花狀納米金的製備方法

2023-06-13 16:32:01

專利名稱：花狀納米金的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種納米金，尤其是涉及一種以胰蛋白酶和氯金酸為原料，抗壞血酸
為還原劑，水為溶劑，採用常溫攪拌法一步控制合成花狀納米金。
背景技術：
納米顆粒作為一種典型的介觀系統，具有很多不同於本體材料和單個分子的獨特 性質。作為納米顆粒體系中極其重要的一員，納米金顆粒本身還具有獨特的物理化學性 能，如良好的生物相容性，使納米金顆粒在生物標記和生物傳感方面得到廣泛應用，優異的 電學、化學性能使之用於電子產品及高效催化劑。目前納米金的製備方法主要有液相還 原法、光化學法、氣相蒸發法、種金生長法、電化學還原法、相轉移法、水熱法、微波法等。文 獻報導採用的還原劑較多為化學試劑，其中強還原劑，如檸檬酸三鈉和硼氫化鈉等；弱還原 劑，如抗壞血酸、多醇類等化合物。在生物領域，也涉及生物大分子、生物小分子、以及生物 有機體作為還原劑合成納米顆粒。 胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰島中提取的一種蛋白水解酶。中國藥品標準規定按幹 燥品計算，每lmg的效價不得少於2500單位。由牛、羊、豬胰臟提取而得的一種肽鏈內切酶， 只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。胰蛋白酶為白色或米黃色結晶性粉末，溶 於水，不溶於乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pl 10. 5，最適pH值7.8 8. 5左右。 pH值2 3是穩定的。pH值5以上易白溶失活。Ca2+對酶活性有穩定作用；重金屬離子、 有機磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制劑對其活性有強烈抑制。臨床用於抗炎消腫，工業上 用於皮革製造、生絲處理、食品加工等。 生物分子用於納米金顆粒的合成主要有以下三類 第一類以植物提取物為還原劑，K. Badri Narayanan.等(K. Badri Narayanan, N. Sakthivel. Materials. Letters. 2008， 62， 4588-4590)採用胡妥葉提取物用於合成納米 金顆粒，產物為球形、三面體、缺角三面體以及十面體納米顆粒，粒徑在6. 75 57. 91nm範 圍內。Shankar等(ShankarS S， Rai A， Ankamwar B， Singh A， Ahmad A， Sastry M.Nat. Mater. ，2004,3 :482-488)利用檸檬香草的萃取液在室溫下還原得到三角形的金納米薄 片。 第二類以微生物為還原劑，Murali Sastry等(Murali Sastry， Absar Ahmad， M. Islam Khan. Current Science, 2003， 85， 162-170)採用放射菌和真菌類作為還原劑，合 成了金銀納米顆粒。 第三類以蛋白酶、DNA和胺基酸等為還原齊U， Kei Yasui等(Kei Yasui， Nobuo Kimizuka. Chem. Lett, 2005， 34， 416-417)採用葡萄糖氧化酶催化合成金納米 顆粒，BETA-D-glucose包覆穩定納米金。Shao等(Wang L， Guo S J， Hu X G， Dong S J. Electrochem. Commun. ， 2008， 10 (1) :95-99)採用賴氨酸、色氨酸、精氨酸、酪氨酸在 水溶液中還原氯金酸得到金納米粒子，而採用天東氨酸還原得到了大量金納米薄片。 Wallen(Raveendran P， Fu J， Wallen S L.Green Chem. ，2006,8(1) :34-38)發現了一種金納米顆粒的綠色合成方法。用葡萄糖作為還原劑，澱粉作為保護劑，可以製備金銀顆粒以及 金銀合金顆粒。但是這些方法製備的金納米顆粒粒徑並不均一，產率不高且反應時間較長。
生物有機體合成的納米顆粒，因其良好的生物相容性以及環保性，在生物、醫學和 工業等領域具有很好的應用前景。蛋白-納米複合體，在基因表達中，可能增強DNA到細 胞核的傳遞作用(參見文獻Austin RH， Tegenfeldt J0， Cao H， Chou SY， Cox EC. IEEE TransacNanotechnol. 2002， 1， 12-18)。同樣，蛋白_納米複合物在納米探針，醫療以及診斷 器件中都有很好的發展前景(參見文獻Pennadam SS， Firman K， Alexander C， Gorecki DC. JNanobiotechno1，2004，2，8)。 胰蛋白酶修飾納米材料的應用胰蛋白酶具良好的生物特性，其特定的裂解功能
備受關注，是常用的蛋白裂解酶。目前針對胰蛋白酶的研究，主要涉及酶的固定，穩定胰
蛋白酶活性，提高其在生產、研究中的再利用。Liu JY等人(Liu JY， Lin S， Qi DW， Den
CH. Journal ofChromatogr即hy A，007， 1176， 169-177)採用超磁性納米粒子，固定胰蛋白
酶，製備成磁性的酶複合物，能降低生產成本以及提高利用率。Liu CG等人(Liu CG， Chen
XG， Park Hy皿-Jin。 Carbohydrate Polymers 2005， 62， 293-298)利用兩性聚合物特殊的
結構性質，其疏水和親水基團，能自由結合蛋白分子，通過條件的控制，能製備得到胰蛋白
酶-兩性複合物，產物具優良的生物相容性，且能穩定胰蛋白酶的活性。 胰蛋白酶製備納米顆粒的優勢，胰蛋白酶的胺基酸組成中，親水性的基團佔一半
以上，在酶分子表面，有大量的親和力強的側鏈基團，這些基團極易與金離子或納米金顆粒
結合。在特定的條件下，胰蛋白酶利用這些基團，通過各種化學結合能，如離子鍵、範德華力
以及靜電吸引力，使大部分的金離子吸附在酶的表面。抗壞血酸作為還原劑，在室溫中即能
還原氯金酸，促使原位還原金離子，以胰蛋白酶的3D結構為模板，合成了花狀納米金顆粒。
該方法操作工藝簡單易行、原料容易獲得，成本低廉、使用於大規模工業化生產，還可通過
改變溶劑，用胰蛋白酶作單一還原劑，在高溫9(TC條件下能迅速合成納米金顆粒，並且在一
定的條件下，能維持部分酶活力。另外，生產過程對環境無汙染，符合倡導的"綠色化學"的要求。

發明內容
本發明的目的在於提供一種穩定性較高、生物相容性較好、粒子較均一的胰蛋白
酶包覆的花狀納米金的製備方法。 本發明所述花狀納米金由納米顆粒組成，胰蛋白酶包覆，產物粒徑為100 200nm，形狀粒徑均一。 本發明所述花狀納米金的製備方法包括以下步驟
1)將氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；
2)在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗壞血酸，得反應溶液；
3)收集反應產物，洗滌後得產物花狀納米金。 在步驟l)中，所述氯金酸和胰蛋白酶溶液，按體積比最好為(1 10) : l，所述氯 金酸的濃度最好為0. 02 1. 0mM，所述胰蛋白酶的濃度最好為0. 08 1. 5mg/mL。
在步驟2)中，所述抗壞血酸的濃度最好為0. 5 6. 0mM，所述反應的溫度最好為 25 9(TC，反應的時間最好為5min 24h。反應溶液pH值最好為3. 0 10. 0。
在步驟3)中，所述洗滌最好以超純水超聲洗滌3次。
與現有的花狀納米金的製備方法相比，本發明具有以下突出優點 1)將水作為溶劑的優點是來源最為豐富、無毒、價廉、使用安全、不危害環境； 2)原料胰蛋白酶的生物相容性好，對環境無害，解決其他製備方法攜帶的化學
試劑造成納米金生物相容性差的障礙，納米金容易製備、粒徑、形貌容易調控； 3)還原劑採用抗壞血酸，其成本低廉、容易獲得、生物相容性好、對環境無害； 4)合成方法是胰蛋白酶與氯金酸水溶液混合，抗壞血酸為還原劑，利用常溫攪拌
法製得的納米金顆粒分散性好，形狀均一，粒徑分布窄，穩定性好，操作簡單易行； 5)通過對合成條件的控制能得到形貌均一的花狀納米金顆粒； 6)所採用的合成方法工藝簡單，得到的產物易於分離、清洗、保存。


圖1為實施例1製備的產物的透射電鏡圖。在圖1中，標尺為20nm ;由圖1可見， 產物均為分散的納米金顆粒；抗壞血酸為單一還原劑時不能生成花狀納米金，反應迅速。
圖2為實施例2製備的產物的透射電鏡圖。在圖2中，標尺為20nm ;由圖2可見， 產物均為分散的納米金顆粒，胰蛋白酶為單一還原劑時不能生成花狀納米金，室溫下胰蛋 白酶不能完全還原氯金酸。 圖3為實施例3製備的產物的透射電鏡圖。在圖3中，標尺為50nm ;由圖3可見， 抗壞血酸終濃度為3. OmM得到的產物為花狀納米金，形貌均一，高濃度抗壞血酸產物穩定 性好。 圖4為實施例3製備的產物的透射電鏡圖。在圖4中，標尺為50nm ;由圖4可見， 抗壞血酸終濃度為2. 5mM得到的產物為花狀納米金，穩定性較好。 圖5為實施例3製備的產物的透射電鏡圖。在圖5中，標尺為50nm ;由圖5可見， 抗壞血酸終濃度為2. OmM得到的產物為花狀納米金，穩定性較差。 圖6為實施例3製備的產物的透射電鏡圖。在圖6中，標尺為50nm ;由圖6可見， 抗壞血酸終濃度為1. 5mM得到的產物為花狀納米金，低濃度抗壞血酸產物穩定性差。
圖7為實施例4製備的產物的透射電鏡圖。在圖7中，標尺為50nm ;由圖7可見， 抗壞血酸終濃度為1. OmM得到的產物為未成形的花狀納米金，顆粒團聚，穩定性差。
圖8為實施例4製備的產物的透射電鏡圖。在圖8中，標尺為20nm ;由圖8可見， 抗壞血酸終濃度為0. 5mM得到的產物為未成形的花狀納米金，顆粒團聚，穩定性差。
圖9為實施例3和4製備得到的產物的紫外一可見吸收光譜圖。在圖9中，橫坐 標為波長/咖，縱坐標為吸收強度/a. u.;花狀納米金吸收峰為580nm ;曲線a f為抗壞血 酸終濃度，分別為3. OmM， 2. 5mM， 2. OmM， 1. 5mM， 1. OmM， 0. 5mM。 圖10為實施例3製備得到的產物的粒徑分布圖。在圖10中，橫坐標為粒徑/nm ; 由圖10可見，抗壞血酸終濃度為3. OmM得到的產物。 圖11為實施例3製備得到的產物的粒徑分布圖。在圖11中，橫坐標為粒徑/nm ; 由圖11可見，抗壞血酸終濃度為2. 5mM得到的產物。 圖12為實施例3製備得到的產物的粒徑分布圖。在圖12中，橫坐標為粒徑/nm ; 由圖12可見，抗壞血酸終濃度為2. OmM得到的產物。
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圖13為實施例3製備得到的產物的粒徑分布圖。在圖13中，橫坐標為粒徑/nm ; 由圖13可見，抗壞血酸終濃度為1. 5mM得到的產物。 圖14為實施例4製備得到的產物的粒徑分布圖。在圖14中，橫坐標為粒徑/nm ; 由圖14可見，抗壞血酸終濃度為1. 0mM得到的產物。 圖15為實施例4製備得到的產物的粒徑分布圖。在圖15中，橫坐標為粒徑/nm ; 由圖15可見，抗壞血酸終濃度為0. 5mM得到的產物。 圖16為實施例5製備得到的產物的透射電鏡圖。在圖16中，標尺為20nm ;由圖 16可見，改變胰蛋白酶和抗壞血酸的加入順序，會形成完全不同的產物。
圖17為實施例6製備得到的產物的紫外一可見吸收譜圖。在圖17中，橫坐標為 波長/nm，縱坐標為吸收強度/a. u.;圖中pH值從上至下分別為11. 0、9. 0、7. 0、5. 0、3. 0 ;由 圖17可見，只有pH 5. 0產生580nm的花狀納米金吸收峰。 圖18為實施例6製備的產物的掃描電鏡圖。在圖18中，橫坐標為200nm;由圖18 可見，pH 3.0的條件下，不能得到花狀納米金，生成團聚納米顆粒。 圖19為實施例6製備的產物的掃描電鏡圖。在圖19中，橫坐標為200nm;由圖19 可見，pH5. 0的條件下，生成花狀納米金。 圖20為實施例6製備的產物的掃描電鏡圖。在圖20中，橫坐標為500nm;由圖20 可見，pH 7. 0-11. 0的條件下，不能得到花狀納米金，生成納米金顆粒。
圖21為實施例7製備的產物的透射電鏡圖。在圖21中，橫坐標為50nm ;由圖21 可見，氯金酸濃度為0. 2-0. 4mM的條件下，生成花狀納米金。 圖22為實施例7製備的產物的透射電鏡圖。在圖22中，橫坐標為20nm ;由圖22 可見，氯金酸濃度為0. 6-2. OmM的條件下，不能得到花狀納米金，生成納米金顆粒。
具體實施例方式
以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。
實施例1 量取O. 2mM的氯金酸溶液8mL，以O. 015M抗壞血酸為還原劑，攪拌混勻，溶液pH為 5.0，室溫下反應24h 10d。反應後樣品，以超純水反覆洗滌超聲，15000rpm離心，收集樣 品。反應得到球形納米粒子，參見圖1。
實施例2 量取0. 2mM的氯金酸溶液8mL，以lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(為超純水分散) 為還原劑，攪拌混勻，溶液pH為5.0，室溫下反應10d。反應後樣品，以超純水反覆洗滌超聲， 15000rpm離心，收集樣品。反應得到球形納米粒子，參見圖2。
實施例3 量取0. 2mM的氯金酸溶液8ml與lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(均為超純水分 散)，充分攪拌混勻，保持氯金酸和胰蛋白酶的體積比為5 : 1，溶液pH為5.0;加入一定量 的O. 015M抗壞血酸，使抗壞血酸的濃度為1. 5mM、2. 0mM、2. 5mM、3. OmM，攪拌混勻。室溫下反 應5min 24h。反應後樣品，以超純水反覆洗滌超聲，9000rpm離心，收集樣品。反應得到 花狀納米金，參見圖3 6和圖9 13。
實施例4
量取0. 2mM的氯金酸溶液8mL與lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(均為超純水分 散)，充分攪拌混勻，保持氯金酸和胰蛋白酶的體積比為5 : 1，溶液pH為5.0;加入一定量 的0. 015M抗壞血酸，使抗壞血酸的濃度為0. 5mM、1. OmM，攪拌混勻。室溫下反應lh 24h。 反應後樣品，以超純水反覆洗滌超聲，9000rpm離心，收集樣品。反應得到未成形的花狀納米 金顆粒，參見圖7 8和圖14 15。
實施例5 量取O. 2mM的氯金酸溶液8mL，加入一定量的0. 015M抗壞血酸，使抗壞血酸的濃度 為3. OmM，充分攪拌混勻，溶液pH為5. 0 ;再加入lmg/ml的胰蛋白酶溶液1. 6ml (為超純水 分散)，保持氯金酸和胰蛋白酶的體積比為5 : l，攪拌混勻。室溫下放置24h。反應後樣 品，以超純水反覆洗滌超聲，9000rpm離心，收集樣品。反應得到團聚的納米金顆粒，參見圖 16。 實施例6 量取0. 2mM的氯金酸溶液8mL與lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(均為超純水分 散)，充分攪拌混勻，保持氯金酸和胰蛋白酶的體積比為5 : l，用O. 1M HCl或O. 1M NaOH將 溶液pH調為3. 0、5. 0、7. 0、9. 0、11. 0 ;加入一定量的0. 015M抗壞血酸，使抗壞血酸的濃度 為3.0mM，攪拌混勻。室溫下反應lh 24h。反應後樣品，以超純水反覆洗滌超聲，9000rpm 離心，收集樣品。反應得到不同的納米材料，只有pH 5.0條件下能生成花狀納米金，參見圖 17 20。
實施例7 量取lmg/mL的胰蛋白酶溶液1. 6mL(為超純水分散)，與0. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、 0. 8mM、1. 2mM、2. OmM的氯金酸溶液8mL充分攪拌混勻，保持氯金酸和胰蛋白酶的體積比為 5 : l，溶液pH為5. 0 ;加入一定量的O. 015M抗壞血酸，使抗壞血酸的濃度為3. OmM，攪拌 混勻。室溫下反應lh 24h。反應後樣品，以超純水反覆洗滌超聲，9000rpm離心，收集樣 品。氯金酸濃度為0. 2 0. 4mM得到花狀納米金，濃度為0. 6_2. OmM得到納米金顆粒，參見 圖21 22。
權利要求
花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述花狀納米金由納米顆粒組成，胰蛋白酶包覆，產物粒徑為100～200nm，形狀粒徑均一；所述花狀納米金的製備方法包括以下步驟1)將氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；2)在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗壞血酸，得反應溶液；3)收集反應產物，洗滌後得產物花狀納米金。
2. 如權利要求1所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述氯金酸和胰蛋白酶溶 液，按體積比為1 10 : 1。
3. 如權利要求l所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述氯金酸的濃度為 0. 02 1. OmM。
4. 如權利要求1所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述胰蛋白酶的濃度為 0. 08 1. 5mg/mL。
5. 如權利要求1所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述抗壞血酸的濃度為 0. 5 6. OmM。
6. 如權利要求1所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述反應的溫度為25 90。C，反應的時間為5min 24h。
7. 如權利要求l所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述反應溶液pH值為 3. 0 10. 0。
8. 如權利要求1所述的花狀納米金的製備方法，其特徵在於所述洗滌是以超純水超聲 洗滌3次。
全文摘要
花狀納米金的製備方法，涉及一種納米金。提供一種穩定性較高、生物相容性較好、粒子較均一的胰蛋白酶包覆的花狀納米金的製備方法。所述花狀納米金由納米顆粒組成，胰蛋白酶包覆，產物粒徑為100～200nm，形狀粒徑均一。將氯金酸和胰蛋白酶溶液混合，得氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液；在氯金酸和胰蛋白酶溶液混合液中加入抗壞血酸，得反應溶液；收集反應產物，洗滌後得產物花狀納米金。
文檔編號B22F9/24GK101786168SQ20101004482
公開日2010年7月28日 申請日期2010年1月8日 優先權日2010年1月8日
發明者李林梅, 翁建, 鍾鷺斌 申請人:廈門大學