人同系物；假擬蛋白PRO2249(PRO2)(NM_018518)基因；人膠原，VII型，α1(大皰性表皮鬆解症，DYSTRO(NM_000094)基因；人自分泌運動因子受體(AMFR)，MRNA(NM_001144)基因；人克隆24421MRNA序列/CDS＝未知/GB＝AF070641/GI＝3283914/UG＝(AF070641)基因；人MRNA基因；以CDNADKFZP586E1621(源自克隆DKFZP586E1621)/CDS＝未知/GB(AL080235)基因。
5.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人RESERVED(KCNK12)，MRNA(NM_022055)基因；人泛素結合酶E2C(UBE2C)，MRNA(NM_007019)基因；人CDNA FLJ10517FIS，克隆NT2RP2000812/CDS＝(61，918)/GB＝AK001379/G(AK001379)基因；人軟骨連接蛋白1(CRTL1)，MRNA(NM_001884)基因；人MRNA基因；CDNADKFZP434F2322(由克隆DKFZP434F2322獲得)/CDS＝未知/GB(AL133105)；人，克隆MGC9549IMAGE3857382，MRNA，完整CDS/CDS＝(92，1285)/G(BC012453)基因；人假擬蛋白DKFZP586J1119(DKFZP586J1119)，MRNA(NM_032270)基因；人GLIA成熟因子，GAMMA(GMFG)，MRNA(NM_004877)基因人CDNAFLJ23095FIS，克隆LNG07413/CDS＝未知/GB＝AK026748/GI＝10(AK026748)基因；人假擬蛋白DKFZP762E1312(DKFZP762E1312)，MRNA(NM_018410)基因；人IROQUOIS類同源域蛋白(IRX-2A)，MRNA(NM_005853)基因；或者人假擬蛋白FLJ10540(FLJ10540)，MRNA(NM_018131)基因。
6.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人MRNA；CDNADKFZP434C1915(由克隆DKFZP434C1915獲得)基因；PARTIAL CDS/C(AL137698)；人微染色體維持缺陷型(釀酒酵母)7(M)(NM_005916)基因；人動力蛋白，細胞質的，中間體多肽1(DNCI1)，M(NM_004411)基因；蛋白質基因產物的人MRNA(PGP)9.5.(X04741)基因；人RAD51-相互作用蛋白(PIR51)，MRNA(NM_006479)基因；人含有杆狀病毒IAP重複序列的5(SURVIVIN)(BIRC5)，MR(NM_001168)基因；人UDP-N-乙醯基-α-D-半乳糖胺N-乙醯基GAL多肽(NM_004482)基因；人細胞周期蛋白B1(CCNB1)，MRNA(NM_031966)基因；人FLAP結構特異性內切酶1(FEN1)，MRNA基因(NM_004111)；人絲氨酸/蘇氨酸激酶15(STK15)，MRNA基因(NM_003600)；人MAD2(有絲分裂抑止缺陷型，酵母，同系物)-類似物1(MA)(NM_002358)；基因人核仁蛋白ANKT(ANKT)，MRNA基因(NM_018454)；人與泛素結合酶類似的HSPC150蛋白(H)基因(NM_014176)；人細胞色素P450類維生素A代謝蛋白(P450RAI-2)基因，(NM_019885)；人NIMA(從未有絲分裂基因A)相關激酶2(NEK2)，MR基因(NM_002497)；人骨形態生成蛋白4(BMP4)，MRNA基因(NM_001202)；人CDNAFLJ10674FIS，克隆NT2RP2006436/CDS＝未知/GB＝AK001536/GI(基因AK001536)；或者人著絲粒蛋白A(17KD)(CENPA)，MRNA(NM_001809)基因。
7.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人MRNA基因；CDNADKFZP564P116(FROM克隆DKFZP564P116)/CDS＝未知/GB＝A(AL049338)；人TTK蛋白質激酶(TTK)，MRNA基因(NM_003318)；人KARYOPHERINα2(RAG COHORT1，IMPORTINα1)(KPNA基因(NM_002266)；人聚合酶(DNA導向的)，θ(POLQ)，MRNA基因(NM_006596)；人ETS變異體基因5(ETS相關分子)(ETV5)，MRNA(NM_004454)基因；人含轉化酸性捲曲螺旋蛋白3基因(TAC)(NM_006342)；人驅動蛋白類似物1基因(KNSL1)，MRNA(NM_004523)；人著絲粒蛋白E(312KD)(CENPE)，MRNA基因(NM_001813)；人CDNA，3′END/克隆＝IMAGE1651289/克隆_END＝3′/GB＝AI12基因(AI123815)；人DISTAL-LESS HOMEO BOX 5(DLX5)，MRNA基因(NM_005221)；人V-MYB禽成髓細胞性白血病病毒癌基因同系物類似物2(NM_002466)基因；或者人血清剝奪反應(磷脂醯絲氨酸結合)PRO(NM_004657)基因。
8.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人假擬蛋白FLJ10604(FLJ10604)，MRNA基因(NM_018154)；人核糖核酸酶HI，大亞基(RNASEHI)，MRNA基因(NM_006397)；人ANILLIN(果蠅SCRAPS同系物)，肌動蛋白結合蛋白基因(NM_018685)；人H4組蛋白家族，成員G(H4FG)基因，MRNA(NM_003542)；人G蛋白連結受體37(內皮縮血管肽受體B型-基因(NM_005302)；人泛素載體蛋白(E2-EPF)，MRNA基因(NM_014501)；人，類似於腫瘤差別表達1基因，克隆IMAGE3639252，(BC007375)；人假擬蛋白MGC2577(MGC2577)，MRNA基因(NM_031299)；人假擬蛋白FLJ13912(FLJ13912)，MRNA基因(NM_022770)；人ANNEX IN A3(ANXA3)，MRNA基因(NM_005139)；人STATHMIN 1/ONCO蛋白18(STMN1)，MRNA基因(NM_005563)人，與核糖體蛋白L39類似，克隆MGC20168 IMAGE4555759，M(BC012328)；人POLO(果蠅)類似物激酶(PLK)，MRNA基因(NM_005030)。
9.用於檢測間充質幹細胞的基因標記，特徵在於其是人蛋白酶複合體(PROSOME，MACROPAIN)26S亞基，ATP酶，5(PS)基因(NM_002805)；人真核翻譯起始因子4γ，2(EIF4G)基因(NM_001418)；人二氫嘧啶酶類似物3(DPYSL3)基因，MRNA)(NM_001387)；人ADAPTOR相關蛋白複合體1，σ2亞基(AP1S2)基因(NM_003916)；人網蛋白1，中間絲結合蛋白，500KD(P)基因(NM_000445)；人異種核蛋白U基因(SCAFFOLD ATTAC(NM_031844)；人假擬蛋白MGC5306(MGC5306)，MRNA基因(NM_024116)；人MHC I類多肽相關序列A(MICA)，MRNA基因(NM_000247)；人PRK1相關蛋白(AWP1)，MRNA基因(NM_019006)；人孕酮受體膜成分2(PGRMC2)，MRNA基因(NM_006320)；人多聚穀氨酸結合蛋白1(PQBP1)，MRNA基因(NM_005710)；人S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶1(AMD1)，MRNA基因(NM_001634)；人幹擾素誘導的C型肝炎相關MICROTUBULAR AG基因(NM_006417)；人蛋白質激酶，AMP-活化的，γ1非催化性亞基(NON-CATALYTICSUBUN)基因(NM_002733)；人前膠原-脯氨酸，2-OXOGLUTARATE 4-DIOXYGENASE(脯氨酸(NM_004199)基因；人血管內皮分化，溶血磷脂酸G-PROTE基因(NM_012152)；或人KIAA0127基因產物(KIAA0127)，MRNA基因(NM_014755)。
10.用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針，其具有與權利要求1～9中任一記載的用於檢測間充質幹細胞的基因標記在嚴謹條件下雜交的DNA序列。
11.根據權利要求10記載的用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針，其由權利要求1～9中任一記載的鹼基序列的反義鏈的全部或者部分構成。
12.用於檢測間充質幹細胞基因標記的微陣列或DNA晶片，特徵在於其固定有至少一個以上的權利要求10或11記載的DNA。
13.根據權利要求12記載的用於檢測間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片，其特徵在於其固定有具有序列表序列號1、2、4、6、7、9、10、11、12、14、15、17、19、或46所示鹼基序列的基因組合和檢測出權利要求2～9中任一記載的基因組合的2個以上基因的探針。
14.用於檢測間充質幹細胞的多肽標記，其特徵在於其是具有序列表的序列3、5、8、13、16或18所示的胺基酸序列的多肽。
15.一種抗體，其特徵在於其受權利要求14記載的多肽誘導、與該多肽特異性結合。
16.根據權利要求15記載的抗體，其特徵在於抗體是單克隆抗體。
17.根據權利要求15記載的抗體，其特徵在於抗體是多克隆抗體。
18.識別間充質幹細胞的方法，特徵在於對被檢細胞中權利要求1-9中任一項記載的間充質幹細胞標記基因的表達進行檢測。
19.根據權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用RNA印跡法檢測間充質幹細胞標記基因的表達。
20.根據權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用用於檢測權利要求10或11記載的間充質幹細胞標記基因的探針對間充質幹細胞標記基因的表達進行檢測。
21.根據權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵是採用用於檢測權利要求12或13記載的間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片對間充質幹細胞標記基因的表達進行檢測。
22.識別間充質幹細胞的方法，其特徵是權利要求18-21中任一記載的對間充質幹細胞標記基因表達的檢測包括定量或半定量PCR的使用。
23.根據權利要求22記載的識別間充質幹細胞的方法，其特徵是其使用的定量的或半定量的PCR是RT-PCR法。
24.用於擴增間充質幹細胞標記基因的RT-PCR所使用的引物，其由以下物質組成由具有序列表的序列號20所示的鹼基序列的正義引物以及具有序列表的序列號21所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號22所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號23所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號24所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號25所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號26所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號27所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號28所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號29所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號30所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號31所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號32所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號33所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號34所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號35所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號36所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號37所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號38所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號39所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號40所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號41所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號42所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號43所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號44所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號45所示的鹼基序列的反義引物。
25.擴增間充質幹細胞標記基因的實時PCR所使用的引物，其由下列物質構成具有序列表的序列號47所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號48所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號49所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號50所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號51所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號52所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號53所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號54所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號55所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號56所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號57所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號58所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號59所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號60所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號61所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號62所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號63所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號64所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號65所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號66所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號67所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號68所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號69所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號70所示的鹼基序列的反義引物。
26.用於擴增間充質幹細胞標記基因的RT-PCR所使用的引物，其由下列物質組成具有序列表的序列號71所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號72所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號73所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號74所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號75所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號76所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號77所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號78所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號79所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號80所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號81所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號82所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號83所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號84所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號85所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號86所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號87所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號88所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號89所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號90所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號91所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號92所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號93所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號94所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號95所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號96所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號97所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號98所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號99所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號100所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號101所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號102所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號103所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號104所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號105所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號106所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號107所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號108所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號109所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號110所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號111所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號112所示的鹼基序列的反義引物、具有序列表的序列號113所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號114所示的鹼基序列的反義引物、或具有序列表的序列號115所示的鹼基序列的正義引物和具有序列表的序列號116所示的鹼基序列的反義引物。
27.根據權利要求18記載的間充質幹細胞的識別方法，其特徵在於用權利要求24-26其中之一記載的正義引物以及反義引物中至少一對以上的引物擴增被檢細胞中的基因，採用權利要求10或11中記載的用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針對擴增的基因進行檢測。
28.間充質幹細胞的識別方法，其特徵在於採用權利要求15-17其中之一記載的抗體對被檢細胞中的間充質幹細胞標記多肽的表達進行檢測。
29.間充質幹細胞的識別方法，其特徵在於將被檢細胞中由序列表的序列號1、11和19構成的間充質幹細胞標記基因組成的組中一個以上基因的表達以及由序列表的序列號2、4、6、7、9、10、12、14、15和17構成的間充質幹細胞標記基因組成的組中一個以上基因的表達組合起來，進行評價。
30.間充質幹細胞的識別分離方法，其特徵在於採用權利要求10或權利要求11記載的用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針和/或權利要求15-17中任一記載的抗體對被檢細胞中用於間充質幹細胞檢測的標記基因和/或用於間充質幹細胞檢測的標記多肽的表達進行檢測、對識別出的間充質幹細胞進行分離。
31.根據權利要求30記載的間充質幹細胞的識別分離方法，其特徵是通過採用權利要求15-17中任一記載的抗體的螢光抗體法將被檢細胞中的間充質幹細胞進行標識、分離經標識的間充質幹細胞。
32.用於識別間充質幹細胞的試劑盒，其中裝備有權利要求10或11記載的用於檢測間充質幹細胞基因標記的探針、固定有該探針的權利要求12或13記載的用於檢測間充質幹細胞標記基因的微陣列或DNA晶片、和至少一個以上的權利要求15-17中任一記載的抗體。
全文摘要
本發明提供一種用於檢測、分離識別間充質幹細胞的標記以及採用該標記檢測、分離識別間充質幹細胞的方法。序列表所示基因在間充質幹細胞中特異表達。該基因構成作為檢測間充質幹細胞的標記。尤其是，本發明含有用於檢測該間充質幹細胞標記基因的探針，以及在檢測該間充質幹細胞基因標記時擴增被檢細胞所述基因的PCR所使用的引物，還含有本發明的間充質幹細胞標記基因表達的多肽構成的用於檢測間充質幹細胞的多肽標記、用於檢測該多肽標記的與該多肽標記特異結合的抗體，尤其是含有一種採用用於檢測間充質幹細胞標記基因的探針、與多肽標記特異結合的抗體對間充質幹細胞進行識別、分離的方法。
文檔編號C12P21/08GK1761749SQ200480007550
公開日2006年4月19日 申請日期2004年2月27日 優先權日2003年3月10日
發明者加藤幸夫, 辻紘一郎, 小池千加 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構, 加藤幸夫, 智再如股份有限公司