蛋白質支架的製作方法

2023-06-14 09:25:16

專利名稱：蛋白質支架的製作方法
蛋白質支架1.相關申請的交叉引用本申請要求2007年10月31日提交的美國臨時申請號60/984，209的優先權，該 申請通過引用全文納入本文。2.發明領域本發明涉及特異性結合靶標的蛋白質支架以及製備、篩選和利用這種支架的方法。3.
背景技術：
本發明涉及可用於，例如產生具有新型結合特徵的產物的蛋白質支架。具有相對確定三維結構的蛋白質通常稱為蛋白質支架，其可用作設計工程改造產 物的試劑。這些支架通常含有適於特定或隨機序列改變的一個或多個區域，常進行這種序 列隨機化來產生可從中選擇所需產物的蛋白質文庫。可利用這種支架的一個具體領域是抗 體模擬設計領域。雖然市場上已有治療性抗體的一些成功例子(HERCEPTIN , AVASTIN ,
SYNAGIS )，但製備抗體片段作為治療性蛋白的興趣不斷高漲。其優勢在於便於通過分子 生物學技術操作，從而能獲得所需結合特性，即在微生物系統中表達這種片段的能力，以及 預計抗體片段的組織穿透力優於全長抗體。一個例子是REOPRO 。此外，已有人致力於開發小的、非抗體治療劑，即抗體模擬物，從而能利用抗體和 抗體片段的優勢，例如結合靶標的親和力高和免疫原性及毒性低，同時能避免一些缺點，例 如需要結構域內的二硫鍵，這要求正確摺疊和抗體片段易於凝聚及穩定性不如全長IgG。一 個例子是通過缺失單克隆抗體重鏈可變區的三個β鏈設計的「小抗體(minibody)」支架， 其涉及免疫球蛋白摺疊(Tramontane)等，J. Mol. Recognit. 7 :9，1994)。該蛋白質包含61個 殘基，可用於提供兩個超變環，很像抗體中的互補決定區(CDR)。這兩個環任意排列，並選擇 了能結合抗原的產物，但迄今為止該框架因溶解性問題而看來應用有限。用於展示環的另 一框架是澱粉酶抑肽，它是α -澱粉酶的小蛋白抑制劑，含有74個殘基，通過兩個二硫鍵組 合在一起的6-鏈β片層夾心並形成3個CDR-樣環(McConnell和Hoess，J. Mol. Biol. 250 460，1995)。測試了其它蛋白質是否能作為框架，並用於展示α螺旋表面上的隨機殘基(Nord 等，Nat. Biotechnol. 15 :772，1997 ；Nord 等，Protein Eng. 8 :601，1995)，α 螺旋束中 α 螺 旋之間的環(Ku 和 Schultz，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 92 :6552，1995)，和由二硫鍵約束的 環，例如小蛋白酶抑制劑的那些(Markland等，Biochemistry 35 :8045，1996 ；Markland等， Biochemistry 35 :8058，1996 ；Rottgen 禾口 Collins，Gene 164 -.243,1995 ；Wang 等，J. Biol. Chem. 270 12250，1995)。因此，需要開發小的、穩定的、人工抗體-樣分子以供各種治療和診斷應用。本文對參考文獻的引用或討論不應理解為承認這種參考文獻是本發明的現有技 術。
4.發明概述本發明提供能結合任何感興趣化合物的重組非天然產生的蛋白質支架家族。具體 地說，本文所述蛋白質可用於展示與抗體可變區的互補決定區(OTR)類似的確定環。這些 環可經隨機化或限制性進化而產生結合多種靶化合物所需的多樣性。這些蛋白質可裝配成 能結合不同靶標的多特異性支架。本發明提供重組非天然產生的多肽支架(下文稱為「本發明支架」)，其包含與衍 生自天然產生的蛋白質序列的多個環區域序列相連的多個β鏈結構域，其中通過天然產 生的蛋白質序列中相應環序列的至少一個胺基酸的缺失、取代或添加而改變一個或多個所 述環區域序列，其中該多肽支架的β鏈結構域與天然產生蛋白質序列的相應結構域序列 有至少50%同源性。在一些實施方式中，天然產生的序列是對應於人結合腕蛋白C的蛋白 質序列。具體地說，這些支架包括結合腕蛋白C的第三FnIII結構域(也稱為「Τη3」結構 域)。在具體的實施方式中，本發明支架包含選自下組的胺基酸序列SEQ ID N0:l、5-32、 64-67和210。在其它具體實施方式
中，本發明支架可由包含選自下組的序列的核酸編碼 SEQ ID NO 33-59。在其它實施方式中，天然產生的序列對應於預測的Tn3結構基序，例如衍生自嗜 熱生物的那些，例如但不限於閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、海葡萄嗜熱菌 (Staphylothermus marinus)、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldarius)、硫磺礦硫化 Bflif (Sulfolobus solfataricus)、禾口硫化卩十菌(Sulfolobustokodaii)。在具體的實施方式中，本發明支架包含選自下組的胺基酸序列SEQ IDNO :2_4、 68-88和210。在其它特定實施方式中，本發明支架可由包含選自下組的序列的核酸編碼 SEQ ID NO :89-98。在本發明的另一方面，本發明支架還包括二硫鍵穩定的支架。通過耐熱、耐受離液 變性作用和蛋白酶處理檢測到二硫鍵穩定的支架顯示穩定性增加。本發明的支架經工程改造結合感興趣靶標，如本文所述。這種結合可以，例如顯示 至少100 μ M的親和力。本發明還提供包含至少兩個本發明支架的多聚支架(下文稱為「本發明的多聚支 架」)。在一些實施方式中，本發明的多聚支架包含至少兩個相連的支架，例如但不限於二聚 結構域、胺基酸接頭、二硫鍵、化學交聯和IgG分子或其片段或Fc區域。本發明還提供包含多個本發明支架的多肽展示文庫(下文稱為「本發明文庫」)。 本發明文庫可用於捕捉和堅定靶標結合支架來構建多聚支架。在另一方面，本發明還提供編碼本發明支架和文庫的分離核酸分子。本發明還提供製備、利用、篩選、優化和工程改造本發明支架和文庫的方法。在還有另一方面，本發明還提供包含本發明支架的藥物組合物。本發明還提供通過給予治療有效量的本發明支架和/或包含本發明支架的藥物 組合物來治療、預防、緩解、檢測、診斷或監測患者中疾病或其症狀的方法，如本文所述。在具體的實施方式中，本發明提供可用於預防、緩解、檢測、診斷或監測疾病，例如 但不限於癌症的TRAIL-R2特異性結合物。在其它具體的實施方式中，本發明的TRAIL-R2 特異性結合支架可用於治療其中的癌細胞表達TRAIL-R2的癌症。在一些實施方式中，癌症 可包括但不限於肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胃腸道癌症、腎癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤。5.附圖簡述出於說明本發明的目的，附圖描述了本發明的某些實施方式。然而，本發明不限於 附圖所述實施方式的確切配置和手段。

圖1.支架的重組體總細胞表達.此處顯示了表達蛋白質支架的大腸桿菌培養物 的各種重組體裂解液的考馬斯染色PAGE凝膠。高度表達的支架以星號(*)表示。圖2.基於Tn3的支架的表達和純化.此處顯示了重組體表達和純化後描述基於 Τη3的支架的考馬斯染色PAGE凝膠。不難將Tn3支架純化至均一。圖3Α.基於Τη3的支架的解鏈溫度和測定.該圖顯示了通過示差掃描量熱法檢測 基於Τη3支架的熱解鏈曲線。ρΗ 7.0時，測定的Tm是約45°C。圖3B.基於Tn3的支架的脲變性特徵.該圖顯示了 ρΗ 7. 5時，基於Τη3的支架在各 種濃度的脲中的變性特徵。利用分子的固有螢光的改變檢測分子的解摺疊情況。對於Τη3支 架，解摺疊導致螢光強度增加並向較高波長遷移。如該圖所顯示的，該分子在低濃度脲(小於 或等於1Μ)中摺疊，在較高濃度脲中變性。計算的50%分子解摺疊的摩爾濃度約為2Μ。圖3C. Τη3支架存在單體狀態.該圖顯示純化的Τη3支架的尺寸排阻層析分析結 果，從而測定了汙染性片段和/或高級結構的相對比例。圖上的百分比表示97%以上的支 架以單體形式洗出(通過在線光掃描檢測器測定約為IlkDa)，而只有少部分(約3% )在 峰值為21kDa處洗出，可能是二聚體。圖4.顯示環長度多樣性的支架的BC環.該圖表示各種Tn3相關蛋白質支架的BC 環的長度多樣性。(A)表示衍生自PDB資料庫的Τη3相關支架亞組的序列(51條序列)顯 示的環長度多樣性。(B)表示衍生自瑞士-蛋白質資料庫(Swiss-prot database)的序列 (397條序列)顯示的環長度多樣性。如圖所示，各種Tn3相關支架顯示長度為7-26個氨基 酸殘基。按照本文所用的方案，Τη3中BC環的長度是9個殘基。圖5.支架的TO環顯示環長度多樣性.該圖表示各種Tn3相關支架的TO環的長 度多樣性。該圖描述了衍生自PDB資料庫的Τη3相關支架亞組的序列所顯示的TO環長度 多樣性。如圖所示，Tn3支架的TO環顯示長度為6-18個胺基酸殘基。按照本文所用的方 案，Tn3中TO環的長度是10個殘基。圖6.支架的DE環顯示環長度多樣性.該圖表示各種Tn3相關支架的DE環的長 度多樣性。該圖描述了衍生自PDB資料庫的Τη3相關支架亞組的序列所顯示的DE環長度 多樣性。如圖所示，Τη3支架的DE環顯示長度為約4-約17個胺基酸殘基。按照本文所用 的方案，Τη3中DE環的長度是6個殘基。圖7Α.支架的9胺基酸殘基BC環顯示序列多樣性.該圖表示瑞士 -蛋白質數據 庫的9胺基酸殘基BC環(73條序列)顯示的序列多樣性。利用比對工具，Webl0g0，9氨基 酸殘基BC環中特定位置胺基酸的相對發生率由特定位置上單字母密碼的大小表示。例如， 所分析的9胺基酸殘基BC環3位最常見的胺基酸是脯氨酸(P)，然後是丙氨酸(A)，再然後 是纈氨酸(V)。圖7B.支架的12胺基酸殘基BC環顯示序列多樣性.該圖表示瑞士-蛋白質數據 庫的12胺基酸殘基BC(99條序列)環顯示的序列多樣性。利用比對工具，Webl0g0，12氨 基酸殘基BC環中特定位置胺基酸的相對發生率由特定位置上單字母密碼的大小表示。例如，所分析的12胺基酸殘基BC環3位最常見的胺基酸是脯氨酸(P)，然後是甘氨酸(G)，再 然後是穀氨醯胺(Q)。圖8.支架的re環顯示序列多樣性.該圖表示瑞士-蛋白質資料庫所有長度的re 環(393條序列)顯示的序列多樣性。利用比對工具，ffeblogo, TO環中特定位置胺基酸的 相對發生率由特定位置上單字母密碼的大小表示。例如，所分析的re環2位最常見的氨基 酸是天冬醯胺(N)，然後是蘇氨酸(T)，再然後是賴氨酸(K)。圖9. SYNAGIS 特異性Tn3支架的表達和純化.此處顯示了重組體表達和純化 後描述SYNAGIS 特異性Τη3支架(SynBPOl)的考馬斯染色PAGE凝膠。不難將SynBPOl 支架純化至均一。圖9B.測定SYNAGIS 特異性結合支架的Kd.曲線表示通過BIACORE 試驗 表徵SynBPOl支架與SYNAGIS 的特異性結合親和力的實驗。利用各種濃度的固定化 SYNAGIS 和流動相SynBPOl測定到結合親和力(Kd)為約16 μ M。圖9C. SYNAGIS 特異性結合支架顯示與基礎支架類似的穩定性.從實施例 3製備的支架文庫鑑定SYNAGIS 特異性結合支架。此處顯示了通過固有螢光強度檢測 蛋白質解摺疊情況的脲變性實驗結果。在該實驗中，隨著脲濃度升高，Tn3支架(WT)和 SYNAGIS 特異性結合支架SynBPOl (Al)顯示非常相似的變性特徵。圖9D.結合支架二價結合靶抗體SYNAGIS .曲線表示採用BIAcore試驗方式 表徵兩個支架結合到固定分子上的實驗。在該實驗中，固定的SYNAGIS 覆蓋有ΙμΜ的 SYNAGIS 4寺異性蛋白支架溶液(藍色曲線)或ΙμΜ的SYNAGIS 特異性蛋白支架 +0. 19 μ M交聯mAb溶液(紅色曲線)。圖10Α.含有天然產生的二硫鍵的Τη3結構基序的序列比對.該序列比對在線顯 示了 21個含有天然產生二硫鍵的Τη3相關結構基序中半胱氨酸殘基的位置，從而測定穩定 性工程改造的候選位置。各Τη3序列內類似著色的Cys殘基由二硫鍵相連。比對包括Τη3 的序列(Iten.pro)以促進鑑定Tn3中對應於含二硫鍵的支架中半胱氨酸殘基的殘基和位置。圖10Β.靶向二硫鍵工程改造以增加支架穩定性.該圖描述了支架序列中待工程 改造的潛在二硫鍵位置。為增加穩定性，分別工程改造支架中描述的4個二硫鍵位置。得 到的重組支架分別稱為Tn3SS1、Tn3SS2、Tn3SS3和Tn3ss4。圖10C.所選的純化二硫鍵工程改造支架的RP-HPLC曲線.圖中描述了純化、還原 和重摺疊形成二硫鍵後(i)Tn3SS3和(ii)Tn3ss4的反相HPLC色譜圖。色譜圖顯示了支架內 所含的半胱氨酸在蛋白質純化後僅部分氧化(上曲線)，通過DTT處理完全還原(中間曲 線)和重摺疊後完全氧化成二硫鍵(下曲線)。圖10D. 二硫鍵工程改造支架的表達和表徵.該圖描述了圖IOB所示4個二硫鍵 工程改造支架的聚丙烯醯胺凝膠電泳分析結果。在還原和非還原條件下分析純化和重摺疊 構建物Tn3 (野生型)、Tn3ssl (1)、Tn3SS2 (2)、Tn3SS3 (3)、Tn3ss4 (4)樣品來評估預計的二硫鍵 形成。所述Tn3SS2形成二硫鍵連接的二聚體。其它構建物(Tn3、Tn3ssl、Tn3SS3和Tn3ss4)不 對摻入的半胱氨酸殘基起反應而形成二聚體，因為純化和重摺疊的含二硫鍵支架在還原和 非還原條件下作類似遷移。圖10E.單二硫鍵工程改造支架的脲變性特徵.該圖描述了圖A中概述的所選的含二硫鍵支架，Tn3ssl (SSl)、Tn3SS3(SS3)和Tn3ss4(SS4)以及Tn3(WT)支架的脲變性研究結 果。在該實驗中，各種純化和重摺疊支架接觸水平升高的脲。監測相對螢光作為解摺疊的檢 測手段。隨著蛋白質解摺疊或變得不穩定，相對螢光增加。如圖中所示，與Tn3支架相比， 含有Tn3ssl的支架顯示對脲的敏感性較高，因此較不穩定。與Tn3相比，支架Tn3SS3和Tn3ss4 也顯示對脲介導變性的耐受性更強，因此更穩定。在該實驗所檢驗的支架中，支架Tn3ss4顯 示對脲介導變性的耐受性最強。圖10F.與Tn3支架相比，Tn3ss4 二硫鍵工程改造支架顯示穩定性增加.該圖顯示 了比較Tn3支架(圓圈)和含二硫鍵支架Tn3ss4(正方形)穩定性的鹽酸胍變性試驗結果。 如該圖所示，Tn3ss4支架顯示對胍介導變性的耐受性更強，因此與Tn3支架相比更穩定。圖10G.與Τη3支架相比，Tn3ss4支架顯示高水平的蛋白酶耐受.該圖描述了比較 Tn3支架與含Tn3ss4的支架穩定性的蛋白酶敏感性試驗結果。在該實驗中，相對蛋白酶耐受 性與蛋白質穩定性相關。對於Tn3支架，與嗜熱菌蛋白酶溫育最低10分鐘導致降解。與嗜 熱菌蛋白酶溫育1小時後，Τη3支架完全降解。含Tn3ss4的支架在完整的16小時過程中顯 示嗜熱菌蛋白酶耐受性，提示穩定性高於Tn3支架。圖10Η. Tn3ss4 二硫鍵工程改造支架顯示高解鏈溫度(Tm).該圖描述了比較Tn3支 架(虛線)與含二硫鍵Tn3ss4支架(實線)的熱穩定性研究結果。如解鏈曲線所示，Tn3ss4 支架顯示解鏈溫度(約71°C)高於Tn3支架(約45°C，也參見圖3Α)。圖101. Tn3ss4 二硫鍵工程改造的支架存在單體狀態.該圖描述了 Tn3ss4支架的尺 寸排阻層析/多角度光散射(SEC-MALS)分析曲線。該數據顯示純化的Tn3ss4支架存在單 體狀態，在線光散射檢測器測定到約llkDa。圖10J.純化的Tn3SS3+4 二硫鍵工程改造支架的RP-HPLC色譜.該圖描述了純化後、 還原後和重摺疊形成二硫鍵後Tn3SS3+4的反相HPLC色譜圖。曲線顯示了支架內所含半胱氨 酸在蛋白質純化後僅部分氧化(上曲線)，通過DTT處理完全還原(中間曲線)和重摺疊後 完全氧化成兩個二硫鍵(下曲線)。圖10K.含雙二硫鍵的支架Tn3SS3+4顯示高穩定性水平.該圖顯示比較Tn3 (野生 型)支架(圓圈)與含單二硫鍵的支架，Tn3ss4(正方形)與含雙二硫鍵的支架Tn3SS3+4(三 角形)的穩定性的鹽酸胍變性實驗結果。如圖中所示，與含有單重摺疊二硫鍵的支架Tn3ss4 以及Tn3支架相比，重摺疊的雙二硫鍵支架Tn3SS3+4顯示對胍介導變性的耐受性更強，因此， 更穩定。圖11A.超嗜熱生物的支架的表達和純化.此處顯示了表達和純化各種超嗜熱細 菌的預計支架(Tn3結構基序)的考馬斯染色PAGE凝膠。將所有預計的支架表達和純化至 均一。在該圖中，T表示總細胞裂解液，S表示可溶性裂解液部分，P表示純化的蛋白質。圖11B.海葡萄嗜熱菌的支架顯示高水平的熱穩定性.該圖描述了海葡萄嗜熱菌 的支架的熱穩定性。重組表達、純化推定的支架，並對其進行熱穩定性測試。如圖中所示， 海葡萄嗜熱菌的支架顯示高解鏈溫度(PH 7. 0時約83°C )。圖11C.硫化葉菌的支架顯示高水平的穩定性.該圖描述了硫化葉菌的支架的熱 穩定性。重組表達、純化推定的支架，並利用示差掃描量熱器對其進行熱穩定性測試。如圖 中所示，硫化葉菌的支架顯示高解鏈溫度(pH 3. 0時約98°C )。該支架還在pH 7. 0時顯示 高水平的穩定性，然而其在高於75°C的溫度下凝聚並從溶液中沉澱。
圖11D.海葡萄嗜熱菌的支架顯示高水平的穩定性.該圖描述了鹽酸胍變性試驗 的結果，證明海葡萄嗜熱菌的支架的蛋白質穩定性高。如圖中所示，支架解摺疊需要高濃度 鹽酸胍(胍濃度是5. OM時50%的分子解摺疊)，從而證明高穩定性。圖11E.硫化葉菌的支架顯示高水平的穩定性.該圖描述了鹽酸胍變性試驗的結 果，證明硫化葉菌的支架的蛋白質穩定性高。蛋白質解摺疊與分子的相對螢光增加相關。如 圖中所示，PH 7.0(圓圈)或Ph 3.0(正方形)時解摺疊需要高濃度的胍-HC1，從而證明高 穩定性。圖11F.海葡萄嗜熱菌的支架顯示高水平的蛋白酶耐受性.該圖描述了檢測海葡 萄嗜熱菌的支架的穩定性的蛋白酶敏感性試驗結果。在該實驗中，相對蛋白酶耐受性與蛋 白質穩定性相關。對於該支架，與嗜熱菌蛋白酶溫育10分鐘導致低水平的降解，其在該時 期維持穩定。海葡萄嗜熱菌支架在整個16小時過程中顯示嗜熱菌蛋白酶耐受。圖11G.硫化葉菌的支架顯示高水平的蛋白酶耐受性.該圖描述了檢測硫化葉菌 的支架的穩定性的蛋白酶敏感性試驗結果。在該實驗中，相對蛋白酶耐受性與蛋白質穩定 性相關。硫化葉菌支架在整個16小時過程中顯示嗜熱菌蛋白酶耐受。圖11H.從宿主細胞純化海葡萄嗜熱菌的支架.該圖描述海葡萄嗜熱菌支架純化 中的一步。由於該支架顯示高水平的穩定性，可能加熱含有重組支架的粗製大腸桿菌裂解 液以除去主要的宿主細胞蛋白質，而保留該支架。泳道1表示熱處理前的粗製裂解液。含 有粗製裂解液的PAGE凝膠的考馬斯染色顯示存在候選支架。70°C，熱處理粗製裂解液15 分鐘導致宿主細胞蛋白質大量喪失，而該支架完好保存(泳道2)。圖111.從宿主細胞純化海葡萄嗜熱菌的支架.該圖描述海葡萄嗜熱菌支架純化 中的一步。由於該支架顯示高水平的穩定性，可能加熱含有重組支架的粗製大腸桿菌裂解 液以降解主要的宿主細胞蛋白質，而保留該支架。泳道1表示蛋白酶處理前的粗製裂解液。 含有粗製裂解液的PAGE凝膠的考馬斯染色顯示存在該支架。55°C，蛋白酶處理粗製裂解液 45分鐘導致宿主細胞蛋白質大量喪失，而該支架完好保存(泳道2)。圖11J.從宿主細胞純化硫化葉菌的支架.該圖描述了硫化葉菌支架的純化。由 於該支架顯示高水平的穩定性，可能在PH 3. 0溫育含有重組支架的粗製裂解液並將溫度 升高至70°C，持續15分鐘以除去主要的宿主細胞蛋白質，而保留可溶性支架。泳道1表示 酸或熱處理前的粗製大腸桿菌裂解液。泳道2表示將粗製裂解液的pH降低至3. 0後保留 的可溶性蛋白質。泳道3表示將pH降低至3. 0和在70°C溫育15分鐘後的可溶性蛋白質。 在這些處理中支架耐受並維持在溶液中。圖12. SynBPOl與SYNAGIS 結合所需的兩個環.該圖描述了 SynBPOl及其變體 與結合於平板的SYNAGIS 的結合情況。在該實驗中，將SynBPOl的BC和TO環轉移至野 生型支架，從而產生SynBPOl的單環變體。對這些變體(僅稱為BC和TO)進行基於ELISA 的試驗，在該試驗中它們顯示不結合與平板結合的SYNAGIS 。作為對照，ELISA試驗方式 中存在SynBPOl結合。此外，SynBPOl上存在SS4 二硫鍵突變。稱為SynBP01SS4的該變體 在ELISA中不顯示與結合於平板的SYNAGIS 有任何結合。圖13.通過BIAcore測定TRAIL-R2特異性克隆5E5的結合親和力.該圖描述了 克隆5E5對結合於晶片的TRAIL-R2的親和力測定。測定的Kd約為700nM。圖14.多個TRAIL-R2特異性克隆顯示的競爭性結合.該圖中描述了各種TRAIL-R2特異性支架的競爭性結合實驗的結果。測試了兩個TRAIL-R2特異性克隆，5E5和 7G11與展示在噬菌體上的其它TRAIL-R2特異性克隆的競爭性結合。5E5與本身和除2H6 和7G11以外的所有其它克隆競爭。7G11隻與本身和2H6競爭。該數據表明有兩組克隆識 別TRAIL-R2上的兩個不同表位。圖15.各種TRAIL-2特異性克隆的競爭.該圖中描述了各種TRAIL-R2特異性支架 的競爭性結合實驗的結果。測試了 5種TRAIL-R2特異性克隆，1E3、1G11、2B4、1C12和2D3 與展示在噬菌體上的其它TRAIL-R2特異性克隆的競爭性結合。1E3、1C12和2D3與除8B3 和7G11以外的大多數噬菌體展示克隆競爭。可溶性IGll不與噬菌體展示的任何克隆競爭， 2B4在大多數情況下顯示低到中等的抑制作用。該數據提示1E3、1C12和2D3識別TRAIL-R2 上的相同表位。圖16. TRAIL-R2結合劑抑制細胞活力.該圖描述了當與抗-HIS標籤抗體和抗小 鼠IgG以2 1 0.5的摩爾比形成複合物時，Colo-205細胞系對5E5、7Gll、lC12、2D3和 1E3處理的敏感性。通過將用TRAIL-R2結合克隆處理的試驗信號表示為用不結合TRAIL-R2 的對照Tn3處理細胞獲得信號的百分比而獲得活細胞百分比。圖17Α.表示多價Τη3-融合蛋白例子的圖.二價構建物表示融合於抗體Fc區的 Τη3，而四價構建物將Τη3與重鏈恆定區合夥輕鏈C κ區融合。圖17Β.顯示多價Τη3-融合蛋白中蛋白質模塊連接鍵的圖.i)在Fc融合構建物 中，N-末端Tn3模塊通過肽接頭和IgGl的絞鏈區連接於IgGl的Fc區。接頭序列的長度 和組成可以不同，但在實施例16中是-GA-基序。ii)在Ck融合構建物中，N-末端Tn3模 塊通過肽接頭連接於抗體κ輕鏈的恆定區。接頭序列的長度和組成可以不同，但在實施例 16中是-GGGTPT-基序。iii)在IGHGl融合構建物中，N-末端Tn3模塊通過肽接頭連接於 IgGl重鏈的恆定區。接頭序列的長度和組成可以不同，但在實施例16中是-GGGTPT-基序。圖18.表達多價Τη3構建物.該圖代表還原性SDS-PAGE，其顯示A蛋白純化後二 價Τη3構建物(實施例1-3)，和四價Τη3構建物(實施例4_7)的相對大小。樣品編號對應 於表10所示那些。表達的所有構建物通過該分析顯示預計的大小。圖19. Τη3單體和多聚體的結合親和力.該圖描述了利用單價、二價和四價1C12 和DlTn3構建物獲得的生物傳感器結合實驗的傳感器圖。將TRAIL-R2-FC融合蛋白固定在 傳感器晶片上，將樣品蛋白質注射在該晶片上。「四」指四價Ck/IGHGl融合構建物。1C12 構建物顯示與TRAIL-R2結合改善與化合價呈函數關係，而對照Dl構建物不顯示結合。圖20.靶向TRAIL-R2的二價Tn3構建物的作用.該圖描述了用㈧二價形式的 TRAIL-R2特異性Τη3結合物1C12或⑶加入或未加入交聯抗體(抗-人Fe)的二價形式 非特異性Τη3結合物處理的Η2122細胞的生長抑制曲線。與對照非結合物相比，TRAIL-R2 特異性結合物在試驗中顯示溫和活性，該活性在第二抗體存在下降低。圖21.靶向TRAIL-R2的四價Τη3構建物的作用.該圖描述了用㈧單特異性四 價形式的TRAIL-R2特異性Τη3結合物1C12或⑶加入或未加入交聯抗體(抗-人Fe)的 單特異性四價形式的非特異性Τη3結合物處理的Η2122細胞的生長抑制曲線。與對照非結 合物相比，TRAIL-R2特異性結合物在試驗中顯示有活性，該活性在第二抗體存在下略微降 低。圖22.靶向TRAIL-R2的多特異性四價Τη3構建物的作用.該圖描述了用㈧雙特異性四價形式的TRAIL-R2特異性Tn3結合物1C12和2D3 (1C12融合於IgGl重鏈的恆定 區，2D3融合於Ck結構域)或(B)加入或未加入交聯抗體(抗-人Fe)的雙特異性四價 形式的TRAIL-R2特異性結合物2D3和1C12(2D3融合於IgGl重鏈的恆定區，1C12融合於 Ck結構域)處理的H2122細胞的生長抑制曲線。與對照非結合物相比(如圖21所示)， TRAIL-R2特異性結合物在試驗中顯示有活性，該活性在第二抗體存在下增加。圖23. pSec構建物的設計.(A)表示pSeC-0ppA-Tn3的開放讀框的胺基酸序列。 分泌入周質空間後，oppA信號肽(下劃線所示)SEQ ID N0:227被切割。oppA信號肽內的 倒數第二個殘基(斜體字顯示)突變成pSeC-0ppA(L25M)-Tn3衍生物中的甲硫氨酸以引入 NcoI克隆位點。(B)描述了 pSec-0ppA(L25M)-Tn3構建物，顯示了該構建物內啟動子、信號 肽、Tn3和His標籤模塊的配置。圖24.製備分泌的Tn3構建物.(A)表示分泌Τη3的大腸桿菌粗製培養液和周質 組分的SDS-PAGE分析。(B)表示從大腸桿菌培養液純化的Τη3支架的SDS-PAGE分析。(C) 表示從大腸桿菌培養液純化的Τη3的HPLC分析。DTT處理後保留時間的漂移與二硫鍵的存
在一致。圖25. SYNAGIS -Fc 二價結合物的SDS-PAGE.該圖顯示了與Fc區融合的 SynBPOl支架的還原性(泳道1)和非還原性(泳道2) SDS-PAGE分析。這些結果證明融合 的大小正確，還可能表示二聚化。圖26. SYNAGIS "Fe 二價結合物與SynBPOl的競爭性結合分析.SynBPOl與 SynBPOl-Fc的競爭性BIAcore分析。簡言之，通過胺偶連將SYNAGIS 固定在CM5傳 感器晶片表面。以75微升/分鐘的流速注射IyM濃度的SynBPOl或SynBPOl-Fc。二價 SynBPOI-Fc構建物顯示親和力高於單結構域結合物。圖27.可將Tn3支架偶聯於PEG. (A)固定化金屬親和柱純化STn3 (CTC)(泳道 1-4)和馬來醯亞胺衍生PEG處理後(陽離子交換層析之前)的純化STn3(CTC)(泳道5) 的SDS-PAGE分析。泳道1 表達STn3 (CTC)的細胞的總細胞裂解液；泳道2 =IMAC柱的流出 物；泳道3 IMAC柱的洗滌部分；泳道4 :STn3 (CTC)，未PEG化；泳道5 =PEG化的STn3 (CTC)。 (B)從SP XL陽離子交換柱純化的PEG化STn3 (CTC)的SDS-PAGE分析。柱梯度組分示於泳 道 1-5。圖28. AB、⑶和EF環顯示環長度多樣性.獲得103Fn3序列各自的ABjD和EF環 的長度，利用該數據產生所示的環長度頻率分布。對於任何給定的環，所有長度的頻率總和 等於103，所分析序列的數量。圖29.測定不同pH和離子強度下Tn3的解鏈溫度.這些圖顯示通過示差掃描量 熱器測定PH 7. 0 (20mM磷酸鈉緩衝液)(A)、pH 5. 0 (20mM乙酸鈉緩衝液)(B)和pH 7. 0的 高鹽緩衝液中(含1.0M鹽的20mM磷酸鈉緩衝液)(C)Tn3支架的熱解鏈溫度。有高離子強 度存在下，測定的Tn3的Tm是pH 7. 0時約45°C，pH 5. 0時52°C，pH 7. 0時55°C。反覆掃 描(黃色的)PH 7.0樣品顯示在這些條件下熱解鏈可逆。pH 5. 0時Tn3的熱解鏈是可逆 的。圖30Α.設計Τη3的荷電突變體.顯示了 Τη3三維結構的代表性草圖(pdb代碼 lten)。顯示了 SEQ ID 1的殘基8_90，其中所有Asp和Glu殘基的側鏈以黃色和白色顯示。 設計了一組8個突變體，其中用Asn或Gln替代以黃色顯示的Asp和Glu殘基。如SEQ ID1編號殘基。圖30B.純化的Tn3重組荷電突變體的SDS-PAGE分析.各純化蛋白質的等份試樣 進行SDS-PAGE凝膠電泳。為進行比較，在同一凝膠的不同泳道中對野生型蛋白質進行電 泳，顯示遷移率與各種荷電突變體相似。圖31Α.穩定Τη3突變的加和性.產生一系列Τη3點突變，其中各Asp或Glu殘基替代為Asn或Gin。此處顯示了利 用固有螢光檢測蛋白質解摺疊的脲變性實驗結果。在該實驗中，與野生型Tn3支架相比，8 種Τη3支架荷電突變體中的5種(E33Q、D49N、E52Q、D53N、E86Q)需要較高濃度的脲來實現
解摺疊。圖31B.荷電突變的組合導致Tn3穩定性的加和改進.將提高野生型Τη3穩定性的Asp或Glu殘基的點突變組合成Τη3的雙或三突變。 組合Τη3突變體(E33Q/D49N、D49N/E86Q和E33Q/D49N/E86Q)各自顯示穩定性高於任何相 應的點突變體或野生型Τη3。圖32.野生型和荷電工程改造Τη3支架的解鏈溫度測定.該圖顯示通過示差掃描 量熱法檢測Τη3支架變體在ρΗ 7.0時的熱解鏈曲線。對於野生型Tn3 (A)，測定的Tm是約 45°C，對於 E33Q/D49N Tn3 (B)是 50°C，對於 D49N/E86Q Tn3 (C)是 52°C，對於 E33Q/D49N/ E86Q Tn3 (D)是 52°C。6.詳述本文所述的蛋白質支架設計成優於抗體衍生的片段和非抗體框架。本發明支架勝 過抗體片段的主要優點是結構。這些支架衍生自人體液蛋白質中發現的完整、穩定和可溶 性結構模塊以及衍生自自然界的其它來源(量熱，但不限於嗜熱細菌)。因此，它們顯示優 於抗體片段的摺疊和熱穩定特性，而抗體片段的產生包括除去抗體天然摺疊的部分，從而 通常暴露完整抗體中包埋在疏水環境中的胺基酸殘基，例如可變區和恆定區之間的界面。 這種疏水性殘基暴露於溶劑增加了凝聚的可能性。此外，本發明支架提供抗體分子的功能優點。具體地說，雖然支架不是免疫球蛋 白，但它的總體摺疊接近IgG重鏈可變區的摺疊，從而其可能在相對取向上以抗體CDR的類 似方式展示其三個環。由於該結構，本發明支架具有類似於天然的抗原結合特性和類似於 抗體的親和力。因此，可在體外採用類似於體內抗體親和力成熟方法的環隨機化和改組方案。6. IFnIII 結構基序本發明支架依據III型纖連蛋白模塊(FnIII)，一種在哺乳動物血液和結構蛋 白中發現的結構域的結構。該結構域常見於迄今為止測序的蛋白質，包括纖連蛋白、結 合腕蛋白、胞內細胞骨架蛋白、細胞因子受體和原核生物酶(Bork和Doolittle，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :8990，1992 ；Bork 等，Nature Biotech. 15 :553，1997 ；Meinke 等， J. Bacteriol. 175 :1910，1993 ；Watanabe 等，J. Biol. Chem. 265 15659，1990)。雖然該結構 域在自然界中多次出現，其胺基酸序列差異很大。具體地說，這些支架包括結合腕蛋白C的 第三FnIII結構域(也稱為「Tn3」結構域)。該結構域的總體摺疊極其接近最小功能性抗 體片段(即，重鏈的可變區)的，其包含駱駝和羊駝IgG的完整抗原識別單位。此外，Τη3結構域具有耐受隨機化的暴露環序列，從而有助於產生能以高親和力結合特異性靶標的各種蛋白支架庫。這些蛋白質支架可用於設計能實質性結合任何感興趣化合物的蛋白質(例如，任 何蛋白質)。具體地說，基於本文所述Tn3結構基序的分子可用作支架，其經設計的定向進 化(directed evolution)使得類似於抗體可變區的互補決定區(OTR)的一個或多個環隨 機化。這種定向進化方法產生對感興趣抗原具有高親和力的抗體-樣分子。此外，本文所 述支架可用於展示指定的暴露環(例如，以前依據抗原結合隨機化和選擇的環)來指導結 合這種引入的環的分子的進化。可進行該類選擇以鑑定各CDR-樣環或識別組合在非線形 表位結合部分中的兩個或所有三個CDR-樣環的識別分子。對應於IgG重鏈抗原結合環的一組Tn3的三個環從胺基酸殘基23到31 (BC)、50 到56 (DE)和75到84 (FG)。BC、DE和FG環的長度分別是9、6和10個殘基，落在抗體重鏈 中發現的相應抗原識別環的狹窄範圍內，即分別是7-10、4-8和4-28殘基長度。或者，在另 一實施方式中，BC、DE和TO環可以分別從胺基酸殘基23到31、51到56和75到84。因此， 一旦為高抗原親和力作了隨機化和選擇，這些環可與抗原接觸，等於抗體中相應環的接觸。 Tn3結構域的AB、CD和EF環還可共享該特性，因此，也可用於為高抗原親和力作隨機化和 選擇。該方法可與BC、DE和re環的隨機化平行或串聯進行。在具體的實施方式中，依據人結合腕蛋白C的Tn3結構域的支架的一個或多個環 區域包含以下胺基酸殘基I. AB 環內所含的 12-17 ；II. BC 環內所含的 23-31 ；III. CD 環內所含的 39-45 ；IV. DE 環內所含的 50-56 ；V. EF環內所含的60-66 ；和VI. FG 環所含的 75-84。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、 至少5個或至少6個環，其中環包含SEQ ID NO :201、202、203、204、205或206所示胺基酸 序列。在一個實施方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO: 201所示胺基酸序列的AB環。 在另一實施方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO :202所示胺基酸序列的BC環。在另一 實施方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO :203所示胺基酸序列的⑶環。在另一實施方 式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO: 204所示胺基酸序列的DE環。在另一實施方式中， 本發明支架包含具有SEQ ID NO :205所示胺基酸序列的EF環。在另一實施方式中，本發明 支架包含具有SEQ ID NO :206所示胺基酸序列的TO環。在一具體實施方式
中，本發明支架 包含具有SEQ ID NO :201所示胺基酸序列的AB環，具有SEQ ID NO :202所示胺基酸序列的 BC環，具有SEQ IDNO :203所示胺基酸序列的⑶環，具有SEQ ID NO 204所示胺基酸序列 的DE環，具有SEQ ID NO 205所示胺基酸序列的EF環，和具有SEQ ID NO: 206所示胺基酸 序列的re環。在另一具體實施方式
中，依據人結合腕蛋白C的Tn3結構域的支架的一個或多個 環區域包含以下胺基酸殘基I. AB 環內所含的 11-17 ；II. BC 環內所含的 23-31 ；
III. CD 環內所含的 39-45 ；IV. DE 環內所含的 51-56 ；V. EF環內所含的60-67 ；和VI. FG 環所含的 75-84。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、 至少5個或至少6個環，其中環包含SEQ ID NO :207、202、203、208、209或206所示胺基酸 序列。在一個實施方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO: 207所示胺基酸序列的AB環。 在另一實施方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO :202所示胺基酸序列的BC環。在另一 實施方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO :203所示胺基酸序列的⑶環。在另一實施方 式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO: 208所示胺基酸序列的DE環。在另一實施方式中， 本發明支架包含具有SEQ ID NO :209所示胺基酸序列的EF環。在另一實施方式中，本發明 支架包含具有SEQ ID NO :206所示胺基酸序列的TO環。在一具體實施方式
中，本發明支架 包含具有SEQ ID NO :207所示胺基酸序列的AB環，具有SEQ ID NO :202所示胺基酸序列的 BC環，具有SEQ IDNO 203所示胺基酸序列的⑶環，具有SEQ ID NO 208所示胺基酸序列 的DE環，具有SEQ ID NO 209所示胺基酸序列的EF環，和具有SEQ ID NO: 206所示胺基酸 序列的re環。在其它實施方式中，本發明支架包含的環區域是SEQ ID NO: 1-32或68-88中任一 所示同源環區域的變體。本發明提供重組的、非天然產生的多肽支架，其包含連接於多個衍生自天然產生 蛋白質序列的環區域序列的多個β鏈結構域，其中一個或多個所述環區域序列因天然產 生蛋白質序列中相應環序列的至少一個胺基酸的缺失、取代或添加而有所不同，其中所述 多肽支架的β鏈結構域與天然產生蛋白質序列的相應結構域序列有至少50%同源性。例 如，這種胺基酸序列可以是但不限於SEQID N0:l-32、60-88和210中的任一種。在另一具 體實施方式中，本發明支架包含人結合腕蛋白C的Τη3結構域的序列。在另一實施方式中， 本發明支架包含與人結合腕蛋白C的Τη3結構域有至少50%同源性的序列。在進一步的實 施方式中，與Τη3結構域的所述同源性是至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或更高。在其它實施方式中，所 述天然產生的序列是對應於人結合腕蛋白C的額外Τη3結構基序的蛋白質序列。在其它實 施方式中，所述天然產生的序列是對應於另一結合腕蛋白，或者另一生物(例如但不限於， 鼠、豬、牛或馬結合腕蛋白)的結合腕蛋白的Τη3結構基序的蛋白質序列。雖然Τη3代表用於產生抗體模擬物的支架，但其它分子可取代本文所述分子中的 Τη3。這些包括但不限於動物和原核生物的相關Τη3結構基序。此外，還可利用其它蛋白質 的Τη3結構基序。不同生物和母體蛋白質的模塊可能最適合於不同應用；例如在設計低ρΗ 下穩定的支架中，從優選在低PH下生長的生物(例如但不限於硫化葉菌)產生蛋白質是最 理想的。在另一實施方式中，可從超嗜熱細菌，例如但不限於閃爍古生球菌和海葡萄嗜熱菌 鑑定並利用相關Τη3結構基序，二者各自顯示在大於70°C時生長最佳。在其它實施方式中， 天然產生的序列對應於嗜熱生物的預測Tn3結構基序，例如但不限於閃爍古生球菌、海葡 萄嗜熱菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌和硫化葉菌。在還有另一實施方式中，本發明 支架具有的蛋白質序列與對應於上述嗜熱生物的Τη3結構基序或預測的Τη3結構基序的任一序列具有至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至 少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %的同 源性。在一些實施方式中，可從SEQ ID NO :2-4和68-88所示胺基酸序列選擇嗜熱生物的 Tn3結構基序。本發明還提供含7個以上的多個β鏈的本發明支架。在一個實施方式中，本發明 支架包含多個，至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個或更多個β鏈。本發明還提供含6個以上的多個環區域的本發明支架。在一個實施方式中，本發 明支架包含多個，至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個或更多個環區域。在一個實施方式中，本發明支架包含至少7個β鏈，其中所述β鏈從N-末端向 C-末端稱為Α、B、C、D、E、F和G鏈。在另一實施方式中，本發明支架包含至少7個β鏈， 各鏈由環區域隔開，其中所述環區域從N-末端向C-末端稱為AB、BC、CD、DE、EF和TO環。 在另一實施方式中，本發明支架包含少於7個β鏈，各鏈由環區域隔開。在另一實施方式 中，本發明支架包含少於7個β鏈，各鏈由環區域隔開。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、 至少5個、至少6個或至少7個β鏈，其中所述β鏈包含選自SEQ ID NO 228-234的氨基 酸序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述A鏈包含SEQ ID Ν0:228所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架 包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述B鏈包含SEQ ID NO 229所 示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述C鏈包含SEQ ID Ν0:230所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架 包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述D鏈包含SEQ ID NO 231所 示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述E鏈包含SEQ ID Ν0:232所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架 包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述F鏈包含SEQ ID NO 233所 示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱 為A-G，其中所述G鏈包含SEQ ID Ν0:234所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架 包含具有SEQ ID NO 228所示序列的A鏈、具有SEQ ID NO 229所示序列的B鏈、具有SEQ ID NO :230所示序列的C鏈、具有SEQ ID NO :231所示序列的D鏈、具有SEQ ID Ν0:232所 示序列的E鏈、具有SEQ ID NO 233所示序列的F鏈和具有SEQ ID NO 234所示序列的G 鏈。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、 至少5個、至少6個或至少7個β鏈，其中所述β鏈包含選自SEQ ID NO :235、229、230、 236、232、237和234的胺基酸序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β 鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述A鏈包含SEQ ID Ν0:235所示序列。在另一具 體實施方式中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述B 鏈包含SEQ ID NO :229所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈， 從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述C鏈包含SEQ ID Ν0:230所示序列。在另一具體 實施方式中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述D鏈 包含SEQ ID Ν0:236所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述E鏈包含SEQ ID N0:232所示序列。在另一具體 實施方式中，本發明支架包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述F鏈 包含SEQID Ν0:237所示序列。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含至少7個β鏈，從 N-末端向C-末端稱為A-G，其中所述G鏈包含SEQ ID Ν0:234所示序列。在另一具體實施 方式中，本發明支架包含具有SEQ ID NO :235所示序列的A鏈、具有SEQ ID NO :229所示 序列的B鏈、具有SEQ ID NO 230所示序列的C鏈、具有SEQ ID NO 236所示序列的D鏈、 具有SEQ ID NO :232所示序列的E鏈、具有SEQ ID NO :237所示序列的F鏈和具有SEQ ID NO 234所示序列的G鏈。在另一實施方式中，本發明支架包含與SEQ ID NO :1_32或68_99中任一所示同源 β鏈具有至少50%同源性的β鏈序列。在進一步的實施方式中，所述同源性是至少55%、 至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少99%或更高。連接蛋白質支架各鏈的環可作長度和/或序列多樣性隨機化。在一個實施方式 中，本發明支架的至少一個環作長度和/或序列多樣性隨機化。在另一實施方式中，本發明 支架的至少一個環維持恆定，而至少一個額外的環作長度和/或序列多樣性隨機化。在另 一實施方式中，本發明支架文庫中環AB、CD和EF中至少一個維持恆定，而環BC、DE和TO中 至少一個作長度和/或序列多樣性隨機化。在一具體實施方式
中，本發明支架包含具有以下共有序列的隨機化BC環 S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示脯氨酸或丙氨酸，其中(b)表示 丙氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含具有以下共有序列的隨機化BC環 Α-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X表示任何胺基酸，其中(d)表示脯氨酸、穀氨酸或賴氨 酸，其中(e)表示天冬醯胺或甘氨酸，和其中(f)表示絲氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含BC環，其包含具有以下共有序列的11個氨 基酸S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X表示任何胺基酸，其中(c)表示脯氨酸、絲氨酸或甘 氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含具有以下共有序列的隨機化re環 X-a-X-X-G-X-X-X-S，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示天冬醯胺、蘇氨酸或賴氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含具有以下共有序列的隨機化re環 X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示天冬醯胺、蘇氨酸或賴氨酸， 和其中(b)表示絲氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含具有以下共有序列的隨機化re環 X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示天冬醯胺、蘇氨酸或賴氨酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫包含具有DE環的支架，該環包含6個殘基，並經 隨機化而含有以下共有序列x-x-x-x-x-x，其中X表示任何胺基酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含含有7個殘基的AB環，該環經隨機化而含 有以下共有序列K-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(a)表示絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含含有9個殘基的AB環，該環經隨機化而含 有以下共有序列K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、 異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(a)表示絲氨 酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含含有7、8或9個殘基的⑶環，其中⑶環中 各殘基經隨機化，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸。在一具體實施方式
中，本發明支架包含含有8個殘基的EF環，該環經隨機化而含 有以下共有序列X-b-L-X-P-X-c-X，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異 亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(b)表示天冬醯 胺、賴氨酸、精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸或甘氨酸，和其中(c)表示異亮氨酸、蘇氨酸、絲氨 酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一些實施方式中，本發明支架可包含約75-約500、約75-約200、約75-約100、 約75-約250或約75-約150個胺基酸。6. 2基於二硫鍵工程改造的支架的蛋白質為增加本發明支架的穩定性，採用生物信息學方法鑑定適於二硫鍵工程改造的候 選位置。然而，通過手工檢查蛋白質結構來鑑定毗鄰的候選殘基對進行二硫鍵設計常因該 類鍵所要求的嚴格幾何約束性而沒有效果(參見Dombkowski，Bioinformatics (生物信息 學)第19卷第14號，2003 1852-1853)。因此，本發明提供在通過熱耐受性，對離液變性作 用和蛋白酶處理檢測到穩定性增加的位置具有工程改造的二硫鍵的支架。在一個實施方式中，本發明支架包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或 至少五個非天然產生的二硫鍵。在一個實施方式中，本發明支架包含至少一個非天然產生 的二硫鍵，其中所述至少一個非天然產生的二硫鍵穩定該支架。在另一實施方式中，本發明 支架在兩個β鏈之間包含至少一個非天然產生的二硫鍵。例如，所述至少一個非天然產生 的二硫鍵可在A鏈和B鏈之間，或在D鏈和E鏈之間，或在F鏈和G鏈之間，或在C鏈和F鏈 之間形成連接。在另一實施方式中，所述至少一個非天然產生的二硫鍵在F鏈和G鏈之間 形成第一鍵，在C鏈和F鏈之間形成第二連接。在另一實施方式中，本發明支架在兩個環區 域之間包含至少一個非天然產生的二硫鍵。在另一實施方式中，本發明支架在環區域和β 鏈之間包含至少一個非天然產生的二硫鍵。在另一實施方式中，本發明支架在同一 β鏈內 包含至少一個非天然產生的二硫鍵。在另一實施方式中，本發明支架在同一環區域內包含 至少一個非天然產生的二硫鍵。在另一實施方式中，本發明支架包含至少一個非天然產生 的二硫鍵，其中該鍵位於兩個不同支架間。在另一實施方式中，本發明支架包含形成至少二個、至少三個、至少四個或更多個 支架的多聚支架(術語「多聚」定義為有至少二個或更多個支架結合)的二硫鍵。不難通過本領域熟知的技術檢測工程改造二硫鍵所致的穩定性增加，例如熱(Tm) 和離液變性作用(例如，脲或胍)、蛋白酶處理(例如，嗜熱菌蛋白酶)或本領域接受的另 一穩定性參數。用於檢測蛋白質穩定性的技術的綜述可見，例如"Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物學方法)〃和"CurrentProtocols in ProteinScience (最新蛋白質科學方法)"，約翰威利父子公司(JohnWiley and Sons)出版，2007。在一個實施方式中，與二硫鍵工程改造前的同一支架相比，通過熱耐受性、對離液 變性作用、蛋白酶處理的耐受性或本領域熟知的另一穩定性參數檢測到本發明的含二硫鍵 支架顯示穩定性增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至 少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多。可通過不同條件下蛋白質所顯示的螢光水平檢測蛋白質的穩定性。應激下蛋白質 的相對解摺疊程度和蛋白質顯示的固有螢光之間正相關。檢測熱特徵的合適蛋白質穩定性 試驗包括示差掃描量熱法(DSC)和圓二色性(⑶)。當蛋白質顯示通過DSC或⑶檢測的參 數有相當大漂移時，其與解摺疊結構相關，產生該漂移的溫度稱為解鏈溫度(Tm)。在一個實 施方式中，與相同實驗條件下工程改造前的同一支架所顯示的相比，本發明的二硫鍵工程 改造支架顯示解鏈溫度(Tm)升高，至少高於45°C、至少高於50°C、至少高於55°C、至少高於 60°C、至少高於65°C、至少高於70°C、至少高於71°C、至少高於72°C、至少高於73°C、至少 高於74°C、至少高於75°C、至少高於76°C、至少高於77°C、至少高於78°C、至少高於79°C、 至少高於80°C、至少高於81°C、至少高於82°C、至少高於83°C、至少高於84°C、至少高於 851、至少高於851、至少高於861、至少高於871、至少高於881、至少高於891、至少高 於90°C、至少高於91°C、至少高於92°C、至少高於93°C、至少高於94°C、至少高於94°C、至 少高於95°C、至少高於96°C、至少高於97°C或至少高於98°C、或至少高於100°C、或至少高 於105°或至少高於110°、或至少高於120°。在另一實施方式中，與相同實驗條件下二硫鍵工程改造前的同一支架相比，本發 明的二硫鍵工程改造支架顯示解鏈溫度(Tm)升高至少5%、至少10%、至少15%、至少 20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更聞。蛋白質穩定性的另一試驗包括將蛋白質接觸用於使蛋白質內相互作用失穩定的 離液劑，量熱脲或胍(例如，胍-HCl或異硫氰酸胍)。蛋白質接觸水平升高的脲或胍後，檢 測相對固有螢光來評估50%蛋白質分子解摺疊時的數值。該值稱為Cm值，表示蛋白質穩定 性的基準值。Cm值越高，蛋白質越穩定。在一個實施方式中，與相似實驗條件下在脲變性實 驗中檢測的二硫鍵工程改造前的同一支架相比，本發明的二硫鍵工程改造支架顯示Cm升高 至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至 少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、或至少95%或更高。在另一實施方式中，與相似實驗條件下在胍變性實驗中檢測的二硫鍵工程改造 前的同一支架相比，本發明的二硫鍵工程改造支架顯示Cm升高至少5%、至少10%、至少 15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少
95%或更高。用於測試蛋白質穩定性的另一試驗是蛋白酶耐受性試驗。在該試驗中，蛋白質穩 定性的相對水平與一定時期內對蛋白酶降解作用的耐受性相關。越耐受蛋白酶處理，蛋白質越穩定。在一個實施方式中，與相似實驗條件下在蛋白酶耐受性實驗中檢測的二硫鍵工 程改造前的同一支架相比，本發明的二硫鍵工程改造支架顯示穩定性升高至少5%、至少 10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、或至少95%或更高。在一些例子中，優選利用穩定性降低的本發明支架，例如但不限於偶聯於細胞毒 素或放射性核素的支架。這種支架可能要求非特異性毒性相關的更快清楚速度。在一個 實施方式中，本發明支架包含二硫鍵，與工程改造前的支架相比，該二硫鍵使得該支架去穩 定。在一個實施方式中，與相似實驗條件下通過熱耐受、對離液變性作用、蛋白酶處理的耐 受性或本領域熟知的另一穩定性參數檢測的二硫鍵工程改造前的同一支架相比，含有二硫 鍵的本發明支架顯示穩定性降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多。6. 3支架動力學本發明提供特異性結合靶標(例如，蛋白質)的支架。在一些實施方式中，所述靶 標可以是，例如但不限於細胞表面抗原、可溶性抗原、固定抗原、免疫靜止抗原、胞內抗原、 核內抗原、自體抗原、非自體抗原、癌症抗原、細菌抗原或病毒抗原。在一些實施方式中，本發明支架以特定的動力學特異性結合靶標。在一些實施 方式中，通過BIAcore 試驗或本領域已知的其它試驗檢測到本發明支架的結合率常數 或 k。n 比率(支架(Sc)+ 抗原(Ag) (k。n — Sc-Ag)為至少 IO5M-1 S-1、至少 1. 5X IO5MW至 少 2 X IO5M-1 S—1、至少 2. 5 X IO5IT1S人至少 5 X IO5IT1 s \ 至少 IO6M 1S \ 至少 5 X IO6M 1S \ 至 少IO7MW至少5X ΙΟΙ、—1、或至少IO8M-1 s-1、或者k。n比率為約IOV約IO8MW k。n比 率為約1. 5X IO5MY1-約IX IO7IT1 s入k。n比率為約2X IO5-約IX IO6MW k。n比率為約 4. 5 X IO5-約 5 X IO7M-1S^10在一些實施方式中，通過BIAcore 試驗或本領域已知的其它試驗檢測到本發 明支架的k。ff比率(支架(Sc) +抗原(AgkoffBSc-Ag)為小於ΙΟ、—1、小於δΧΙΟ、—1、 小於ICT4S入小於2X ICT4S人小於5X ICT4S人小於l(T5s人小於5Χ l(T5s人小於1 (T6S人小 於δΧΙΟ、—1、小於川 人小於日父川 人小於ΙΟ、—1、小於5X ΙΟ、—1、小於ΙΟ、—1、小於 sxio、-1、或小於 ο—1、—1、或 lo-s-io-^Vuotio、-1、或 lOH1。在一些實施方式中，本發明支架的親和力常數或Ka (k。n/k。ff)為至少IO2M4、 至少 5 X IO2IT1、至少 IO3IT1、至少 5 X IO3IT1、至少 IO4IT1、至少 5 X IO4IT1、至少 IO5IT1、 至少 5 X IO5IT1、至少 IO6IT1、至少 5 X IO6IT1、至少 IO7IT1、至少 5 X IO7IT1、至少 IO8IT1、至 少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 IO10ITi、至少 5 X IO10ITi、至少 IO11ITi、至 少 5 X IO11ITi、至少 IO12IT1、至少 5 X IO12IT1、至少 IO13IT1、至少 5 X IO13IT1、至少 IO14IT1、 至少 5 X IO14IT1、至少 IO15IT1、或至少 5 X IO15IT1、或 102_5 X IO5IT1、IO4-I X IOiciIT1、或 IO5-IX IO8M-1.通過BIAcore 試驗或本領域已知的其它試驗檢測到本發明支架的Ka可以 是最多 ΙΟ、—1、最多 δΧΙ ΑΓ1、最多 ΙΟΙ—1、最多 5 X ΙΟΙ—1、最多 IO13M.1、最多 5 X IO13M.1、最 多 IO14M-1、或最多 5 X IO14MA在一些實施方式中，通過BIAcore 試驗或本領域已知的其它試驗檢測到本發明支架的解離常數或Kd(koff/kon)為小於10_5M、小於5 X 10_5M、小於10_6M、小於5 X 10_6M、 小於 1(Γ7Μ、小於 5X10〃、小於 1(Γ8Μ、小於 5Χ1(Γ8Μ、小於 1(Γ9Μ、小於 5Χ1(Γ9Μ、小於 1(Γ10Μ、 小於 5 X 1(Γ10Μ、小於 1(Γ"Μ、小於 5 X 1(Γ"Μ、小於 1(Γ12Μ、小於 5 X 1(Γ12Μ、小於 1(Γ13Μ、小於 5Χ1(Γ13Μ、小於 1(Γ14Μ、小於 5Χ1(Γ14Μ、小於 1(Γ15Μ、或小於 5 X 1(Γ15Μ。6. 4基於支架的結合蛋白的定向進化本文所述的支架可用於開發新型或改善的靶標結合蛋白的任何技術。在一個具體 實施例中，所述靶標固定在固體支持物，例如柱樹脂或微量滴定板孔中，並且靶標與基於支 架的候選結合蛋白文庫接觸。這種文庫可通過CDR-樣環的序列和/或長度隨機化，由基 於Τη3基序的支架構建的克隆構成。在一個實施方式中，該文庫可以是噬菌體、噬菌粒、病 毒、細菌或酵母展示或核糖體展示文庫。如果需要，該文庫可以是通過，例如Szostak等， 美國專利號6，258，558Β1，美國專利號6，261，804Β1 ；美國專利號5，643，768和美國專利號 5，658，754所述的技術產生的RNA-蛋白質融合文庫。或者，其可以是DNA-蛋白質文庫(例 如，Lohse 於 1998 年 12 月 2 日提交的 DNA-Protein Fusions and Uses Thereof (DNA-蛋 白質融合及其應用)，美國系列號60/110，549，目前放棄；和1999年12月2日提交的美國 系列號09/453，190所述)。在這點上，細菌噬菌體(噬菌體)展示是能篩選大寡肽文庫來鑑定那些文庫中能 特異性結合靶標的成員的熟知技術。噬菌體展示是將變體多肽作為外殼蛋白的融合蛋白展 示在噬菌體顆粒表面上的技術(Scott, J. K.和Smith, G. P. (1990) Science 249 :386)。應 用噬菌體展示是基於以下事實，可快速而有效地保存選擇性隨機化蛋白質變體(或隨機克 隆的cDNA)的大文庫中以高親和力結合靶分子的那些序列。現已採用在噬菌體上展示肽 (Cwirla, S. Ε.等，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6378)或蛋白質(Lowman，H.B.等， (1991)Biochemistry，3010832 ；Clackson, T.等(1991)Nature, 352624 ；Marks, J. D.等 (1991)，J. Mol. Biol.，222 581 ；Kang, A. S.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 8363)文庫來篩選數百萬的多肽或寡肽中具有特異性結合特性的那些(Smith，G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol.，2 :668)。分選隨機突變體的噬菌體文庫需要構建和擴增大量 變體的方案，這是利用靶標受體的親和力純化方法和評估結合富集結果的手段(參見，例 如美國專利號 5，223，409，5，403，484，5，571，689 和 5，663，143)。雖然大多數噬菌體展示方法利用絲狀噬菌體，但λ形噬菌體展示系統(W0 95/34683 ；美國專利號 5，627，024)、Τ4 噬菌體展示系統(Ren 等，Gene, 215 439(1998)； Zhu 等，Cancer Research, 58 (15) :3209_3214 (1998) Jiang 等，Infection& Immunity, 65(11) 4770-4777(1997) ；Ren 等，Gene, 195(2) :303_311 (1997) ；Ren, Protein Sci. ,5 1833(1996) ；Efimov 等，Virus Genes，10 173 (1995))和 T7 噬菌體展示系統(Smith 和 Scott, Methods in Enzymology, 217 228-257 (1993)；美國專利號 5，766，905)也是已知 的。現已開發可基礎噬菌體展示概念的許多其它改進和改變形式。這些改進形式增 強了展示系統篩選肽文庫以便結合所選靶分子和展示功能性蛋白質的能力，所述功能性蛋 白質可能篩選具有所需特性的這些蛋白質。現已開發了噬菌體展示反應的組合反應裝置 (TO 98/14277)，噬菌體展示文庫已用於分析和控制生物分子相互作用(W0 98/20169 ；WO 98/20159)和受約束螺旋肽的特性(W098/20036)。WO 97/35196描述了分離親和配體的方法，其中將噬菌體展示文庫與其中的配體會結合靶分子的一種溶液和其中的親和配體不會 結合該靶分子的第二種溶液接觸來選擇性分離結合配體。WO 97/46251描述的方法用親和 純化的抗體生物淘選隨機噬菌體展示文庫，然後分離結合噬菌體，然後利用微量滴定板孔 通過微量淘選方法分離高親和力結合噬菌體。利用金黃色葡萄球菌A蛋白作為親和力標籤 也已有報導(Li等· (1998)Mol Biotech.，9 :187)。W097/47314描述了利用底物扣除文庫 區分酶特異性，該方法利用組合文庫，所述文庫可以是噬菌體展示文庫。WO 97/09446描述 了採用噬菌體展示選擇適用於洗滌劑中酶的方法。選擇特異性結合蛋白質的其它方法描述 於美國專利號 5，498，538，5，432，018 和 WO 98/15833。美國專利號5，723，286，5，432，018，5，580，717，5，427，908，5，498，530， 5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192 和 5，723，323 也描述了產生肽文庫和篩選這
些文庫的方法。對於本發明的文庫，採用生物信息學方法測定天然產生的Tn3結構基序的環長度 和多樣性偏好(參見實施例2)。在該分析中，利用環長度和序列多樣性的偏好開發「限制 性隨機化(restricted randomization) 」方法。在該限制性隨機化方法中，將相對環長度 和序列偏好引入文庫開發方案。例如，測定到BC環的一種環長度偏好是9個殘基。對含有 9個殘基的BC環作進一步分析後，測定在該位置是否有特定胺基酸，或胺基酸組的偏好，或 者該位置是否完全隨機。將環長度和序列多樣性分析整合入文庫開發產生了限制性隨機化 (即，隨機環內胺基酸可處於的某些位置是有限的)。實施例中描述了限制性隨機化方法的 例子(參見實施例2)。本發明還提供包含本文所述本發明支架的文庫(下文稱為「本發明文庫」)。在一 個實施方式中，本發明文庫包含非天然產生的多肽支架，其包含與衍生自天然產生的蛋白 質序列的多個環區域序列相連的多個β鏈結構域，其中通過天然產生的蛋白質序列中相 應環序列的至少一個胺基酸的缺失、取代或添加而改變一個或多個所述環區域序列，其中 該多肽支架的β鏈結構域與天然產生蛋白質序列的相應結構域序列有至少50%同源性。 在一些實施方式中，天然產生的序列是對應於人結合腕蛋白C的蛋白質序列。在其它實施 方式中，天然產生的序列是對應於人結合腕蛋白C的額外Τη3結構基序的蛋白質序列。在其 它實施方式中，所述天然產生的序列是對應於另一結合腕蛋白，或者另一生物(例如但不 限於，鼠、豬、牛或馬結合腕蛋白)的結合腕蛋白的Τη3結構基序的蛋白質序列。在還有另一 實施方式中，所述天然產生的序列是對應於任何生物的Τη3結構基序的蛋白質序列。在其 它實施方式中，所述天然產生的序列對應於嗜熱生物的預測Τη3結構基序，例如但不限於 閃爍古生球菌、海葡萄嗜熱菌、嗜酸熱硫化葉菌、硫磺礦硫化葉菌和硫化葉菌。在還有另一 實施方式中，本發明支架具有的蛋白質序列與對應於上述Τη3結構基序或預測的Τη3結構 基序的任一序列具有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至 少99%的同源性。將文庫與固定的靶標溫育，洗滌支持物以除去非特異性結合的物質，在非常嚴格 的條件下洗脫最緊密的結合物並進行PCR以回收序列信息或產生新的結合物文庫，從而可 用於重複該選擇過程，可進一步誘變或不誘變該序列。可進行多輪選擇直至獲得對抗原具 有足夠親和力的結合物。
在另一實施方式中，本發明文庫包含本文所述支架。在一個實施方式中，本發明文 庫包含的支架還包含至少7個β鏈，其中所述β鏈從N-末端向C-末端稱為A、B、C、D、E、 F和G鏈。在另一實施方式中，本發明空位包含的支架還包含至少7個β鏈，各鏈由環區 域隔開，其中所述環區域從N-末端向C-末端稱為AB、BC、⑶、DE、EF和TO環。在另一實施 方式中，本發明文庫包含的支架還包含至少7個β鏈，從N-末端向C-末端稱為A、B、C、D、 Ε、F和G鏈，各鏈由環區域相連，其中所述環區域從N-末端向C-末端稱為AB、BC、⑶、DE、 EF禾口 FG環。在具體的實施方式中，本發明文庫包含的支架還包含依據人結合腕蛋白C的Τη3 結構域的支架的一個或多個環區域，其包含以下胺基酸殘基I. AB 環內所含的 12-17 ；II. BC 環內所含的 23-31 ；III. CD 環內所含的 39-45 ；IV. DE 環內所含的 50-56 ；V. EF環內所含的60-66 ；和VI. FG 環內所含的 75-84。在另一具體實施方式
中，本發明文庫包含的支架還包含依據人結合腕蛋白C的 Τη3結構域的支架的一個或多個環區域，其包含以下胺基酸殘基I. AB 環內所含的 11-17 ；II. BC 環內所含的 23-31 ；III. CD 環內所含的 39-45 ；IV. DE 環內所含的 51-56 ；V. EF環內所含的60-67 ；和VI. FG 環內所含的 75-84。本發明還提供包含支架的文庫，所述支架包含環序列多樣性。在一個實施方式中， 本發明文庫包含具有至少一個環的支架，該環含有至少一個隨機化的位置。在另一實施方 式中，本發明文庫包含具有至少一個環的支架，該環含有至少一個隨機化的位置，還含有至 少一個維持恆定的位置。在另一實施方式中，本發明文庫包含具有環的支架，該環含有至少 一個經限制性隨機化的位置。在另一實施方式中，本發明文庫包含具有至少一個環的支架， 該環含有至少一個經限制性隨機化的位置，還含有至少一個維持恆定的位置。在另一實施 方式中，本發明文庫包含具有至少一個環的支架，該環含有至少一個經限制性隨機化的位 置，還含有至少一個維持恆定的位置。連接蛋白質支架各鏈的環可作長度和/或序列多樣性隨機化。在一個實施方式 中，本發明文庫具有含至少一個環的支架，該環作長度和/或序列多樣性隨機化。在另一實 施方式中，本發明文庫具有的支架中至少一個環維持恆定，而至少一個額外的環作長度和/ 或序列多樣性隨機化。在另一實施方式中，本發明文庫具有的支架中環AB、CD和EF中至少 一個、至少兩個或所有三個維持恆定，而環BC、DE和re中至少一個、至少兩個或所有三個作 長度和/或序列多樣性隨機化。在另一實施方式中，本發明文庫具有的支架中環AB、CD和 EF中至少一個、至少兩個或所有三個作隨機化，而環BC、DE和TO中至少一個、至少兩個或 所有三個作長度和/或序列多樣性隨機化。
在一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含具有以下共有序列的隨機化 BC環S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示脯氨酸或丙氨酸，其中 (b)表示丙氨酸或甘氨酸。在另一具體實施方式
中，本發明支架包含具有以下共有序列的隨機化BC環 Α-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X表示任何胺基酸，其中(d)表示脯氨酸、穀氨酸或賴氨 酸，其中(e)表示天冬醯胺或甘氨酸，和其中(f)表示絲氨酸或甘氨酸。在另一實施方式中，本發明文庫具有BC環，其包含具有以下共有序列的11個氨基 酸S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X表示任何胺基酸，其中(c)表示脯氨酸、絲氨酸或甘氨 酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含具有以下共有序列的隨機化 re環X-a-X-X-G-X-X-X-S，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示天冬醯胺、蘇氨酸或賴氨酸。在另一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含具有以下共有序列的隨機 化TO環X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示天冬醯胺、蘇氨酸或 賴氨酸，和其中(b)表示絲氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫包含的支架包含具有以下共有序列的隨機化re 環X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X表示任何胺基酸，其中(a)表示天冬醯胺、蘇氨酸或賴氨酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含含有7個殘基的AB環，該環 經隨機化而含有以下共有序列K-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、 酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中(a) 表示絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含含有9個殘基的AB環，該環 經隨機化而含有以下共有序列K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組 氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中
(a)表示絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含含有7、8或9個殘基的CD 環，其中CD環中各殘基經隨機化，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨酸、酪氨酸、異亮氨 酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸。在一具體實施方式
中，本發明文庫所包含的支架包含含有8個殘基的EF環，該環 經隨機化而含有以下共有序列X-b-L-X-P-X-c-X，其中X表示天冬醯胺、天冬氨酸、組氨 酸、酪氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸，其中
(b)表示天冬醯胺、賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬氨酸、穀氨酸或甘氨酸，和其中(c)表示異 亮氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、丙氨酸或甘氨酸。本發明的進一步實施方式是編碼文庫的分離核酸分子的集合，所述文庫包含本發 明和上述的支架。設計這些Tn3文庫的另一實際考慮是鑑定通常用於簡併寡核苷酸中以編碼任何 胺基酸的「NNK」(N = A，G，T，C;K = G，T)混合密碼子方案的替代方案。雖然「ΝΝΚ」混合產生 能編碼所有20種胺基酸的32種不同密碼子，但它們不是等同編碼的(表11)。例如，「ΝΝΚ」方案中3/32密碼子編碼Leu (CTG，CTT, TTG)，但只有1/32編碼Asp (GAT)。此外，「NNK」混合 編碼一個終止密碼子(TAG)和Cys密碼子(TGT)，當產生天然文庫時，二者均不需要。考慮替 代方案時，我們注意到以下事實，即有人描述合成的抗體文庫編碼由小亞組的胺基酸構成 的CDR序列。其中CDR僅由4種胺基酸(Tyr，Ala，ASp，Ser)，或者甚至二元配對(Tyr，Ser) 構成的抗體文庫顯示能產生針對蛋白質抗原的特定高親和力mAMFellouse等，Proc Natl Acad Sci，2004，101 12467-72，Fellouse 等· J. Mol. Biol.，2005，348 1153-62) 類似地， 僅包含Tyr和Ser的含隨機化環序列的10Fn3支架蛋白的文庫也產生針對靶蛋白的特異性 結合物(Koide等· ProcNatl Acad, Sci, 2007,104 :66_32_7)。雖然含有高度局限性胺基酸 組的文庫能產生特異性結合蛋白，但從文庫獲得的結合物的多樣性可能有限。因此，我們設 計了替代的「NHT」混合密碼子方案以便在Tn3文庫中引入多樣性(H = A，T，C)。「NHT」混 合物編碼20種胺基酸的合理亞組，但規避了 「NNK」混合密碼子所述的不足(表12)。該方 案產生編碼12/20胺基酸的12種密碼子，S卩，各密碼子編碼獨特的胺基酸。此外，其中沒有 終止或Cys密碼子。因此，在一些實施方式中，本發明支架包含NHT密碼子方案編碼的密碼 子。在其它實施方式中，本發明支架包含NNK混合密碼子方案所編碼的密碼子。在其它實施方式中，可對本發明支架進行親和力成熟。在該本領域接受的方法中， 對特異性結合蛋白進行選擇對特定靶標的親和力是否增加的方案(參見Wu等.Proc Natl Aca Sci USA. 1998年5月26日；95(11) :6037_42)。得到的本發明支架可顯示至少與親和 力成熟前的支架一樣高的結合特徵。在其它實施方式中，可對本發明支架進行類似於抗體CDR嫁接的「環嫁接」。在該 本領域接受方法中，抗體的一個或多個CDR被「嫁接」到受者抗體上，或者，在此例中是本發 明支架(參見Ewert等.Methods :2004年10月；34(2) :184_99)。在另一實施方式中，可 將另一支架的至少一個環嫁接到本發明支架上。本發明還提供鑑定能結合靶標從而形成支架靶標複合物的蛋白質支架的氨基 酸序列的方法。在一個實施方式中，該方法包括以下步驟a)提供本發明的多肽展示文庫； b)將(a)的多肽展示文庫與固定或可分離的靶標接觸；c)將支架靶標複合物與游離支架 相分離；d)複製(c)的分離支架從而產生因多樣性降低和富集了能結合靶標的所展示支架 而不同於(a)中的新多肽展示文庫；e)任選用(d)的新文庫重複步驟(b)、(c)和(d)；和 f)測定編碼(d)物質的所展示支架的區域的核酸序列，從而推測能結合靶標的肽序列。在另一實施方式中，文庫篩選鑑定後，本發明支架可進一步隨機化。在一個實施方 式中，本發明方法包括採用本文所述方法使得從文庫鑑定的支架的至少一個、至少兩個、至 少三個、至少四個、至少五個或至少六個環進一步隨機化。在另一實施方式中，對進一步隨 機化的支架進行後續方法以鑑定能結合靶標的支架，所述方法包括a)將所述進一步隨機 化的支架與固定或可分離的靶標接觸；b)將進一步隨機化的支架靶標複合物與游離支架 相分離；c)複製(b)的分離支架，任選重複步驟(a)-(c)；和d)測定編碼所述進一步隨機化 的支架的區域的核酸序列，從而推測能結合靶標的肽序列。在進一步的實施方式中，進一步 隨機化的支架包含以前在第一文庫中進行隨機化的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四 個、至少五個或至少六個隨機化的環。在其它進一步的實施方式中，所述進一步隨機化的支 架包含以前未在第一文庫中進行隨機化的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少 五個或至少六個隨機化的環。
在另一實施方式中，文庫篩選鑑定後，本發明支架可進一步隨機化。在一個實施 方式中，本發明方法包括採用本文所述方法使得從文庫鑑定的支架的至少一個、至少兩個、 至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個鏈環進一步隨機化。在另一實施方式 中，對進一步隨機化的支架進行後續方法以鑑定能結合靶標的支架，所述方法包括a)將所 述進一步隨機化的支架與固定或可分離的靶標接觸；b)將進一步隨機化的支架靶標複合 物與游離支架相分離；c)複製(b)的分離支架，任選重複步驟(a)-(c)；和d)測定編碼所述 進一步隨機化的支架的區域的核酸序列，從而推測能結合靶標的肽序列。在進一步的實施 方式中，進一步隨機化的支架包含以前在第一文庫中進行隨機化的至少一個、至少兩個、至 少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個隨機化的鏈。在其它進一步的實施方式 中，所述進一步隨機化的支架包含以前未在第一文庫中進行隨機化的至少一個、至少兩個、 至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個隨機化的鏈。在另一實施方式中，文庫篩選鑑定後，本發明支架可進一步隨機化。在一個實施方 式中，本發明方法包括採用本文所述方法使得從文庫鑑定的支架的至少一個、至少兩個、至 少三個、至少四個、至少五個或至少六個和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少 五個、至少六個或至少七個鏈環進一步隨機化。在另一實施方式中，對進一步隨機化的支架 進行後續方法以鑑定能結合靶標的支架，所述方法包括a)將所述進一步隨機化的支架與 固定或可分離的靶標接觸；b)將進一步隨機化的支架靶標複合物與游離支架相分離；C) 複製(b)的分離支架，任選重複步驟(a)-(c)；和d)測定編碼所述進一步隨機化的支架的 區域的核酸序列，從而推測能結合靶標的肽序列。在進一步的實施方式中，進一步隨機化的 支架包含以前在第一文庫中進行隨機化的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少 五個或至少六個隨機化的環和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六 個或至少七個鏈。在其它進一步的實施方式中，所述進一步隨機化的支架包含以前未在第 一文庫中進行隨機化的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個隨 機化的環和至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個或至少七個鏈。在另一實施方式中，獲得本發明支架的一種方法包括選自BC、DE或TO環的第一隨 機化環和未在所述文庫中作隨機化的選自AB、CD或EF環的第二環。在還有另一實施方式 中，獲得本發明支架的另一方法包括選自AB、CD或EF環的第一隨機化環和未在所述文庫中 作隨機化的選自BC、DE或re環的第二環。本發明還提供獲得結合至少一種或更多種靶標的至少兩種支架的方法。該方法 能篩選共同起作用而引發特定反應的試劑。當需要激動活性，而激動活性需要多種支架協 作時(例如但不限於，受體酪氨酸激酶的激動作用)，優選採用這種篩選。該方法能篩選 協作性試劑而無需重新設計文庫來形成多聚複合物。在一個實施方式中，本發明方法包括 在允許支架靶配體複合物形成的條件下將靶配體與本發明文庫接觸，將所述支架與交聯 劑(定義為將至少兩個相同或不同的支架緊密結合在一起的試劑)結合，其中所述支架的 交聯引發可檢測的反應，以及從該複合物獲得結合靶標的所述支架。在進一步的實施方式 中，所述交聯劑是支架特異性抗體，或其片段，表位標籤特異性抗體或其片段，二聚體化功 能域，例如Fc區，亮氨酸拉鏈基序，化學交聯劑或本領域已知的另一二聚體化功能域。本發明還提供利用本發明支架檢測化合物的方法。依據通過文庫篩選所得支架的 結合特異性，可能在試驗中利用這種支架檢測樣品中的特異性靶標，例如用於診斷方法。在一個實施方式中，檢測化合物的方法包括在允許化合物支架複合物形成的條件下將樣品 中的所述化合物與本發明支架接觸並檢測所述支架，從而檢測樣品中的所述化合物。在進 一步的實施方式中，對支架作標記(即，放射性標記、螢光、酶聯或比色標記)以促進檢測所 述化合物。本發明還提供利用本發明支架捕捉化合物的方法。依據通過文庫篩選所得支架的 結合特異性，可能在試驗中利用這種支架捕捉樣品中的特異性靶標，例如用於純化方法。在 一個實施方式中，捕捉樣品中化合物的方法包括在允許化合物支架複合物形成的條件下 將樣品中的所述化合物與本發明支架接觸並從樣品中除去所述複合物，從而捕捉所述樣品 中的所述化合物。在進一步的實施方式中，所述支架固定以促進除去化合物支架複合物。在一些實施方式中，從本發明文庫分離的支架包含至少一個、至少兩個、至少四 個、至少五個、至少六個或更多個隨機化的環區域。在一些實施方式中，分離的支架環序列 可從供者支架交換至受者支架的任何環(例如，供者支架的AB環序列可轉移至受者支架中 的任何環區域)。在具體的實施方式中，可將分離的環序列轉移至受者支架中的同源環(例 如，供者支架的AB環序列可轉移至受者支架中的AB環位置)。在一些實施方式中，分離的 環序列可以與各種受者支架隨機「混合和匹配」。在其它實施方式中，可通過環序列鑑定分離的支架序列。例如，利用文庫對特定靶 標進行淘選，分離特異性結合物的集合。隨機化環序列的特徵在於不依賴支架背景的特定 序列(即，結合靶標X的支架，其中所述支架包含SEQ IDNO :x所示的AB環序列)。在支架 顯示結合靶標X的兩個環序列的其它實施方式中，所述環序列的特徵在於沒有支架序列存 在下結合靶標X。換言之，考慮到可將從結合特定靶標的文庫分離的支架表達為不依賴支架 主鏈而結合該靶標的可變環序列。該方法類似於抗體可變區中CDR的概念。在一些實施方式中，本發明提供包含特異性結合SYNAGIS 的序列的支架。在這 種實施方式中，特異性結合SYNAGIS 的本發明支架可包含選自SEQID NO 100、102、105、 107或109的BC環序列。在其它實施方式中，特異性結合SYNAGIS 的本發明支架可包含 選自SEQ ID NO :101、103、104、106、108、或110的TO環序列。在進一步的實施方式中，特 異性結合SYNAGIS 的本發明支架可包含選自SEQ ID NO :100、102、105、107、或109的至 少一個BC環序列；還可包含選自SEQ ID NO :101、103、104、106、108、或110的至少一個FG 環序列。在其它實施方式中，本發明還可包含與特異性結合SYNAGIS 的支架競爭結合的 支架，所述SYNAGIS 結合物包含選自SEQ IDNO :100、102、105、107、或 109 的一個BC環序列；還包含選自 SEQ ID N0:101、103、 104、106、108、或110的TO環序列。可如本文在實施例11和/或14中所示，或通過本領域 已知的其它試驗進行競爭性試驗。在一些實施方式中，本發明提供包含特異性結合溶菌酶的序列的支架。在這種實 施方式中，特異性結合溶菌酶的本發明支架可包含選自SEQ ID N0:lll、114、102、120或 124的至少一個BC環序列。在其它實施方式中，特異性結合溶菌酶的本發明支架可包含選 自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、118、119、121、122、或 125 的至少一個 FG 環序列。在 進一步的實施方式中，特異性結合溶菌酶的本發明支架可包含選自SED ID N0:lll、114、 102、120、或 124 的至少一個 BC 環序列；還可包含選自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、 118、119、121、122、或125的至少一個TO環序列。在其它實施方式中，本發明還可包含與特異性結合溶菌酶的支架競爭結合的支架，所述溶菌酶結合物包含選自SED ID N0:lll、114、 102、120、或 124 的至少一個 BC 環序列；還包含選自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、118、 119、121、122、或125的至少一個!7G環序列。可如本文在實施例11和/或14中所示，或通 過本領域已知的其它試驗進行競爭性試驗。6. 5多聚支架除了支架單體，可將本文所述的任何支架構建物製備成支架二聚體或多聚體，作 為增加化合價和由此導致的抗原結合親合力的手段。還可本文所述的任何支架構建物製備 成支架的二聚體或多聚體，從而作為增加抗原結合特異性的手段(例如，可製備結合不同 抗原的支架)。可通過各支架模塊之間的共價結合，例如通過包含入胺基酸接頭來產生這種 多聚體(多聚支架或者本文也稱為多價支架)。在其它方法中，可利用本領域已知的二聚體 化功能域裝配多聚支架。在具體實例中，可通過構建編碼單體支架的融合基因，或者通過工 程改造密碼子將半胱氨酸殘基摻入單體序列並在表達產物之間形成二硫鍵來產生共價結 合的支架。還可通過各種技術產生非共價結合的多聚支架。這些技術包括在單體序列中引入 對應於荷正電和/或負電殘基的密碼子並使得表達產物中這些殘基之間(和由此的單體之 間)相互作用。利用單體亞單位中天然存在的荷電殘基可簡化該方法。產生非共價結合支 架的另一方法是在單體支架基因中(例如，在氨基或羧基末端)引入已知相互作用的蛋白 質或蛋白質結構域的編碼序列。這種蛋白質或蛋白質結構域包括捲曲螺旋基序、亮氨酸拉 鏈基序和已知指導二聚體或高級多聚體形成的許多蛋白質亞單位(或其片段)中的任一 種。在一些實施方式中，本發明的多聚支架包含融合於抗體的任何結構域(或片段) 的至少一個支架。在一些實施方式中，至少一個支架融合於抗體可變區、CHl結構域、Ck結 構域、C λ結構域、CH2或CH3結構域。在其它實施方式中，至少一個支架融合於抗體Fc的 CH2結構域。在這種實施方式中，表達時，通過抗體Fc片段的CH2和CH3區二聚化而得到的 蛋白質對於特定靶標是二價的。在進一步實施方式中，本發明支架替代與Fc片段相連的抗 體可變區。在其它實施方式中，本發明支架不替代與CHl-Fc片段、Ck結構域或CX結構 域相連的抗體可變區。在進一步的實施方式中，通過將支架融合於抗體的CHl和CK或CX區來構建多 聚支架。在一些實施方式中，本發明支架替代融合於抗體的CHl和Ck或CX區的抗體可 變區。在進一步的實施方式中，本發明支架可融合於抗體輕鏈或重鏈的C-末端。在其它實 施方式中，本發明支架可融合於抗體輕鏈或重鏈的N-末端。在一些實施方式中，本發明的多聚支架包含對同一表位具有特異性的多個支 架。在其它實施方式中，本發明的多聚支架包含對不同表位具有特異性的多個支架，或稱 為表位結合結構域。可如出於所有目的通過引用全文納入本文的2008年7月30日提交 的美國申請系列號 12/182，975〃 Multispecific epitopebinding proteins and uses thereof (多特異性表位結合蛋白及其應用)"所示裝配和使用本發明的多聚支架。可從抗 體、抗體片段、雙抗體、scFv.Fab.Fv或結合肽選擇這種表位結合結構域。在其它實施方式中，與本發明支架的一樣，表位結合結構域對相同靶標具有特異 性。
在另一實施方式中，與本發明支架的一樣，表位結合結構域對不同靶標具有特異 性。為連接兩個或更多個支架的具體情況選擇合適的接頭取決於各種參數，包括，例 如單體結構域的性質和/或肽接頭對蛋白水解和氧化的穩定性。接頭多肽可主要包含選自Gly、Ser、Ala或Thr的胺基酸殘基。例如，肽接頭含有的 至少75% (根據肽接頭中存在的殘基總數計算)，例如至少80%，如至少85%或至少90% 的胺基酸殘基可選自Gly、Ser、Ala或Thr。肽接頭還可僅由Gly、Ser、Ala和/或Thr殘基 構成。接頭多肽應具有足以連接兩個或更多個本發明單體結構域或兩個或更多個本發明多 聚支架的長度，如此它們彼此能採取正確的構象，從而保留所需活性。為該目的，合適的長度是至少一個，通常少於約50個胺基酸殘基，例如2-25氨基 酸殘基、5-20胺基酸殘基、5-15胺基酸殘基、8-12胺基酸殘基或11個殘基。類似地，多肽編 碼接頭大小可以是，例如約2-約15胺基酸、約3-約15、約4-約12、約10、約8或約6氨基 酸。在涉及核酸，例如DNA、RNA或二者的組合的方法和組合物中，含有接頭序列的多核苷酸 可以是，例如約6個核苷酸-約45個核苷酸、約9個核苷酸-約45個核苷酸、約12個核苷 酸-約36個核苷酸、約30個核苷酸、約24個核苷酸或約18個核苷酸。類似地，選擇包含 入接頭多肽的胺基酸殘基應顯示不明顯幹擾多肽多聚體的活性或功能的特性。因此，肽接 頭整體上應不顯示電荷，電荷與多肽多聚體的活性或功能不一致，會干擾內部摺疊，或與一 個或多個單體結構域中的胺基酸殘基形成鍵或其它相互作用從而嚴重阻礙多肽多聚體結 合特異性靶標。還可從文庫選擇肽接頭，其中該肽接頭中的胺基酸殘基為特定多肽多聚體中特定 組的單體結構域作隨機化。可利用柔性接頭發現單體結構域的合適組合，然後利用可變接 頭的這種隨機文庫優化以獲得具有最佳長度和幾何特徵的接頭。最佳接頭可含有參與結合 靶標並在不結合特定靶標時約束單體結構域在多肽多聚體中相對彼此運動的類型正確的
最低數量胺基酸殘基。利用天然產生以及人工肽接頭將多肽連接入新型連接的融合多肽是參考文獻中 熟知的(Hallewell 等· (1989)，J. Biol. Chem. 264,5260-5268 ；Alfthan等.(1995),Protein Eng.8,725-731 ；Robinson 禾口 Sauer(1996) , Biochemistry 35,109-116 ；Khandekar 等· (1997)，J.Biol.Chem. 272,32190-32197 ；Fares 等· (1998)，Endocrinology 139， 2459-2464 ；SmalIshaw 等· (1999)，Protein Eng. 12，623-630 ；美國專利號 5，856，456)。如上所述，通常優選肽接頭具有至少一定的柔韌性。因此，在一些實施方式中，肽 接頭含有1-25個甘氨酸殘基、5-20個甘氨酸殘基、5-15個甘氨酸殘基或8_12個甘氨酸殘 基。肽接頭通常含有至少50%甘氨酸殘基，例如至少75%甘氨酸殘基。在本發明的一些實 施方式中，肽接頭只包含甘氨酸殘基。在具體的實施方式中，接頭序列可包含(G-G-G-G-S)x 所示序列，其中χ是正整數。在另一具體實施方式
中，接頭序列可包含(G-A)x所示序列，其 中χ是正整數。在另一具體實施方式
中，接頭序列可包含(G-G-G-T-P-T),所示序列，其中χ 是正整數。在一些情況中，優選或需要在肽接頭中提供一定的剛性。這可通過在肽接頭的氨 基酸序列中包含脯氨酸殘基來實現。因此，在本發明的另一實施方式中，肽接頭在其氨基 酸序列中可包含至少一個脯氨酸殘基。例如，肽接頭的胺基酸序列中至少25%，例如至少本發明的一個特定實施方式中，肽接頭只 包含脯氨酸殘基。在本發明的一些實施方式中，修飾肽接頭從而引入包含用於非多肽部分的連接基 團的胺基酸殘基。這種胺基酸殘基的例子可以是半胱氨酸殘基(隨後連接非多肽部分)或 者該胺基酸序列可在體內包含N-糖基化位點(從而將糖部分連接(體內)於肽接頭)。其 它選擇是利用設計的tRNA和tRNA合成酶將非天然胺基酸遺傳學摻入(參見，例如美國申 請公布系列號2003/0082575)多肽結構域或接頭。例如，插入酮基-酪氨酸能位點特異性 地偶連於表達的單體結構域或多聚體。多肽多聚體中存在的所有肽接頭的胺基酸序列有時相同。或者，多肽多聚體中存 在的所有肽接頭的胺基酸序列可以不同。6. 6 融合本文所述支架可融合於其它蛋白質結構域。例如，可經N或C-末端融合IgG的恆 定區(Fc)與支架而整合這些支架與人免疫反應。Fc融合分子活化免疫反應的補體組分並 提高蛋白質支架的治療價值。類似地，支架和補體蛋白，例如Clq之間融合可用於靶向細 胞，支架和毒素之間的融合可用於特異性破壞攜帶特定抗原的細胞。此外，各種出版物描述了獲得生理活性分子的方法，其半衰期通過在該分子中 引入FcRn-結合多肽(W0 97/43316 ；美國專利號5，869，046 ；美國專利號5，747，035 ；W0 96/32478 ；W0 91/14438)或通過融合分子與保留FcRn-結合親和力但對其它Fc受體的親 和力極大降低的抗體(W0 99/43713)或與抗體的FcRn結合結構域融合(W0 00/09560 ；美 國專利號4，703，039)而得到修飾。增加生理活性分子半衰期的具體技術和方法還可見 於2006年8月1日授權的美國專利號7，083，784，名為〃 Antibodies with Increased Half-lives (半衰期增加的抗體)"，該篇專利出於所有目的通過引用納入本文。具體地 說，考慮到本發明支架可融合於IgG的Fc區，其中所述Fc區包含胺基酸殘基突變(如Kabat 的 EU 指數編號):M252Y/S254T/T256E 或 H433K/N434F/Y436H。此外，本發明支架可與增加或延長體內或血清半衰期的分子融合。在一些實施方 式中，本發明支架與白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白 分子(IgG)、補體、血紅蛋白、結合肽、脂蛋白和其它因子締合以增加其在血流中的半衰期或 其組織穿透性。可通過標準技術，例如從利用公眾可得的基因序列構建的重組融合基因表 達融合蛋白來製備這些融合體。本發明支架還可與增加或延長體內或血清半衰期的分子結合或締合。在一些實施 方式中，本發明支架與白蛋白、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白分子或具有增加血清半衰 期的Fc突變的免疫球蛋白分子、補體、血紅蛋白、脂蛋白和其它因子締合以增加血清半衰 期。可通過標準技術，例如從利用公眾可得的基因序列構建的重組融合基因表達融合蛋白 來製備這些融合體。術語「聚乙二醇」或「PEG」表示含或不含偶聯劑、偶連或活化部分(例如，含巰 基、三氟甲磺酸根、三氟乙基磺酸根(tresylate)、氮丙啶、環氧乙烷、N-羥基琥珀醯亞 胺或馬來醯亞胺部分)的聚乙二醇化合物或其衍生物。術語「PEG」應表示分子量介於 500-150, OOODa之間的聚乙二醇，包括其類似物，其中例如末端0H-基團被甲氧基取代(稱 為 mPEG)。
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在一個實施方式中，用聚乙二醇(PEG)衍生支架。PEG是含有兩個末端羥基的環 氧乙烷重複單位的線形、水溶性聚合物。PEG根據其分子量分類，其分子量通常為約500 道爾頓到約40，000道爾頓。在目前優選的實施方式中，所用的PEG的分子量是5，000道 爾頓到約20，000道爾頓。偶連於本發明支架的PEG可以是支化或非支化的(參見，例 如 Monfardini，C.等.1995Bioconjugate Chem6 62-69)。PEG 可從耐卡塔公司(Nektar Inc.)、西格瑪化學品公司(Sigma ChemicalCo.)和其它公司商品化購得。這種PEG包括但 不限於單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG_S)、單甲氧 基聚乙二醇-琥珀醯亞胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG_NH2)、 單甲氧基聚乙二酉享-三氟乙基磺酸酉旨(monomethoxypolyethyleneglycol-tresylate) (MePEG-TRES)和單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。簡言之，在一個實施方式中，通過無反應活性的基團，例如甲氧基或乙氧基對 所用親水性聚合物，例如PEG的一端封端。隨後，通過與合適的活化劑反應而活化該 聚合物的另一端，所述活化劑是例如三聚氰醯滷(例如，三聚氰醯氯、溴或氟)、二咪唑 (diimadozle)、酐試劑(例如，二滷代琥珀酸酐，如二溴代琥珀酸酐)、醯疊氮、對二唑鐺苄 基SI (p-diazoiumbenzyl ether)、3_ (對坐金翁苯氧基(p_diazoniumphenoxy)) p聖基丙 基醚)等。然後活化的聚合物與本文所述多肽反應產生用聚合物衍生的多肽。或者，可活 化本發明支架中的官能團以便與聚合物反應，或者可採用已知的偶連方法在協調偶連反應 中連接兩個基團。不難知道可採用本領域技術人員已知和使用的多種其它反應方案以PEG 衍生本發明多肽。在一些實施方式中，工程改造本發明支架以提供用於偶連的反應活性基團。在這 種支架中，N-末端和/或C-末端還可用於提供用於偶連的反應活性基團。在其它實施方 式中，N-末端可偶連於一個部分(例如但不限於PEG)，而C-末端偶連於另一部分(例如但 不限於生物素)，反之亦然。術語「體內半衰期」以其常規意義使用，即，身體/靶器官中存在多肽的50%生物 學活性的時間，或者多肽活性是其初始值的50%的時間。作為測定功能性體內半衰期的替 代方案，可測定「血清半衰期」，即，清除前50%多肽分子在血漿或血流中循環的時間。測定 血清半衰期常比測定功能半衰期簡單，血清半衰期的幅度常是功能性體內半衰期幅度的良 好指示。血清半衰期的其它術語包括血漿半衰期、循環半衰期、循環性半衰期、血清清除率、 血漿清除率和清除半衰期。待保留的功能通常選自促凝血、蛋白水解、輔因子結合、受體結 合活性或特定蛋白質相關的其它類型生物學活性。與功能性體內半衰期或血漿半衰期有關的術語「增加」用於表示與參比分子(例 如，未修飾的多肽)相比，在可比條件下測得多肽的相關半衰期統計學顯著地增加。例如， 與未修飾的參比分子相比，相關半衰期可增加至少約25%，例如至少約50%，如至少約 100%、至少約150%、至少約200%、至少約250%或至少約500%。在其它實施方式中，與 未修飾的參比分子相比，半衰期可增加約至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5 倍、至少10倍、至少20倍、或至少50倍。6. 7隨機化實施方式在一方面，本發明提供隨機化支架。在另一實施方式中，本發明還提供多聚隨機化 支架。在另一實施方式中，本發明還提供二硫鍵工程改造的隨機化支架。在還有另一實施方式中，本發明提供包含隨機化支架的文庫。下文提供了本發明支架和包含所述支架的展 示文庫的隨機化方案，在本節中統稱為「本發明」。在一個實施方式中，本發明支架包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6 個隨機化環。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化環，其中至少AB、或至少BC、 或至少⑶、或至少DE、或至少EF、或至少TO環隨機化。在一個實施方式中，本發明包含一個隨機化的環。例如，本發明包含隨機化的AB 環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC環。在另一實施方式中，本發明包含隨機 化的CD環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的DE環。在另一實施方式中，本發明包 含隨機化的EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的re環。在一個實施方式中，本發明包含兩個隨機化的環。例如，本發明包含隨機化的AB 和BC環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB和CD環。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的AB和DE環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB和EF環。在另 一實施方式中，本發明包含隨機化的AB和re環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 BC和CD環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC和DE環。在另一實施方式中，本 發明包含隨機化的BC和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC和TO環。在另 一實施方式中，本發明包含隨機化的CD和DE環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 CD和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的CD和TO環。在另一實施方式中，本 發明包含隨機化的DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的DE和TO環。在 另一實施方式中，本發明包含隨機化的EF和re環。在另一實施方式中，本發明包含三個隨機化的環。例如，在一個實施方式中，本發 明包含隨機化的AB、BC和⑶環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、BC和DE環。 在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、BC和EF環。在另一實施方式中，本發明包含 隨機化的AB、BC和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、CD和DE環。在另 一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、⑶和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機 化的AB、⑶和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、DE和EF環。在另一實 施方式中，本發明包含隨機化的AB、DE和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 AB、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、⑶和DE環。在另一實施方式 中，本發明包含隨機化的BC、⑶和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、⑶ 和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、DE和EF環。在另一實施方式中，本 發明包含隨機化的BC、DE和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、EF和TO 環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的CD、DE和EF環。在另一實施方式中，本發明 包含隨機化的⑶、DE和re環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的⑶、EF和re環。 在另一實施方式中，本發明包含隨機化的DE、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含四個隨機化的環。在另一實施方式中，本發明包含 隨機化的AB、BC、⑶和DE環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、BC、⑶和EF環。 在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、BC、CD和TO環。在另一實施方式中，本發明 包含隨機化的AB、⑶、DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、⑶、DE和 re環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、CD、EF和re環。在另一實施方式中， 本發明包含隨機化的AB、DE、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、⑶、DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、⑶、DE和TO環。在另一實施方 式中，本發明包含隨機化的BC、DE、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 CD、DE、EF 禾口 FG 環。在另一實施方式中，本發明包含五個隨機化的環。在另一實施方式中，本發明包含 隨機化的AB、BC、CD、DE，和EF環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、BC、CD、DE， 和re環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的AB、⑶、DE、EF和re環。在另一實施方 式中，本發明包含隨機化的AB、BC、DE、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化 的AB、BC、⑶、EF，和TO環。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的BC、⑶、DE、EF和TO 環。在另一實施方式中，本發明包含六個隨機化的環。在一個實施方式中，本發明包含 隨機化 AB、BC、CD、DE、EF 禾口 FG 環。在一具體實施方式
中，本發明包含三個隨機化的環，其中BC、DE、和TO環均隨機 化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、至少⑶、至少EF環 隨機化。在一具體實施方式
中，本發明包含三個隨機化的環，其中AB、CD、和EF環均隨機化。 在另一具體實施方式
中，本發明包含隨機化的環，其中AB、BC、CD、DE、EF、和TO環均隨機化。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的環，其中至少一個、或至少兩個、或至少 三個、或至少四個、或至少五個、或至少六個環未隨機化。在一個實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中一個環未隨機化。在一 個實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中AB環未隨機化。在另一實施方式中， 本發明包含至少一個隨機化的環，其中BC環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至 少一個隨機化的環，其中CD環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化 的環，其中DE環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中EF 環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中兩個環未隨機化。在一 個實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB和BC環未隨機化。在另一實 施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB和CD環未隨機化。在另一實施方 式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB和DE環未隨機化。在另一實施方式中， 本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB和EF環未隨機化。在另一實施方式中，本發 明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB和re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包 含至少一個隨機化的環，其中至少BC和⑶環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至 少一個隨機化的環，其中至少BC和DE環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一 個隨機化的環，其中至少BC和EF環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨 機化的環，其中至少BC和re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化 的環，其中至少⑶和DE環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環， 其中至少⑶和EF環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中 至少⑶和re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少 DE和EF環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少DE和 re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少EF和re環 未隨機化。
在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中三個環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC和⑶環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC和DE環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC和EF環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC和re環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶和DE環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶和EF環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶和re環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、DE和EF環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、EF和TO環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、⑶和DE環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、⑶和EF環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、⑶和re環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、DE和EF環未隨機化。另一 實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、EF和re環未隨機化。在另一 實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少⑶、DE和EF環未隨機化。在另一 實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少⑶、DE和re環未隨機化。在另一 實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少⑶、EF和re環未隨機化。在另一 實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少DE、EF和TO環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中四個環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、⑶和DE環未隨機化。在 另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、⑶和EF環未隨機化。 在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、⑶和re環未隨機 化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶、DE和EF環未隨 機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶、DE和TO環未 隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶、EF和TO環 未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、DE、EF和TO 環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、⑶、DE和 EF環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、⑶、DE 和re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、DE、 EF和re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少⑶、 DE、EF和TO環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中五個環環未隨機化。在 另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、⑶、DE和EF環未隨機 化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、⑶、DE和TO環 未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、⑶、DE、EF 和re環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、 DE、EF和TO環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少 AB、BC、⑶、EF和TO環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少BC、CD、DE、EF和FG環未隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中六個環未隨機化。在另 一實施方式中，本發明包含至少一個隨機化的環，其中至少AB、BC、⑶、DE、EF和TO環未隨 機化。本發明還提供其中β鏈區域隨機化的支架，其中在相似條件下檢測到所述β鏈 隨機化支架顯示至少與β鏈隨機化之前的同一支架一樣高的穩定性和特異性靶標親和 力。在一個實施方式中，本發明包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或 至少六個β鏈隨機化。在另一實施方式中，本發明包含至少A鏈、或至少B鏈、或至少C鏈、 或至少D鏈、或至少E鏈、或至少F鏈隨機化。在另一實施方式中，本發明包含兩個隨機化的β鏈。在另一實施方式中，本發明 包含隨機化的A鏈和B鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A鏈和C鏈。在另一 實施方式中，本發明包含隨機化的A鏈和D鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A 鏈和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A鏈和F鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的A鏈和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B鏈和C鏈。在另一 實施方式中，本發明包含隨機化的B鏈和D鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B 鏈和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B鏈和F鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的B鏈和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C鏈和D鏈。在另 一實施方式中，本發明包含隨機化的C鏈和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 C鏈和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C鏈和G鏈。在另一實施方式中，本 發明包含隨機化的D鏈和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的D鏈和F鏈。在 另一實施方式中，本發明包含隨機化的D鏈和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化 的E鏈和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的E鏈和G鏈。在另一實施方式中， 本發明包含隨機化的F鏈和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含三個隨機化的β鏈。在一個實施方式中，本發明 包含隨機化的Α、Β、和C鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、Β、和D鏈。在另一 實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 Α、Β、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、和G鏈。在另一實施方式中， 本發明包含隨機化的Α、C、和D鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、C、和E鏈。 在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、C、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨 機化的A、C、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、D、和E鏈。在另一實施方 式中，本發明包含隨機化的A、D、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、D、和 G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、和D鏈。在另一實施方式中，本發明包 含隨機化的B、C、和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、和F鏈。在另一 實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 B、D、和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、D、和F鏈。在另一實施方式中， 本發明包含隨機化的B、D、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C、D、和E鏈。 在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C、D、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨 機化的C、D、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C、E、和F鏈。在另一實施方 式中，本發明包含隨機化的C、E、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C、F、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的D、E、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包 含隨機化的D、F、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的E、F、和G鏈。在一個實施方式中，本發明包含四個隨機化的β鏈。在另一實施方式中，本發明 包含隨機化的Α、B、C、和D鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、C、和E鏈。 在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、C、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含 隨機化的Α、B、C、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、C、D、和E鏈。在另 一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、C、D、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機 化的Α、C、D、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、D、E、和F鏈。在另一實 施方式中，本發明包含隨機化的A、D、E、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的 A、E、F、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、D、和E鏈。在另一實施方 式中，本發明包含隨機化的B、C、D、和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、 D、和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、D、E、和F鏈。在另一實施方式中， 本發明包含隨機化的B、D、EjP G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、E、F、和 G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C、D、E和F鏈。在另一實施方式中，本發明 包含隨機化的C、D、EjP G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的D、E、F、和G鏈。在一個實施方式中，本發明包含五個隨機化的β鏈。在另一實施方式中，本發明 包含隨機化的Α、B、C、D、和E鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、C、D、和F 鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、C、D、和G鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的A、C、D、E和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、C、D、E和G 鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、C、D、E和F鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的A、C、D、EjP G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、B、C、E和 F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、B、C、E和G鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的A、B、C、D和F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、B、C、D和G 鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、D、E、和F鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的B、C、D、EjP G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、D、E、F和 G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的B、C、E、F和G鏈。在另一實施方式中，本發 明包含隨機化的B、C、D、F和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的C、D、E、F、和 G鏈。在一個實施方式中，本發明包含六個隨機化的β鏈。在一個實施方式中，本發明 包含隨機化的Α、B、C、D、EJP F鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的Α、B、C、D、Ε、 和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、C、D、E、F和G鏈。在另一實施方式中， 本發明包含隨機化的A、B、D、E、F和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、B、 C、E、F和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化的A、B、C、D、F和G鏈。在另一實施 方式中，本發明包含隨機化的A、B、C、D、E和G鏈。在另一實施方式中，本發明包含隨機化 的 B、C、D、E、F 和 G 鏈。在一個實施方式中，本發明包含六個隨機化的β鏈。在一個實施方式中，本發明 包含隨機化的Α、B、C、D、Ε、F和G鏈。本發明還提供聚環長度多樣性的蛋白質支架。在一個實施方式中，本發明包含至 少一個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、 至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個 胺基酸殘基。在另一實施方式中，本發明可包含至少一個環，其包含1、2、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30 個胺基酸殘基。在 另一實施方式中，本發明可包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個相同 長度的環。在另一實施方式中，本發明可包含至少兩個環、至少三個、至少四個、至少五個或 至少六個不同長度的環。在另一實施方式中，本發明因天然產生蛋白質序列中相應環序列的至少一個氨基 酸的缺失、取代或添加而不同於天然產生的蛋白質序列。在一個實施方式中，本發明在相應 天然產生的蛋白質序列的至少一個、或至少兩個、或至少四個、或至少四個、或至少五個、或 至少六個環序列中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在 相應天然產生的蛋白質序列的至少一個、或至少兩個、或至少三個、或至少四個、或至少五 個、或至少六個環序列中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至 少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至少15、 或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少23、或 至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個胺基酸的缺失、 取代或添加。在另一實施方式中，本發明在相應天然產生的蛋白質序列的至少一個、或至少 兩個、或至少三個、或至少四個、或至少五個、或至少六個環序列中包含至少1、至少2、至少 3、至少4到約至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個胺基酸 的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在環AB中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。 在另一實施方式中，本發明在環AB中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個胺基酸的缺失、取代或添加。在另一實施方式中，本發明在環AB中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在環BC中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。 在另一實施方式中，本發明在環BC中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個胺基酸的缺失、取代或添加。在另一實施方式中，本發明在環BC中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或
41至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在環CD中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。 在另一實施方式中，本發明在環CD中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少 14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、 或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個 胺基酸的缺失、取代或添加。在另一實施方式中，本發明在環⑶中包含至少1、至少2、至少 3、至少4到約至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個胺基酸 的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在環DE中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。 在另一實施方式中，本發明在環DE中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個胺基酸的缺失、取代或添加。在另一實施方式中，本發明在環DE中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在環EF中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。 在另一實施方式中，本發明在環EF中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 個胺基酸的缺失、取代或添加。在另一實施方式中，本發明在環EF中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到約至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個氨基 酸的缺失、取代或添加。在一個實施方式中，本發明在環re中包含至少一個胺基酸的缺失、取代或添加。 在另一實施方式中，本發明在環re中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少 14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、 或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個 胺基酸的缺失、取代或添加。在另一實施方式中，本發明在環re中包含至少1、至少2、至少3、至少4到約至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30個胺基酸 的缺失、取代或添加。 本發明還提供包含環序列多樣性的支架。在一個實施方式中，本發明包含至少1、 至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至 少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30個隨機化的位置。在另一實施方式中，本發明包含至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至 少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30個隨機化的位置，還包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少 5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少 16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、 至少27、至少28、至少29或至少30個維持恆定的位置。在另一實施方式中，本發明包含至 少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至 少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至 少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少 26、至少27、至少28、至少29或至少30個經歷限制性隨機化的位置。在另一實施方式中， 本發明包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至 少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至 少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、 至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至 少28、至少29或至少30個經歷限制性隨機化的位置，還包含至少1、至少2、至少3、至少4、 至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、 至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少 19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29 或至少30個維持恆定的位置。在另一實施方式中，本發明包含至少1、至少2、至少3、至少
4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含 至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少 12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、 至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個經歷限制性隨機 化的位置，還包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少 2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、 至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至 少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30個隨機化的位置，和至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5或至少6個環，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30個維持恆定的位置。本發明還提供包含環序列多樣性的支架。在一個實施方式中，本發明包含至少一 個環，其含有至少一個隨機化的位置。在另一實施方式中，本發明包含至少一個環，其含有 至少一個隨機化的位置，還包含至少一個維持恆定的位置。在另一實施方式中，本發明包含 環，其包含至少一個經歷限制性隨機化的位置。在另一實施方式中，本發明包含至少一個 環，其包含至少一個經歷限制性隨機化的位置，還包含至少一個維持恆定的位置。在另一實 施方式中，本發明包含至少一個環，其包含至少一個經歷限制性隨機化的位置，還包含至少 一個隨機化的位置和至少一個維持恆定的位置。在一個實施方式中，本發明包含至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五 個或至少六個序列長度和多樣性隨機化的環。在一個實施方式中，本發明包含序列長度和 多樣性隨機化的AB環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC環。 本發明包含序列長度和多樣性隨機化的CD環。本發明包含序列長度和多樣性隨機化的DE 環。本發明包含序列長度和多樣性隨機化的EF環。本發明包含序列長度和多樣性隨機化 的re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB和BC環。在另一實 施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB和CD環。在另一實施方式中，本發明 包含序列長度和多樣性隨機化的AB和DE環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和 多樣性隨機化的AB和EF環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的 AB和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC和CD環。在另 一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC和DE環。在另一實施方式中，本 發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC和EF環。在另一實施方式中，本發明包含序列長 度和多樣性隨機化的BC和re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機 化的CD和DE環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的CD和EF環。 在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的CD和re環。在另一實施方式 中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包含序 列長度和多樣性隨機化的DE和re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性 隨機化的EF和re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC和CD環。在另 一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC和DE環。在另一實施方式 中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC和EF環。在另一實施方式中，本發明包 含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC和re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和 多樣性隨機化的AB、CD和DE環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化 的AB、CD和EF環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、CD和TO 環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、DE和EF環。在另一實 施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、DE和TO環。在另一實施方式中，本 發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列 長度和多樣性隨機化的BC、CD和DE環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性 隨機化的BC、CD和EF環在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、CD
44和re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、DE和EF環。在 另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、DE和re環。在另一實施方式 中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、EF和re環。在另一實施方式中，本發明包 含序列長度和多樣性隨機化的CD、DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和 多樣性隨機化的CD、DE和re環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化 的CD、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的DE、EF和 FG環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD和DE環。 在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD和EF環。在另一實 施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD和re環。在另一實施方式中， 本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、⑶、DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包 含序列長度和多樣性隨機化的AB、CD、DE和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列長 度和多樣性隨機化的AB、CD、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣 性隨機化的AB、DE、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化 的BC、CD、DE和EF環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、CD、 DE和TO環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、CD、EF和TO 環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、DE、EF和TO環。在另 一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的CD、DE、EF和TO環。在另一實施方式中，本發明包序列長度和多樣性隨機化的含AB、BC、⑶、DEjP EF 環。在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD、DE、和TO環。 在另一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、CD、DE、EF和TO環。在另 一實施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、DE、EF和TO環。在另一實 施方式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD、EF和TO環。在另一實施方 式中，本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD、EF、和TO環。在另一實施方式中， 本發明包含序列長度和多樣性隨機化的AB、BC、CD、DEJP EF環。在另一實施方式中，本發 明包含序列長度和多樣性隨機化的BC、⑶、DE、EF和TO環。6. 8支架偶聯物本發明包括利用偶連或融合於一個或多個部分支架，所述部分包括但不限於肽、 多肽、蛋白質、融合蛋白、核酸分子、小分子、模擬試劑、合成藥物、無機分子和有機分子。本 發明包括利用重組融合或化學偶連(包括共價和非共價偶連)於異源蛋白質或多肽(或其 片段，至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至 少80個、至少90或至少100個胺基酸的多肽)的支架，從而產生融合蛋白。這種融合無需 直接進行，而可以通過本文所述的接頭序列發生。例如，可通過將支架融合或偶連於特定細 胞表面受體的特異性抗體，在體外或體內利用支架將異源靶多肽靶向特定細胞類型。還可 將融合或偶連於異源多肽的支架用於採用本領域已知方法的體外免疫測定和純化方法中， 參見,例如國際公布號WO 93/21232 ；歐洲專利號EP439, 095 ；Naramura等，1994，Immunol. Lett. 39 91-99 ；美國專利號 5，474，981 ；Gillies 等，1992，PNAS 89 1428-1432 ；和 Fell 等，1991，J. Immunol. 146 :2446_2452，它們通過引用全文納入本文。可通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統稱為「DNA改組」)的技術產生包含本發明支架的其它融合蛋白。可採用DNA改組來改變本發明支 架的活性(例如，具有較高親和力和較低解離速率的支架)。一般可參見，美國專利號 5，605，793 ；5，811，238 ；5，830，721 ；5，834，252 和 5，837，458 ；Patten 等，1997，Curr. Opinion Biotechnol. 8 724-33 ；Harayama,1998, Trends Biotechnol. 16(2) :76_82 ； Hansson 等，1999， J. Mol. Biol. 287 265-76 ；Lorenzo 禾口 Blasco，1998，BioTechniques 24(2) :308-313(各份專利和出版物通過引用全文納入本文)。先通過易錯PCR、隨機核苷 酸插入或其它方法進行隨機誘變，再重組來改變支架，或者其編碼的支架。可將編碼特異性 結合靶標的支架的多核苷酸的一個或多個部分與一種或多種異源分子的一個或多個組分、 基序、區段、部分、結構域、片段等重組(recombine)。此外，可將本發明支架與標記序列，例如肽融合以促進純化。在某些實施方式中， 標記胺基酸序列是六_組氨酸肽(his-標籤)，例如，加利福尼亞州查塔沃斯市恰根公司 (QIAGEN, Inc.，9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif.，91311)的 pQE 載體中提供的標籤 等，其中許多標記可商品化購得。如Gentz等(1989，PNAS，86 :821-824)中所述，六-組氨 酸為純化融合蛋白提供了便利。可用於純化的其它肽標籤包括但不限於對應於衍生自流 感血凝素蛋白某表位的血凝素「HA」標籤(Wilson等，Cell, 37 767)和「flag」標籤。在其它實施方式中，可將本發明支架、其類似物或衍生物與診斷或可檢測試劑偶 連。可利用這種支架作為臨床檢驗方法的一部分來監測或預後疾病的發生或進展，例如測 定具體療法的效力。可將支架與可檢測物質偶聯來實現這種診斷和檢測，所述可檢測物質 包括但不限於各種酶，例如但不限於辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙 醯膽鹼酯酶；輔基，例如但不限於鏈黴親和素/生物素及親和素/生物素；螢光材料，例如 但不限於傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪基胺螢光素(dichlorotriaz inylaminefluorescein)、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料，例如但不限於魯米諾；生物發 光物質，例如但不限於螢光素酶、螢光素和水母蛋白；放射性物質，例如但不限於碘(1311、 1251、1231、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115ln、113ln、112ln、mln)、鎝(99Tc)、鉈(2tllTi)、鎵 (6W7Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y、47Sc、186Re J88ReJ42PiNic15RtK97Riu68Gh57CcK65ZrK85SiN32Pj53GcU169YlK51CiN54MrK75SeJ13SrK 和117Tn ；用於各種正電子發射斷層顯像的正電子發射金屬和非放射性順磁金屬離子，以及 作放射性標記或偶連於特定放射性同位素的分子。本發明還包括利用與治療性部分偶連的支架。可將支架與治療性部分，例如 細胞毒素，如抑制細胞或殺細胞藥物，治療性藥物或放射性金屬離子，如α-(射線)發 射體偶連。細胞毒素或細胞毒性藥物可以是對細胞有害的任何藥物。治療性部分包括 但不限於抗代謝劑(如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、 達卡巴嗪)、烷化劑(如雙氯乙基甲胺、塞替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司 汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C和 順二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環黴素類(如道諾比星(以前稱為道諾黴素)和多 柔比星)、抗生素(如放線菌素d(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素和氨茴黴 素(AMC))、耳他汀分子(如耳他汀PHE、苔蘚抑素1和索拉他汀liKsolastatin 10)；參 B Woyke 等，Antimicrob. Agents Chemother. 46 3802-8 (2002), Woyke 等，Antimicrob. AgentsChemother. 45 3580-4 (2001)，Mohammad 等，Anticancer Drugs 12 735-40 (2001)，Wall 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 76-80 (1999)，Mohammad 等，Int. J. Oncol. 15 367-72 (1999)，所有通過引用納入本文)、激素(如糖皮質激素類、孕激素、雄激素和雌激 素)、DNA修復酶抑制劑(如依託泊甙或拓撲替康)、激酶抑制劑(如化合物T1571、甲磺 酸伊馬替尼(Kantaijian 等，Clin Cancer Res. 8(7) :2167_76 (2002))、細胞毒劑(如紫 杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊甙、替尼泊甙、長春新鹼、 長春鹼、秋水仙素、多柔比星、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米託蒽醌、光神黴素、放線 菌素D、l-去氫睪酮、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素和它們的類似物 或同源物)以及美國專利號 6，245，759,6, 399，633,6, 383，790,6, 335，156,6, 271，242、 6，242，196,6，218，410,6，218，372,6，057，300,6，034，053,5，985，877,5，958，769, 5，925，376,5，922，844,5，911，995,5，872，223,5，863，904,5，840，745,5，728，868, 5，648，239,5, 587，459中公開的化合物)、法呢基轉移酶抑制劑(如R115777、BMS-214662 和美國專利號 6，458，935、6，451，812、6，440，974、6，436，960、6，432，959、6，420，387、
6，414，145,6,410，541、6，410，539、6，403，581,6，399，615、6，387，905、6，372，747、6，369，034,6，362，188、6，342，765、6，342，487,6，300，501、6，268，363、6，265，422、6，248，756,6,239，140、6，232，338、6，228，865,6，228，856、6，225，322、6，218，406、6，211，193,6,187，786、6，169，096、6，159，984,6，143，766、6，133，303、6，127，366、6，124，465,6，124，295、6，103，723、6，093，737,6，090，948、6，080，870、6，077，853、
6，071，935,6, 066，738,6, 063，930,6, 054，466,6, 051，582,6, 051，574 和 6，040，305 中公
開的化合物)、拓撲異構酶抑制劑(如喜樹鹼；伊立替康；SN-38 ；拓撲替康；9-氨基喜樹 鹼；GG-211(GI 147211) ；DX_8951f ；IST-622 ；盧比替康；卩比唑啉吖啶；XR-5000 ；賽託品 (saintopin) ；UCE6 ；UCE1022 ；TAN-1518A ；TAN-1518B ；KT6006 ；KT6528 ；ED-110 ；NB-506 ； ED-110 ；NB-506 ；和羅貝黴素(rebeccamycin))；布各雷(bulgarein) ；DNA 小溝結合劑如 Hoescht染料33342和Hoechst染料33258 ；兩面針鹼；花椒寧鹼；表小檗鹼；甲氧檗因； β-拉帕醌；BC-4-1 ；二膦酸鹽(如阿侖膦酸鹽、西馬膦酸鹽(cimadronte)、氯屈膦酸鹽、 替魯膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、奈立膦酸鹽、奧帕膦酸鹽(olpandronate)、利塞膦 酸鹽、吡膦酸鹽、帕米膦酸鹽、坐萊膦酸鹽(zolendronate))、HMG-CoA還原酶抑制劑(如 洛伐他汀、辛伐他汀、阿託伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、他汀、西立伐他汀、來適可、魯匹妥 (Iupitor)、羅蘇伐他汀和阿託伐他汀)和其藥學上可接受的鹽、溶劑化物、包合物和前藥 (參見例如 Rothenberg，Μ. L.，Annals of Oncology 8 :837_855 (1997)；禾口 Moreau，P.等， J. Med. Chem. 41 :1631-1640 (1998))，反義寡核苷酸(如美國專利號 6，277，832,5, 998，596、 5，885，834,5, 734，033和5，618，709公開的物質)，免疫調節劑(如抗體和細胞因子)、抗 體和腺苷脫氨酶抑制劑(如磷酸氟達拉濱和2-氯脫氧腺苷)。例子包括紫杉醇、松胞菌 素B、短桿菌肽D、溴乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊甙、替尼泊甙、長春新鹼、長春鹼、秋水 仙素、多柔比星、道諾黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米託蒽醌、光神黴素、放線菌素D、l-去氫 睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素和它們的類似物或同 源物。治療劑包括但不限於抗代謝劑(如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、 5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷化劑(如雙氯乙基甲胺、塞替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法 侖、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴 素C和順二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環黴素類(如道諾比星(以前稱為道諾黴素)和多柔比星)、抗生素(如放線菌素d(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素和氨茴黴素 (AMC))、耳他汀分子(如耳他汀PHE、苔蘚抑素1和索拉他汀10 ；參見Woyke等，Antimicrob. Agents Chemother. 46 3802-8 (2002)， Woyke 等，Antimicrob. Agents Chemother. 45 3580-4(2001)，Mohammad 等，Anticancer Drugs 12 :735_40 (2001)，Wall 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 :76_80(1999)，Mohammad 等，Int. J. Oncol. 15 :367_72 (1999)，所 有通過引用納入本文)、抗有絲分裂劑(例如，長春新鹼和長春鹼)、激素(如糖皮質激素類、 孕激素、雄激素和雌激素)、DNA修復酶抑制劑(如依託泊甙或拓撲替康)、激酶抑制劑(如 化合物 T1571、甲磺酸伊馬替尼(Kantaijian 等，Clin Cancer Res. 8(7) :2167_76 (2002)) 以及美國專利號 6，245，759,6, 399，633,6, 383，790,6, 335，156,6, 271，242,6, 242，196、 6，218，410,6，218，372,6，057，300,6，034，053,5，985，877,5，958，769,5，925，376, 5，922，844,5，911，995,5，872，223,5，863，904,5，840，745,5，728，868,5，648，239, 5，587，459中公開的化合物)、法呢基轉移酶抑制劑(如R115777、BMS-214662和美國專
利號6，458，935,6, 451，812、6:,440,974,6,436，960,6,432，959,6, 420, 387,6，414:,145、6，410，541,6,410，539、6:,403，581、6，399:』 615、6，387，905,6，372，747,6，369，034、6，362，188,6,342，765,6;,342，487、6，300:』 501、6，268，363,6，265，422,6，248，756、6，239，140,6,232，338,6;,228，865、6，228;,856、6，225，322,6，218，406,6，211，193、6，187，786,6,169，096,6,,159，984、6，143;,766、6，133，303,6，127，366,6,124，465、6，124，295,6，103，723,6,,093，737、6，090;,948、6，080，870,6，077，853,6，071，935、
6，066，738,6, 063，930,6, 054，466,6, 051，582,6, 051，574和 6，040，305 中公開的化合物)、
拓撲異構酶抑制劑(如喜樹鹼；伊立替康；SN-38 ；拓撲替康；9-氨基喜樹鹼；GG-21KGI 147211) ；DX-8951f ；IST-622 ；盧比替康；吡唑啉吖啶；XR-5000 ；賽託品(saintopin)； UCE6 ；UCE1022 ；TAN-1518A；TAN-1518B；KT6006 ；KT6528 ；ED-110 ；NB-506 ；ED-110 ；NB-506 ； 和羅貝黴素(rebeccamycin))；布各雷(bulgarein) ；DNA小溝結合劑如Hoescht染料33342 和Hoechst染料33258 ；兩面針鹼；花椒寧鹼；表小檗鹼；甲氧檗因；β _拉帕醌；BC-4-1 ；和 它們藥學上可接受的鹽、溶劑化物、包合物和前藥(參見例如Rothenberg，M. L.，Annals of Oncology 8:837-855(1997)；和 Moreau，P.等，J. Med. Chem. 41 1631-1640 (1998))，反義寡 核苷酸(如美國專利號 6，277，832,5, 998，596,5, 885，834,5, 734，033 和 5，618，709 公開的 物質)，免疫調節劑(如抗體和細胞因子)、抗體(例如，利妥昔單抗(Rituxan )、刺孢黴素 (Mylotarg 、伊利圖莫單抗(ibritumomab)圖西坦(tiuxetan) (Zevalin )和託西莫單抗 (Bexxar ))和腺苷脫氨酶抑制劑(如磷酸氟達拉濱和2-氯脫氧腺苷)。
此外，可將支架與能改進給定的生物學反應的治療性部分或藥物部分偶聯。治療 性部分或藥物部分不應理解為僅限於典型的化療藥物。例如，藥物部分可以是具有所需 生物學活性的蛋白質或多肽。這種蛋白質可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋 白A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白質，如腫瘤壞死因子、α-幹擾素、β-幹 擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、凋亡物質(如TNF-α、 TNF-β ), AIM I (參見國際公布號WO 97/33899)、AIM II (參見國際公布號WO 97/34911)、 Fas 配體(Takahashi 等，1994，J. Immunol.，6 1567-1574)和 VEGI (參見國際公布號 W099/23105)；血栓形成劑或抗血管新生藥物，例如血管抑制素、內皮抑制素或凝血途徑 (coagulation pathway)的組分(如組織因子)；或生物反應修飾劑，如淋巴因子(如白介素-1( 「IL-1」)、白介素-2( 「IL-2」)、白介素_6( 「IL-6」)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子 (「GM-CSF」)和粒細胞集落刺激因子(「G-CSF」))、生長因子(如生長激素(「GH」))、或 凝血藥物(如鈣、維生素K、組織因子，例如但不限於Hageman因子(因子XII)、高分子量激 肽原(HMWK)、前激肽釋放酶(PK)、凝血蛋白因子II (凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、 XI、XIa、IX、IXa、X、血纖蛋白原的α和β鏈的磷脂血纖肽A和B、血纖蛋白單體)。還可將支架偶聯於治療性部分如放射性金屬離子，如α _發射體(如213Bi)或用於 將放射性金屬離子，包括但不限於131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm與多肽偶聯的大環螯合劑。在 某些實施方式中，所述大環螯合劑是可經接頭分子與支架相連的1，4，7，10_四氮雜環十二 烷-N，N'，N"，N"『-四乙酸(DOTA)。本領域公知這種接頭分子，參見Denardo等，1998， Clin Cancer Res. 4(10) 2483-90 ；Peterson φ, 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4) 553-7 ； Zimmerman等，1999，Nucl. Med. Biol. 26(8) :943_50，各篇文獻通過引用全文納入本文。將治療性部分偶聯於抗體的技術是熟知的，參見例如Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，，(癌症治療中用於藥 物的免疫靶向的單克隆抗體)，刊於Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy (《單 克隆抗體和癌症治療》)，Reisfeld等編，第243-56頁，(奧蘭李斯公司(Alan R. Liss, Inc.) 1985) ；Hellstrom 等，「Antibodies For DrugDelivery，，(用於藥物遞送的抗體)， 刊於Controlled Drug Delivery(《受控藥物遞送》)，(第二版)，Robinson等編，第 623-53 頁，(馬賽爾戴克公司(Marcel Dekker, Inc.) 1987) ；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review」(癌症治療中的細胞毒性藥物 的抗體運載體綜述)，刊於 MonoclonalAntibodies 『84 biological And Clinical Applications (《單克隆抗體『84 生物學和臨床應用》)，Pinchera等編，第475-506頁， (1985) ；"Analysis, Results, AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy」(癌症治療中放射性標記抗體的治療性應 用)，幹1J於MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy (《用於癌症檢測禾口 治療的單克隆抗體》)，Baldwin等編，第303-16頁，(學術出版社(Academic Press) 1985) 禾口 Thorpe 等，1982，Immunol. Rev. 62 :119-58。應選擇偶聯於支架的治療性部分或藥物，從而在對象中實現對具體疾病的所需預 防或治療作用。決定將哪種治療性部分或藥物偶聯於支架時，醫生或其他醫務人員應考慮 以下情況疾病的性質、疾病的嚴重程度和對象的情況。本發明支架也可連接於固體支持物，該固體支持物尤其可用於靶抗原的免疫測得 或純化。這種固體支持物包括但不限於玻璃、纖維素、聚丙烯醯胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙 烯或聚丙烯。6. 9 製備重組表達本發明支架需要構建含有編碼該支架的多核苷酸的表達載體。一旦獲得 編碼支架的多核苷酸，可採用本領域熟知的技術通過重組DNA技術製備用於產生支架的載 體。因此，本文描述了通過表達含有支架編碼核苷酸序列的多核苷酸來製備蛋白的方法。可 採用本領域技術人員熟知的方法構建含有支架多肽編碼序列及合適的轉錄和翻譯控制信 號的表達載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術、合成技術和體內基因重組。因此， 本發明提供了包含編碼本發明支架的操作性連接於啟動子的核苷酸序列的可複製載體。
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通過常規技術將表達載體轉入宿主細胞，並通過常規技術培養轉染細胞以產生本 發明支架。因此，本發明包括含有編碼本發明支架的操作性連接於異源啟動子的多核苷酸 的宿主細胞。合適的宿主細胞包括但不限於微生物，例如細菌(如大腸桿菌(E. coli)和枯 草芽胞桿菌(B. subtilis))。可利用各種宿主表達載體系統來表達本發明支架。這種宿主表達系統提供產生 感興趣編碼序列，隨後將其純化的運載體，但也提供了用合適的核苷酸編碼序列轉化或轉 染時能原位表達本發明支架的細胞。這些系統包括但不限於微生物，例如用含有支架編 碼序列的重組細菌噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA表達載體轉化的細菌(如大腸桿菌 和枯草芽胞桿菌)；用含有支架編碼序列的重組酵母菌表達載體轉化的酵母菌(如酵母 (Saccharomyces)，畢赤酵母(Pichia))；用含有支架編碼序列的重組病毒表達載體(例如， 杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用含支架編碼序列的重組病毒表達載體(例如，花椰菜花 葉病毒，CaMV ；菸草花葉病毒，TMV)感染或用含支架編碼序列的重組質粒表達載體(例如， Ti質粒)轉化的植物細胞系統；或包含含有源自哺乳動物細胞基因組的啟動子(如金屬硫 蛋白啟動子)或源自哺乳動物病毒的啟動子(如腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7. 5K啟動 子)的重組表達構建物的哺乳動物細胞系統(如COS、CHO、BHK,293, NSO和3T3細胞)。可通過三種通用方法鑑定含有編碼本發明支架的基因插入物的表達載體(a)核 酸雜交，(b) 「標記」基因功能的存在或不存在，和(c)所插入序列的表達。在第一方法中， 可分別利用包含的序列與編碼肽、多肽、蛋白質或融合蛋白的插入基因同源的探針，通過核 酸雜交檢測表達載體中是否存在編碼肽、多肽、蛋白質或融合蛋白的基因。在第二方法中， 可根據載體中編碼抗體或融合蛋白的核苷酸序列插入所致某些「標記」基因功能(例如，胸 苷激酶活性、對抗生素的耐受性、轉化表型、杆狀病毒中形成包含體等)是否存在來鑑定和 選擇重組載體/宿主系統。例如，如果編碼支架的核苷酸序列插入載體的標記基因序列內， 可通過標記基因功能不存在來鑑定含有編碼支架的插入基因的重組體。在第三方法中，可 通過檢驗該重組體表達的基因產物(例如，支架或其多聚體)鑑定重組表達載體。這種使 用可以基於，例如蛋白質在體外試驗系統中的物理和功能特性，如該支架的結合、激動或拮 抗特性。在一些實施方式中，至少可部分化學合成本發明支架。在其它實施方式中，可半合 成製備本發明支架。6. 10支架純化一旦通過重組表達產生了本發明支架，可通過蛋白質純化領域已知的任何方法來 純化，例如層析(如，金屬螯合層析、離子交換、親和力和分子大小柱層析)、離心、差別溶解 性或蛋白質純化的任何其它標準技術。本發明支架的高度穩定性質能允許改變純化方案。例如，本發明支架所顯示的熱 穩定性允許加熱包含支架的粗製裂解液，從而通過變性除去主要的宿主細胞蛋白。在另一 實施方式中，本發明支架顯示的高度蛋白酶耐受性允許在任何純化步驟之前快速降解粗製 裂解液中的宿主細胞蛋白。本發明支架顯示的PH耐受性還允許在任何純化步驟之前通過 降低或升高PH來選擇性沉澱粗製裂解液中的宿主細胞蛋白。在一些實施方式中，通過高溫 轉變、蛋白酶處理、PH上調或下調或以上任意的組合以圖除去粗製裂解液中主要的宿主細 胞蛋白來促進純化本發明支架。在一些實施方式中，熱變性、蛋白酶處理或PH改變後剩餘的蛋白質是至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至 少85 %、至少90 %、或至少95 %的特異性支架蛋白。在一些實施方式中，純化支架的方法包括將含有所述支架的粗製裂解液的pH降 低至約6. 5、或約6. 0、或約5. 5、或約5. 0、或約4. 5、或約4. 0、或約3. 5、或約3. 0、、或約2. 5、 或約2.0以圖沉澱宿主細胞蛋白。在其它實施方式中，純化方法包括將含有所述支架的粗 制裂解液的PH升高至約8. 0、或約8. 5、或約9. 0、或約9. 5、或約10. 0、或約10. 5、或約11. 0、 或約11. 5、或約12.0、或約12.5以圖沉澱宿主細胞蛋白。6. 11支架的放大生產為大量獲得，可通過放大工藝(下文稱為「本發明的放大工藝」)製備本發明支架。 在一些實施方式中，可通過本發明的放大工藝在研究實驗室中產生支架，該工藝可放大從 而在分析級生物反應器中(例如但不限於51^、1(^、151^、3(^或5(^生物反應器)產生本發 明支架。在其它實施方式中，可通過本發明的放大工藝在研究實驗室中產生支架，該工藝可 放大從而在生產規模的生物反應器中(例如但不限於75L、100L、150L、300L或500L生物 反應器)產生本發明支架。在一些實施方式中，與在研究實驗室中進行的生產工藝相比，本 發明的放大工藝不導致或幾乎不導致生產率降低。在一些實施方式中，本發明的放大工藝以約lg/L、約2g/L、約3g/L、約5g/L、約 7. 5g/L、約 10g/L、約 12. 5g/L、約 15. Og/L、約 17. 5g/L、約 20g/L、約 25g/L、約 30g/L 或更高 的生產率產生支架。在其它實施方式中，本發明的放大工藝以約10g/L-約300g/L、約10g/L_約250g/ L、約 10g/L-約 200g/L、約 10g/L-約 175g/L、約 10g/L-約 150g/L、約 10g/L-約 100g/L、約 20g/L-約 300g/L、約 20g/L-約 250g/L、約 20g/L_ 約 200g/L, from 20g/L_ 約 175g/L、約 20g/L-約 150g/L、約 20g/L-約 125g/L、約 20g/L_ 約 100g/L、約 30g/L_ 約 300g/L、約 30g/ L-約 250g/L、約 30g/L-約 200g/L、約 30g/L_ 約 175g/L、約 30g/L_ 約 150g/L、約 30g/L_ 約 125g/L、約 30g/L-約 100g/L、約 50g/L_ 約 300g/L、約 50g/L_ 約 250g/L、約 50g/L_ 約 200g/ L、50g/L-約 175g/L、約 50g/L_ 約 150g/L、約 50g/L_ 約 125g/L 或約 50g/L_ 約 lOOg/L 的生 產率產生支架。在一些實施方式中，本發明的放大工藝以約10mg/L、約20m/L、約30mg/L、約50mg/ L、約 75mg/L、約 100mg/L、約 125mg/L、約 150mg/L、約 175mg/L、約 200mg/L、約 250mg/L、約 300mg/L或更高的生產率產生多聚支架。在其它實施方式中，本發明的放大工藝以至少約10mg/L、至少約20m/L、至少約 30mg/L、至少約50mg/L、至少約75mg/L、至少約100mg/L、至少約125mg/L、至少約150mg/L、 至少約175mg/L、至少約200mg/L、至少約250mg/L、至少約300mg/L或更高的生產率產生多 聚支架。在其它實施方式中，本發明的放大工藝以約10mg/L-約300mg/L、約10mg/L_約 250mg/L、約 10mg/L-約 200mg/L、約 10mg/L-約 175mg/L、約 10mg/L-約 150mg/L、約 IOmg/ L-約 100mg/L、約 20mg/L-約 300mg/L、約 20mg/L_ 約 250mg/L、約 20mg/L_ 約 200mg/L、20mg/ L-約 175mg/L、約 20mg/L_ 約 150mg/L、約 20mg/L_ 約 125mg/L、約 20mg/L_ 約 100mg/L、約 30mg/L-約 300mg/L、約 30mg/L_ 約 250mg/L、約 30mg/L_ 約 200mg/L、約 30mg/L_ 約 175mg/ L、約 30mg/L-約 150mg/L、約 30mg/L_ 約 125mg/L、約 30mg/L_ 約 100mg/L、約 50mg/L_ 約300mg/L、約 50mg/L-約 250mg/L、約 50mg/L-約 200mg/L、50mg/L-約 175mg/L、約 50mg/L_ 約 150mg/L、約50mg/L-約125mg/L或約50mg/L_約100mg/L的生產率產生多聚支架。6. 12產生分泌型支架本發明還提供胞內產生支架或以分泌形式產生支架的方法。在一些實施方式中， 分泌型支架的產生水平如本文所述。在其它實施方式中，分泌型支架適當摺疊並完全功能 化。在其它實施方式中，分泌型支架的產生包括利用Ptac啟動子。在其它實施方式中，分 泌型支架的產生包括利用oppA信號。在還有其它實施方式中，分泌型支架在原核宿主細胞 中表達。在進一步的實施方式中，支架分泌入原核宿主細胞的周質空間。在還有其它實施 方式中，支架直接分泌入培養基。在還有進一步的實施方式中，可從粗製細胞培養液或周質 提取物篩選支架。本發明還提供利用蛋白質支架分泌串聯蛋白質或融合物的方法。在一些實施方式 中，本發明支架可用作將肽和/或蛋白質分泌入細胞培養基或原核細胞周質空間中的運載 體分子。在另一實施方式中，純化本發明支架的方法包括將包含所述支架的粗製裂解液加 熱至70°C，15分鐘，隨後通過離心除去凝聚的化合物。在其它實施方式中，純化本發明支 架的方法包括將包含所述支架的粗製裂解液加熱至約50°C、約55°C、約60°C、約65°C、約 70°C、約75°C、約80°C、約85°C或約90°C，隨後通過離心除去凝聚的化合物。在其它實施方 式中，純化本發明支架的方法包括將粗製裂解液加熱至少約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約 4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘、約11分鐘、約12分 鍾、約13分鐘、約14分鐘、約15分鐘、約20分鐘或約30分鐘，隨後通過離心除去凝聚的化 合物。在另一具體實施方式
中，純化本發明支架的方法包括將粗製裂解液的pH改變至 3. 0，將包含所述支架的粗製裂解液在70°C加熱15分鐘，然後通過離心除去凝聚的化合物。6. 13檢驗支架可通過本領域已知的任何方法檢驗本發明支架與靶標的特異性結合。可採用的代 表性試驗包括但不限於採用例如以下技術的競爭性和非競爭性試驗系統蛋白質印跡、放 射性免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、「夾心"免疫測定、免疫沉澱試驗、沉澱反應、 凝膠擴散沉澱毒反應、免疫擴散試驗、凝集試驗、補體結合試驗、免疫放射測得、螢光免疫測 定，等等。這些試驗是本領域已知的常規試驗(參見，例如Ausubel等編，1994，最新分子生 物學方法，第1卷，約翰威利父子公司，紐約)。ELISA包括製備抗原(例如，支架)、用抗原包被96孔微量滴定板的孔、將偶連於 可檢測化合物，例如酶底物(如辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶)的感興趣表位結合蛋白 (例如，支架特異性抗體)加入孔中、溫育一定時期並檢測抗原是否存在。在ELISA中，感興 趣的表位結合蛋白不偶連於可檢測化合物，而可向孔中加入偶連於可檢測化合物的第二抗 體(識別感興趣的蛋白質)。此外，可將感興趣的蛋白質包被孔，而不是用抗原包被孔。在 該情況中，可加入偶聯於可檢測化合物的第二抗體，然後向包被的孔中加入感興趣抗原。本 領域技術人員應知道可作出改變以增加所檢測信號的參數以及本領域已知的ELISA的其 它改進形式。ELISA的其它討論參見，例如Ausubel等編，1994，最新分子生物學方法，第1 卷，約翰威利父子公司，紐約，11. 2. 1。
可通過本領域已知的各種體外試驗方法測得支架對抗原的結合親和力和其它結 合特性，包括例如平衡方法(如酶聯免疫吸附測定(ELISA;或放射性免疫測定(RIA))、或 動力學方法(如BIACORE 分析)和其它方法，例如間接結合試驗、競爭性結合試驗、熒 光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳和色譜(如凝膠過濾)。這些和其它方法可採用檢測一 個或多個組分上的標記和/或採用各種檢測方法，例如但不限於生色、螢光、發光或同位素 標記。結合親和力和動力學的詳述見Paul，W. E.編，Fundamental Immunology (基礎免疫 學)，第 4 版，L&R 公司(Lippincott-Raven)，費城(1999)。可通過許多不同方法增加本發明支架的穩定性。在一個實施方式中，本發明支架 包含非天然產生的二硫鍵，如本文所述。在另一實施方式中，本發明支架包含N和/或C末 端區域的延伸段。在另一實施方式中，本發明支架包含至少一個胺基酸殘基的添加、缺失或 取代以便調節支架的表面電荷。在另一實施方式中，本發明支架包含改變以增加血清半衰 期，如本文所述。在還有另一實施方式中，本發明支架包含至少一個胺基酸殘基的添加、缺 失或取代以便穩定支架的疏水核。可通過許多不同技術評估本發明支架的穩定性。選擇本領域已知的技術包括解鏈 溫度、示差掃描量熱法(DSC)、圓二色性(⑶)、聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)、蛋白酶耐受性、 等溫量熱法(ITC)、核磁共振(NMR)、固有螢光和生物學活性。在一個實施方式中，與工程改 造前的同一支架相比，本發明的工程改造支架顯示穩定性增加。6. 14藥物組合物在另一方面，本發明通過組合物，例如但不限於含有本發明支架或靶標結合蛋白 中的一種或組合，用藥學上可接受的運載體配製在一起的藥物組合物。這種組合物可包含 本發明不同支架中的一種或組合，例如但不限於兩種或更多種。例如，本發明的藥物組合物 可包含結合靶抗原上不同表位或具有互補活性的支架組合。本發明的藥物組合物還可在組合治療中，例如與其它藥劑組合給予。例如，組合治 療可包括本發明支架與至少一種其它治療相組合，其中所述治療可以是免疫治療、化療、放 療或藥物治療。本發明的藥物組合物可包含一種或多種藥學上可接受的鹽。此類鹽的例子包括酸 加成鹽和鹼加成鹽。酸加成鹽包括那些源自無毒性無機酸，如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴 酸、氫碘酸和亞磷酸等的鹽，以及源自無毒性有機酸，如脂族單和二羧酸、苯基取代的鏈烷 酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等的鹽。鹼加成鹽包括衍生自鹼土金屬，例如鈉、 鉀、鎂、鈣等的鹽，以及衍生自無毒有機胺，如N，N' -二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯 卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺和普魯卡因等的鹽。本發明的藥物組合物也可包含藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化 劑包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫 酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基 甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四 乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。用於本發明藥物組合物中的水性和非水性運載體的例子包括水、乙醇、多元醇 (如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它們的合適混合物，植物油如橄欖油，以及可注射的有機 酯，如油酸乙酯。可利用塗覆材料如卵磷脂，在分散體的情況中通過保持所需粒度，和使用
53表面活性劑來維持合適的流動性。這些組合物還可包含輔料，如防腐劑、溼潤劑、乳化劑和分散劑。可通過滅菌方法 和加入各種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇和苯酚山梨酸等確保防止 存在微生物。組合物中包含等滲劑，如糖、氯化鈉等也是理想的。此外，可通過加入能延緩 吸收的物質，例如單硬脂酸鋁和明膠實現可注射藥物形式的長期吸收。在製備和儲存條件下，藥物組合物通常必須無菌和穩定。可將組合物製成適合高 藥物濃度的溶液、微乳劑、脂質體或其它有序結構。運載體可以是含有，例如水、乙醇、多元 醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及它們的合適混合物的溶劑或分散介質。可利用 塗覆材料如卵磷脂，在分散體的情況中通過保持所需粒度和使用表面活性劑來維持合適的 流動性。在許多情況中，組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉的 合適的。組合物中包含延遲吸收的試劑如單硬脂酸鹽和明膠可延長可注射組合物的吸收。可視需要將所需量的活性化合物和上述組分中的一種或組合摻入合適溶劑，隨後 滅菌和微過濾來製備無菌注射液。通常將活性活化物摻入含有基礎分散介質和上述其它所 需成分的無菌載體中來製備分散劑。在用於無菌注射液製備的無菌粉末情況中，優選的制 備方法是真空乾燥和冷凍乾燥(凍幹)，從之前無菌過濾的溶液得到活性組分和任何其它 所需組分的粉末。在一個實施方式中，本發明組合物(例如，液體製劑)是基本不含內毒素和/或相 關熱原物質的無熱原製劑。內毒素包括局限在微生物內並且在微生物破壞或死亡時釋放 的毒素。熱原也包括來自細菌和其它微生物外膜的誘導發熱的熱穩定性物質(糖蛋白)。 如果給予人，這些物質均可引起發熱、低血壓和休克。因為有潛在的有害作用，優選的做法 是從靜脈內給予的藥物溶液中去除即使含量很低的內毒素。食品藥品管理局(「FDA") 規定在靜脈內藥物應用的一小時期間，上限是5內毒素單位(EU)/劑量/千克體重(The United States PharmacopeialConvention, Pharmacopeial Forum(美國藥典大會，藥典論 壇)26(1) =223(2000)) 0當以數百或數千毫克每千克體重的劑量給予治療性蛋白時，最好 去除即使痕量的內毒素。在一個實施方式中，組合物中內毒素和熱原水平低於10EU/mg、或 低於5EU/mg、或低於lEU/mg、或低於0. lEU/mg、或低於0. 01EU/mg、或低於0. 001EU/mg。在 另一實施方式中，組合物中內毒素和熱原水平低於約10EU/mg、或低於約5EU/mg、或低於約 lEU/mg、或低於約 0. lEU/mg、或低於約 0. 01EU/mg、或低於約 0. 001EU/mg。6. 15劑量/給藥為了製備包含本發明支架的藥物或無菌組合物，將支架與藥學上可接受的運載體 或賦形劑混合。可通過與凍乾粉末、漿液、水性溶液、洗劑或懸浮液形式的生理上可接受的 運載體、賦形劑或穩定劑混合製備治療和診斷物質的製劑(參見例如Hardman等(2001) Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basisof Therapeutics (古德曼禾口吉爾曼 治療藥理學基礎)，紐約州紐約的MGH公司(McGraw-Hill，New York,N. Y.) ；Gennaro (2000) Remington :The Science andPractice of Pharmacy (雷明頓藥物科學禾口 實踐)； Lippincott, Williams 和 ffilkins,紐約州紐約；Avis 等(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms :ParenteralMedications (藥物劑型胃腸夕卜藥物)；紐約州 MD 公司(Marcel Dekker, NY) ；Lieberman 等(編)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets(藥物 劑型片劑)，紐約州 MD 公司；Lieberman 等(編)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms Disperse Systems (藥物劑型分散體系)，紐約州 MD 公司；Weiner 和 Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety (賦形劑毒性和安全性)，紐約州紐約的MD公司)。治療劑給藥方案的選擇依據多種因素，包括實體的血清或組織周轉速率、症狀的 水平、實體的免疫原性和生物基質中靶細胞的可接近性。在某些實施方式中，在與可接受的 副作用水平相一致的情況下，給藥方案儘可能增大遞送給患者的治療劑用量。因此，生物遞 送量部分取決於特定實體和所治療症狀的嚴重程度。選擇抗體、細胞因子和小分子的合適 劑量有指南可用(參見例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy (抗體治療)，英國牛津 郡生物科學出版公司(Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK) ；Kresina (編)(1991) MonoclonalAntibodies, Cytokines and Arthritis (單克隆抗體，細胞因子和關節炎)，紐 約MD公司(Marcel Dekker,New York,N. Y.) ；Bach(H) (1993)Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases (自身免疫病中的單克隆抗體和多肽治療)， 紐約 MD 公司(Marcel Dekker, New York, N. Y.) ；Baert 等(2003) NewEngl. J. Med. 348 601-608 ；Milgrom 等(1999)New Engl. J. Med. 341 :1966_1973 ；Slamon 等(2001)New Engl. J. Med. 344 :783_792 ；Beniaminovitz,等(2000)NewEngl. J. Med. 342 :613_619 ；Ghosh 等 (2003) New Engl. J. Med. 348 :24_32 ；Lipsky 等(2000) New Engl. J. Med. 343 1594-1602)。臨床醫生使用本領域已知或懷疑會影響治療或估計會影響治療的參數或因素來 確定合適的劑量。通常，以稍低於最佳劑量的用量開始，然後少量遞增直至相對任何不良副 作用達到所需或最優效果。重要的診斷手段包括檢測如炎症症狀或炎性細胞因子產生水 平。可改變本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平，從而獲得有效實現特定患 者、組成與給藥方式的所需治療應答而對患者無毒的活性成分用量。所選劑量水平取決於 各種藥代動力學因素，包括所用的本發明特定組合物或其脂、鹽、醯胺的活性，給藥途徑，給 藥時間，所用特定化合物的排出率，治療持續時間，與所用特定組合物聯用的其他藥物、化 合物和/或材料，年齡、性別、體重、病症、整體健康狀況、所治療病人的既往醫療史以及醫 學領域熟知的類似因素。本發明支架可通過連續輸注提供，或以如1天、1周或每周1-7次的間隔提供。可通 過靜脈內、皮下、局部、口服、鼻部、直腸、肌肉內、腦內或吸入的方式提供劑量。具體的給藥 方案涉及避免顯著不良副作用的最大劑量或給藥頻率。每周總劑量可以是至少0. 05μ g/kg 體重、至少 0. 2μ g/kg、至少 0. 5μ g/kg、至少 1 μ g/kg、至少 10 μ g/kg、至少 100 μ g/kg、至少 0. 2mg/kg、至少 1. 0mg/kg、至少 2. 0mg/kg、至少 10mg/kg、至少 25mg/kg 或至少 50mg/kg (參 見如 Yang等(2003) New Engl. J. Med. 349 427-434 ；Herold等(2002) New Engl. J. Med. 346 1692-1698 ；Liu 等(1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67 :451_456 ；Portielji 等(20003) Cancer Immunol. Immunother. 52 133-144)。以摩爾/千克體重計,小分子治療劑,例如肽 模擬物、蛋白質支架、天然產物或有機化學物質的所需劑量大致與抗體或多肽的相同。以 摩爾/千克體重計，小分子或支架治療劑的所需血漿濃度大致與抗體相同。該劑量可以是 至少15 μ g、至少20 μ g、至少25 μ g、至少30 μ g、至少35 μ g、至少40 μ g、至少45μ g、至 少50 μ g、至少55 μ g、至少60 μ g、至少65 μ g、至少70 μ g、至少75 μ g、至少80 μ g、至少 85μ g、至少90μ g、至少95 μ g或至少100 μ g。給予對象的劑量可以是至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12 或更多次。
對於本發明支架，給予患者的劑量可以是0. 000 lmg/kg-100mg/kg患者體 重。該齊U 量可以是 0. 0001mg/kg-20mg/kg、0. 0001mg/kg-10mg/kg、0. 0001mg/kg_5mg/ kg、0.0001-2mg/kg、0. 0001-lmg/kg、0. 0001mg/kg-0. 75mg/kg、0. 0001mg/kg-0. 5mg/ kg、0. 0001mg/kg-0. 25mg/kg、0. 0001-0. 15mg/kg、0. 0001-0. 10mg/kg、0. 001-0. 5mg/kg、 0. 01-0. 25mg/kg 或 0. 01-0. lOmg/kg 患者體重。可以用以千克(kg)計的患者體重乘以以mg/kg計的待給予劑量來計算本發明 支架的劑量。本發明支架的劑量可以是150μg/kg患者體重或更少、125μg/kg或更少、 100 μ g/kg或更少、95 μ g/kg或更少、90 μ g/kg或更少、85 μ g/kg或更少、80 μ g/kg或更少、 75 μ g/kg或更少、70 μ g/kg或更少、65 μ g/kg或更少、60 μ g/kg或更少、55 μ g/kg或更少、 50 μ g/kg或更少、45 μ g/kg或更少、40 μ g/kg或更少、35 μ g/kg或更少、30 μ g/kg或更少、 25 μ g/kg或更少、20 μ g/kg或更少、15 μ g/kg或更少、10 μ g/kg或更少、5 μ g/kg或更少、 2. 5 μ g/kg或更少、2 μ g/kg或更少、1. 5 μ g/kg或更少、1 μ g/kg或更少、0. 5 μ g/kg或更少 或0. 5 μ g/kg或更少。本發明支架的單位劑量可以是0. lmg-20mg、0. lmg-15mg、0. lmg_12mg、 0. lmg-10mg、0. lmg-8mg、0. lmg-7mg、0. lmg-5mg、0. 1-2. 5mg、0. 25mg-20mg、0. 25_15mg、 0. 25_12mg、0. 25_10mg、0. 25_8mg、0. 25mg_7mg、0· 25mg_5mg、0· 5mg-2. 5mg、lmg_20mg、 Img-15mg、lmg-12mg、Img-IOmg、lmg_8mg、lmg_7mg、lmg_5mg 或 lmg-2. 5mg。本發明支架的劑量在對象中可達到的血清滴度為至少0. 1 μ g/ml、至少0. 5 μ g/ ml、至少 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ml、至 少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml0或者，本發明支架的劑量在對象中可達到的血清滴度為至少0. 1 μ g/ml、至少 0. 5 μ g/ml、至少 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ ml、至少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至 少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml。可重複給予本發明支架的劑量，給藥間隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30 天、45天、2個月、75天、3個月或至少6個月。特定病人有效量可以根據諸如所治療的病症、病人總體健康、給藥方法途徑和劑 量以及副作用嚴重性等因素而有所不同(參見如Maynard等(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice (藥物臨床試驗質量管理規範SOP手冊)，佛羅裡達州伯克萊屯英 特法姆出版社(Interpharm Press, Boca Raton, Fla. ) ；Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice (藥物實驗室和臨床試驗質量管理規範)，英國倫敦UP公司(Urch Publ. , London, UK)。給藥途徑可以通過，例如局部或皮膚應用、靜脈內注射或輸液、腹膜內、腦內、 肌肉內、眼內、動脈內、腦脊髓內、病損內或緩釋系統或植入物(參見例如Sidman等 (1983)Biopolymers 22 547-556 ；Langer 等(1981)J. Biomed. Mater. Res. 15 167-277 ；Langer(1982)Chem. Tech. 12 98-105 ；Epstein 等(1985)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82 3688-3692 ；Hwang ^ (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034;美國專利號 6，350466和6，316，024)。如果需要，組合物也可含有增溶劑和局部麻醉劑，例如利多卡因 來減輕注射部位的疼痛。此外，也可採用肺部給藥，例如利用吸入器或噴霧器，和用霧化 劑配製。參見例如美國專利號 6，019，968,5, 985，320,5, 985，309,5, 934，272,5, 874，064、 5，855，913、5，290，540 和 4，880，078 ；以及 PCT
發明者B·查科, H·吳, J·斯維斯, M·巴卡 申請人:米迪繆尼有限公司