羰基壓力改善劑和腹膜透析液的製作方法

2023-06-14 10:21:26 3

專利名稱：羰基壓力改善劑和腹膜透析液的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於治療腎衰病人的腹膜透析液。
背景技術：
血液透析和腹膜透析這兩類透析均用於治療慢性腎衰病人。腹膜透析是一種使透析液在腹腔內滯留一段時間，從而促進體內廢物穿過腹膜排洩到透析液中的方法。然後回收透析液。腹膜透析可進一步分為間斷型腹膜透析(IPD)和連續便攜型(ambulatory)腹膜透析(CAPD)。CAPD法增加了IPD法的優點，即通過延長灌注液在腹腔中的滯留時間而每天約4次換液。
腹膜透析具有方便和耗時少等優點。但已知長期透析可進行性降低脫水能力，還可導致腹部蛋白質變性和硬化，腹膜融合等異常。
腹膜透析液中的葡萄糖可能是原因之一。當前所用的多數類型的腹膜透析液均以葡萄糖為滲透壓調節劑。葡萄糖遇熱不穩定，其一部分在加熱滅菌期間被降解。結果，能修飾蛋白質的強活性羰基化合物可能以降解產物的形式產生。這類降解產物可能也產生並積累於含有葡萄糖的腹膜透析液中，即使在滅菌後的儲存期間也是如此。
通常，葡萄糖在近中性或鹼性pH下易降解，因此選用酸性緩衝液(pH5.0-5.4)來維持常規腹膜透析液中葡萄糖的穩定性。然而，這類酸性緩衝液有著諸如抑制腹膜巨噬細胞之免疫防禦機制、因細菌感染導致腹膜炎、以及對腹膜間皮細胞產生毒性等等危險。為了克服這些相互矛盾的問題，迫切需要防止因近中性腹膜透析液中葡萄糖的降解而產生羰基化合物，或消除這類化合物。
一方面，用高濃度葡萄糖配製成的腹膜透析液能修飾蛋白質，因此這類透析液不適用於腹膜。從這類觀點出發，通過利用幾乎不產生降解產物的葡萄糖聚合物開發了一些腹膜透析液(平成10年日本專利申請94598；Wilkie,M.E.等，Perit.Dial.Int.,17:S47-50(1997))。
出於同樣的觀點，有人提議用其它化合物取代葡萄糖作為腹膜透析液中所用的滲透壓調節劑。這些包括環糊精(日本平成8年專利申請71146)、二糖(日本平成8年專利申請131541)、以及胺基酸(Faller,B.等，KidneyInt.,50(增刊56),S81-85(1996))。已有人公開了一種使用半胱氨酸作為添加劑以防止葡萄糖降解的腹膜透析液(日本平成5年專利申請105633)。
這些方法目的在於減少腹膜透析液中高濃度葡萄糖帶來的不便。
已有報導說，慢性腎衰病人不管有沒有高血糖症，其血液和組織中都會積累大量的強反應性羰基化合物和AGE(高級糖化終產物)(Miyata,T.等，Kidney Int.,51:1170-1181(1997)；Miyata,T.等，J.Am.Soc.Nephrol.,7:1198-1206(1996)；Miyata,T.等，Kidney Int.54:1290-1295(1998)；Miyata,T.等，J.Am.Soc.Nephrol.9:2349-2356(1998))。腎衰常伴有羰基化合物過多的情況(羰基壓力)。這種羰基壓力來自從糖類和脂類產生羰基化合物的非酶性生物化學反應，據信這些反應導致蛋白質的修飾增加(Miyata,T.等，Kidney Int.55:389-399(1999))。羰基壓力不僅改變基質蛋白如膠原蛋白和粘連蛋白的結構，而且參與增強腹膜通透性和因羰基化合物對各種細胞的生理學活性而發生炎症。
在腹膜透析液中，血液中的廢物穿過腹膜排洩至該腹膜透析液中。腹腔內高滲透壓性腹膜透析液通過腹膜將腎衰病人血液中累積的強反應性羰基化合物收集在該滲透液中。因此，該腹膜透析液中的羰基化合物濃度升高，導致羰基壓力狀態。這被認為引起對腹腔內蛋白質的羰基修飾，其結果是腹膜的功能受損，引起進一步腹膜硬化。
對內皮和間皮的免疫組化檢查證實，羰基壓力來自於腹膜透析病人腹腔內出現的葡萄糖(Yamada,K.等，Clin.Nephrol.,42:354-361(1994)；Nakayama,M.等，KidneyInt.,51:182-186(1997)；Miyata,T.等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版；Combet,S.等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版；Inagi,R等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版)發明公開本發明的一個目的是提供用於減少腹膜透析期間羰基化合物所致損害的方法，尤其用於改善羰基壓力狀態的方法，並提供應用該方法所需的透析液和藥學試劑。「羰基化合物」在本發明中指病人接受腹膜透析時產生的羰基化合物，所述腹膜透析液在製造或保存期間產生的羰基化合物，以及腹膜透析時腹腔內產生的羰基化合物。本發明旨在儘可能減小這些羰基化合物對接受透析的病人造成的損傷。
本發明人已發現，腹膜透析病人腹腔內出現的強反應性羰基化合物不僅僅是最初注入腹腔內的腹膜透析液中出現的那些。具體地，從腹膜透析病人體內收穫的腹膜透析液中除葡萄糖以外的羰基化合物的量比透析前的量多5倍，因此，大多數羰基化合物被認為來自血液(

圖1)。這表明，腹腔內腹膜透析液中出現的羰基化合物不僅包括加熱滅菌過程中產生的羰基化合物和保存期間積累的羰基化合物，還包括來自血液的那些和在透析過程中產生並積累於腹腔內的那些，後兩類是不能忽略的。對腹膜透析病人的腹膜組織進行免疫組化檢查揭示了羰基化合物的存在(圖2)。相應地，如果能除去腹膜透析期間血液轉移至腹腔內的羰基化合物，就能有效緩解羰基壓力。
本發明人考慮到，腎衰應經常伴有以下情況，其中體內蛋白質修飾得到加強，且當葡萄糖通過諸如腹膜透析等方法以高濃度連續注入腹腔中時，腹膜內蛋白質將由於腹腔內產生的羰基化合物在腹膜透析液中的累積而對非酶性修飾更敏感(圖7)。
基於這類背景，本發明人發現，羰基化合物捕獲劑可有效用於製備能減少腹膜透析液所產生的羰基化合物的透析液，並因此完成本發明。主要焦點在於血液中累積的羰基化合物，本發明人進一步發現，防止羰基壓力所致蛋白質修飾及這類腹膜透析相關性症候群的藥學製劑均十分有效，因此進一步完成本發明。
具體地，本發明涉及一種羰基壓力改善劑，和基於這種改善劑的一種腹膜透析液，以及一種藥劑。本發明更具體地涉及(1)一種用於改進腹膜透析期間腹膜內羰基壓力狀態的試劑，其以一種羰基化合物捕獲劑作為一種活性成分；(2)(1)的試劑，其中所述羰基化合物捕獲劑固定在不溶性載體上；(3)(1)的試劑，其中所述羰基化合物捕獲劑與一種腹膜透析液混合；(4)(1)至(3)中任一種試劑，其中所述羰基化合物捕獲劑選自氨基胍、吡哆胺、肼、含巰基化合物、以及它們的衍生物；(5)(1)至(3)中任一種試劑，其中所述羰基化合物捕獲劑是一種抑制美拉德(Maillard)反應的試劑；(6)(1)的試劑，其中所述羰基化合物捕獲劑是一種在腹膜透析液中不溶並能吸收羰基化合物的化合物；
(7)用於捕獲腹膜透析液中羰基化合物的藥筒，其中所述藥筒裝有(2)和/或(6)的羰基化合物捕獲劑；(8)一種用於製備腹膜透析液的方法，所述腹膜透析液中羰基化合物含量已降低，所述方法包括使所述腹膜透析液通過藥筒(7)；(9)一種用於製備腹膜透析液的方法，所述腹膜透析液中羰基化合物含量已降低，所述方法包括(a)使所述腹膜透析液與(2)和/或(6)的羰基化合物捕獲劑接觸，(b)使所述腹膜透析液與所述羰基化合物捕獲劑分離；(10)一種含有羰基化合物捕獲劑的腹膜透析液；(11)(10)的腹膜透析液，其中所述腹膜透析液還包含一種還原糖，並被放置在含有第一和第二室的容器內，使所述第一室容納所述還原糖而所述第二室容納所述羰基化合物捕獲劑；和(12)(10)的腹膜透析液，其中所述羰基化合物捕獲劑將被施用於腹膜內。
本發明還涉及羰基化合物捕獲劑改善腹膜內羰基壓力狀態的用途。本發明也涉及羰基化合物捕獲劑進行腹膜透析治療的用途。此外，本發明涉及羰基化合物捕獲劑產生改善羰基壓力之試劑的用途。
在本發明中，待捕獲的羰基化合物包括，如生產和保存腹膜透析液期間產生的羰基化合物。如上述，在含有高濃度葡萄糖作為滲透壓調節劑的腹膜透析液中總是能產生羰基化合物。這類羰基化合物包括，如以下化合物(Richard,J.U.等，Fund.Appl.Toxic.,4:843-853(1984)):
·3-脫氧葡糖醛酮·5-羥甲基糠醛(後文縮寫為「5-HMF」)·甲醛·乙醛·乙二醛·甲基乙二醛·乙醯丙酸·糠醛·阿拉伯糖在本發明中，羰基化合物捕獲劑在透析的全程內使用，以除去下文所列羰基化合物(這些化合物是在腎衰病人血液中累積並在腹膜透析後轉移至腹腔的)，以及除去腹膜透析液在生產和保存過程中產生的羰基化合物。
衍生自抗壞血酸的羰基化合物·脫氫抗壞血酸衍生自碳水化合物、脂、或胺基酸的羰基化合物·乙二醛·甲基乙二醛·3-脫氧葡糖醛酮·羥基壬烯醛·丙醛·丙烯醛本發明優選的羰基化合物捕獲劑是能通過化學反應或吸收作用徹底抑制或降低所有這些羰基化合物的蛋白質修飾活性的一類；但所述羰基化合物捕獲劑也包括僅對這些羰基化合物中主要成員有效的試劑。例如，據信甲基乙二醛在這些羰基化合物中具有相對較高的反應性(參見Thomalley,R.J.,Endocrinol.Metab.3(1996)149-166；Inagi,R等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版；和實施例3)，並因此它在抑制甲基乙二醛的活性方面具有極大的病理生理學意義。結果，對甲基乙二醛有效的化合物可成為本發明的優選羰基化合物捕獲劑。具體地，如實施例所示，諸如活性炭、胍、氨基胍、縮二胍、半胱氨酸、和清蛋白等化合物均為對甲基乙二醛特別有效的羰基化合物捕獲劑。
儘管有人報導作為滲透壓調節劑使用的某些碳水化合物比葡萄糖更穩定，但在加熱滅菌和保存期間很難徹底抑制這些碳水化合物的羰基化合物產生。因此，所述羰基化合物捕獲劑的使用對於用除葡萄糖以外的碳水化合物作為滲透壓調節劑的情況具有意義。能在腹膜透析中作為滲透壓調節劑使用的除葡萄糖以外的碳水化合物包括海藻糖(日本平成7年專利申請323084)、水解的澱粉(日本平成8年專利申請85701)、麥芽糖醇和乳糖醇(日本平成8年專利申請131541)、以及非還原寡糖和非還原多糖(日本平成10年專利申請94598)。
本發明的羰基化合物捕獲劑包括能抑制或減少由羰基化合物經化學反應或吸收作用對透析病人所造成的損傷，且其本身對所述病人安全的化合物。這類化合物包括以下所列。本發明的羰基化合物捕獲劑可單獨使用或與兩或更多種化合物聯合使用。
·氨基胍(Foote，E.F.等，美國腎病雜誌，25:420-425(1995))·±2-異亞丙基亞肼基-4-氧-噻唑啉-5-基-N-乙醯苯胺(OPB-9195；S.Nakamura,1997，糖尿病(Diabetes)46:895-899)所述羰基化合物捕獲劑還包括以下具有羰基化合物捕獲劑功能的化合物或其衍生物。「衍生物」指與母體化合物相比，在任何部位有一個原子或分子取代的化合物。
(1)胍衍生物如甲基胍(日本昭和62年專利申請142114；日本昭和62年專利申請249908；日本平成1年專利申請56614；日本平成1年專利申請83059；日本平成2年專利申請156；日本平成2年專利申請765；JP-A Hei2-42053；日本平成6年專利申請9380；已公開國際申請的日文譯本5-505189)等。
(2)肼衍生物如磺醯肼等。
(3)含有2個氮原子的5元雜環化合物如吡唑啉酮(日本平成6年專利申請287179)，吡唑啉(日本平成10年專利申請167965)，吡唑(日本平成6年專利申請192089；日本平成6年專利申請298737；日本平成6年專利申請298738),imidazolysine(日本平成5年專利申請201993；日本平成6年專利申請135968；日本平成7年專利申請133264；日本平成10年專利申請182460)，已內醯脲(日本平成6年專利申請135968)等。
(4)含有3個氮原子的5元雜環化合物如三唑(日本平成6年專利申請192089)等。
(5)含有1個氮原子和1個硫原子的5元雜環化合物如噻唑啉(日本平成10年專利申請167965)，噻唑(日本平成4年專利申請9375；日本平成9年專利申請59258)，噻唑啉(日本平成5年專利申請201993；日本平成3年專利申請261772；日本平成7年專利申請133264；日本平成8年專利申請157473)，等。
(6)含有1個氮原子和1個氧原子的5元雜環化合物如噁唑(日本平成9年專利申請59258)，等。
(7)含氮原子的六元雜環化合物如吡啶(日本平成10年專利申請158244；日本平成10年專利申請170954)，嘧啶(已公開的國際申請7-500811的日文譯本)，等。
(8)含氮原子的縮合雜環化合物如吲唑(日本平成6年專利申請287180)，苯並咪唑(日本平成6年專利申請305964)，喹啉(日本平成3年專利申請161441)等。
(9)含硫和含氮的縮合雜環化合物如苯並噻唑(日本平成6年專利申請305964)等。
(10)含硫的縮合雜環化合物如苯並噻吩(日本平成7年專利申請196498)等。
(11)含氧原子的縮合雜環化合物如苯並吡喃(日本平成3年專利申請204874；日本平成4年專利申請308586)等。
(12)產生氮原子的化合物如咔唑基(日本平成2年專利申請156；日本平成2年專利申請753)，肼基甲酸(日本平成2年專利申請167264)，肼(日本平成3年專利申請148220)等。
(13)醌如苯醌(日本平成9年專利申請315960)，氫醌(日本平成5年專利申請9114)等。
(14)脂肪族二羧酸(日本平成1年專利申請56614；日本平成5年專利申請310565)等。
(15)矽化物(日本昭和62年專利申請249709)。
(16)有機鍺(organogermanes)(日本平成2年專利申請62885；日本平成5年專利申請255130；日本平成7年專利申請247296；日本平成8年專利申請59485)。
(17)類黃酮(日本平成3年專利申請240725；日本平成7年專利申請206838；日本平成9年專利申請241165；WO 94/04520)。
(18)烷基胺(日本平成6年專利申請206818；日本平成9年專利申請59233；日本平成9年專利申請40626；日本平成9年專利申請124471)。
(19)胺基酸(國際申請4-502611的日文公開譯本；國際申請7-503713的日文公開譯本)。
(20)芳香族化合物如殼二孢氯素(日本平成6年專利申請305959)，苯甲酸(WO 91/11997)，吡咯並二氮雜萘鎓(日本平成10年專利申請158265)，等。
(21)多肽(國際申請7-500580的日文公開譯本)。
(22)維生素如維生素B6(即吡哆胺)(WO 97/09981)等。
(23)含巰基化合物如穀胱甘肽，半胱氨酸，N-乙醯半胱氨酸等。
(24)含巰基蛋白質如還原型清蛋白等。
(25)四環素(日本平成6年專利申請256280)。
(26)脫乙醯殼多糖(日本平成9年專利申請221427)。
(27)鞣質(日本平成9年專利申請40519)。
(28)含季銨離子的化合物。
(29)雙縮胍試劑如苯乙雙胍(phenformin)，丁二胍(buformin)，二甲雙胍(metformin)，等。
(30)離子交換樹脂(31)無機化合物如活性炭，矽膠，氧化鋁，碳酸鈣等。
以上化合物包括已知總稱為美拉德反應抑制物的那些。美拉德反應是葡萄糖等還原糖與胺基酸或蛋白質之間的非酶性糖化反應。Maillard於1912年報導了這一反應，其焦點是胺基酸和還原糖在加熱的情況下形成的混合物的棕色顯色現象(Maillard,L.C.,Compt.Rend.Soc.Biol.,72:599(1912))。該美拉德反應涉及食物在加熱和儲存期間的棕色顯色、芳香族成分的產生和口味的形成、以及蛋白質變性。因此，該反應主要在食品化學領域得以研究。
1968年，體外鑑定了一種血紅蛋白的纖維級分，即糖化的血紅蛋白(HbAlc)，其顯示在糖尿病人體內水平增高(Rahbar.S.,Clin.Chim.Acta,22:296(1968))。這些發現更增加了對體內美拉德反應的重大意義的興趣以及對該反應參與成人疾病如糖尿病綜合症和動脈硬化以及老化的發生的興趣。抑制體內美拉德反應的試劑得到廣泛而深入的研究，結果發現上述化合物可以作為抑制美拉德反應的試劑。
已知這類美拉德反應抑制劑能改善腹膜透析病人的羰基壓力狀態，並抑制與腹膜透析相關的由羰基壓力所引起的綜合症，其方式是消除腹膜透析液和血液中的羰基化合物。
本發明的羰基化合物捕獲劑包括大分子化合物如離子交換樹脂，或無機化合物如活性炭，矽膠，氧化鋁和碳酸鈣，以及有機化合物如上述美拉德反應抑制劑。這些化合物是利用它們的羰基化合物吸收活性而捕獲腹膜透析液中的不溶性羰基化合物。已知這些化合物可作為層析載體，但並不知它們可用於改善羰基壓力狀態。
利用了活性炭的吸附性血液淨化劑已用於藥物中毒或肝性昏迷中純化血液。它們還用於與血液透析有關的輔助治療，以除去多器官衰竭中急性腎衰早期增加的各種內毒素、外毒素、和血管活性物質。然而目前尚未知吸附性血液淨化劑可用於去除腹膜透析液中的羰基化合物或透析期間在腹腔內積累的羰基化合物。
日本昭和58年專利申請169458描述了一項發明，其涉及含有固體顆粒吸附劑的腹膜透析液以及用這種腹膜透析液進行腹膜透析的方法。根據該文獻，加入所述固體顆粒吸附劑旨在消除肌酸酐和低分子量代謝物；但它並未描述該吸附劑可有效消除腹膜透析液中或透析期間腹腔內所積累的羰基化合物。此外該文獻並未指出或暗示腹膜透析病人的羰基壓力狀態可通過腹膜透析方法改善。
可添加本發明的羰基化合物捕獲劑的腹膜透析液組合物可以是任何常規透析液。腹膜透析液通常包含滲透壓調節劑、緩衝劑、和無機鹽。上述糖類作為滲透壓調節劑使用。考慮到葡萄糖的穩定性，常使用具有酸性pH(pH5.0-5.4)的緩衝劑。當然，如果滲透壓調節劑不是葡萄糖，則可適當選擇更接近生理pH(pH7.0左右)的緩衝劑。或者，可設計一種產物形式，其中用於調節pH的緩衝劑單獨包裝，從而既可以使用葡萄糖又可以使用中性pH。在本發明中，加熱滅菌過程和長期保存所產生的羰基化合物被消除，從而使產生中性pH的緩衝系統得到最佳利用。這類配方以前因葡萄糖的降解而很難實現。腹膜透析液通常包含無機鹽如氯化鈉、氯化鈣、或氯化鎂。這些鹽使腹膜透析液更接近生理條件，預期可產生更高的生物相容性。
本發明的羰基化合物捕獲劑可在配製時加入已知組份的腹膜透析液中，配好並密封的透析液可加熱除菌。預期該試劑的加入足以抑制加熱滅菌時由主要組分產生羰基化合物。或者，將腹膜透析液置於有第一和第二隔室的容器內；將還原糖置於第一隔室，將羰基化合物捕獲劑置於第二隔室內，二者在使用前臨時混合。在這種情況下，滅菌和保存期間產生的羰基化合物迅速與羰基化合物捕獲劑混合。過量的羰基化合物捕獲劑還可在腹腔施用後捕獲血液衍生的羰基化合物。可向腹膜透析液中添加單一一種羰基化合物捕獲劑或多種捕獲劑的組合。
使腹膜透析液與固定有羰基化合物捕獲劑的載體或與不溶於該腹膜透析液的羰基化合物捕獲劑接觸的方法很多。例如，將腹膜透析液裝入容器內，所述容器已在其內部固定了羰基化合物捕獲劑或含有固定於顆粒或纖維載體上的羰基化合物捕獲劑，從而可捕獲保存期間產生和積累的羰基化合物。在後一個系統中，不溶性載體可通過過濾與腹膜透析液分離。或者，可在一個柱中裝填固定有羰基化合物捕獲劑的載珠或纖維狀載體，或裝填不溶於腹膜透析液的羰基化合物捕獲劑，從而製備一種羰基化合物捕獲劑藥筒。然後，使腹膜透析液與藥筒中的載體接觸，再使液體流入腹腔。優選藥筒中預裝填蒸餾水，以防止開始腹膜透析時的氣泡。當羰基化合物捕獲藥筒在腹膜灌注時與腹膜透析液接觸，儘管不能除去病人在透析時體液中產生的羰基化合物，但透析液中最初出現的羰基化合物可以消除。或者，當用一個小循環泵在封閉的環路中使腹膜透析液循環而實施腹膜透析處理時，有可能通過在上述環路中安裝含有固定了羰基化合物捕獲劑的載體的羰基化合物捕獲藥筒，而不僅除去透析液中最初出現的羰基化合物，還除去透析時腹腔中積累的那些。
對固定本發明羰基化合物捕獲劑所用的載體無具體限制，只要該載體對人體無害，且作為直接接觸復膜透析液的物質保證安全和穩定便可。所述載體包括，如合成的或天然的有機大分子化合物，和無機物質如玻璃珠、矽膠、氧化鋁、和活性炭，以及包被有多糖或合成聚合物的這些物質。常規修飾、重新成型或變性可改善固定羰基化合物捕獲劑的載體，或本身不溶於腹膜透析液的羰基化合物的滲透性、藥物兼容性、保護力度、吸收能力、或羰基化合物特異性。
包含大分子的載體實例有聚甲基異丁烯酸酯聚合物，聚丙烯腈聚合物，聚碸聚合物，乙烯基聚合物，聚烯烴聚合物，氟聚合物，聚酯聚合物，聚醯胺聚合物，聚亞胺聚合物，聚氨基甲酸酯聚合物，聚丙烯醯基聚合物，聚苯乙烯聚合物，聚酮聚合物，矽聚合物，纖維素聚合物，脫乙醯殼多糖聚合物；尤其，多糖如瓊脂糖，纖維素，殼多糖，脫乙醯殼多糖，Sepharose，葡聚糖，等及其衍生物，以及聚酯，聚乙烯氯化物，聚苯乙烯，聚碸，聚醚碸，聚丙烯，聚乙烯醇，聚芳醚碸，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚碳酸，乙醯化纖維素，聚丙烯腈，聚對苯二甲酸乙二酯，聚醯胺，聚矽氧烷樹脂，螢光素，聚氨基甲酸酯，聚醚氨酯，和聚丙烯醯胺以及它們的衍生物。所述大分子物質可單獨使用，也可使兩種或更多種大分子物質組合使用。在後一種情況中，至少一種大分子物質上固定有羰基化合物捕獲劑。所固定的羰基化合物捕獲劑可單獨使用或使兩種或更多種化合物組合使用。上述聚合物物質可以是包含一種類型單體的聚合物，或是包含多種類型單體的共聚物。此外，所述物質可加入適當修飾劑進行處理，或可進行變性處理如放射交聯或用過氧化物交聯。
對載體的形狀無限制。例如，載體可以是膜狀，纖維狀，粒狀，中空纖維樣，非編織纖維樣，孔狀，或蜂窩狀。載體與腹膜透析液的接觸面積可通過改變該載體的厚度，表面積，直徑，長度，形狀，和/或大小來控制。此外，所述羰基化合物捕獲劑可固定在放置腹膜透析液的容器的內壁，和使腹膜透析液循環於其中的環路內。
可用已知方法將羰基化合物捕獲劑固定在上述載體上，如物理吸附、特異性生物化學結合反應、離子結合、共價鍵結合、移植等。如有必要，可在載體和羰基化合物捕獲劑之間插入間隔臂。當羰基化合物捕獲劑顯示毒性時，其釋放量至關重要。因此，優選通過共價鍵結合使羰基化合物捕獲劑固定在載體上，從而使釋放量最小。載體上的功能基團可用於經共價鍵結合羰基化合物捕獲劑。所述功能基團如，羥基、氨基、醛基、羧基、硫醇基、矽烷醇基、醯胺基、環氧基、琥珀醯亞胺基等；但不止這些。所述共價鍵如酯鍵、醚鍵、氨基鍵、醯胺鍵、硫鍵、亞氨鍵、二硫鍵等。
商業產品如帶有磺醯肼基團的聚苯乙烯載體(PS-TsNHNH2,ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)可作為固定羰基化合物捕獲劑的載體使用。
可根據所用羰基化合物捕獲劑和載體的類型，選擇適當的公知滅菌方法對固定了本發明羰基化合物捕獲劑的載體滅菌。所述滅菌方法包括，如高壓蒸汽滅菌、γ射線輻射滅菌、蒸汽滅菌等。裝有不溶性羰基化合物捕獲劑或裝有固定化羰基化合物捕獲劑之載體的藥筒與含有腹膜透析液的容器相連，以便同時對藥筒和容器實施滅菌。
當只有少量羰基化合物捕獲劑與腹膜透析液接觸時，可不充分地消除腹膜透析液中的羰基化合物。通常，難以預計腹膜透析時的羰基化合物量。因此，在不危及病人安全的情況下儘可能多地使用羰基化合物捕獲劑，以便維持最大效應。可改變載體上所固定的羰基化合物捕獲劑的量，或改變臨用前才將羰基化合物捕獲劑固定於其上的載體的量，從而控制羰基化合物捕獲劑的用量。
羰基化合物捕獲劑也可通過安裝在腹膜透析環路中的適當混合連接器注入該環路。此時，滅菌和保存過程中產生的羰基化合物被限制在環路中。
此外，可將羰基化合物捕獲劑直接施用於腹腔，並與腹膜透析液在腹腔中混合。此時，腹膜透析液和血液中產生的羰基化合物在腹腔中被滅活。
而且，在將腹膜透析液注入病人體內之前，或當該流體充滿腹腔時，可通過靜脈注射等方式將羰基化合物捕獲劑施用於該腹膜透析病人，從而成功改善腹腔中的羰基壓力狀態。
本發明腹膜透析液的優選實施方案具體描述於下。
基本透析液的組成通常如下葡萄糖 1-5％w/v鈉離子 100-150meq鉀離子 0-0.05meq鎂離子 0-2meq鈣離子 0-4meq氯離子 80-150meq緩衝劑 10-50mM(有機酸如乳酸、檸檬酸、蘋果酸、乙酸、丙酮酸、和琥珀酸)這只是一個常用配方，可根據病人的症狀選擇更合適的組合物。
本發明的羰基化合物捕獲劑以有效量加入上述基本配方中。例如，當使用氨基胍時，濃度為1mM或更高，優選10mM或更高，更優選10mM或更高但不超過100mM。如果羰基化合物捕獲劑僅加入少量，它們可能被生產和保存期間產生的羰基化合物耗盡。結果，該捕獲劑不能處理透析期間從病人血液和組織中轉移至透析液的羰基化合物。尤其，難以預計從血液和組織中轉移至透析液的羰基化合物的量。因此，在不危及病人安全的情況下儘可能多地使用羰基化合物捕獲劑，以便維持最大效應。已知氨基胍對動物毒性很低。根據「化學物質的毒性作用」(1978)，皮下給藥時氨基胍的半數致死劑量為大鼠1258mg/kg，或小鼠963mg/kg。該化合物可溶於水。OPB-9195也可類似地加入，至濃度為1mM或更高，優選10mM或更高，更優選10mM或更高但不超過100mM。
將本發明如上配製的腹膜透析液裝於適當密閉容器內，並進行滅菌。有效的滅菌包括加熱滅菌如高壓蒸汽滅菌，和熱水(hot water)滅菌。此時，重要的是使用高溫下不釋放毒性物質的容器，其強度足以在滅菌後承受運輸損傷。這類容器的具體實例如聚乙烯氯化物、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物製成的韌性塑膠袋。此外，為避免流體受空氣影響而變質，裝有腹膜透析液的容器可用高壓載體(high gas barrier)包裝材料包裝。
可選用過濾除菌替代加熱滅菌。例如，可用精確過濾裝置加孔徑大小0.2μm的濾膜使流體過濾而除菌。該方法不產生加熱時才生成的羰基化合物。將通過濾器除菌的腹膜透析液裝入容器如韌性塑膠袋中再密封。由於從滅菌至運輸的過程與現有透析液的製備無異，故本發明的腹膜透析液也可以用含有類似步驟的方法生產。
通過高壓加熱滅菌等加熱方法滅菌時，只要所用羰基化合物捕獲劑在加熱等處理條件下足夠穩定，便可在配製腹膜透析液但未加熱滅菌之前加入該捕獲劑。此方法可減少透析液在加熱期間羰基化合物的產生和積累。當然，羰基化合物捕獲劑還能減少保存和腹膜透析時的羰基化合物的產生和積累。
如果所用羰基化合物捕獲劑在加熱滅菌時不穩定，可用不需加熱的方法使其滅菌。這類滅菌方法包括如過濾除菌。或者，可將羰基化合物捕獲劑加至滅菌後的腹膜透析液中。對加試劑的時間無特別限制。例如，優選滅菌後加入羰基化合物捕獲劑，因為此種情況下，該捕獲劑不僅能抑制腹膜透析時產生羰基化合物，還可抑制腹膜透析液在透析前的保存期間產生和積累的羰基化合物。
或者，可在腹膜透析處理之前或之時臨時加入羰基化合物捕獲劑。例如，可在處理前將基本溶液和羰基化合物捕獲劑分別包裝在上述韌性塑膠袋中，開始腹膜透析時在無菌條件下將二者混合。為達到此目的，最好使用日本專利申請昭和63年19149所述的韌性塑膠袋(其包含兩個可拆卸的隔室)。
或者，可在腹膜透析環路中安裝一個混合連接器，而羰基化合物捕獲可通過該連接器注入。
腹膜透析液的這類製備方法可用於製備熱穩定性羰基化合物捕獲劑以及熱不穩定性羰基化合物捕獲劑。
此外，當通過使腹膜透析液在帶有小循環泵的閉合環路中循環而進行腹膜透析時，可在該環路的任何一處安裝一個盛有羰基化合物捕獲劑的過濾裝置。
本發明的腹膜透析液可用於一種類似於用現有腹膜透析液進行的腹膜透析治療。具體地，可將適當量的本發明腹膜透析液注入病人腹腔，使機體中存在的低分子量成分穿過腹膜轉移至該腹膜透析液中。使腹膜透析液間斷地循環，根據病人的症狀可使治療進一步持續。在此期間，羰基化合物以及其它物質如肌酸酐、無機鹽、和氯離子，從血液和腹膜內側轉移至腹膜透析液中。同時，羰基化合物的毒性被羰基化合物捕獲劑消除，從而使這些化合物無害。
附圖簡述圖1顯示出現在腹膜透析液和排出液中的羰基化合物的量。
圖2顯示羰基化蛋白質在腹膜透析病人的腹膜組織中的組織學定位照片(上圖)和相應圖例說明(下圖)。在此圖中，A表示結締組織中的陽性區，此區中出現了間皮細胞但已被除去；B表示增厚的血管壁上的陽性區。
圖3顯示間皮細胞接觸乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮時VEGF mRNA的表達。將大鼠間皮細胞與各種濃度(0,100,200，和400μM)的乙二醛(A)、3-脫氧葡糖醛酮(B)、或甲基乙二醛(C)一起溫育，提取細胞的總RNA，對其進行逆轉錄。用PCR將VEGF和G3PDH cDNA分別擴增30和21個循環。試驗均重複至三次以計算平均值。計算每一試驗的VEGFmRNA比G3PDH mRNA的均值比例。三次試驗的平均值±標準差(S.D.)如圖所示。*P＜0.0005。
圖4顯示微脈管內皮細胞接觸甲基乙二醛時的VEGF蛋白質的產生。在有各種濃度(0,200,和400μM)的甲基乙二醛存在下培養人內皮細胞，用ELISA定量釋放至培養液上清中的VEGF蛋白。三次試驗的代表性數據如所示。數據均表示為平均值±範圍。*P＜0.05,**P＜0.01。
圖5顯示內皮細胞接觸甲基乙二醛時VEGF mRNA的表達。在有各種濃度(0,100,200,和400μM)的甲基乙二醛存在下培養人內皮細胞。用PCR將VEGF和G3PDH cDNA分別擴增30和21個循環。試驗均重複至三次以計算平均值。計算每一試驗的VEGF mRNA比G3PDH mRNA的均值比例。三次試驗的平均值±標準差如圖所示。*P＜0.05,**P＜0.005,***P＜0.0001。
圖6顯示大鼠每天腹膜內給與甲基乙二醛，10天後其腹膜組織中的VEGF mRNA表達。表達於腹膜中的VEGF和G3PDH mRNA分別經RT-PCR擴增28和16個循環。試驗均重複至三次以計算平均值。計算每一試驗的VEGF mRNA比G3PDH mRNA的均值比例。三次試驗的平均值±標準差如圖所示。*P＜0.05。
圖7顯示腹膜透析病人腹腔中羰基壓力的產生過程。
圖8顯示使腹膜透析的排出液保溫後加入氨基胍對戊糖定(pentosidine)產生的影響。
圖9顯示使腹膜透析的排出液保溫後加入氨基胍對蛋白質羰基的產生的影響。
圖10顯示加入氨基胍對三例腹膜透析病人(病人I，病人S，和病人K)的腹膜透析排出液中羰基化合物(CAPD)量的影響。
圖11顯示加入氨基胍對酸性pH範圍的腹膜透析液中5-HMF的產生的影響。
圖12顯示加入氨基胍對中性pH範圍的腹膜透析液中5-HMF的產生的影響。
圖13顯示加入氨基胍對酸性和中性pH範圍的腹膜透析液中羰基化合物量的影響。
圖14顯示加入腹膜透析液中的羰基化合物捕獲珠對戊糖定產生的抑制效應。
圖15顯示加入腹膜透析液中的羰基化合物捕獲珠的羰基化合物消除效應。
圖16顯示加入二羰基化合物溶液中的活性炭的羰基化合物消除效應。
圖17顯示加入腹膜透析液中的活性炭的羰基化合物消除效應。
圖18顯示胍對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖19顯示二甲雙胍(一種二胍)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖20顯示丁二胍(一種二胍)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖21顯示苯乙雙胍(一種二胍)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖22顯示氨基胍對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖23顯示半胱氨酸(一種巰基化合物)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖24顯示N-乙醯半胱氨酸(一種巰基化合物)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖25顯示GSH(一種巰基化合物)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖26顯示清蛋白(一種巰基化合物)對乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脫氧葡糖醛酮的捕獲活性。
圖27顯示加入腹膜透析液中的巰基化合物對戊糖定產生的抑制效應。
實施本發明的最佳模式本發明參照以下實施例更具體地舉例說明，但並非限制。
實施例1．測定腹膜透析液和腹膜透析液排出液中出現的羰基化合物的量為了證實腹腔中羰基壓力的產生，按以下實驗方法測定腹膜透析液排出液中出現的羰基化合物的量。
(ⅰ)羰基化合物的測定將腹膜透析液(Baxter Ltd；Dianeal PD-225)施用於腹膜透析病人，並使之充盈在腹腔中過夜，收集該病人的腹膜透析液排出液。取腹膜透析液和腹膜透析液排出液的等分試樣(400μl)，分別與含有1.5mM 2,4-二硝基苯基肼(2,4-DNPH)(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)的0.5N鹽酸溶液400μl混合，室溫攪拌30分鐘使羰基化合物與2,4-DNPH反應。然後，向該混合物中加入1M丙酮的水溶液(40μl)，室溫攪拌5分鐘以除去過量2,4-DNPH。將該混合物用400μl正己烷洗三次。回收水相，在微滴板分光光度儀(NipponMolecular Devices Co.；SPECTRAmax250)上讀取360nm處的吸收值。
(ⅱ)製備標準曲線製備各種濃度的葡萄糖水溶液，用(ⅰ)所述方法測定葡萄糖衍生的羰基化合物量。葡萄糖濃度對羰基化合物濃度的標準曲線根據此實驗製備。
(ⅲ)羰基化合物的定量腹膜透析液和腹膜透析液排出液各自的葡萄糖濃度用葡萄糖測試盒(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.；萄萄糖CII-Test Wako)測定。由葡萄糖衍生的羰基化合物量用標準曲線估計。流體中羰基化合物的量為樣品溶液中羰基化合物的總量減去葡萄糖衍生的羰基化合物量的所得。
結果見圖1。已在腹腔中充盈過夜的腹膜透析液排出液含有5倍於腹膜透析液在給藥前的羰基化合物的量。這表明，羰基化合物從血液中轉移至腹腔。
實施例2．腹膜透析病人腹膜中羰基修飾的蛋白質的組織學定位腹膜透析病人腹膜組織中羰基化合物的定位以丙二醛作指示劑用免疫染色進行研究。
腹膜透析病人(50歲男性，有5年腹膜透析史)的腹膜組織按Horie等(Horie,K.等，臨床研究雜誌，100,2995-3004(1997))的方法進行免疫染色。所用第一抗體為小鼠抗丙二醛單克隆抗體。結果顯示，強陽性信號出現在已去除的間皮細胞下層的結締組織中，以及增厚的脈管壁上(圖2)。
丙二醛(MDA)為羰基化合物，其通過過氧化脂質的降解產生。因此，免疫染色用抗4-羥基-2-壬烯醛(其為過氧化脂質的降解產物，而非MDA的降解產物)、抗羧甲基賴氨酸和戊糖定(它們由糖類氧化產生)的抗體來進行。結果顯示，陽性信號定位於圖2所示的相同區域。這些說明，在腹膜透析病人的腹膜組織中，引起過氧化脂質的降解產物和糖類氧化產生的羰基化合物導致羰基壓力增大，蛋白質在羰基壓力的增強過程中得到修飾。
實施例3．腹膜細胞被甲基乙二醛損傷長期腹膜透析導致的超濾作用降低已被作為腹膜表面可用於擴散交換的區域存在的證據(Krediet RT,Kidney Int,55:341-356(1999)；Heimburger O等，Kidney Int,38:495-506(1990)；Imholz AL等，Kidney Int,43:1339-1346(1993)；Ho-dac-Pannekeet MM等，Perit Dial Int,17:144-150(1997))。即，腹膜透析液中的葡萄糖從腹腔擴散而出，從而減弱基於滲透壓梯度的透析功能。腹膜內血管表面積的增加也可能造成這種情況。此外，血管內皮細胞生長因子(VEGF)也可能在該病理狀況中起重要作用。VEGF可增加血管通透性(Senger DR等，科學219:983-985(1983)；Connolly DT等，生物化學雜誌，264:20017-20024(1989))，刺激一氧化氮(NO)合成和血管舒張(Hood JD等，美國生理學雜誌，274:H1054-1058(1998))，誘導炎性應答(Clauss M等，實驗醫學雜誌，172:1535-1545(1990)；Melder RJ等，Nat Med,2:992-997(1996))。此外，VEGF是強效血管生成因子，可促進血管損傷的恢復(ThomasKA，生物化學雜誌，271:603-606(1996)；Ferrara N等，內分泌綜述(EndocrRev),18:4-25(1997)；Shoji M等，美國病理學雜誌，152:399-411(1998))。結果，檢查了透析液中所含葡萄糖降解產物對VEGF生成的影響。
3-1在有葡萄糖降解產物存在時培養的腹膜間皮細胞和血管內皮細胞中VEGF的表達腹膜來自6周齡雄性CD(SD)IGS大鼠(Charles-River,Kanagawa，日本)。按Hjelle等的方法(Hjelle JT等，Perit Dial Int,9:341-347(1989))分離間皮細胞，將其培養於含10％胎牛血清的Dulbecco改良型Eagle培養基(DMEM)中。將傳代至7-10代的間皮細胞，於CO2培養箱中，在各種濃度的葡萄糖降解產物(乙二醛，甲基乙二醛(Sigma,St.Louis,MO)，或3-脫氧葡糖醛酮(由Fuji Memorial研究所，Otsuka Pharmaceutical Co.,Kyoto，日本，友情提供))存在的情況下，培養3小時。用半定量的RT-PCR分析VEGF mRNA的表達。用Rneasy Mini試劑盒(Qiagen，德國)分離間皮細胞的總RNA。用oligo(dT)12-18引物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)及200單位的不含Rnase H的逆轉錄酶(SuperscriptⅡ:Gibco BRL)對5μg上述RNA進行逆轉錄，如文獻所述(Miyata T等，臨床研究雜誌，93:521-528(1994))實施PCR擴增。用於擴增大鼠VEGF的引物序列為5』-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3』(SEQ ID NO:1)和5』-TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG-3』(SEQ IDNO:2)。擴增產物長310bp。用於擴增大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)的引物為5』-CCTGCACCACCAACTGCTTAGCCC-3』(SEQ ID NO:3)和5』-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3』(SEQID NO:4)，擴增得到322bp的片段。G3PDH作為內部RNA對照可比較不同標本之間的RNA水平。標本在DNA熱循環儀(Perkin Elmer Cetus,Norwork,CT)中擴增，以測定循環(94℃0.5分鐘、60℃1分鐘、72℃1.5分鐘)的適當次數。在初步實驗中，對各種量的RNA實施16,18,21,25,28,31，和34次循環的逆轉錄和PCR擴增。這些實驗顯示，對VEGF mRNA擴增30個循環，對G3PDH mRNA擴增21個循環，PCR產物信號可與摻入的RNA相當。將PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分離並用溴乙錠染色，經定量程序(NIH image)測定信號強度，從而定量該PCR產物。對葡萄糖降解產物的每一濃度進行實驗。信使RNA的測定重複三次，每次實驗的結果取平均值。對每一實驗條件進行3-4次不同實驗。結果取平均值並表示為平均值±標準差(S.D.)。用方差分析(ANOVA)評估統計學顯著性。如果經過該分析顯示出顯著性差異，將甲基乙二醛的不同濃度的結果用Scheffe氏t檢驗進行比較。
在0-400μM的濃度範圍內，乙二醛或3-脫氧葡糖醛酮均不能改變VEGF的表達(圖3A和3B)。只有甲基乙二醛在400μM的濃度下可刺激VEGF mRNA表達(P＜0.0005)(圖3C)。未經逆轉錄的RNA樣品不產生PCR產物。所有細胞均保持活性。間皮細胞也在高濃度3-脫氧葡糖醛酮(0.625,2.5，和5mM)存在時進行培養，顯示其活性降低(在有0.625,2.5，和5mM的3-脫氧葡糖醛酮存在時細胞活性分別為80,55,和8％)。由於活性降低，VEGF mRNA的表達無法檢測。根據這些觀察，僅有甲基乙二醛在後續實驗中使用。
將間皮細胞在有各種濃度的甲基乙二醛存在時培養24小時，用ELISA分析釋放至培養上清中的VEGF蛋白。人微血管內皮細胞購自Kurabo(Osaka，日本)並培養於VEGF已排除的EGM-2培養基(Takara,Tokyo，日本)中。以對大鼠腹膜間皮細胞相同的方法使這些細胞與甲基乙二醛一起溫育。培養上清中的VEGF蛋白(重複三份)用試劑盒(Quantikine:RDSystems,Minneapolis,USA)按說明書經酶聯免疫吸附實驗(ELISA)定量。實驗重複三次。結果如上述進行統計學分析。
結果，培養基中加入甲基乙二醛導致VEGF以濃度依賴方式增長(圖4)。缺乏甲基乙二醛時未檢測到VEGF的釋放。即，在蛋白質水平上，甲基乙二醛也是以濃度依賴的方式刺激VEGF的產生和釋放。
然後評估有各種濃度(0-400μM)甲基乙二醛存在時培養的內皮細胞中VEGF mRNA的表達。實驗如對大鼠間皮細胞所進行的一樣。但用於擴增人VEGF的引物為5』-GGCAGAATCATCACGAAGTGGTG-3』(SEQ ID NO:5)和5』CTGTAGGAAGCTCATCTCTCC-3』(SEQ ID NO:6)。擴增的片段長271bp。同樣的引物還用於擴增人和大鼠的G3PDH。分析顯示，VEGF mRNA以濃度依賴的方式表達(圖5)。
3-2腹膜內注射了甲基乙二醛的大鼠的腹膜組織中VEGF的表達為了進一步評估甲基乙二醛對腹膜中VEGF mRNA表達的體內生物學效應，大鼠腹腔連續10天接受各種量的甲基乙二醛。6周齡雄性CD(SD)IGS大鼠每天腹膜內注射50mg/kg含各種濃度甲基乙二醛的生理鹽水，共10天。從腹腔壁上分離腹膜，檢查其VEGF mRNA表達。如上述對大鼠間皮細胞的體外實驗一樣進行實驗。但用ISOGEN(Nippon Gene,Tokyo，日本)提取腹膜組織的mRNA。此外，對VEGF mRNA經PCR擴增28個循環，對G3PDHmRNA經PCR擴增16個循環。
如圖6所示，腹腔壁腹膜標本中的VEGF mRNA隨甲基乙二醛濃度的增加而顯著增加(P＜0.05)。在光學顯微鏡下，腹膜組織未受感染血管數、血管壁、間質、以及間皮細胞均維持正常。
3-3長期腹膜透析病人腹膜組織的VEGF和羧甲基賴氨酸(CML)的免疫染色用免疫組化技術檢查9例腹膜透析病人腹膜組織中的VEGF和羧甲基賴氨酸的分布。羧甲基賴氨酸衍生自葡萄糖降解產物如乙二醛和3-脫氧葡糖醛酮(Miyata T等，KidneyInt,55:389-399(1999))。故用抗羧甲基賴氨酸的抗體作為葡萄糖降解產物修飾的蛋白質的標誌物。
經同意，從9例非糖尿病腹膜透析病人在其重新插管期間分離腹膜組織(表1)。因導管破裂、插入位置不正確、和/或導管阻塞造成插管失敗，故必需重新插管。無一例病人患有腹膜炎。經腹部手術從兩例男性受試者(48歲和52歲，腎功能正常)獲得正常腹膜組織。
將2μ厚的腹膜組織切片封固在包被有3-氨基丙基三乙氧基甲矽烷(Sigma)的載玻片上，脫蠟，於蒸餾水中再水化，與含鏈黴蛋白酶(0.5 mg/μl:Dako,Glostrup，丹麥)的緩衝液(0.05M Tris-HCl(pH7.2),0.1M NaCl)在室溫下一起保溫15分鐘。載玻片用含0.5％土溫20的PBS衝洗，於4％脫脂牛奶中封閉2小時，再與抗VEGF的兔IgG(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,CA)或抗AGE的小鼠IgG(Ikeda K等，生物化學，35:8075-8083(1996))於4℃溼室中一起保溫過夜，所述抗體的表位為羧甲基賴氨酸(Miyata T等，Kedney Int,51:1170-1181(1997))。切片衝洗後，與1∶100稀釋的辣根過氧化酶偶聯型山羊抗兔IgG或辣根過氧化酶偶聯型山羊抗小鼠IgG(Dako)於室溫保溫2小時，然後用含0.003％H2O2的3,3｀-二氨基聯苯胺檢測。也用高碘酸-Schiff染色實施組織學分析。由兩位觀察者分別經免疫染色評估信號強度和分布。
結果見表1。該表中，「正常1」和「正常2」表示有正常腎功能的受試者的標本，「PD1」至「PD9」表示腹膜透析病人的標本。在長期腹膜透析病人(表1的PD6)的腹膜組織圖片中，觀察到多孔纖維，以及血管壁的增厚和透明變性。VEGF和羧甲基賴氨酸共定位於間皮細胞內和血管壁上。在間皮層中，VEGF的信號比羧甲基賴氨酸的信號弱。另8例病人的結果與此類似。在正常腹膜標本(表1的正常2)中，與腹膜透析標本形成對照，VEGF僅出現在血管壁上，間皮層中沒有。羧甲基賴氨酸在間皮層中沒有，在血管壁上信號很弱。另一正常對照標本的結果與此類似。用正常小鼠IgG進行免疫染色沒有結果。因此，間皮層中的VEGF表達及其與羧甲基賴氨酸的共定位僅出現在腹膜透析病人中，這提示腹膜透析液中的葡萄糖降解產物確實促進了接受腹膜透析的尿毒症病人的VEGF生成。
表1．PD(腹膜透析)病人腹膜組織中CML和VEGF的免疫組化檢測

-陰性，±弱，+陽性，++強陽性上述結果證實，腹膜透析病人由於腹膜透析液中存在葡萄糖降解產物等物質，所以都有羰基壓力，此外，還首次證實甲基乙二醛促進腹膜細胞中的VEGF生成。這提示，腹膜透析液中所含葡萄糖降解產物導致的腹膜通透性的降低至少部分歸因於對VEGF生成的促進以及伴隨而來的對血管生成的刺激。
實施例4．加入腹膜透析病人的腹膜透析排出液中的羰基化合物捕獲劑的作用
4-1
戊糖定為AGE結構，其在腎衰病人血液中比在健康人血液中多20倍(Miyata,T.等，美國腎病協會雜誌(J.Am.Soc.Nephrol.),7:1198-1206(1996))。發明人檢測了37℃保溫腹膜透析病人的排出液時，加入氨基胍如何使戊糖定和蛋白質上的羰基增加。
將放置過夜的腹膜透析病人的排出液離心，將所得上清過濾除菌(孔徑大小0.45μm)。向其中加入氨基胍(Tokyo Kasei Kogyo Co.)至終濃度為0,1,10，或100mM。將混合物37℃保溫。分析戊糖定時保溫1-2周，分析蛋白質的羰基時保溫2周。在用6N HCl於110℃水解蛋白質後用HPLC(SHIMADZU Co.；LC-10A)定量分析戊糖定(T.Miyata等，1996，美國腎病協會雜誌，7:1198-1206；T.Miyata等，1996，美國國家科學院院刊，93:2353-2358)。通過將蛋白質與2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH；Wako PureChemical Industries,Ltd.)保溫使羰基反應後，測定所產生的腙的光吸收值(Nippon Molecular Devices Co.；SPECTRAmax250)，而定量測定蛋白質的羰基(Levine,R.L.等，酶學方法，233,346-357(1994))。
根據上述實驗結果，氨基胍顯示能以濃度依賴的方式抑制戊糖定的產生(圖8)。氨基胍對蛋白質羰基的產生顯示類似的濃度依賴性抑制作用(圖9)。
4-2
然後，根據以下實驗方法檢測氨基胍對已在腹膜透析病人體內過夜之體液中羰基化合物而非葡萄糖的量的影響。
(A)腹膜透析排出液的保溫回收病人的腹膜透析排出液，用孔徑0.45μm的濾膜過濾。向其中加入0,10,50，或250mM的氨基胍(Tokyo Kasei Kogyo Co.)以製備樣品溶液。取一等份樣品溶液(1ml)加入帶有螺旋帽的塑料試管，37℃保溫15小時。保溫前將該樣品溶液於-30℃保存。
(B)羰基化合物的定量(i)對樣品溶液中存在的羰基化合物的分析取幾份400μl等份的樣品溶液，分別與400μl的含1.5mM2,4-DNPH(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)之0.5N鹽酸溶液混合，然後，室溫攪拌該混合物30分鐘使羰基化合物與2,4-DNPH反應。隨後向該混合物中加入1M丙酮水溶液(40μl)。將所得混合物室溫攪拌5分鐘，使過量的2,4-DNPH通過與丙酮反應而除去。將混合物水溶液用400μl正己烷洗三次。回收水相，在微滴板分光光度讀取儀(Nippon Molecular Devices Co.；SPECTRAmax250)上檢測其360nm的光吸收值。
(ⅱ)標準曲線的制定製備各種濃度的葡萄糖水溶液，用(ⅰ)所述方法測定葡萄糖所衍生的羰基化合物量；根據該實驗制定葡萄糖濃度對羰基化合物濃度的標準曲線。
(ⅲ)羰基化合物的定量用葡萄糖分析試劑盒(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.；Glucose CII-Test Wako)測定各種葡萄糖濃度的樣品。葡萄糖衍生的羰基化合物量用該標準曲線估計。樣品中羰基化合物的量為樣品溶液之羰基化合物總量減去葡萄糖衍生的羰基化合物量的所得。
結果見圖10。隨著氨基胍的濃度增加，未保溫和保溫(37℃15小時)樣品中的羰基化合物而非葡萄糖的量降低。
這些結果顯示，將羰基化合物捕獲劑加入腹膜透析液或施用於病人可有效抑制注入腹腔之腹膜透析液中羰基化合物的產生和/或積累。因此，衍生於腹膜透析液或血液的羰基化合物均從腹腔中減少，從而改善了腹膜透析病人的羰基壓力。
實施例5．在腹膜透析液的加熱滅菌過程中加入羰基化合物捕獲劑的作用腹膜透析液含有高濃度葡萄糖作為滲透壓調節劑(1.35-4.0w/v％)。葡萄糖不能加熱，在加熱滅菌或保存期間被降解。已報導葡萄糖的降解產物包括5-羥甲基糠醛(5-HMF)，乙醯丙酸，以及乙醛(Richard,J.U.等，Fund.Appl.Toxic.,4:843-853(1984),Nilsson,C.B.等，Perit.Dial.Int.,13:208-213(1993))。本發明人通過監控5-HMF和羰基化合物含量，檢測了氨基胍對腹膜透析液加熱滅菌期間羰基化合物之產生的抑制作用。由於葡萄糖的降解程度受溶液pH的影響，故製備了酸性pH(pH5.3)和中性pH(pH7.0)的兩種腹膜透析液來進行該實驗。滅菌溫度為121℃。
5-1
5-HMF用高壓液相層析(SHIMADZU Co.；LC-10A)進行分析(Nillson,C.B.等，Perit,Dial.Int.,13:208-213(1993))。
結果顯示，氨基胍在酸性pH(圖11)和中性pH(圖12)條件下以濃度依賴的方式有效抑制5-HMF的生成。
5-2
用實施例1所述方法，通過測定腹膜透析液與2,4-DNPH反應後的光吸收值，而測定腹膜透析液中的羰基化合物(Levine,R.L.等，酶學方法，233:346-357(1994))。滅菌溫度121℃。
結果顯示，氨基胍以濃度依賴方式有效抑制羰基化合物的生成(圖13)。
這些發現清楚表明，在腹膜透析液中加入抑制羰基化合物生成的試劑可極有效抑制腹膜透析液中羰基化合物的產生和/或積累。
實施例6．羰基化合物捕獲珠加入腹膜透析液後對戊糖定生成的影響羰基化合物捕獲珠含有磺醯肼偶聯型聚苯乙烯樹脂(PS-TsNHNH2；ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)，測定其消除腹膜透析液中羰基化合物的效應。將腹膜透析液，和含有羰基化合物捕獲珠的透析液於37℃保溫，以評估抑制戊糖定生成的效應。向含有羰基化合物捕獲珠的試管中加入二甲亞碸(100μl)，使所述珠溶脹。然後向試管中加入800μl腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)和200μl 150mg/ml牛血清清蛋白的水溶液。試管於37℃保溫1周。然後，用膜孔徑0.22μm的離心過濾管(Millipore Co.；UFC30GV00)除去所述珠。然後向已除去珠的溶液(50μl)中加入50μl 10％三氯乙酸。將該混合物離心以沉澱蛋白質。將蛋白質沉澱用300μl 5％三氯乙酸洗滌，然後乾燥。接著，向該蛋白質沉澱中加入100μl 6N HCl，使溶解的蛋白質於110℃加熱16小時。用HPLC定量所得樣品的戊糖定(T.Miyata等，1996，美國腎病協會雜誌，7:1198-1206；T.Miyata等，1996，美國國家科學院院刊，93:2353-2358)。
通過37℃保溫後產生的戊糖定量見圖14所示。其表明，加入羰基化合物捕獲珠可極有效地抑制戊糖定產生。
實施例7．腹膜透析液中加入羰基化合物捕獲珠的羰基化合物消除效應檢測羰基化合物捕獲珠消除腹膜透析液中羰基化合物的效應。向含有羰基化合物捕獲珠(PS-TsNHNH2；ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)的試管中加入二甲亞碸(100μl)，以使珠溶脹。再加入900μl腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)。用旋轉器室溫攪拌該混合物16小時。然後將含有羰基化合物捕獲珠的懸浮液用膜孔徑0.22μm的離心過濾管(Millipore Co.；UFC30GV00)過濾，經以下方法測定濾液中羰基化合物的量。
羰基化合物的定量
(1)樣品溶液的分析將樣品溶液(200μl)與200μl的含2,4-DNPH(0.025％)之0.5N鹽酸溶液混合，30℃保溫30分鐘。隨後向該混合物中加入1M丙酮水溶液(20μl)。將所得混合物30℃保溫10分鐘。將混合物水溶液用200μl正己烷洗三次，在水相加入200μl辛醇以抽提腙。回收辛醇層，在微滴板分光光度讀取儀(Nippon Molecular Devices Co.；SPECTRAmax250)上檢測360nm的光吸收值。
(2)標準曲線的制定製備各種濃度的葡萄糖水溶液，用(1)所述方法測定葡萄糖所衍生的羰基化合物量；根據該實驗制定葡萄糖濃度對羰基化合物濃度的標準曲線。
(3)羰基化合物的定量用葡萄糖分析試劑盒(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.；Glucose CII-Test Wako)測定各種葡萄糖濃度的樣品。葡萄糖衍生的羰基化合物量用該標準曲線估計。樣品溶液中羰基化合物的量為樣品溶液之羰基化合物總量減去葡萄糖衍生的羰基化合物量。
結果見圖15。在腹膜透析液中加入羰基化合物捕獲珠(2mg)，室溫攪拌該懸浮液16小時。該處理可減少55％的羰基化合物。當加入透析液的羰基化合物捕獲珠為10mg時，羰基化合物的量進一步減少。
這些結果清楚表明，帶有固定化羰基化合物捕獲劑的載體可用於抑制腹膜透析液中羰基化合物的產生和/或積累。
實施例8．活性炭對二羰基化合物溶液中羰基化合物的捕獲活性用活性炭作為羰基化合物捕獲劑，評估其消除二羰基化合物溶液中羰基化合物的效應。將一種二羰基化合物(100μM)溶於磷酸鹽緩衝液(簡稱「PBS」)，製備出二羰基化合物溶液。將該溶液(900μl)加入含25μg或50μg活性炭(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的試管中。所用二羰基化合物為乙二醛、甲基乙二醛、以及3-葡糖醛酮。將試管置於旋轉器上，室溫攪拌19小時。然後，將試管中的溶液用膜孔徑0.22μm的離心過濾管(Millipore Co.；UFC30GV00)過濾。每種二羰基化合物的濃度用高壓液相層析根據常用方法測定。
結果見圖16。將25μg活性炭加入900μl二羰基化合物溶液時，活性炭所捕獲的乙二醛(GO)為71％、甲基乙二醛(MGO)為94％、3-葡糖醛酮(3DG)為93％。加入50μg活性炭時，活性炭所捕獲的乙二醛為85％、甲基乙二醛和3-葡糖醛酮均為98％。故，證實所檢測的每種二羰基化合物的大多數均被活性炭捕獲。
實施例9．活性炭對腹膜透析液中羰基化合物的捕獲活性用活性炭作為羰基化合物捕獲劑，評估其消除腹膜透析液中羰基化合物的效應。將一等份(900μl)腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)加入含25μg或50μg活性炭(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的試管中。將試管置於旋轉器上，室溫攪拌19小時。然後，將試管中的溶液用膜孔徑0.22μm的離心過濾管(Millipore Co.；UFC30GV00)過濾。乙二醛、甲基乙二醛、以及3-葡糖醛酮的濃度用高壓液相層析根據常用方法測定。
結果見圖17。將25μg活性炭加入900μl腹膜透析液時，活性炭所捕獲的乙二醛(GO)為56％、甲基乙二醛(MGO)為71％、3-葡糖醛酮(3DG)為62％，均為與不含活性炭的透析液比較。加入50μg活性炭時，活性炭所捕獲的乙二醛為64％、甲基乙二醛為78％、3-葡糖醛酮為77％。故，證實所檢測的每種二羰基化合物均被活性炭捕獲。
實施例10．胍、氨基胍、和雙胍試劑捕獲乙二醛、甲基乙二醛、以及3-葡糖醛酮的活性將乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮(各1mM)的混合物(50μl)再與0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)400μl，以及胍、氨基胍、或一種雙胍試劑(各50μl；30mM)混合。將所得混合液37℃保溫。所用雙胍試劑為二甲雙胍、丁二胍、和苯乙雙胍。保溫後，用鄰苯二胺將乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮轉化為喹喔啉衍生物，並用高壓液相層析測定各自的濃度。
結果見圖18(胍)、圖19(二甲雙胍)、圖20(丁二胍)、圖21(苯乙雙胍)、和圖22(氨基胍)。胍、氨基胍、以及所有雙胍試劑均顯示能顯著降低甲基乙二醛(具體而言)的濃度。此外，氨基胍極顯著降低甲基乙二醛的濃度，並明顯降低3-葡糖醛酮的濃度(其不因其它雙胍試劑而明顯降低)。
實施例11．含巰基試劑捕獲乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮的活性將乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮(各1mM)的混合溶液(50μl)再與0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)400μl，以及巰基化合物溶液(50μl；30mM)混合。將所得混合液37℃保溫。所用巰基化合物為半胱氨酸、N-乙醯半胱氨酸、和GSH。保溫後，用鄰苯二胺將乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮轉化為喹喔啉衍生物，並用高壓液相層析測定各自的濃度。
結果見圖23(半胱氨酸)、圖24(N-乙醯半胱氨酸)、和圖25(GSH)。發現所有巰基化合物均顯示能顯著降低乙二醛和甲基乙二醛的濃度。
實施例12．清蛋白捕獲乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮的活性將乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮(各1mM)的混合溶液(50μl)再與0.1 M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)400μl，以及100mg/ml牛血清清蛋白溶液50μl混合。將所得混合液37℃保溫。保溫後，用鄰苯二胺將乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮轉化為喹喔啉衍生物，並用高壓液相層析測定各自的濃度。
結果見圖26。發現牛血清清蛋白能顯著降低乙二醛和甲基乙二醛的濃度。
實施例13．巰基化合物加入腹膜透析液並於37℃保溫後對戊糖定生成的抑制效應將一等份(490μl)腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)與70μl含巰基化合物的0.1 M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)以及140μl含30mg/ml牛血清清蛋白之腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)混合。將所得混合液37℃保溫1周。所用巰基化合物為半胱氨酸、N-乙醯半胱氨酸、和GSH。還用到氨基胍。保溫後，向該溶液(50μl)中加入50μl 10％三氯乙酸。離心該混合物以沉澱蛋白質。沉澱的蛋白質用300μl 5％三氯乙酸洗滌，然後乾燥。接著，向蛋白質沉澱中加入100μl 6NHCl，將溶解的蛋白質110℃加熱16小時。用高壓液相層析定量所得樣品的戊糖定(T.Miyata等，1996，美國腎病協會雜誌，7:1198-1206；T.Miyata等，1996，美國國家科學院院刊，93:2353-2358)。
結果見圖27。表明加入含巰基化合物可極有效地抑制戊糖定產生。
工業實用性本發明可輕易消除腹膜透析期間由羰基化合物導致的長期折磨病人的毒性損害。當使用傳統腹膜透析液時，由於透析期間從機體其它部位轉移至腹腔的羰基化合物，以及由於透析液製備過程中產生的羰基化合物，導致病人被透析的腹膜長期處於羰基壓力之下。相比之下，本發明可有效消除腹膜透析液中產生的羰基化合物，並因此可有效改善透析病人的羰基壓力。此外，轉移至腹腔的羰基化合物還可通過注入羰基化合物捕獲劑或使透析液通過羰基化合物捕獲藥筒進行循環而有效滅活或消除。因此，本發明提供一種預防由腹膜透析所致損害，包括與腹膜透析相關的羰基化合物所致損害的很有效的方法。
此外，本發明能除去加熱或長期保存期間因葡萄糖的降解所產生的羰基化合物，從而成功提供了一種中性pH的腹膜透析液，其在目前的製藥學上因葡萄糖的降解而難以製備。因此，本發明能提供更符合生理學的腹膜透析治療。
本發明的腹膜透析液實際可用簡單的方法製備，如與羰基化合物捕獲劑接觸或直接施用。此外，本發明腹膜透析液的生產不需要任何專用設備。因此本發明的羰基化合物捕獲劑、用其製備的腹膜透析液、以及其生產方法為腹膜透析治療帶來一個全新的治療概念。
序列表110KUROKAWA,KiyoshiMIYATA,Toshio120羰基壓力改善劑和腹膜透析液130KRK002DP1PCT140141150JP 1998-2371081511998-08-24150JP 1999-1553931511999-06-021606170PatentIn Ver.2.0210121121212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列4001actggaccct ggctttactg c 21210221122212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列4002ttggtgaggt ttgatccgca tg 22210321124212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列4003cctgcaccac caactgctta gccc 24210421123212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列4004gatgtcatca tatttggcag gtt23210521123212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列4005ggcagaatca tcacgaagtg gtg23210621121212DNA213人工序列220223人工序列的描述人工合成的引物序列4006ctgtaggaag ctcatctctc c 2權利要求
1．一種用於改善腹膜透析期間腹膜內的羰基壓力狀態的試劑，其包含一種羰基化合物捕獲劑作為活性成分。
2．權利要求1的試劑，其中羰基化合物捕獲劑固定在不溶性載體上。
3．權利要求1的試劑，其中羰基化合物捕獲劑與腹膜透析液混合。
4．權利要求1-3中任一項的試劑，其中羰基化合物捕獲劑選自氨基胍、吡哆胺、肼、雙胍化合物、含巰基化合物、以及它們的衍生物。
5．權利要求1-3中任一項的試劑，其中羰基化合物捕獲劑為抑制美拉德反應的試劑。
6．權利要求1的試劑，其中羰基化合物捕獲劑為不溶於腹膜透析液但能吸收羰基化合物的化合物。
7．一種用於捕獲腹膜透析液中羰基化合物的藥筒，其中該藥筒中裝有權利要求2和/或權利要求6的羰基化合物捕獲劑。
8．一種用於製備羰基化合物含量降低的腹膜透析液的方法，該方法包括使所述腹膜透析液通過權利要求7的藥筒。
9．一種用於製備羰基化合物含量降低的腹膜透析液的方法，該方法包括(a)使所述腹膜透析液與權利要求2和/或權利要求6的羰基化合物捕獲劑接觸，和(b)使所述腹膜透析液與所述羰基化合物捕獲劑分離。
10．一種含有羰基化合物捕獲劑的腹膜透析液。
11．權利要求10的腹膜透析液，其中該腹膜透析液還含有一種還原糖，並被置於含有第一室和第二室的一個容器內，使第一室容納所述還原糖，第二室容納所述羰基化合物捕獲劑。
12．權利要求10的腹膜透析液，其中所述羰基化合物捕獲劑於腹腔內施用。
全文摘要
本發明將緩解腹腔內羰基壓力的藥物應用於腹膜透析,所述藥物以羰基化合物捕獲劑作為活性成分。腹膜透析期間形成並累積的羰基化合物由諸如氨基胍之類的羰基化合物捕獲劑滅活或消除。腹膜透析液的滅菌和保存期間形成的羰基化合物通過事先與所述捕獲劑接觸而被消除。此外,在腹膜透析液中添加所述捕獲劑或通過應用藥筒使所述捕獲劑循環以捕獲羰基化合物,有可能消除病人血液中產生並在透析過程中流入腹腔中的羰基化合物。從而可抑制腹腔中的蛋白質修飾和緩解因腹膜透析造成的腹膜損傷。
文檔編號A61M1/28GK1324248SQ99812545
公開日2001年11月28日 申請日期1999年8月23日 優先權日1998年8月24日
發明者宮田敏男 申請人:黑川清, 宮田敏男