雪蓮查耳酮合成酶基因(chs)、其編碼蛋白及其克隆方法

2023-06-18 02:31:41 2

專利名稱：雪蓮查耳酮合成酶基因(chs)、其編碼蛋白及其克隆方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。本發明公開了通過篩選雪蓮cDNA文庫及PCR法克隆查耳酮合成酶基因方法，提供了克隆查耳酮合成酶基因全長cDNA核酸序列及其編碼的蛋白序列。
背景技術：
雪蓮花又名雪蓮，菊科風毛菊屬。是民間常用的一類名貴藥用植物，屬多年生草本植物。一般分布於海拔4,000米以上的高山流石灘上。早在《西北域記》和《相園小識》中，就有關於雪蓮的記載。具有散寒除溼，活血通經、強筋助陽、抗炎、鎮痛、收縮子宮等功能，民間用於治療風溼性關節炎，延緩衰老、動脈硬化、終止妊娠，婦女小腹冷痛、閉經、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、陽萎等症。雪蓮花原生植物種類較多，雖然據中藥文獻記載均可同等入藥，但其品質有優劣之分。據有關報導，在以上幾種雪蓮中銷售量最大的是新疆天山雪蓮(雪荷花)(S.involucrata Kar.et Kir.)和水母雪蓮(S.medusa Maxim)。而水母雪蓮(Saussurea medusaMaxim.)是藏藥「雪蓮」藥材的原植物，分布在我國青海、甘肅、西藏等地。水母雪蓮是藏藥中的名貴藥材，具有散寒除溼、活血通絡、抗癌、抗炎及抗疲勞等功效，可治療風溼性關節炎、婦女月經不調、癰瘡腫毒和高山不適應等多種疾病。
黃酮類化合物的藥理作用包括抗癌、抗腫瘤，抗心腦血管疾病，鎮咳祛痰，抗炎、鎮痛作用，免疫調節作用，雌性激素樣作用，抗菌及抗病毒作用，抗氧化、抗衰老作用，抗輻射。雪蓮中含黃酮、生物鹼、內酯、甾醇、揮髮油、多糖等多種成分，其有效成分主要為黃酮類化合物。如用來治療偏癱的雪蓮通脈丸、雪蓮注射液和治療腦動脈硬化與缺血性中風的雪蓮通脈口服液，都是以黃酮類化合物含量為質量標準的。雪蓮黃酮藥理作用顯著，如水母雪蓮黃酮成分對中樞神經系統有抑制作用；以黃酮類化合物為有效成分的雪蓮注射液治療偏頭痛效果顯著。
黃酮類化合物的生物合成是通過苯丙烷類生物合成途徑實現的。是由1分子4-香豆醯-CoA和3分子丙二醯-CoA在查耳酮合酶(CHS)催化下產生查耳酮(苯基苯乙烯酮)開始的，查耳酮合酶是將苯丙烷類代謝途徑引向黃酮類合成的第一個最關鍵酶。
在此專利公開之前，尚沒有發現任何他人公開或報導的本專利申請提及的雪蓮查耳酮合成酶基因及其cDNA全長序列和編碼蛋白的胺基酸序列。

發明內容
本發明的目的就是提供一種新的水母雪蓮查耳酮合成酶基因及其全長序列。
在本發明中，「分離的」的cDNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位於其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與細胞中伴隨其蛋白質分開。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒、粘粒等。在產生本發明的雪蓮查耳酮合成酶基因時，可以將雪蓮查耳酮合成酶基因編碼序列可操作地連於表達調控序列，從而形成雪蓮查耳酮合成酶基因的表達載體。
「可操作地連於」指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達並參與多肽的分泌，那麼信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連於多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那麼它是可操作地連於編碼序列；如果核糖體結合位點被置於能使其翻譯的位置時，那麼它是可操作地連於編碼序列。一般，「可操作地連於」意味著相鄰，而對於分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
本發明的雪蓮查耳酮合成酶基因全長cDNA序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然後再將各次擴增出來的的片段按正確次序拼接在一起。
獲得有關序列後，用重組法來大批量的獲得有關序列。通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可以用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然後再進行連接而獲得編碼本發明的雪蓮查耳酮合成酶基因的核酸序列。然後，可將該核酸序列引入本領域中各種現有的DNA分子(如載體)和細胞中。
下面結合具體步驟，進一步闡述本發明。應理解，這些步驟僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列步驟中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如J.薩姆布魯克等《分子克隆實驗指南》(科學出版社2002)、F.奧斯伯等《精編分子生物學實驗指南》(科學出版社1998)所述條件，或按照所用產品製造廠商所建議的條件。所涉及到的雪蓮中編碼CHS的核苷酸片段的序列及其編碼蛋白質已在附錄中列出，其中SEQ ID NO1是編碼CHScDNA的全長核苷酸序列；SEQ ID NO2是編碼CHScDNA中開放閱讀框的核苷酸序列；SEQ ID NO3是SEQ NO2中核苷酸序列的翻譯胺基酸序列；具體而言，本發明提供以下各項1.一種克隆基因的方法，其特徵在於(a)構建cDNA文庫；(b)用簡併引物篩選文庫中陽性單克隆；(c)用特異引物從cDNA中克隆目的片段。
2.按照1的方法，其中所說的基因為雪蓮查耳酮合成酶基因。
3.按照1的方法，其中所說的簡併引物為CP1和CP2，其各自序列為CP1AAT GCG ATG AAT GAA TGG GG；CP2AAG CAA CCG TGTTAC ATC AT，所說的特異引物為CP3ATG GTG ACC GTC GAG GAAGTC CG；CP4GCA CTA CTA GTG GCG TTG；CP5GGC CAC ATCAAG AGA TAG ACT AGG。
4.按照3的方法，其特徵在於簡併引物中CP1和CP2進行文庫篩選獲得陽性單克隆，並得到特異性探針片段，根據此探針片段設計CP4和CP5，CP3和CP4，並以cDNA為模板進行PCR獲得文庫篩選未獲得的部分缺失部分，用CP3和CP5為引物，並以cDNA為模板進行PCR最終獲得CHS的全長cDNA。
5.用權利要求1的方法構建的雪蓮cDNA文庫。
6.用按照5中的cDNA文庫篩選雪蓮中編碼基因的方法。
7.用按照1的方法所獲得的一種的編碼雪蓮查耳酮合成酶(CHS)的cDNA序列，其特徵在於該cDNA序列具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸1到1313的序列。
8.按照5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的部分序列。
9.按照5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的同源序列。
10.一種多肽序列，其特徵在於該多肽序列是由按照5的cDNA所編碼，且具有如SEQ ID NO3所示的胺基酸1到389的序列。
11.按照8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的部分序列。
12.按照8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的同源序列。
13.一種基因構建體(重組質粒)，其特徵在於該構建體根據5到7的任何一種核苷酸序列所構建。
14.一個大腸桿菌細胞，其特徵是，含由按照11的重組質粒轉化該細胞。
具體實施例方式
以下是本發明的實施實例實施例實施例1雪蓮cDNA文庫的建立建庫所用水母雪蓮(原植株採自甘肅省祁連4500-5000海拔山脈，並經植物所陳藝林研究員保存並鑑定為水母雪蓮)(Saussurea.medusa)1-15天愈傷組織紅色係為本實驗室誘導獲得，並在附加2mg/L NAA和0.5mg/LBA的MS培養基中，25±1℃，16h光照/8h黑暗下培養、繼代擴繁。
稱取1-14天紅色系愈傷組織，每天50mg，共計700mg混合樣品於研缽中，用TRIZOL Reagent(購自GIBCO公司)提取總RNA。取1～3μl總RNA樣品，用SMART cDNA Library Construction Kit(Catlog#K1051-1)(CLONTEC)自帶的CDSIII酶切位點的PolyT引物合成第一鏈cDNA.採用LD PCR(long distance PCR)擴增用cDNA第一鏈以獲得雙鏈cDNA。
加入蛋白酶K消化去除cDNA中的Taq酶，再用Sfi I酶切cDNA，然後用CHROMA SPIN-400對cDNA進行大小分離。收集大小＞500bp的cDNA，將收集到的cDNA與λTripIEx2 Vector(Promega)連接，連接反應中cDNA與載體中的比例對於轉染效率及庫中獨立克隆的數目至關重要。對於每對cDNA/載體，這一比例都需要優化。連接好的DNA由包裝蛋白Packagene Lambda DNA Packaging System(購自Promega公司)包裝後，加入明膠使終濃度為0.01％，DMSO終濃度為7％，可以在-70℃下保存1年滴度不變。將文庫分成20個亞文庫，避免反覆凍溶，每個亞文庫來自於在原始文庫擴增時不同培養皿的回收物，其組成可能不同可保存，這樣就完成了雪蓮噬菌體文庫構建。
實施例2從文庫篩選雪蓮查耳酮合成酶基因chs cDNA根據GenBank中已發表的chs基因保守的胺基酸序列用軟體DNAMAN4.0(美國Lynnon Biosoft公司)設計合成上下遊部分簡併引物CP15′-AAT GCG ATG AAT GAA TGG GG-3′CP25′-AAG CAA CCG TGT TAC ATC AT-3′每個亞文庫取1μL為模板，以CP1、CP2為引物，以25μL體系，先於95℃加熱10min裂解噬菌體，加入PCR擴增混合物，進行TD-PCR擴增。程序94℃變性5min，隨之以94℃1min，65-50℃退火1min(每進行一個循環退火溫度比上一循環下降0.5℃)，72℃延伸1min，進行30循環；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，15循環；72℃延伸5min，1循環。1.6％瓊脂糖電泳檢測，確定陽性池。選取信號最強的陽性池，作10倍梯度稀釋到106倍，每個梯度稀釋物取1μL為模板，按同樣程序進行PCR檢測，確定在下一級篩選時本級陽性池的最大稀釋倍數N(能夠檢測到陽性信號的極限稀釋倍數)。將選中的初級陽性池按其最大稀釋倍數N稀釋，取1μL稀釋物感染大腸桿菌並鋪制10個9cm LB平板，培養並回收洗脫物。從平板上挑取生長並分離良好的單噬菌斑，置於緩衝液中，渦旋震蕩，稍離心，於4℃冰箱過夜。取3μL洗脫物為模板，PCR程序擴增檢測，獲得陽性單克隆。
選取PCR檢測陽性單克隆，送上海生物工程公司測序。測序結果在GenBank中比較分析以確認所克隆的片段為帶有完整3′端Poly A尾巴的，大小為1232bp的chs特異片段，通過比較發現並不是完整的chs全長cDNA基因，在5′端缺失了100bp左右片段。
實施例3PCR法克隆雪蓮查耳酮合成酶基因chs全長cDNA根據GenBank中已公布的chs cDNA的序列，在開放閱讀框上遊，即5′端，根據保守性設計一段引物，再用軟體DNAMAN4.0從測序序列的中部設計一段引物
CP35′-ATG GTG ACC GTC GAG GAA GTC CG-3′CP45′-GCA CTA CTA GTG GCG TTG-3′用TRIZOL Reagent小量提取總RNA，取2μL總RNA，20μL反應混合體系中在M-MLV反轉錄酶(購自Promega公司)作用下合成第一鏈cDNA，以此第一鏈cDNA為模板，以上述CP3，CP4為引物進行PCR擴增94℃變性5min，隨之以94℃1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，進行30循環；72℃延伸10min，1循環。
PCR產物送上海生物工程公司測序。測序結果為406bp左右的片段，在GeneBank中比對為chs基因的上遊序列。用DNAMAN4.0軟體將此406bp片段與上述1232bp片段拼接起來，得到一個長度為1313bp的chscDNA序列。根據這拼接後的鹼基序列，在開放閱讀框3′端後面，且PolyA尾巴前面設計一段引物CP55′-GGC CAC ATC AAG AGA TAG ACT AGG-3′。
以第一鏈cDNA為模板，CP3，CP5為引物進行PCR擴增94℃變性5min熱啟動後，隨之以94℃1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，進行35循環；72℃延伸10min，1循環。取3μL經凝膠電泳，回收純化後的PCR產物，再加1μL的連接緩衝液，1μL T-easy載體(購自Promega公司)，4μL無菌雙蒸水，1μL的T4DNA連接酶，總共反應體積10μL。4℃下連接過夜。CaCl2法製備感受態大腸杆DH5α。取連接產物加入CaCl2溶液製備的感受態細胞中，輕輕混勻內容物，在冰上放置30min。將管放入預加熱到42℃的循環水浴中，靜置90s，後快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2min。每管加入400μl LB培養基，用水浴將培養基加熱到37℃，然後將管轉移到搖床上，溫育45min，使細菌復甦並表達質粒編碼的抗生素標記基因。將適當體積轉化細胞轉移塗布到相應抗生素LB平板上。於37℃培養，篩選轉化子。挑取單菌落接於加入0.5ml附加50mg/L Amp的LB培養基的離心管中，37℃、300rpm振蕩培養5-8h，取菌液為模板，CP3，CP5為引物進行PCR擴增94℃變性5min熱啟動後，隨之以94℃1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，進行35循環；72℃延伸10min，1循環。選取PCR檢測陽性單克隆，送上海生物工程公司測序。測序結果為1313bp大小，在GenBank中比較分析以確認所克隆的片段chs全長cDNA(SEQID NO1)。其中開放閱讀框1170bp大小(SEQ ID NO2)。翻譯後的蛋白質為389個胺基酸，分子量為42268(SEQ ID NO3)。將含有完整chs全長cDNA序列質粒的大腸桿菌保存於-20℃中。
實施例4 chs全長cDNA的鑑定採用BLAST同源性分析，BLAST(網址為www.ncbi.nlm.nih.gov/BlAST/)是在BLAST「nr」資料庫中(包括所有非冗餘GenBank CDS、具有三維結構的蛋白質資料庫的序列、SWISS-PROT蛋白質序列資料庫、EMBL及DDBJ資料庫)進行同源性搜尋的一種方式。BLASTX是NCBI(National Center of Biology Information)提供的一種將核苷酸序列的6種翻譯序列與蛋白質資料庫進行比較的一種方式。P值(probability)是被查詢cDNA序列與資料庫中的某一序列相比較的同源性程度，P值越大，其二者的同源性就越大。所有的比較都是由BLASTXnr完成的，通過比較得知，chs全長cDNA序列與八仙花(Hydrangeamacrophylla AB011467)中的CHS基因的同源性最高，達到79％。蛋白質序列與核桃(Juglans nigra x Juglans regia CAA64452)的CHS胺基酸序列同源性最高，達到89％，可以認為兩者在功能上有很大相似性。從BLAST序結果在GenBank中比較分析以確認所克隆的片段為chs全長cDNA，並且是正向插入載體的。BLASTX比較結果見表1表1BLAST結果Score ESequences producing significant alignments(Bits)Valuegi|1296816|emb|CAA64452.1|naringenin-chalcone synthase[Juglans7240.0gi|20536|emb|CAA32737.1|chalcone synthase[Petunia x hybrida...7230.0gi|19848923|gb|AAL92879.1|chalcone synthase[Cannabis sativa]7220.0gi|11096319|gb|AAG30295.1|chalcone synthase[Hypericum andro...7200.0gi|1345787|sp|P48387|CHS2 CAMSIChalcone synthase 2(Naringen...7190.0gi|18376653|dbj|BAB84111.1|chalcone synthase[Vitis vinifera]7190.0gi|1296818|emb|CAA64366.1|naringenin-chalcone synthase[Juglans7190.0gi|18308038|gb|AAL67805.1|chalcone synthase[Hypericum perforat7180.0gi|1345785|sp|P48386|CHS1 CAMSIChalcone synthase 1(Naringen...7160.0
gi|3551031|dbj|BAA32732.1|chalcone synthase[Hydrangea macro...7140.0gi|4191255|emb|CAA10641.1|chalcone synthase[Casuarina glauc...7130.0gi|5921769|sp|Q43163|CHSB SOLTUChalcone synthase 1B (Naringe...7110.0gi|37727303|gb|AAO13091.1|chalcone synthase[Camellia sinensis]7110.0gi|5921776|sp|O22046|CHSE IPONIChalcone synthase E (Naringen...7110.0gi|5921768|sp|Q41436|CHSA SOLTUChalcone synthase 1A (Naringe...7110.0gi|5921775|sp|022047|CHSE IPOPUChalcone synthase E (Naringen...7100.0……gi|1296816|emb|CAA64452.1|naringenin-chalcone synthase[Juglans nigra x Juglansregia]Length＝389Score＝724bits (1868)，Expect ＝0.0，MethodComposition-based stats.
Identities ＝346/388(89％)，Positives ＝370/388(95％)，Gaps＝0/388(0％)Query 1 MVTVEEVRKATRAEGPATIMAIGTATPPNCVLQSAYPDYYFRVTKSEHKKELKEKFRRMC 60MVTVE+VR+A RAEGPAT+MAIGTATPPNCV QSAYPDYYFR+T SEHK ELKEKF+RMCSbjct 1 MVTVEDVRRAQRAEGPATVMAIGTATPPNCVDQSAYPDYYFRITNSEHKTELKEKFKRMC 60Query 61 DKSMIKKRYMHLTEEILQEKPNICAYMAPSLDERQDIVVVEVPKLGKEAATRAIKEWGQP 120+KSMIKKRYMHLTEEIL+E PN+CAYMA SLD RQD+VVVEVPKLGKEAAT+AIKEWGQPSbjct 61 EKSMIKKRYMHLTEEILKENPNVCAYMASSLDARQDMVVVEVPKLGKEAATKAIKEWGQP 120Query 121 KSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAEN 180KSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAENSbjct 121 KSKITHLVFCTTSGVDMPGADYQLTKLLGLRPSVKRLMMYQQGCFAGGTVLRLAKDLAEN 180Query 181 NKGARVLVVCSEITAVTFRGPNETHLDSLVGQALFGDGAAAIIVGSDPLLGVEKPLFEIV 240NKGARVLVVCSEITAVTFRGP++THLDSLVGQALFGDGAAA+IVG+DP+ GVEKPLFE+VSbjct 181 NKGARVLVVCSEITAVTFRGPSDTHLDSLVGQALFGDGAAALIVGADPVPGVEKPLFELV 240Query 241 SAAQTILPDSEGAIDGHLREVGLTFHLLEDVPGLNSKHIEKSLLEAFRPLGIFDWNSLFW 300SAAQTILPDS+GAIDGHLREVGLTFHLL+DVPGL SK+IEKSL+EAF+PLGI DWNSLFWSbjct 241 SAAQTILPDSDGAIDGHLREVGLTFHLLKDVPGLISKNIEKSLVEAFQPLGITDWNSLFW 300Query 301 IAHPGGPAILDQVEEKLSLKPDKLRATRHVLSEYGNMSSACVLFILNEMRHASATDGFNT 360IAHPGGPAILDQVE KL LKP+KLRATRHVLSEYGNMSSACVLFIL+EMR SA D TSbjct 301 IAHPGGPAILDQVESKLELKPEKLRATRHVLSEYGNMSSACVLFILDEMRKKSAEDRLKT 360Query 361 TGEGLEWGVLFGFGPGLTVETLVLHSVS 388TGEGLEWGVLFGFGPGLTVET+VLHSVSSbjct 361 TGEGLEWGVLFGFGPGLTVETVVLHSVS 388
附錄SEQ ID NO1序列特徵長度1313bp類型核酸鏈型雙鏈拓撲結構線性最初來源水母雪蓮分子類型cDNA序列描述1 ATGGTGACCG TCGAGGAAGT CCGTAAGGCG ACACGAGCTG AAGGTCCAGC51CACCATCATG GCCATCGGCA CCGCCACACC GCCTAATTGC GTGCTTCAAA101 GCGCATATCC CGATTACTAT TTTCGTGTTA CAAAAAGCGA GCACAAAAAA151 GAACTTAAAG AGAAATTTAG ACGCATGTGT GATAAATCTA TGATCAAAAA201 ACGATACATG CACTTGACGG AGGAGATTTT GCAAGAAAAA CCGAACATTT251 GTGCCTACAT GGCACCTTCG TTAGACGAGC GACAAGATAT TGTGGTCGTG301 GAAGTACCAA AGCTCGGGAA AGAAGCCGCG ACACGGGCAA TCAAGGAGTG351 GGGCCAACCA AAATCGAAAA TCACCCATCT TGTTTTTTGC ACTACTAGTG401 GCGTTGACAT GCCAGGAGCT GATTATCAGC TCACAAAGCT TCTCGGTCTT451 CGGCCTTCAG TCAAACGCCT GATGATGTAC CAGCAAGGTT GTTTTGCTGG501 AGGAACTGTC TTGCGTTTGG CCAAAGACCT GGCTGAGAAC AACAAGGGGG551 CCCGCGTACT GGTGGTCTGC TCTGAGATCA CCGCAGTGAC TTTCCGCGGG601 CCCAATGAAA CCCATCTCGA TAGCCTGGTG GGCCAAGCTT TGTTTGGCGA651 TGGTGCAGCC GCGATAATAG TCGGGTCTGA CCCATTGCTC GGCGTAGAGA701 AGCCTCTTTT CGAGATTGTT TCCGCGGCCC AAACAATTCT CCCCGATAGT751 GAGGGCGCAA TCGATGGACA CCTTCGCGAA GTCGGGCTTA CGTTTCATCT801 CCTCGAAGAC GTTCCCGGAC TTAACTCAAA ACACATCGAA AAGAGCCTGT851 TAGAGGCCTT TCGACCATTG GGCATTTTCG ATTGGAACTC GCTTTTCTGG901 ATCGCGCATC CGGGCGGGCC CGCGATCTTG GACCAAGTTG AGGAAAAACT951 AAGCCTGAAG CCCGATAAAT TACGGGCCAC ACGACACGTG CTGAGCGAAT
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551CCCGCGTACT GGTGGTCTGC TCTGAGATCA CCGCAGTGAC TTTCCGCGGG601CCCAATGAAA CCCATCTCGA TAGCCTGGTG GGCCAAGCTT TGTTTGGCGA651TGGTGCAGCC GCGATAATAG TCGGGTCTGA CCCATTGCTC GGCGTAGAGA701AGCCTCTTTT CGAGATTGTT TCCGCGGCCC AAACAATTCT CCCCGATAGT751GAGGGCGCAA TCGATGGACA CCTTCGCGAA GTCGGGCTTA CGTTTCATCT801CCTCGAAGAC GTTCCCGGAC TTAACTCAAA ACACATCGAA AAGAGCCTGT851TAGAGGCCTT TCGACCATTG GGCATTTTCG ATTGGAACTC GCTTTTCTGG901ATCGCGCATC CGGGCGGGCC CGCGATCTTG GACCAAGTTG AGGAAAAACT951AAGCCTGAAG CCCGATAAAT TACGGGCCAC ACGACACGTG CTGAGCGAAT1001 ACGGAAACAT GTCGAGTGCT TGTGTGCTGT TTATCCTAAA CGAAATGCGA1051 CACGCTTCGG CTACAGATGG GTTCAACACC ACGGGTGAGG GGCTCGAGTG1101 GGGGGTGTTG TTTGGGTTCG GACCTGGGCT AACCGTCGAG ACCCTGGTCC1151 TCCATAGTGT GTCCATTTAASEQ ID NO3序列特徵長度389胺基酸分子大小42680等電點7.09類型胺基酸序列鏈型單鏈拓撲結構線性最初來源水母雪蓮分子類型蛋白質序列描述1 M V T V E E V R K A T R A E G P A T I M21A I G T A T P P N C V L Q S A Y P D Y Y41F R V T K S E H K K E L K E K F R R M C61D K S M I K K R Y M H L T E E I L Q E K81P N I C A Y M A P S L D E R Q D I V V V101 E V P K L G K E A A T R A I K E W G Q P
121K S K I T H L V F C T T S G V D M P G A141D Y Q L T K L L G L R P S V K R L M M Y161Q Q G C F A G G T V L R L A K D L A E N181N K G A R V L V V C S E I T A V T F R G201P N E T H L D S L V G Q A L F G D G A A221A I I V G S D P L L G V E K P L F E I V241S A A Q T I L P D S E G A I D G H L R E261V G L T F H L L E D V P G L N S K H I E281K S L L E A F R P L G I F D W N S L F W301I A H P G G P A I L D Q V E E K L S L K321P D K L R A T R H V L S E Y G N M S S A341C V L F I L N E M R H A S A T D G F N T361T G E G L E W G V L F G F G P G L T V E381T L V L H S V S I
序列表110中國科學院植物研究所120雪蓮查耳酮合成酶基因(chs)、其編碼蛋白及其克隆方法130IB0611081603170PatentIn version 3.121012111313212DNA213Saussurea medusa4001atggtgaccg tcgaggaagt ccgtaaggcg acacgagctg aaggtccagc caccatcatg60gccatcggca ccgccacacc gcctaattgc gtgcttcaaa gcgcatatcc cgattactat120tttcgtgtta caaaaagcga gcacaaaaaa gaacttaaag agaaatttag acgcatgtgt180gataaatcta tgatcaaaaa acgatacatg cacttgacgg aggagatttt gcaagaaaaa240ccgaacattt gtgcctacat ggcaccttcg ttagacgagc gacaagatat tgtggtcgtg300gaagtaccaa agctcgggaa agaagccgcg acacgggcaa tcaaggagtg gggccaacca360aaatcgaaaa tcacccatct tgttttttgc actactagtg gcgttgacat gccaggagct420gattatcagc tcacaaagct tctcggtctt cggccttcag tcaaacgcct gatgatgtac480cagcaaggtt gttttgctgg aggaactgtc ttgcgtttgg ccaaagacct ggctgagaac540aacaaggggg cccgcgtact ggtggtctgc tctgagatca ccgcagtgac tttccgcggg600cccaatgaaa cccatctcga tagcctggtg ggccaagctt tgtttggcga tggtgcagcc660gcgataatag tcgggtctga cccattgctc ggcgtagaga agcctctttt cgagattgtt720tccgcggccc aaacaattct ccccgatagt gagggcgcaa tcgatggaca ccttcgcgaa780gtcgggctta cgtttcatct cctcgaagac gttcccggac ttaactcaaa acacatcgaa840aagagcctgt tagaggcctt tcgaccattg ggcattttcg attggaactc gcttttctgg900atcgcgcatc cgggcgggcc cgcgatcttg gaccaagttg aggaaaaact aagcctgaag960cccgataaat tacgggccac acgacacgtg ctgagcgaat acggaaacat gtcgagtgct1020tgtgtgctgt ttatcctaaa cgaaatgcga cacgcttcgg ctacagatgg gttcaacacc1080
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2103211389212PRT213Saussurea medusa4003Met Val Thr Val Glu Glu Val Arg Lys Ala Thr Arg Ala Glu Gly Pro1 5 10 15Ala Thr Ile Met Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Pro Asn Cys Val Leu20 25 30Gln Ser Ala Tyr Pro Asp Tyr Tyr Phe Arg Val Thr Lys Ser Glu His35 40 45Lys Lys Glu Leu Lys Glu Lys Phe Arg Arg Met Cys Asp Lys Ser Met50 55 60Ile Lys Lys Arg Tyr Met His Leu Thr Glu Glu Ile Leu Gln Glu Lys65 70 75 80Pro Asn Ile Cys Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asp Glu Arg Gln Asp85 90 95Ile Val Val Val Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Thr Arg100 105 110Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val115 120 125Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr Gln Leu130 135 140Thr Lys Leu Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Lys Arg Leu Met Met Tyr145 150 155 160Gln Gln Gly Cys Phe Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Leu Ala Lys Asp165 170 175Leu Ala Glu Asn Asn Lys Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu180 185 190Ile Thr Ala Val Thr Phe Arg Gly Pro Asn Glu Thr His Leu Asp Ser
195 200 205Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ala Ala Ala Ile Ile Val210 215 220Gly Ser Asp Pro Leu Leu Gly Val Glu Lys Pro Leu Phe Glu Ile Val225 230 235 240Ser Ala Ala Gln Thr Ile Leu Pro Asp Ser Glu Gly Ala Ile Asp Gly245 250 255His Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Leu Glu Asp Val Pro260 265 270Gly Leu Asn Ser Lys His Ile Glu Lys Ser Leu Leu Glu Ala Phe Arg275 280 285Pro Leu Gly Ile Phe Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro290 295 300Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Gln Val Glu Glu Lys Leu Ser Leu Lys305 310 315 320Pro Asp Lys Leu Arg Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn325 330 335Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asn Glu Met Arg His Ala340 345 350Ser Ala Thr Asp Gly Phe Asn Thr Thr Gly Glu Gly Leu Glu Trp Gly355 360 365Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Val Glu Thr Leu Val Leu370 375 380His Ser Val Ser Ile38權利要求
1.一種克隆基因的方法，其特徵在於(a)構建cDNA文庫；(b)用簡併引物篩選文庫中陽性單克隆；(c)用特異引物從cDNA中克隆目的片段。
2.權利要求1的方法，其中所說的基因為雪蓮查耳酮合成酶基因。
3.權利要求1的方法，其中所說的簡併引物為CP1和CP2，其各自序列為CP1AAT GCG ATG AAT GAA TGG GG；CP2AAG CAA CCGTGT TAC ATC AT，所說的特異引物為CP3ATG GTG ACC GTC GAGGAA GTC CG；CP4GCA CTA CTA GTG GCG TTG；CP5GGC CACATC AAG AGA TAG ACT AGG。
4.權利要求3的方法，其特徵在於簡併引物中CP1和CP2進行文庫篩選獲得陽性單克隆，並得到特異性探針片段，根據此探針片段設計CP4和CP5，CP3和CP4，並以cDNA為模板進行PCR獲得文庫篩選未獲得的部分缺失部分，用CP3和CP5為引物，並以cDNA為模板進行PCR最終獲得CHS的全長cDNA。
5.用權利要求1的方法構建的雪蓮cDNA文庫。
6.用權利要求5中的cDNA文庫篩選雪蓮中編碼基因的方法。
7.用權利要求1的方法所獲得的一種的編碼雪蓮查耳酮合成酶(CHS)的cDNA序列，其特徵在於該cDNA序列具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸1到1313的序列。
8.權利要求5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的部分序列。
9.權利要求5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的同源序列。
10.一種多肽序列，其特徵在於該多肽序列是由權利要求5的cDNA所編碼，且具有如SEQ ID NO3所示的胺基酸1到389的序列。
11.權利要求8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的部分序列。
12.權利要求8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的同源序列。
13.一種基因構建體(重組質粒)，其特徵在於該構建體根據權利要求5到7的任何一種核苷酸序列所構建。
14.一個大腸桿菌細胞，其特徵是，含由權利要求11中的重組質粒轉化該細胞。
全文摘要
本發明提供了雪蓮cDNA文庫構建方法，並利用此文庫通過簡併引物篩選雪蓮中編碼基因(包括雪蓮查耳酮合成酶基因)的方法，和利用特異引物通過PCR克隆雪蓮查耳酮合成酶基因的方法。提供了雪蓮查耳酮合成酶基因chs的全長cDNA序列及編碼的胺基酸多肽序列。該cDNA序列全長1,313bp，編碼389個胺基酸的多肽。該cDNA可用於構建正義基因構建體。利用該構建體可控制植物或植物培養體提高黃酮產量。
文檔編號C12N9/00GK101029306SQ20061001140
公開日2007年9月5日 申請日期2006年3月1日 優先權日2006年3月1日
發明者趙德修, 虞珍珍, 程麗琴, 徐亮勝, 金治平 申請人:中國科學院植物研究所