防治柑橘樹腳腐病的生物農藥及其製備方法與流程
2023-06-13 11:48:51
本發明屬於農藥領域，涉及一種微生物農藥，具體來說涉及一種防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，及其製備方法。
背景技術：
：目前，農業上對植物病蟲害的防治方法主要是化學防治方法，化學防治容易引起抗藥性產生，大量使用時會造成農藥殘留物超標，危害人類及其他生物的生存，引起環境汙染，破壞生態平衡。化學農藥的廣泛應用使公眾越來越擔心其安全性和對環境造成的汙染問題。隨著人們環保意識的增強和對綠色無公害農產品需求的擴大，使得植物病害的生物防治越來越受到人們的關注，生物防治因其具有對環境、生態和人類健康安全的優點，在世界各國得到了廠泛的重視並發揮著越來越重要的作用。生物農藥是指用來防治農林牧業有害生物的生物活體及其代謝產物和轉基因產物，一般分為生物體農藥和生物化學農藥兩大類，其中生物體農藥又分為動物體農藥、植物體農藥和微生物體農藥：生物化學農藥又分為動物源生物化學農藥、植物源生物化學農藥和微生物源生物化學農藥等。目前，利用生物農藥防治植物病害是當今植病界十分活躍的研究領域之一，並已顯示出良好的應用前景。生物農藥是公認的很有前途的生防因子。生物農藥以其種類和數量眾多、分布廣泛、作用方式多樣、對非靶標生物安全及不汙染環境等優點而倍受重視。在國內外的研究中，利用生物農藥防治植物病害特別是土傳病害的報導很多且都取得了良好的效果。柑橘樹腳腐病，又名裙腐病、爛蔸病、褐腐病，該病可由多種疫黴屬真菌侵入引起。在柑橘老產區，感病後的樹體樹勢衰退，產量急劇下降，而且造成柑橘植株的大量死亡，嚴重影響柑橘產量和果品質量，已成為生產上的一種常見病害。腳腐病主要發生於主幹基部，引起皮層腐爛。發病初期，病部樹皮呈水漬狀，有酒糟氣味，顏色變褐常滲出褐色膠液。氣候乾燥時，病斑乾裂。溫暖潮溼時，病部不斷向縱橫擴展，向下蔓延至根群，向上蔓延一般不超過離地面30釐米，橫向擴展，浩成環割，最終導致植株死亡。病樹部分大枝上或整個樹冠葉片的中脈及側脈呈黃色，引起葉落、枝枯，樹勢衰弱，開花多，花期短，結果少，所結的果實著色早，皮粗味酸。果實發病時，先為圓形的淡褐色病斑，後漸變成褐色水漬狀。病健部分界明顯，只侵染白皮層，不爛及果肉。乾燥時病斑幹韌，手指按下稍有彈性；潮溼時則呈水漬狀軟腐，長出白色菌絲，有腐臭味。發病嚴重的果實不久即脫落。目前柑橘樹腳腐病在生產上主要以化學藥劑防治為主，採用化學藥劑防治容易造成農藥在土壤和作物上的殘留，對土壤、地下水、河流、湖泊造成汙染，尤其是給人類的生存、發展和健康帶來危害。化學農藥的大量使用也使病菌對常用藥劑產生了一定的抗藥性，使其防治效果不斷下降。所以必須尋找新的途徑以克服化學藥劑防治帶來的農藥殘留和病菌抗藥性等問題。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於提供一種防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，該生物農藥具有安全、環境友好等特點，防治柑橘樹腳腐病效果好，降低了多菌靈的使用次數，減少對多菌靈的抗性藥。為實現上述目的，本發明的技術方案為：一種防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，由木黴菌發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、細黃連黴菌發酵液及中藥提取物製備而成，所述中藥提取物為金錢柳、花椒和馬鞭草的提取物。本發明的生物農藥是將拮抗細菌發酵液與中藥提取物按一定比例製成微生物農藥，具有防效好、安全、環境友好等特點，降低了化學農藥的使用次數，減少抗性藥，是生產綠色食品所必須的生物農藥。進一步，所述的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，所述中藥提取物為金錢柳、花椒和馬鞭草的水提取物，所述金錢柳、花椒和馬鞭草的重量比為1-2：1-2：1-2；所述中藥提取物由下述製備方法製得：取花椒、馬鞭草和金錢柳幹品混合得中藥混合物，加入中藥混合物重量3-5倍的水浸泡1-3小時，90-100℃保持10-30分鐘，自然冷卻，過濾棄殘渣，得濾液即為中藥提取物。優選的，所述金錢柳、花椒和馬鞭草的重量比為1：1：1。進一步，所述的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，所述生物農藥由以下重量百分比的組份組成：木黴菌發酵液200-300倍稀釋液5％-10％；枯草芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液10％-25％；細黃連黴菌發酵液200-300倍稀釋液10％-25％；金錢柳、花椒和馬鞭草的提取物3％-5％；及餘量的水。進一步，所述的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，所述生物農藥由以下重量百分比的組份組成：木黴菌發酵液200-300倍稀釋液6％-8％；枯草芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液15％-23％；細黃連黴菌發酵液200-300倍稀釋液12％-20％；金錢柳、花椒和馬鞭草的提取物3.5％-4.5％；及餘量的水。更進一步，所述的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，所述生物農藥由以下重量百分比的組份組成：木黴菌發酵液200-300倍稀釋液7％；枯草芽孢桿菌發酵液200-300倍稀釋液18％；細黃連黴菌發酵液200-300倍稀釋液15％；金錢柳、花椒和馬鞭草的提取物4％；及餘量的水。本發明還提供了一種防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的製備方法，包括如下進行的步驟：(1)分別取木黴菌發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、細黃連黴菌發酵液根據需要進行稀釋得木黴菌發酵液稀釋液、枯草芽孢桿菌發酵液稀釋液、細黃連黴菌發酵液稀釋液；(2)取所需量的木黴菌發酵液稀釋液，然後將所需量的枯草芽孢桿菌發酵液稀釋液和細黃連黴菌發酵液稀釋液加入到木黴菌發酵液稀釋液中得到培養液A；(3)將所需量的中藥提取物加入所需量的水中，混合均勻，加熱煮沸30-45min，自然冷卻至室溫得到培養液B；(4)將培養液A和培養液B混合攪拌均勻後30℃-50℃放置48h以上，即得到防治柑橘樹腳腐病的生物農藥。進一步，所述的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的製備方法，所述步驟(4)中，所述攪拌方式應同一方向勻速攪拌。本發明的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，其中木黴菌發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、細黃連黴菌發酵液可以是採用本領域任何常規方法生產所得，也可以購買商業成品直接使用。在本發明的一個具體實施例中，所述的木黴菌發酵液的製備方法為：取固體瓊脂平板培養基，將木黴菌接種於固體瓊脂平板培養基，在25-35℃下培養30-80小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在25-35℃下在搖床中培養20-30小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌液體培養基內，25-35℃下在搖床中60-80小時得木黴菌發酵液；種子液與液體培養基的重量份數比為l：8-20。在本發明的一個具體實施例中，所述的枯草芽孢桿菌發酵液的製備方法為：取固體瓊脂平板培養基，將枯草芽孢桿菌接種於固體瓊脂平板培養基，在25-35℃下培養30-80小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在25-35℃下在搖床中培養20-30小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，25-30℃下在搖床中60-80小時得枯草芽孢桿菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l：8-20。在本發明的一個具體實施例中，所述的細黃連黴菌發酵液的製備方法為：取固體瓊脂平板培養基，將細黃連黴菌接種於固體瓊脂平板培養基，在25-35℃下培養30-80小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在25-35℃下在搖床中培養20-30小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，25-30℃下在搖床中60-80小時得細黃連黴菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l：8-20。木黴菌發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、細黃連黴菌發酵液之後可根據需要加滅菌水進行稀釋。進一步，所述固體瓊脂平板培養基按重量份計由以下組分製備而成：胰蛋白腖1-2份，酵母提取物0.5-1份，氯化鈉0.5-1份，瓊脂1-1.5份，水800-1000份；所述固體瓊脂平板培養基pH為7-7.5。製備方法為：將各組分加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7-7.5，過濾，裝瓶封口後進行溼熱滅菌，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。進一步，所述固體瓊脂平板培養基中的菌種接種量為0.001-0.005份。進一步，所述液體培養基按重量份計由以下組分製備而成：澱粉10-30份，牛肉膏10-30份，蛋白腖10-30份，NaCl4-8份，水1000-3000份；所述液體培養基pH為7-7.5。製備方法為：將各組分加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7-7.5，過濾，裝瓶封口後進行溼熱滅菌，冷卻至室溫得液體培養基。進一步，所述的溼熱滅菌是裝瓶封口的培養基放入高壓蒸汽滅菌鍋內，於0.8-1.05kg/cm2，115-130℃條件下，溼熱滅菌15-30min。本發明還提供了一種防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的優選的使用方法，在果實幼果期噴施，使用濃度100倍，具有保護作用。果實生長期和其他防治措施結合使用，使用濃度100倍，減少化學藥劑抗性藥，減少農藥殘留。本發明的有益效果在於：(1)本發明的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥，是將拮抗細菌發酵液與中藥提取物按一定比例製成(微)生物農藥，具有防效好、安全、環境友好等特點，降低了化學農藥的使用次數，減少抗性藥，是生產綠色食品所必須的生物農藥。(2)本發明的防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的製備方法，操作簡單，對環境友好，適於大規模生產。具體實施方式所舉實施例是為了更好地對本發明的內容進行說明，但並不是本發明的內容僅限於所舉實施例。所以熟悉本領域的技術人員根據上述
發明內容對實施方案進行非本質的改進和調整，還包括各具體實施方式間的任意組合，仍屬於本發明的保護範圍。第一部分防治柑橘樹腳腐病的生物農藥實施例1固體瓊脂平板培養基的製備：1份胰蛋白腖，0.5份酵母提取物，0.5份氯化鈉，1份瓊脂，水800份，將各組分加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7，過濾，裝瓶封口後放入高壓蒸汽滅菌鍋內，0.8kg/cm2，115℃，溼熱滅菌15min，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。液體培養基的製備：取澱粉10份，牛肉膏10份，蛋白腖10份，NaCl4份，水1000份；加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7，過濾，裝瓶封口後放入高壓蒸汽滅菌鍋內，0.8kg/cm2，115℃，溼熱滅菌15min，冷卻至室溫得液體培養基。木黴菌發酵液的製備方法如下：取固體瓊脂平板培養基，將木黴菌接種於固體瓊脂平板培養基，接種菌為0.001份，在25℃下培養30小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在25℃下在搖床中培養20小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌液體培養基內，25℃下在搖床中60小時得木黴菌發酵液；種子液與液體培養基的重量份數比為l：8。枯草芽抱桿菌發酵液的製備方法如下：取固體瓊脂平板培養基，將枯草芽孢桿菌接種於固體瓊脂平板培養基，接種菌為0.001份，在25℃下培養30小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在25℃下在搖床中培養20小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，25℃下在搖床中60小時得枯草芽孢桿菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l：8。細黃連黴菌發酵液的製備方法如下：取固體瓊脂平板培養基，將細黃連黴菌接種於固體瓊脂平板培養基，接種菌為0.001份，在25℃下培養30小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在25℃下在搖床中培養20小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，25℃下在搖床中60小時得細黃連黴菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l：8。花椒提取物、馬鞭草提取物和金錢柳提取物是由下述製備方法製得：取等量花椒、馬鞭草和金錢柳幹品各1份，加水10份浸泡2小時後，100℃保持10分鐘，自然冷卻，過濾棄殘渣，得濾液即可。防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的配方：木黴菌發酵液200倍稀釋液5％；枯草芽抱桿菌發酵液200倍稀釋液10％；細黃連黴菌發酵液200倍稀釋液10％；金錢柳、花椒和馬鞭草提取物3％；水餘量。防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的製備方法：(1)分別取木黴菌發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、細黃連黴菌發酵液，加入滅菌水稀釋至所需倍數，得木黴菌發酵液稀釋液、枯草芽孢桿菌發酵液稀釋液、細黃連黴菌發酵液稀釋液；(2)取所需量的木黴菌發酵液稀釋液，然後將所需量的枯草芽孢桿菌發酵液稀釋液和細黃連黴菌發酵液稀釋液加入到木黴菌發酵液稀釋液中得到培養液A；(3)將所需量的馬鞭草提取物、金錢柳提取物、花椒提取物及餘下的水混合均勻加熱煮沸30-45min，自然冷卻至室溫得到培養液B；(4)將培養液A和培養液B混合攪拌均勻後30℃-50℃放置48h以上，即得到防治柑橘樹腳腐病的生物農藥。實施例2固體瓊脂平板培養基的製備：1.5份胰蛋白腖，0.6份酵母提取物，0.6份氯化鈉，1.5份瓊脂，水1000份，將各組分加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7.5，過濾，裝瓶封口後放入高壓蒸汽滅菌鍋內，0.9kg/cm2，120℃，溼熱滅菌25min，無菌操作倒入平板，冷卻至室溫得固體培養基。液體培養基的製備：取澱粉20份，牛肉膏20份，蛋白腖20份，NaCl5份，水2000份；加入到沸水浴鍋中混合加熱熔化，加入NaOH調pH至7.5，過濾，裝瓶封口後放入高壓蒸汽滅菌鍋內，0.9kg/cm2，120℃，溼熱滅菌25min，冷卻至室溫得液體培養基。木黴菌發酵液的製備方法如下：取固體瓊脂平板培養基，將木黴菌接種於固體瓊脂平板培養基，接種菌為0.002份，在30℃下培養36小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在30℃下在搖床中培養24小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌液體培養基內，30℃下在搖床中72小時得木黴菌發酵液；種子液與液體培養基的重量份數比為l：15。枯草芽抱桿菌發酵液的製備方法如下：取固體瓊脂平板培養基，將枯草芽孢桿菌接種於固體瓊脂平板培養基，接種菌為0.002份，在30℃下培養36小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在35℃下在搖床中培養24小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，30℃下在搖床中72小時得枯草芽孢桿菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l：9。細黃連黴菌發酵液的製備方法如下：取固體瓊脂平板培養基，將細黃連黴菌接種於固體瓊脂平板培養基，接種菌為0.002份，在25℃下培養36小時得菌落；取單菌落，接種於滅菌液體培養基內在30℃下在搖床中培養24小時，製成種子液；將種子液接種到滅菌培養基內，35℃下在搖床中70小時得細黃連黴菌發酵液；種子液與培養液的重量份數比為l：18。花椒提取物、馬鞭草提取物和金錢柳提取物是由下述製備方法製得：取等量花椒、馬鞭草和金錢柳幹品各1份，加水15份浸泡2小時後，100℃保持20分鐘，自然冷卻，過濾棄殘渣，得濾液即可。防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的配方：木黴菌發酵液250倍稀釋液10％；枯草芽抱桿菌發酵液200倍稀釋液15％；細黃連黴菌發酵液300倍稀釋液15％；金錢柳、花椒和馬鞭草提取物4％；水餘量。防治柑橘樹腳腐病的生物農藥的製備方法：(1)分別取木黴菌發酵液、枯草芽孢桿菌發酵液、細黃連黴菌發酵液，加入滅菌水稀釋至所需倍數，得木黴菌發酵液稀釋液、枯草芽孢桿菌發酵液稀釋液、細黃連黴菌發酵液稀釋液；(2)取所需量的木黴菌發酵液稀釋液，然後將所需量的枯草芽孢桿菌發酵液稀釋液和細黃連黴菌發酵液稀釋液加入到木黴菌發酵液稀釋液中得到培養液A；(3)將所需量的馬鞭草提取物、金錢柳提取物、花椒提取物及餘下的水混合均勻加熱煮沸40min，自然冷卻至室溫得到培養液B；(4)將培養液A和培養液B混合攪拌均勻後35℃放置48h以上，即得到防治柑橘樹腳腐病的生物農藥。第二部分生物農藥對柑橘樹腳腐病的防治效果驗證為了證明本發明的生物農藥對柑橘樹腳腐病的效果進行了多次試驗，防治效果較好，下述實驗中所用生物農藥是採用實施例1的方法製備的，另外，還做了三組平行對照試驗，對照A的生物農藥配方不含木黴菌發酵液，對照B的生物農藥配方不含枯草芽抱桿菌發酵液，對照C的生物農藥配方不含細黃連黴菌發酵液，其餘同實施例1。每組田間實驗4年總計實驗示範400棵有腐爛病的柑橘樹，每棵樹只噴施一次。試驗結果如表1-4：實驗結果表明，本發明對柑橘腐爛病當年治癒率為97-100％，次年有3-4棵柑橘樹腳腐病復發，平均復發率為3.57％，最高復發率為4.12％，最低復發率為3.06％。表1本發明的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治癒治癒率次年復發復發率20131009797％44.12％20141009898％33.06％20151009797％33.09％2016100100100％44.00％平均1009898％3.53.57％總計40039298％143.57％表2對照A的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治癒治癒率次年復發復發率20131007878％810.26％20141007474％79.46％20151007676％79.21％20161007272％68.33％平均1007575％79.33％總計40030075％289.33％表3對照B的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治癒治癒率次年復發復發率20131008686％55.81％20141008585％67.06％20151008787％55.75％20161008585％55.88％平均10085.7585.75％5.256.12％總計40034385.75％216.12％表4對照C的生物農藥田間試驗結果年份病樹當年治癒治癒率次年復發復發率20131008383％67.23％20141007979％78.86％20151008282％78.54％20161008181％67.41％平均10081.2581.25％6.58.00％總計40032581.25％268.00％結合上述試驗，本發明的生物農藥田間實驗結果表明有下述特點：本發明農藥治癒率高，復發率低。本發明對柑橘腐爛病當年治癒率為97-100％，次年有3-4棵柑橘樹腳腐病復發，平均復發率為3.57％，最高復發率為4.12％，最低復發率為3.06％。本發明無需多次噴施，每個病患處只需一次就可康復。本發明農藥無汙染，適合於綠色食品生產，有利於提高果品品質。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。當前第1頁1 2 3