新的具有殺蟲活性的細菌蛋白質的製作方法

2023-05-12 09:43:21

專利名稱：新的具有殺蟲活性的細菌蛋白質的製作方法
新的具有殺蟲活性的細菌蛋白質 發明領域
本發明涉及害蟲控制、特別是昆蟲控制領域，提供了編碼命名為ISLP 蛋白質的殺蟲蛋白質其毒性片段或變體的重組DNA序列，其有效用於保護 生物體不受害蟲損傷，如保護植物不被昆蟲損傷。還提供了含有編碼本發 明的ISLP蛋白質的核酸分子的植物，及使用這些核酸序列來減少害蟲如昆 蟲對於植物的危害的方法和手段。
背景技術：
使用細菌生物殺蟲劑如蘇雲金芽孢桿菌(5fl"7/附幼wW"g/e附/s, Bt) 是農業及其他領域(即疾病載體)用於昆蟲控制的可行選擇，這將會以經 濟上可持續和環境上友好的方式增加作物產量。Bt的Cry蛋白質是高度特 異性的，對於人類、脊推動物和植物無害，並且是可完全生物降解的，所 以不會在環境中累積殘留的毒性產物(Schnepf等，1998)。迄今為止超過 200種c/j基因序列已經被確定並分類成44個家族和不同的亞類(Crickmore 等，1998， 2005)。此外，Bt生產許多可能對毒力有貢獻的胞外化合物， 如磷脂酶、蛋白酶、幾丁質酶及其他毒素如p-外毒素或VIP蛋白質(Schnepf 等，1998)。
儘管過去十年來進行了廣泛研究，但只有少數的細菌殺昆蟲毒素大規 模地用於最具破壞性蟲害的生物害蟲防治應用，例如那些使用Bt植物的應用。
S層是蛋白質原性晶格排列的有序結構，覆蓋在許多古細菌和真細菌 的表面(Beveridge等，1997; Sara和Sleytr， 2000)，並構成高達總細胞 蛋白質的15%。 S層蛋白質的功能還沒有被精確地說明，但是認為這些蛋白質參與細胞完整性和形狀的維持。因為它們是最外層的細胞被膜組分，
還有人假設其可能參與與環境間的大分子交換(Beveridge等，1997)。在 某些革蘭氏陰性致病細菌中，它們已經與毒力和補體介導的殺傷抗性相牽 連(Sara和SLeytr， 2000; Pei和Blaser, 19卯)。據描述在蠟狀芽孢桿菌 中，S層能促進和人類白細胞及與宿主間的相互作用，促成了 致病性(Kotiranta等，1998)。認為在炭疽芽孢桿菌(及fl"^,"c&)中， S層和莢膜可能協同地和宿主相互作用(Mignot等，2002)。
已描述了炭疽芽孢桿菌中兩種不同的S層蛋白質(SAP和EA1 X Mignot 等，2002)。這些蛋白質的存在並非桿菌正常莢膜化所必需的(Mesnage 等，1998)。這些蛋白質以生長階段依賴性的方式陸續出現，SAP的合成 在EA1合成之前(Mignot等，2002 )。描述了蘇雲金芽孢桿菌蠟螟亞種(醜. //rwn'wg/e船/51 gfl〃er/fl)的S層蛋白質SlpA， 它與炭疽芽孢桿菌的SAP 蛋白質類似。在蘇雲金芽孢桿菌幕蟲亞種(凡幼MnVigiews/s sti6sp./ m'ri附附) 中描述了S層CTC蛋白質(GenBank登錄號AAR23791 )，此蛋白質和炭疽 芽孢桿菌的EA1類似(Sun等，2001 ) 。 CTC分子大小為100 kDa,並在生 長的芽孢形成期能形成類芽孢體。
芽孢桿菌菌林的晶體/芽孢混合物時，存在120 kDa的蛋白質。發現溶解、 離心並透析之後獲得的此晶體/芽孢混合物的上清液能延長用傳染性伯氏 痴原蟲(7Vflw附0(/i'w附Z^rg/ie/)血才羊注射的小鼠的存活。該120 kDa蛋白質 的N端序列(15個胺基酸)顯示出和蘇雲金芽孢桿菌蠟螟亞種S層蛋白質N 端100%的同源性(Mesimge等，1998報導)。未提供此蛋白質編碼基因的 核苷酸序列，但據說編碼821個胺基酸殘基，推斷具有87.5kDa的分子量。 在此文獻中未測定分離或純化的蛋白質或生產此蛋白質的重組宿主針對痴 原蟲感染的功效。並且，此文章中沒有保藏或具體描述從中分離這種晶體/ 芽孢混合物的菌林。
發明概述本發明提供了分離的殺蟲ISLP蛋白質，其特徵在於
a) 對於一些害蟲具有特異性殺蟲活性，而對於其他害蟲則沒有，且
b) 與細菌S層蛋白質具有至少50。/o的序列同一性，以及這樣的蛋白質 其與SEQ ID NO: 2的蛋白質或其毒性片段具有至少50%的序列同一性，且 具有大約50到大約120 kDa的分子量。
本文還提供了分離的殺蟲ISLP蛋白質，其特徵在於
a) 對於一些昆蟲具特異性殺昆蟲活性，而對於其他昆蟲則沒有，
b) 與細菌S層蛋白質具有至少70。/。的序列同一性，
e)大約50到大約120kDa的分子量，以及這樣的蛋白質其與SEQID NO: 2的蛋白質或其毒性片段具有至少75%的序列同一性，且具有大約50 到大約120 kDa的分子量。
根據本發明還提供了如上文所定義的ISLP殺蟲蛋白質，含有SEQ ID NO: 2中始於第1位胺基酸和第31位胺基酸之間的胺基酸止於第863位氨基 酸的胺基酸序列，或者含有SEQ ID NO: 2中始於第1位胺基酸和第531位氨 基酸之間的胺基酸止於第863位胺基酸的胺基酸序列，例如含有SEQ ID NO: 2胺基酸序列的蛋白質。
本文還包括分離的編碼任一上述ISLP蛋白質的DNA序列及嵌合基因， 所述嵌合基因包含a)含有這樣的DNA的編碼序列，及b)允許在植物細胞 中表達的啟動子。在一實施方案中，這樣的嵌合基因含有的編碼序列是經 優化的合成DNA序列，以便在宿主植物特別是玉米、棉花、大豆、稻、油 菜、花椰菜及甘藍中表達。
本文還提供了含有此類上述嵌合基因的植物轉化栽體。
在本發明另 一實施方案中，提供了含有任一上述嵌合基因的轉基因植 物、種子或植物細胞，特別是玉米、棉花、大豆、稻、油菜、花椰菜及甘 藍的植物、種子或細胞。
蟲如昆蟲害蟲導致的損傷的方法，包括在所述植物的細胞中表達任一上述 嵌合基因的步驟；還有保護植物對抗以所述植物所屬的植物物種為食的植物害蟲例如昆蟲害蟲導致的損傷的方法，包括以任 一 上述嵌合基因轉化植 物細胞，將所述細胞再生為植物，和獲得含有任一這類嵌合基因的所述植 物的後代或繁殖材料例如種子的步驟。
本發明還提供了用於殺死害蟲的方法，包括用任一上述ISLP蛋白質接 觸所述害蟲，特別是這樣的害蟲是昆蟲類害蟲的時候；以及保護田間植物 對抗害蟲如昆蟲的方法，包括對田間植物應用任一上述ISLP蛋白質，或 者以含有此類蛋白質的殺蟲組合物的形式，或者以表達所述蛋白質的重組 生物體的形式，特別地，其中所述的生物體是表達此類蛋白質的轉基因植 物。
本文還提供了編碼任一上述ISLP蛋白質或其毒性片段的任一DNA、或 任一上述嵌合基因，或任一上述ISLP蛋白質在控制或殺死害蟲如昆蟲害蟲 中的用途。
本發明實施方案的詳細描述
本發明提供了用於減輕害蟲特別是昆蟲害蟲如鞘翅目(CW^/^ni/i) 或鱗翅目(/wVfe/^m )蟲害所導致的植物損傷的方法和手段。本發明還 提供了與從前描述的核酸序列和蛋白質截然不同的新的核酸序列和蛋白 質。這些核酸和蛋白質能用於控制害蟲如昆蟲害蟲，例如通過在植物或植 物細胞中整合併表達至少一種這些新核苷酸序列，或者通過用含有這些核 酸分子編碼的毒素的組合物來外部處理植物或植物部分。
本發明提供了新的來自於細菌菌林的殺蟲毒素，及其在控制害蟲例如 昆蟲中的用途。
根據本發明，"核酸序列"意指DNA或RNA分子，是單鏈或雙鏈形式， 其編碼本發明的任一ISLP蛋白質。本文使用的術語"分離的核酸序列，，不 局限於分離狀態的核酸序列，還包括不再處於其分離自的天然環境的核酸 序列。因而，才艮據本發明，"分離的ISLP核酸(序列)"或"分離的ISLP 蛋白質(序列)"包括相較於原始細菌生物體的另一細菌宿主中或在植物 核基因組中的核酸或蛋白質(序列)。根據本發明，術語"蛋白質"或"多肽，，可互換使用，是指由胺基酸 鏈組成的分子，而不考慮任何具體作用方式、大小、三維結構或來源。因
此，本發明ISLP蛋白質的片段或部分在本文仍稱為"蛋白質"。本文使用 的短語"分離的蛋白質"不局限於分離狀態的蛋白質，還包括不再處於其 天然環境的蛋白質。蛋白質的天然環境意指在其中該蛋白質能被從自然中 找到的環境，即核苷酸序列最初被分離自的菌林。例如，分離的蛋白質可 以體外存在，或是在另一細菌宿主或植物細胞中，或者其能分泌自另一細 菌宿主或植物細胞。
根據本發明，編碼新ISLP蛋白質的核酸序列，包括DNA序列，已被分 離和表徵，且通過DNA合成人工製備了新形式。本文所述的具體ISLP基因 命名為,'W屍7，而它編碼的蛋白質命名為ISLP1。
根據本發明，"ISLP"或"ISLP蛋白質"是殺蟲、特別是殺昆蟲蛋白 質，大約40到大約250 kDa，特別是約50到約120 kDa，或是約60到約100 kDa，尤其是大約80或大約100 kDa的蛋白質，分離或來源自細菌優選桿菌， 和已知的S層蛋白質如蘇雲金芽孢桿菌CTC的CTC2蛋白質(GenBank登錄 號AAR23791 )具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、優選至 少85%或90%的序列同一性或序列相似性；及其任何毒性片段(如本文定 義)或變體如前體蛋白質、成熟形式、或與信號肽、與選擇性標記蛋白質、 或與其他殺蟲或殺昆蟲蛋白質的融合蛋白質。本文使用的ISLP蛋白質的變 體包括與ISLP蛋白質免疫相關的殺蟲優選殺昆蟲蛋白質，從而它們能被識 別ISLP的抗體識別。本發明的ISLP優選來源於或見於厚壁菌門
(F,>w/cwtes)芽孢桿菌綱(5a"'〃i')的細菌中(或其上)。在本發明的另 一實施方案中，本發明ISLP來源於或見於芽孢桿菌目(5tf"7/fl&)細菌中
(或其上)。而在本發明另一實施方案中，本發明ISLP來源於或見於芽孢 桿菌科(5""7toce"e )細菌中(或其上)。在本發明另一實施方案中，ISLP 來源於或見於蠟狀芽孢桿菌群細菌中(或其上)、或見於短芽孢桿菌屬
(^Mv溈fld//^)或芽孢桿菌屬(5tf"7/附)，優選蠟狀芽孢桿菌、球形芽 孢桿菌(及印/^eWc"s)、炭疽芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(及/Zc/^mybmi&)和蘇雲金芽孢桿菌中(或其上)。根據本發明的ISLP蛋白質可以在細菌生 命周期的營養生長期和/或芽孢形成期產生，並且一般本質上是分泌型蛋白 質。根據本發明，ISLP蛋白質的毒性優選是特異性的，從而所述ISLP只對 於一些害蟲優選昆蟲有毒性，而非目標生物如哺乳動物不受影響。本發明 的一個實施方案中，ISLP蛋白質對於哺乳動物無毒，或易於在哺乳動物消 化系統中被降解。
本文使用的"成熟ISLP蛋白質"意指本發明缺少其細菌信號肽的ISLP 蛋白質。本文使用的ISLP蛋白質可以是有全長大小的蛋白質或是截短形 式，只要其殺蟲例如殺昆蟲活性或控制害蟲例如控制昆蟲的活性能保留即 可，或者可以是雜合或融合蛋白質形式的幾個蛋白質或蛋白質結構域的組 合。
在本發明一個實施方案中，ISLP蛋白質是殺蟲蛋白質，特別是殺昆蟲 蛋白質，特異性地對某些害蟲優選昆蟲有毒性，能夠形成晶體結構如晶格 陣列或天然細菌細胞外側的S層。本發明的一個實施方案中，這樣的ISLP 通常可在分離細菌如蘇雲金芽孢桿菌(Bt)的晶體/芽孢製品的操作中被分 離或共純化，不過它們與已知的細菌殺蟲或殺昆蟲毒素如蘇雲金芽孢桿菌 Cry、 VIP或Cyt蛋白質(見Crickmore等，1998和2005 )、或其它已知的 殺蟲或殺昆蟲細菌蛋白質如Bt蛋白質不具顯著的序列同一性，優選低於 40%、低於30°/。或低於20%的序列同一性。這些ISLP天然地見於細菌細胞 壁的外側r能夠在芽孢形成時釋放到細菌或芽孢的環境中。
在一實施方案中，ISLP是殺蟲特別是殺昆蟲蛋白質，包含三個S層同 源(SLH)區域，這些區域各自與SEQ ID NO: 2的S層同源區域具有至少 50°/o、或至少60%、或至少70%、特別是至少85%或90%的序列同一性或 相似性。本文使用的SEQ ID NO: 2的ISLP蛋白質的"S層同源區域"是SEQ ID NO: 2中第34-76位胺基酸的區域、第95-136位胺基酸的區域及第162-198 位胺基酸的區域。
如本文定義，本發明還提供了 ISLP蛋白質用於控制或殺死害蟲例如昆 蟲的用途，例如通過在田間播種種子或種植表達ISLP蛋白質的植物，或者通過對植物上或動物應用ISLP蛋白質來保護不受害蟲例如昆蟲損傷。還提 供了用於提高產率或增強作物生產力的方法，其包括培養含有編碼本發明 ISLP蛋白質的DNA的作物的步驟。
根據本發明，提供了用於自桿菌中分離ISLP蛋白質的步驟。在一實施 方案中，桿菌在分離ISLP蛋白質之前無需或無需太多的傳代培養步驟，因 為延長傳代會降低ISLP蛋白質的產量。可選的，自其中分離ISLP的桿菌可 以生長在易感害蟲優選昆蟲害蟲中，例如通過將其施加到它們的消化系統 或血淋巴中。該桿菌生產的ISLP蛋白質然後可以從害蟲如昆蟲中例如從它 的內臟或淋巴中分離，優選從那些在應用ISLP生產菌之後死亡的或顯示出 嚴重的生長抑制的害蟲或昆蟲中分離。在這個過程中，產生對於某個耙害 蟲例如昆蟲害蟲具高毒性的ISLP的細菌將很容易通過它們對於耙害蟲的 明顯效應來鑑定。同樣，優選靶害蟲和體內靶害蟲環境能誘導高水平的 ISLP蛋白質。通常ISLP蛋白質能從細菌中分離，例如從培養上清液特別是 離心後芽孢形成培養物、或像蘇雲金芽孢桿菌的Cry蛋白質那樣一般被富 集和分離。本文使用的術語"桿菌"意指杆狀細菌。這些包括芽孢桿菌綱、 芽孢桿菌目或芽孢桿菌科的細菌，例如蠟狀芽孢桿菌群的細菌，或芽孢杆 菌屬的細菌例如蘇雲金芽孢桿菌。
在本發明的一實施方案中，提供了用於分離新的殺蟲優選殺昆蟲ISLP 蛋白質，特別是對於鱗翅目或鞘翅目昆蟲有毒性的ISLP蛋白質的方法。這 樣的方法包括步驟篩選殺蟲(優選殺昆蟲)桿菌(優選Bt)培養物中與 ISLP具有高度序列相似性的基因，特別是在殺蟲(例如殺昆蟲)的桿菌菌 林(優選Bt菌抹)中，在PCR分析中Cry或VIP基因陰性，特別是在對於某 些害蟲顯示出特異性毒性而不對其它害蟲作用的菌林中。這樣的具有高度
的S層同源區域的引物，例如ISLP1的S層同源區域)來識別。然後可以分 離出相應的基因並通過重組表達技術生產新的ISLP蛋白質。
本文使用的"kDa"意指以千道爾頓表示的蛋白質分子量大小。本文 與術語"大約" 一起使用或就約數("約80kDa")而言的"kDa"，意指在標準的蛋白質SDS-P AGE/Western印跡(即十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯 胺凝膠電泳/蛋白質分析)中與分子量標準相比觀察到的分子量。 SDS-PAGE/Western印跡使用標準技術進行。優選蛋白質或蛋白質片段通 過免疫交叉反應(例如Western印跡)或通過其特徵(例如S層蛋白質或其 片段的典型蛋白質特徵)證實為ISLP蛋白質。
本文使用的"S層蛋白質"或"表面層蛋白質，，意指分泌自生產它的 細胞的蛋白質，並且在原核生物特別是細菌表面能形成晶格陣列或點陣。 此類點陣多數通過蛋白質亞基自組裝形成於原核生物表面，因而形成平坦 的晶體層面。例子有Luckevich和Beveridge ( 1989) 、 Sleytr和Beveridge
(1999)及Mesnage等(2001 )所述的S層蛋白質，特別是Bt菌林的S層蛋 白質CTC ， GenBank登錄編號AAR23791的S層蛋白質。
ISLP蛋白質的一個例子是本發明的ISLP1蛋白質。根據本發明，
"ISLP1蛋白質"意指包含保留殺昆蟲活性的SEQIDNO: 2胺基酸序列的 最小毒性片段(下文稱為"最小ISLP1毒性片段")的任何蛋白質，特別 是包含SEQ ID NO: 2中始於第1位胺基酸和第31位胺基酸之間的胺基酸止 於第863位胺基酸的胺基酸序列的任何殺昆蟲蛋白質，或是含有SEQ ID NO: 2中始於第1位胺基酸和第531位胺基酸之間的胺基酸止於第863位氨 基酸的氨基斷列的任何殺昆蟲蛋白質，或是含有來自SEQ ID NO: 2蛋白 質的蛋白酶消化特別是胰蛋白酶消化片段的胺基酸序列的任何殺蟲蛋白 質，特別是通過胰蛋白酶消化自SEQIDNO:2成熟蛋白質得到的約30、約 40、約50或約60 kDa的蛋白質。本文包括ISLP1蛋白質與植物信號肽如葉 綠體轉運肽融合而產生融合蛋白質。這包括含有SEQ ID NO: 2胺基酸序列 的最小毒性片段的雜合或嵌合蛋白質。本文使用的ISLP1蛋白質中包括 SEQIDN0.2蛋白質的殺昆蟲蛋白質水解片段，優選胰蛋白酶消化片段， 或SEQ ID NO. 2蛋白質的任何殺昆蟲有效片段，以及含有某些胺基酸缺 失、添加或替換而仍保持全部或多數ISLP1蛋白質殺昆蟲活性的其變體或 等同體。本文包括成熟的ISLP蛋白質，缺少其信號肽或具有以甲硫氨酸或 以Met-Ala或Met-Asp二肽替換的信號肽。在本定義中還包括SEQ ID NO: 2胺基酸序列的變體，如與SEQ ID NO: 2基本上相似的胺基酸序列，在胺基酸序列水平上具有至少70%、或至少 75%、 80%、 85%、卯％、 95%、 97%、 98%或99%的序列同一性。在本 發明上下文中，"序列同一性，，可以使用威斯康星(Wisconsin) GCG包(麥 迪遜，威斯康星，美國，第10,2版)的GAP程序用成對比對來確定。對於氨 基酸序列比較GAP程序使用下列參數'blosum62，得分矩陣、'空位建 立罰分，(或'空位權重，)為8、而'空位延伸罰分'(或'長度權重，) 為2。根據本發明的殺昆蟲蛋白質可能有一些胺基酸添加、替換或缺失而不 會顯著改變或降低蛋白質的殺昆蟲活性。
本文使用的術語"包含"應被闡釋為規定存在所提及的所述特徵、要 素、步驟或組分，但不排除存在或增加一個或多個特徵、要素、步驟或組 分或其群組。因此，此處提到的"包含序列或區域X"的DNA或蛋白質意 指至少包括或含有該序列或區域X的DNA或蛋白質，因此其它核苷酸或氨 基酸序列可包含在5，(或N-末端)和/或3，(或C-末端)端。例如，核苷酸 序列可以包含編碼轉運肽和/或5，或3，前導序列的核苷酸序列。
本文使用的ISLP蛋白質的"毒性片段"是ISLP蛋白質的片段或部分， 其保留一些或全部、優選多數殺蟲(優選殺昆蟲)成熟ISLP蛋白質的毒性。 一般此類毒性片段通過剪切信號肽或通過酶促消化全長或成熟ISLP蛋白 質獲得，例如通過害蟲優選昆蟲腸道酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或其它 在靶害蟲消化系統中有活性的蛋白酶例如靶昆蟲中腸消化酶來消化。 一般 此類毒性片段具有大約40到大約80 kDa的分子量，優選大約50或大約60 kDa 。本發明ISLP1蛋白質的毒性片段是大約50 kDa的胰蛋白酶消化片段。 ISLP蛋白質的"最小毒性片段"是ISLP蛋白質的最小毒性的片段。這樣的 最小毒性片段可以通過酶促切割或通過表達具有核苷酸缺失的/^p DNA來 獲得。編碼毒性ISLP片段的DNA還可以是化學合成的，因此，毒性片段的 定義包含可從轉錄和翻譯合成DNA獲得的毒性片段。包含最小ISLP毒性片 段的任何蛋白質都可用於本發明，並且不僅僅是原始或成熟的ISLP蛋白 質，因為對於毒性並非必需的胺基酸序列可以被缺失或被其他序列替換而仍保持ISLP蛋白質的特徵。
ISLP蛋白質的毒性片段還可以通過細菌自溶時ISLP蛋白質的降解和 溶解作用來獲得，例如在害蟲消化系統中，如昆蟲的中腸裡，或是在體外 培養物的芽孢形成時獲得。出現了仍然能被抗ISLP抗體免疫檢測的更小更 可溶的片段，並且能在自溶後用常規技術如抗體介導的純化來鑑定或分離。
本文使用的"靶害蟲，，是害蟲，優選昆蟲，其能被ISLP所殺死或負面 影響(例如抑制其生長)。當以此害蟲或昆蟲感染產ISLP蛋白質的細菌或 以之為食時，或以含有分離的ISLP蛋白質的食物餵養時，所述害蟲或昆蟲 顯示出高於對照水平的毒性。
本發明ISLP蛋白質可能的鱗翅目靶昆蟲包括但不限於美洲棉鈴蟲 (T7e/,V^v^7 fl )、才帛螟蛉(^^//"^"/ " flfr附/gem)、澳洲衝帛鈴蟲(^Te/Zcover/m 戸"c&em)、煙芽夜織(//^//。幼& Wre5re—、歐洲玉米螺(OstWm'fl wMa/is)、 草地夜蛾(S/wrfo/)teni /,wg^"f/fl)、小地老虎(」g/""ris ^w7fl")、才帛紅鈴蟲 (戶e"/"o/^/Yi gos柳/C/a)、 三化螺(5W /ro/7/r嘆ff /"ce怖/"s)、 稻縱巻葉螺 (Oifl/ /rflf,c&附eflf,Vm//51)、 大螟(5^s"wwVi /w/ere"51)、 玉米斑點螟(CA//o /;fl故〃w51)、 黎豆夜蛾(Jwricflm'" ge附附fftoto)、 大豆夜餓(屍5^"d印/w5i'fl /"c/"rfms)、 大豆食心蟲(E/;/"6^tf ""miiff)和i tfc鄉/"5i" /im 。
本發明ISLP蛋白質的其它可能靶昆蟲選自苜蓿綠夜蛾(屍/a^y/^mi scfl6,fl)、 甜菜夜械(S/wflfo>/7tera ex/g"fl)、 黃斑夜械(iS^o^/o/;feni Of7i欣og"///) 、 二化螺(C緒o s"/7pr柳fl嗣、/yem'togm附附fl //cfln's"fc、 稻 螺玲(7V((WYmgfl 、稻眉目艮蝶(聊c"/es/s1 、 A/ams/mVi
/m加fl/Zs、牙舀顯紋席'J須野螟(Manw附/fl exZgim)、 Manjw附/a f^ra"s、 三點7jC 螟、 稻白螟(5Wr/;o/ /r"g 'Vmo加")、斜紋夜蛾
sflccAani/Zs), 草地夜蛾、粘蟲(柳,/r/zmia朋—《"")、 C緒o zamm/附和直 統稻弄蝶CP"r""m gwftfl似)、楊毛臀螢葉曱(v4ge/flwft'cfl fl/m〕、苜蓿葉象 (//"mi "Wcfl)、6屍朋w"]pe朋/s、 i7a/ft.cfl to附6a"'"fl、 墨西哥衝帛鈴 象(/4w幼owo附"51 gnmrf/s)、 黃粉蟲(J^we6Wo附C/to,)、 赤才以谷盜(7W'6o/ew附稻負泥蟲
(Ow/e附a oz^"e) 、 Cote/7is1 6rw""gfl 、 稻7_K象甲(Zis5wAt7r/;/rM51 r fjzof屍A Z/"51)、 黃曲條跳甲(屍/^〃o^e紐crw"/e,ae)、黃曲條跳甲(PAj;//o^^fl 5tn》/"似)、油菜蚤跳甲(i^j;〃/6Jflfes1 pw/ic似/ff似)、芫胥紅葉甲CEyito附05^e/is fl附eWc"wfl)、 油菜露尾曱(MeZ/g^幼es aeMe附)、Owto/jwc/iMS 、 油菜藍 跳曱(屍s^"》""c/ro^oce/ /^/fl)、婉豆細紋跳曱(屍/y;"o""" w"rf"/"to)、馬 鈴薯曱蟲 (Xe/;ftViotoraflr flfece附/iVieflto)、 黃瓜葉甲 (D/flAraric" ""flfe"Vw/;""c似to Mrtflfe"7w屍"/i""to)、 黃瓜十 一 星葉甲(Z)/fl6raft'c" wrtded附/ wwc似似/^Hvzn/、 北部玉米食才艮蟲(Z)zV^ra,Zcfl Afl屍6eW)和西部食 才艮蟲(Z)/flA屍W/cfl v//^/em)。
本文使用的術語"islpDNA"或"ISLPDNA"意指編碼ISLP蛋白質 的任何DNA,例如編碼如上文所定義的"ISLP1蛋白質"的DNA，如SEQ ID NO: 1所示的&//^/ DNA，特別是自第325位核苷酸到第2913位核苷酸， 優選自笫412位核苦酸到第2913位核苷酸。這包括編碼SEQ ID NO: 2蛋白 質或如上文所定義的其毒性片段或變體的天然產生的人工或合成的DNA 序列。本文還包括編碼殺昆蟲蛋白質的DNA序列，其與編碼本發明ISLP 蛋白質的DNA足夠相似，從而能夠(即具有能力)在嚴格雜交條件下與這 些DNA序列雜交。
本發明還包括根據本發明分離的islp基因的任何啟動子及其用途，例如 SEQIDNO:l的fe/j^ DNA的啟動子區域，其能夠提供用於細菌表達的強 啟動子。本文使用的&//;/ DNA的啟動子包含SEQ ID NO: l中第l位至第 324位核苷酸的序列。
本文4吏用的"嚴格雜交條件"特別指下列條件在濾膜上固定相應的 DNA,並將濾膜在42。C於50。/。甲醯胺、5% SSPE、 2 x Denhardt，s試劑和 0.1% SDS中預雜交1到2小時，或者在68'C於6xSSC、 2 x Denhardt，s試劑 和0.1% SDS中預雜交1到2小時。然後直接把變性(地高辛或放射性)標記 的探針加入到預雜交液中，並在上述的合適溫度下進行孵育16到24小時。 在孵育後，在室溫於2xSSC、 0.1% SDS中洗塗濾膜30分鐘，繼以在68。C於0.5xSSC和0.1。/0 SDS中洗滌兩次，每次30分鐘。在-70。C利用增感屏通 過曝光濾膜24到48小時到X光片(柯達XAR-2或等同物)來完成放射性自 顯影(20xSSC = 3M NaCl和0,3M檸檬酸鈉；100 x Denhardt，s試劑 =2%~ )牛血清白蛋白，2%(w/v) Fieoll 及2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮； SDS =十二烷J^危酸鈉；20 x SSPE- 3，6 M NaCl， 0.2 M磷酸鈉和0.02 M EDTA pH7.7)。本領域普通技術人員能容易地改良上面說明的具體條件 和參數而保持期望的嚴格雜交條件。
對於分離本發明DNA序列的變體有很多本領域已知的方法。例如，變
林如桿菌特別是芽孢桿菌屬物種中檢測和分離。可以製備/s/p DNA序列區 域的特異性或簡併引物，並用來擴增已知或新細菌菌林的變體。
本發明&//; DNA的變體包括編碼上述ISLP蛋白質變體的DNA序列，或 編碼與本發明islp DNA序列如SEQ ID NO: 1、優選第412位至笫2913位核 苷酸具有至少60%、至少65%、至少70%、 80%或90°/。同一性的殺昆蟲蛋 白質的DNA序列。提及的序列同一性利用威斯康星GCG包(麥迪遜，威斯 康星，美國)第10.2版的GAP程序計算。對於核酸GAP程序使用下列參數 "nwsgapdna，，得分矩陣，"空位建立罰分"(或"空位權重，，)為50， 而"空位延伸罰分"(或"長度權重")為3。嚴格雜交條件如上文所定義。
本文使用的ISLP蛋白質的"殺昆蟲活性"意味著當用此蛋白質餵養昆 蟲(優選通過在重組宿主例如植物中表達)時，此蛋白質殺死昆蟲的能力。 如杲蛋白質在至少一個昆蟲發育階段(優選幼蟲階段)具有殺死昆蟲的能 力，就應理解為其具有殺昆蟲活性。
本文使用的蛋白質的"昆蟲控制量"意指足以將以植物為食的處於任 何發育階段(例如昆蟲幼蟲)的昆蟲所導致的植物損傷的限制在商業上可 接受水平的蛋白質的量。限制昆蟲對植物的損傷可能是例如殺死昆蟲或抑 制昆蟲發育、繁育或生長的結果，從而昆蟲對植物造成的損傷更小，且植 物產率不會被顯著地不利影響。本文使用的"控制"昆蟲意味著當用本發 明ISLP蛋白質處理時獲得至少顯著的(高於對照值)對於昆蟲的生長抑制、發育延遲或繁育抑制。
根據本發明，易感於本發明新ISLP蛋白質的昆蟲接觸昆蟲控制量、優 選殺昆蟲劑量的蛋白質。本發明蛋白質的優選靶昆蟲是，特別在歐洲、北 美和南美國家、亞洲和澳大利亞，對玉米、棉花、稻、大豆、蔬菜植物、
芸苔屬物種的才直物、歐洲油菜(Bmsw'c"/m;uis)、花椰菜、胡蘿蔔、豌豆、 小麥、大麥、黑麥、番茄、馬鈴薯、甜菜、切花、玫瑰、水果植物(蘋果、 梨、桃、草莓等)、樹(如白楊和柳樹)及萵苣經濟上有害的昆蟲害蟲。 本文使用的術語"植物"包括整個植物還有植物的部分如葉、莖、種子、 花或根。
本文使用的ISLP蛋白質的"殺蟲活性，，意指蛋白質殺死、致病、抑制 生長或以其他方式負面作用於所有或部分植物或動物害蟲生物體例如某些 節肢動物、線蟲、蟎、蛘蟲、蒼蠅、細菌、病毒、真菌等的活性。本文使 用的植物或動物害蟲生物體是任何的活的生物體，它能通過導致部分或全 部植物或動物感染、疾病或死亡、或以其他方式抑制生長、使這樣的植物 或動物(優選這些是更小的生物體例如無脊推動物)喪失能力或對其負面 影響來對植物或動物包括人類導致損傷。能夠將害蟲生物體傳遞給植物或 動物的媒介生物也被認為是本文所用的害蟲生物體，例如諸如蚊子或螳埤 的害蟲。
插入到表達栽體來生產大量的ISLP蛋白質。ISLP蛋白質可用於以常規方式 (服fte等,1988; Harlow和Lane， 1988)製備特異性單克隆或多克隆抗 體。
在本發明一個實施方案中，提供了特異性結合ISLP蛋白質的抗體。特 別是提供了結合ISLP蛋白質或其片段或變體的單克隆或多克隆抗體。還包 括單克隆或多克隆抗體的片斷，其保留結合用於產生它們(例如單鏈抗體) 的ISLP蛋白質或片斷的能力。ISLP蛋白質的抗體可以通過本領域已知的方 法、使用1SLP蛋白質作為動物(例如兔或小鼠)體內的抗原來製備。用來 製備抗體的合適的方法包括Harlow和Lane《抗體使用實驗室手冊》("Using Antibodies: A Laboratory Manual")(紐約冷泉港實驗室出版社， 1998)和Liddell和Cryer《單克隆抗體實用指南》("A Practical Guide to Monoclonal Antibodies") ( Wiley和Sons， 1991)中描述的那些。抗體可用 於分離、鑑定、表徵或純化其與之結合的ISLP蛋白質。例如，抗體通過允 許抗體和蛋白質形成免疫複合物並檢測免疫複合物的存在，例如通過
ELISA或免疫印跡法，可用於檢測樣品中的ISLP蛋白質。
本發明的另 一實施方案中提供了用於檢測ISLP DNA序列的PCR引物 和/或探針及試劑盒。用於從樣品中擴增本發明中植物優化的ISLP DNA的 PCR引物對(其中每個引物長至少15到25、優選至少18或20個核苷酸)可 以基於該ISLP序列例如ISLP1序列通過本領域已知的方法來合成(見例如 Dieffenbach和Dveksler (1995)《PCR引物實驗室手冊》(屍C/ 戶W附w/4 丄fl6omtoo; Af朋鄉/), 冷泉港實驗室出版社及McPherson等(2000) PC7 -5"s/^.' F/wm 5"c/^rawwd似5ewcA，第一版，德國施普林格出版社 (Springer Verlag)。同樣的，SEQ ID NO: l序列的DNA片段、特別是在多 種細菌(優選桿菌)S層蛋白質中具有高度同源性的區域的部分，例如SLH 區域(Mesnage等，2001， Microbiology 147， 1343-1351 )，如上述ISLP1的 SLH區域，可以用作雜交探針。ISLP檢測試劑盒可能含有ISLP特異性引物 或者ISLP特異性探針，以及隨附的使用所述引物或探針來檢測樣品中ISLP DNA的說明書。例如，此類檢測試劑盒可用來確定是否植物已經被編碼本 發明ISLP蛋白質(或其部分)的基因所轉化。
因為遺傳密碼的簡併性，某些胺基酸密碼可以為其它替換而不會改變 蛋白質的胺基酸序列。此外， 一些胺基酸可以被其他等同胺基酸取代而不 改變或不顯著改變蛋白質的殺蟲優選殺昆蟲活性，或至少不降低蛋白質的 殺蟲優選殺昆蟲活性。例如，胺基酸取代包括同類的互換胺基酸鹼性(如 Arg、 His、 Lys)，酸性(如Asp、 Glu)，非極性(如Ala、 Val、 Trp、 Leu、 Ile、 Pro、 Met、 Phe、 Trp、 Gly)及極性(i口Ser、 Thr、 Tyr、 Cys、 Asn、 Gln)。只要ISLP蛋白質的殺蟲活性基本上相同或並未降低至獲得害 蟲控制例如昆蟲控制所需的水平之下，這樣的同類取代均落於本發明的範圍之內。此外，只要ISLP蛋白質的殺蟲活性基本上是相同或並未降低，非 保守胺基酸取代落在本發明的範圍之內。本發明DNA序列的變體或等同體 包括編碼本文定義的ISLP的DNA序列，在嚴格雜交條件下能與SEQ ID NO: 1的ZW:PDNA序列雜交。此類變體或等同體應編碼與本發明蛋白質具有相 同或基本上相同的殺蟲特性的蛋白質，而其他特性例如熱穩定性或對蛋白 酶切割的易感性可以被改變。在某些情況下可優選獲得毒性相同或大致相 似但熱穩定性較低或胃蛋白酶敏感性較高的毒性ISLP，且此類變體可以通 過已知用於隨機誘變和篩選的步驟，或通過定點突變本發明的ISLP蛋白質 (例如通過在ISLP蛋白質中引入胃蛋白酶切割位點，見WO 02074799 )來 製備。本文使用的變體或等同體還包括這樣的DNA序列，其與本發明天然 ZSX戶基因相比具有不同的密碼子利用，但編碼具有相同殺蟲活性並具有相 同或基本上相同的胺基酸序列的蛋白質。Z5丄戶DNA序列可以通過調整密 碼利用，使之成為植物基因，特別是目的植物屬或種(即期望通過可用的 密碼子表而從中表達ISLP蛋白質的植物屬或種)的天然基因中最優選的， 來進行密碼子最佳化(例如更適於在棉花、大豆、玉米或稻中表達)。
對於植物或其他真核生物中的表達，在本發明ISLP基因中要避免、去 除或減少長鏈的AT或GC核苷酸(如6個或以上的A或T核苷酸鏈或6個或以 上的G或C核苦酸鏈)，並可以引入合適的限制性位點。
此外，ISLP蛋白質的N-末端可以進行修飾，以使之具有最佳的翻譯起 始環境，由此在蛋白質的N-末端添加或缺失一個或多個胺基酸。在多數情 況下，優選欲在植物細胞中表達的本發明蛋白質以Met-Asp或Met-Ala二肽 起始，以進行最佳的翻譯起始，因此有時需要在/S丄戶DNA中起始密碼子 的下遊插入編碼Asp或Ala胺基酸的密碼子作為新的第二個密碼子(如果此 第二個密碼子並不已經是Ala或Asp的話)。
DNA序列還可以進行修飾，以去除不合理的剪接位點或轉錄終止信 號。因為細菌基因可能包含被其他宿主特別是真核宿主如植物識別為5，或 3，剪接位點或轉錄終止信號的基序，在那些其他宿主中的轉錄可能無效或 可能過早地終止。可以通過基於計算機的DNA序列分析和/或通過本領域已知的PCR分析來鑑別不合理的剪接位點或轉錄終止信號。
可根據具體的目的來構建密碼子利用不同但編碼具有基本上相同的殺 蟲活性的相同蛋白質或相似蛋白質的任何DNA序列。已描述在原核和真核 表達系統中改成宿主細胞的密碼子利用有助於異質宿主中的基因表達
(Be隱tzen和Hall， 1982; Itakura等，1977)。在文獻(Wada等，19卯； Murray等，1989 )和主要的DNA序列資料庫(如位於德國海德堡的EMBL ) 及如Nakamura等(2000)所述中可找到密碼子利用表。相應地，本領域普通 技術人員能容易地構建合成的DNA序列，以生產相同或基本相同的蛋白 質。顯而易見的是， 一旦知道了本發明ISLP蛋白質的胺基酸序列，就可以 製備可選的DNA序列。此類可選的DNA序列包括合成的或半合成的DNA 序列，為使基因中某些位點失活，所述序列已經被改變。這種失活作用可 以通過例如使整體密碼子利用情況調整成更為相關的宿主生物(例如希望 在其中進行表達的宿主生物)的密碼子利用來實現。用於將密碼子利用改 變成宿主細胞優選的多種技術可以在專利和科學文獻中找到。只要多數或 全部密碼子調控序列或加工元件(如植物多聚腺苷酸信號和剪接位點)為 其他序列所替換，並優選編碼區域的AT含量接近宿主生物，確切的密碼子 利用改變的方法在本發明中並非關鍵。
例如上述的對DNA序列的小的修飾可以常規進行，例如通過PCR介導 的誘變(Ho等，1989; White等，1989)。通過使用可用的技術從頭DNA 合成期望的編碼區可以對DNA序列常規地進行的更為大量的修飾。
短語"基本上相同"當在這裡用於指ISLP蛋白質的氨基,列時，意 指與相比較的蛋白質胺基酸序列的差異不超過5%或不超過2% (如果一個 蛋白質較小，則是對於相同長度的區域而言)的氨基^列。當指ISLP蛋 白質的毒性時，短語"基本上相同"意指蛋白質與相比較的蛋白質得到的 平均LCso值比，其平均LCs。值相差不超過2-5倍，優選2倍。本上下文中，
"平均LCso"是導致測試種群50%死亡率的蛋白質濃度，從三次使用相同 生物測定條件進行的獨立生物測定計算而來。用Probit分析、使用程序 POLOPC(來自LeOra軟體，1987，伯克利，加利福尼亞州)計算LCs。值。可以理解，為了確定LC別值是否存在統計學顯著差異，對兩比較蛋白質中 每一個的LCso值計算95。/。(或90%)的置信限度(用Probit分析計算的一 個相關參數)。在本發明一個實施方案中，在使用適當對照的相同或可比 試^i殳置中，可以看到如果置信P艮度重疊，兩個蛋白質的毒性基本上相同， 如果置信限度不重疊則基本上不同。
體並轉化到細菌菌林例如大腸桿菌或其他細菌菌林中，優選在其他桿菌如 蘇雲金芽孢桿菌中。在本發明的一個實施方案中，為在細菌中表達，在DNA 構建體中納入了編碼ISLP蛋白質細菌信號肽或適合的其他細菌信號肽(例 如來源於宿主細胞產生的分泌蛋白質的信號肽)的DNA序列。然後可以通 過常規的克隆免疫探測方法(French等，1986)用針對ISLP蛋白質製備的 單克隆或多克隆抗體來篩選表達毒素的克隆。
可以篩選細菌克隆用於生產ISLP蛋白質(細胞裂解液或上清液可使用 標準方法跑SDS-PAGE膠並進行標準的western印跡步驟)，細菌或純化或 半純化的ISLP蛋白質可以使用本領域已知或在下面所述的方法檢測其相 比於對照細菌的殺蟲活性。還可以使用標準PCR方法如RT-PCR分析克隆 中編碼ISLP蛋白質的mRNA的存在情況。
可以常^L的方式對編碼本發明ISLP蛋白質的基因進行測序(Maxam 和Gilbert， 1980; Sanger, 1977 )來得到DNA序列。
序列比較顯示&// 基因和以前所述的編碼殺蟲特別是殺昆蟲的細菌毒 素的基因不同，且屬於一類新的基因，編碼與細菌優選桿菌S層蛋白質具 有顯著序列同一性的殺蟲或殺昆蟲蛋白質。
可以在基因序列分析之後以常規的方式製備。ISLP蛋白質的胺基酸序列可 以由分離的DNA序列確定。短語編碼ISLP蛋白質的DNA序列的"殺蟲有 效部分(或一部分或片段)"本文也稱為"截短的基因"或"截短的DNA"， 本文使用意指編碼本文定義的ISLP蛋白質毒性片段的DNA序列。
為了在大腸桿菌、其他細菌菌林或植物中表達編碼本發明ISLP蛋白質的DNA序列所有的部分或殺蟲有效部分，可以在DNA序列側翼引入合適的 限制性位點。這可以用熟知的方法(見例如Stanssens等，1989; White等， 1989)通過定點誘變來進行。為提高植物中的表達，本發明的/5X屍基因或 /5X戶基因殺蟲有效部分可以依據PCT出版物WO 91/16432和WO 93/09218 和出版物EP 0 385 962、 EP 0 359 472和US 5，689,052進行修飾來形成等同 的、修飾的或人工基因或基因部分。/S丄屍基因或基因部分還可以插入到植 物的質體(如葉綠體)或線粒體基因組中，並使用合適的啟動子在那裡表 達(見例如McBride等，1995; US 5,693,507 )。
為了增強單子葉植物例如玉米或稻中的表達，可在嵌合基因中添加內 含子(例如單子葉內含子)。例如，在5，調控區添加玉米^/W基因內含 子已表明增強玉米中的表達(Callis等，1987)。同樣地，如US 5,859,347 中所述，HSP70內含子可以用於增強表達。T5XP基因的DNA序列或它的毒 性片段還可以改變為翻譯不確定方式。通過定點內含子插入和/或通過對 密碼子利用引入變化，此類改變可能修飾抑制基因部分中存在的DNA序 列。密碼子利用變化可以是例如調整密碼子利用，使之成為植物，特別是 宿主植物最優選的，而不改變或不顯著改變編碼的胺基酸序列。
根據本發明的一個實施方案，蛋白質可以靶向到植物細胞中的胞內細 胞器，如質體(如葉綠體)、線粒體，或可能從細胞中分泌出去。為了這 個目的，在本發明一個實施方案中，本發明嵌合基因包含編碼信號肽或乾 向肽的編碼區，優選植物信號肽或靶向肽，連接於本發明ISLP蛋白質的編 碼區。可能包含在本發明蛋白質中的肽是用於葉綠體或其他質體把向的轉 運肽，例如來自植物基因的重複轉運肽區域，其基因產物被耙向到質體中， Capellades等(US 5,635,618)的經優化轉運肽、菠菜中的鐵氧還蛋白質 -NADP+氧化還原酶的轉運肽(Oelmuller等，1993) 、 Wong等(1992)所 述的轉運肽及PCT專利公開WO 00/26371中的耙向肽。可選的肽包括那些 傳導連接於此類肽的蛋白質分泌信號的肽，例如馬鈴薯蛋白酶抑制劑II的 分泌信號(Keil等，1986)、稻a澱粉酶3基因的分泌信號(Sutliff等，1991) 及菸草PR1蛋白質的分泌信號(Cornelissen等，1986)。根據本發明有用的信號肽包括葉綠體轉運肽(例如Van Den Broeck 等，1985),或US5，510，471和US5，635，618中經優化的導致蛋白質轉運到 葉綠體的葉綠體轉運肽、分泌信號肽或將蛋白質耙向到其他質體、線粒體、 內質網或其他細胞器的肽。在天然靶向或分泌蛋白質內可以找到用於靶向 到胞內細胞器或用於分泌出植物細胞或靶向到細胞壁的信號序列，例如 K16sgen等(1989 ) 、 K16sgen和Weil (1991) 、 Neuhaus和Rogers (1998 )、 Bih等(1999 ) 、 Morris等(1999 ) 、 Hesse等(1989 ) 、 Tavladoraki等(1998 )、 Terashima等(1999) 、 Park等(1997) 、 Shcherban等(1995)所述的那 些，所有這些引入本文作為參考。可選的信號序列包括來自玉米、棉花、 大豆或稻的靶向或分泌蛋白質的信號肽序列。
為使ISLP蛋白質分泌到轉化的宿主細胞的外面，可以將適當的分泌信 號肽融合到ISLP蛋白質的氨基末端(N-末端)。同樣，任何天然細菌分泌 信號肽可以淨皮缺失或替換為二肽Met-Ala或Met-Asp或另一信號肽如上述 的植物分泌信號肽。特別地，本發明ISLP蛋白質例如SEQ ID NO: 2所示 ISLP1蛋白質的第l-29位胺基酸包含細菌信號肽。可以移除第l-29位氨基 酸，或將其替換為甲硫氨酸或Met-Ala或Met-Asp二肽，或替換為合適的信 號肽例如上述的植物信號肽。信號肽可以使用基於計算機的分析(使用程 序如信號肽搜索程序(SignalP Vl.l或2.0)、使用合適的矩陣(如用於原 核革蘭氏陽性菌)和閾值分少於0.5、閾值分數為0.25或更小(見例如Von Heijne、 Gunnar， 1986和Bendtsen等，2004)，或通過與具有已知信號肽 的相似蛋白質比對來檢測。
此外，可以使用本領域已知方法(見例如VanRie等，1990)計算本發 明ISLP蛋白質的結合特性，來確定是否本發明ISLP蛋白質能結合害蟲如昆 蟲內臟中不被其他細菌蛋白質識別(或竟爭)的位點。和已知殺昆蟲蛋白 質例如Cry、 Cyt或VIP毒素家族的Bt毒素相比，能結合相應易感昆蟲的不 同結合位點的一類新的殺昆蟲蛋白質很有價值。此類蛋白質可以用來代替 昆蟲已經對於其具有抗性的已知細菌蛋白質，或用來與具有不同作用方式 的殺昆蟲細菌蛋白質聯合來防止或延緩昆蟲對細菌蛋白質抗性的發展，特別是在植物中(優選同時)表達的情況下。因為本發明的ISLP毒素的特性， 它們尤其可用於轉化植物例如單子葉如玉米和稻以及和雙子葉如棉花、蔬 菜作物、豌豆和大豆，來保護這些植物免受昆蟲損傷。本發明ISLP蛋白質 的作用方式和當前用於轉基因植物產品的已知Bt毒素如桿菌的Cry或VIP 蛋白質相比是不同的。此類結合特性可以通過如上面或美國專利6，291，156 和6，137，033所述的常規結合測試來測定。
特別是出於對特定昆蟲害蟲的昆蟲抗性管理目的，優選本發明的ISLP 聯合另一昆蟲控制蛋白質特別是細菌Cry蛋白質例如CrylF、 Cry2A或 CrylAc蛋白質或VIP或VIP樣蛋白質如VIP3A，優選對於此類ISLP蛋白質 識別的至少一個結合位點不識別的蛋白質。與本發明ISLP蛋白質聯合的特 別是在植物(例如玉米、棉花、芸苔屬物種(例如花椰菜或甘藍)、稻或 大豆植物)中同時表達的合適的昆蟲控制蛋白質包括，但不局限於Cry 蛋白質如CrylB、 CrylC、 CrylD或CrylE蛋白質或其毒性片段；包含CrylF 毒性片段的蛋白質或來源於CrylF蛋白質的雜合蛋白(例如US 6，326，169、 US 6,281,016、 US 6，218，188中所述的雜合CrylA-CrylF蛋白質或其毒性片 段)；包含CrylA型蛋白質或其毒性片段的蛋白質，優選CrylAc蛋白質或 來源於CrylAc蛋白質的雜合蛋白(例如US 5,880,275中描述的雜合 CrylAb-CrylAc蛋白質)或如在EP451878中所述的包含CrylAb蛋白質或 其殺昆蟲片段；包含Cry2Ab蛋白質毒性片段的蛋白質，例如在美國專利 6,489,542中描述的Cry2Ab蛋白質-轉運肽融合蛋白質；包含如 WO02/057664中所述Cry2Ae、 Cry2Af或Cry2Ag毒性片段的蛋白質；包含 如WO01/47952中所述的Cry蛋白質毒性片段的蛋白質；包含如Estruch等 (1996)及US 6，291,156所述的VIP3Aa蛋白質或其毒性片段的蛋白質；如 WO98/50427所述來自致病桿菌屬物種(Xew^^Mws spp.)的殺昆蟲蛋白 質；來自於沙雷氏菌屬(Scrarifl)(特別來自嗜線蟲沙雷氏菌 ^似/ 0/^//"))或光桿菌屬物種(屍/^似^"/^附)菌林的殺昆蟲蛋白質，例如在 WO98/08932中所述來自光桿菌的Tc蛋白質(例如Waterfield等，2001; Ffrench-Constant和Bowen， 2000)。在一實施方案中，此類共表達通過用編碼本發明ISLP蛋白質的DNA轉化已經表達昆蟲控制蛋白質的植物、或是 通過以已知昆蟲控制蛋白質轉化的植物和以一個或多個本發明ISLP蛋白 質轉化的植物雜交能容易地得到。對於玉米、稻、棉花或大豆植物，可以 使用ISLP蛋白質作為第一個昆蟲控制蛋白質，並使用CrylAb、 CrylAc、 Cry2Ae或VIP3Aa蛋白質或包含它們毒性片段的蛋白質、雜合蛋白或其變 體作為第二個昆蟲控制蛋白質。在EP 0 408 403中描述了用於獲得不同殺 昆蟲蛋白質在同一植物中的表達以致力於最小化或防止對於轉基因昆蟲抗 性植物抗性發展的方法。不同的蛋白質可以表達於同一植物，或每一個能 被表達於單一的植物爾後通過單一植物彼此雜交而在同一植物中組合。例 如，在雜種種子生產中，每一親本植物能表達單一蛋白質。通過雜交親本 植物來產生雜種，兩蛋白質在雜合植物中被組合在一起。在某些情況中， 可優選在植物的同 一位點或遺傳座位插入不同的毒性基因，以便於在該植 物的後代中基因不會分離。
廣為人知的是Bt Cry蛋白質表達成原毒素，通過在昆蟲腸內蛋白質水 解它可轉化為毒性核心。當本發明ISLP蛋白質和BtCry蛋白質組合時，可 以理解，可以使用編碼全長原毒素或者毒性核心或者任何中間體形式的 基因。
出於篩選目的和/或增強控制雜草的選擇，本發明的轉基因植物也可以 用賦予廣譜除草劑(例如基於草丁膦或草甘膦的除草劑)抗性的蛋白質的 編碼DNA進行轉化。
殺蟲有效75X屍基因的部分或其等同體，優選/S丄戶嵌合基因，編碼ISLP 蛋白質的殺蟲有效部分，可以用常規方式穩定地插入單一植物細胞的核基 因組中。並且如此轉化的植物細胞可以用常規方式用於產生控制害蟲例如 昆蟲害蟲的轉化植物。在這一點上，在農桿菌中的包含編碼ISLP蛋白質的 DNA的T-DNA載體可用於轉化植物細胞。其後，可以用例如在EP 0 116 718、 EP 0 270 822、 PCT文獻WO 84/02913和乂A開的歐洲專利申請EPO 242 246及在Gould等(1991)中所述的方法從轉化植物細胞再生轉化植物。構 建用於農桿菌介導的植物轉化的T-DNA載體在本領域廣為人知。T-DNA載體可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515所述的雙元載體或者如EP 0 116 718所述的能通過同源重組整合進農桿菌Ti質粒的共整合載體。優選 T-DNA載體每個包含位於T-DNA邊界序列之間的、或至少位於右邊界序列 左側的有效連接於殺蟲有效Zy丄屍基因部分的啟動子。Gielen等(1984 )描 述了邊界序列。其它類型的載體可使用例如直接基因轉移(例如在EP 0 223 247中所述)、花粉介導的轉化(例如在EP 0 270 356和WO 85/01856中所 述)、原生質體轉化(例如在US 4，684，611中所述)、植物RNA病毒介導 的轉化(例如在EP 0 067 553和US 4，407，956中所述)、脂質體介導的轉 化(例如在US 4，536，475中所述)的方法及如最近描述的用於轉化某些玉 米(例如US 6，140，553; Fromm等，1990; Gordon-Kamm等，19卯)和稻 (SWmamoto等，1989; Datta等，1990 )品系的其它方法和一般用於轉化 單子葉的方法(PCT文獻WO 92/09696)來轉化植物細胞。合適的用於棉 花轉化的方法見述於PCT專利文獻WO 00/71733。有關稻轉化，參考在 WO92/09696、 WO94/00977和WO95/06722中所迷的方法。
本文使用的術語"玉蜀黍，，和"玉米"同義，指玉蜀黍(Zefl /mi")。 本文使用的棉花指棉屬物種((7仍^p/w附spp.)，特別是陸地棉(G. Zi,V^"似附)和海島棉(G. 6tfMflfife"se )。術語"稻，，指稻屬物種(0o^fl spp.), 特別是水稻(a sflftVfl)。"大豆"指大豆屬物種(G/_v"'""pp),特別是大 豆(G".附ax)。本文使用的蔬菜植物或蔬菜指黃瓜、番茄、萵苣、布魯塞爾 菊苣、芸苔屬植物如花椰菜或甘藍、韭菜、生菜、洋蔥、(西)瓜、朝鮮 薊、胡蘿蔔或胡椒。
除轉化核基因組以外，本發明還包括轉化質體基因組(例如葉綠體基 因組)。Kota等(1999)已描述了在菸草葉綠體中過表達Cry2Aa蛋白質 的方法。
產生的轉化植物可以用於常規植物育種方案來生產更多的具有相同特 徵的轉化植物，或用於向相同或相關植物種類的其它品種中引入殺蟲有效 /5X戶基因的部分。從轉化植物得到的種子包含編碼ISLP蛋白質作為穩定的 基因組插入物的基因。轉化植物的細胞可以用常規方式培養來生產ISLP毒素或蛋白質的殺蟲有效部分，它可以回收，用於常規殺昆蟲組合物特別是 抗鱗翅目的殺昆蟲組合物。
殺蟲有^L/5X戶基因部分插入於植物細胞基因組中，從而插入的基因位 於指導植物細胞中基因部分表達的啟動子的下遊(即3，)並在其控制下。 這可以通過在植物細胞基因組例如在細胞核或質體(例如葉綠體)基因組 內插入/5X戶嵌合基因來實現。
合適的啟動子包括，但不局限於強組成型花椰菜花葉病毒(CaMV) 分離林CM1841 (Gardner等，1981) 、 CabbB-S (Franck等，1980)和 CabbB-JI (Hull和Howell， 1987)的35S啟動子("35S啟動子");Odell 等(1985)所述的35S啟動子；來自泛素家族的啟動子(例如Christensen 等，1992、 EP 0 342 926、還見於Cornejo等，1993的玉米泛素啟動子)； gos2啟動子(dePater等，1992) ; emu啟動子(Last等，1990);擬南芥 肌動蛋白啟動子例如An等(1996)所述的啟動子；稻肌動蛋白質啟動子例 如Zhang等(1991)所述的啟動子及在US 5，641，876中描述的啟動子；木薯 葉脈花葉病毒啟動子(WO 97/48819, Verdaguer等，1998 );來自 Subterranean Clover Stunt病毒的pPLEX系列啟動子(WO 96/06932，特 別是S7啟動子)；醇脫氫酶啟動子例如pAdhlS ( GenBank登錄號X04049、 X00581 )及分別驅動T-DNA 1，和2，基因表達的TR1，啟動子和TR2，啟動子 (分別為"TR1，啟動子"和"TR2，啟動子")(Velten等，1984)。可選地， 可以使用不是組成型的而是特異於一種或多種植物組織或器官(如葉子和/ 或根部)的啟動子，由此插入的/S丄屍基因部分只表達於特異組織或器官的 細胞中。例如，如US 5,254，799所披露，通過將殺蟲有效基因部分放置在 光誘導型啟動子例如植物本身或另 一植物如豌豆的核酮糖-l，5-二磷酸羧化 酶小亞基基因啟動子的控制下，殺蟲有^t/5X戶基因部分可以選擇性地表達 在植物(如玉米、棉花、稻、大豆)葉子中。例如，可如此選擇啟動子以 使本發明/SZP基因只表達於靶害蟲如昆蟲害蟲以之為食的那些組織或細 胞中，以便於易感靼害蟲的吃食導致對於宿主植物相比於不表達ZS丄戶基因 的植物的損傷降低。因而，通過在根特異性啟動子控制之下表達ISLP基因，可以有效控制主要損傷根部的害蟲。在WO00/29566中敘述了優先在根部 作用的啟動子。用於根部優先表達的合適的啟動子是在US 5，633，363中所 述的ZRP啟動子(及其修飾)。另一個可選的是使用其表達為誘導型的啟 動子，例如創傷誘導型啟動子如例子Cordera等(1994)敘述的MPI啟 動子，它是通過(如由昆蟲吃食所導致的)創傷誘導，或是由化學品例如 Aoyama和Chua (1997 )所述的地塞米柏H秀導的啟動子，或是由溫度誘導 的啟動子例如US 5，447，858中描述的熱休克啟動子，或是由其它外部刺激 誘導的啟動子。在單子葉植物例如玉米和稻中，農桿菌TR2，啟動子或其 變體是優選的創傷誘導型啟動子，用來驅動本發明嵌合ISLP基因的轉錄， 見WO 03/093483。
殺蟲有^t75丄屍基因可以插入植物基因組，以便所插入的基因部分是在 合適的3，末端轉錄調控信號(即轉錄物形成和多腺苷酸化信號)的上遊(即 5，)。這優選通過將/^SX屍嵌合基因插入到植物細胞基因組內來獲得。合適 的多腺苷酸化和轉錄物形成信號包括CaMV 35S基因、胭脂鹼合酶基因 (Depicker等，1982)、章魚鹼合酶基因(Gielen等，1984)和T誦DNA基 因7 (Velten和Schell， 1985)的那些信號，其作用為轉化植物細胞中的3， 不翻譯DNA序列。
使用已知的方法如電穿孔或三親本交配能夠將T-DNA載體引入至農 桿菌。
殺蟲有效ZW^基因部分可以任選地作為雜合基因(US 5,254,799; Vaeck等，1987)插入到植物基因組中，位於和選擇性或能夠做為標記的 基因例如編碼卡那黴素抗性的weo基因(EP 0 242 236)的同一啟動子的控 制下，以便於植物表達的融合蛋白質能夠容易地檢測。
還可以使用轉化植物細胞來在植物細胞培養物中生產大量的本發明蛋 白質，例如產生可以經合適的配製後應用於作物的ISLP蛋白質。當本文提 及轉基因植物細胞時，是指如此類分離狀態或在組織培養物中的植物細胞 (或也有植物原生質體)，或者包含在植物或在分化的器官或組織中的植 物細胞(或原生質體)，兩種可能性本文都特別包括進來。因此，在說明書或權利要求中涉及的植物細胞意味著不僅指培養物中分離的細胞，還指 任何植物細胞,無論它可能位於或可能存在於哪種類型植物組織或器官中。
編碼殺昆蟲特別是抗鱗翅目蛋白質的所有或部分ZS/JP基因還可以用
於轉化其它微生物包括細菌如蘇雲金芽孢桿菌，其可能已經具有抗鱗翅目 或鞘翅目的殺昆蟲活性。因此，可以生產轉化的份菌林，其可用於抗擊廣 譜的鱗翅目和/或鞘翅目昆蟲害蟲，或者用於抗擊另外的鱗翅目昆蟲害蟲。
用摻入適當克隆載體中的本發明全部或部分/5X戶基因轉化細菌例如假單 胞菌屬(/^e"rfo附o"fl51)、農桿菌屬(々ra6""m'"附)、桿菌屬(5fl"7/ws)或埃希 氏菌屬(E^^rZc/^Vz)的細菌，可用常規方式進行，使用例如在Mahillon等 (1989 )和在PCT專利文獻WO卯/06999中所述的常規電穿孔技術。
包含本發明/5Z屍基因的轉化桿菌屬菌林可以用常規方法(Dulmage， 1981; Bernhard和Utz，1993)發酵，來提供高產量的細胞。在合適的生長 條件下，這些菌林可以產生高產量的ISLP蛋白質。
在其中能夠表達/^丄屍基因的可選的合適的宿主微生物有真菌、藻類或 病毒，特別是植物侵佔物種(如(內)共生體)或害蟲如昆蟲害蟲的病原 體。
殺昆蟲的特別是抗鱗翅目的本發明組合物可以使用以/S丄戶基因轉化 的微生物、或ISLP蛋白質、或殺昆蟲有效ISLP部分作為活性成分加以合適 的載劑、稀釋劑、乳化劑和/或分歉劑通過常規方式配製(例如，如Bernhard 和Utz所述，1993)。這類殺昆蟲組合物可以配製為可溼性散劑、丸劑、顆 粒劑或塵劑或者作為以水性或非水性溶劑配成的液體^f象泡沫劑、凝膠劑、 混懸劑、濃縮劑等。包含殺昆蟲細菌芽孢的組合物的例子在W096/10083 中有描述。
根據本發明，控制昆蟲特別是鱗翅目或鞘翅目的方法可包括施加(如 噴灑)殺昆蟲量的ISLP蛋白質或包含本發明ISLP蛋白質或包含以本發明 /S丄P基因轉化的宿主細胞的組合物到欲保護的地點(區域)。要保護的地 點可包括例如昆蟲害蟲的棲息地或生長植被(如應用到樹葉)或待生長植 被的區域(如應用到土壤或水源)。在一實施方案中，依據本發明的組合物包括殺昆蟲量的至少一種本發明的ISLP蛋白質，其可以由細菌宿主產 生。此類組合物可以被應用於葉子、土壤或種皮。
本文使用的術語"接觸"指"與…進行物理接觸"。用殺昆蟲蛋白質 接觸植物意思是使殺昆蟲蛋白質接觸植物細胞，或者在內部(例如通過在 植物中表達)或者在外部(例如通過外部施加包含殺蟲蛋白質的組合物於 植物)。可以理解，該術語不指示接觸時間長度，而是包含任何時間單位 的接觸。當提及包括用本發明殺昆蟲蛋白質接觸植物(或其細胞或組織) 的保護所述植物抵抗昆蟲損傷的方法時，接觸可能是足夠長而且足夠廣泛
(使用足夠高量的蛋白質接觸足夠大量的細胞)來預防或減輕昆蟲損傷。
本發明還涉及用於控制鱗翅目或鞘翅目棉花害蟲或攝取棉花昆蟲害蟲 如棉籽象鼻蟲、棉螟蛉、蚜蟲或棉鈴蟲、棉蚜蟲(/1/;/^^w矽/^)、桃蚜
(Af，s/;w^)、草盲棒、粉蝨、椿象、牧草蟲或綠盲蜂(Oe卵ftVwifes rf"W附)的方法。可以用本發明方法控制的具體鱗翅目棉花害蟲包括，但 不局限於選自美洲棉鈴蟲、棉螟蛉、澳洲棉鈴蟲(本地螟蛉)、煙芽夜 蛾(菸草對蟲)、草地夜蛾(秋粘蟲)和棉紅鈴蟲(粉紅螟蛉)的那些。 控制棉花昆蟲害蟲的方法包括向要保護的區域或植物施加本文定義的 ISLP蛋白質。這可以通過以本發明ISLP蛋白質接觸棉花植物來實現，例如 通過種植以本發明ISLP基因轉化的植物如棉花植物，或噴灑含有本發明 ISLP蛋白質的組合物。本發明還涉及本發明ISLP蛋白質在抵抗鱗翅目、辨 蟲或鞘翅目棉花昆蟲害蟲以最小化棉花植物損傷中的用途。
本發明ISLP蛋白質如ISLP1蛋白質的靶昆蟲害蟲還可以是墨西哥豆瓢 蟲(￡^//"^"<^",/1^泡)， 一種墨西哥豆曱。這不但是北美多種豆科作物的 一種嚴重的害蟲，還是亞洲和非洲其他作物如葫蘆、茄科植物、豆類、玉 米、高粱、稻、小麥、棉花、芝麻、萵苣、大豆和扛豆的一個嚴重問題。 本發明還涉及控制鱗翅目或鞘翅目玉米害蟲或蚜蟲如玉米辨
(i Ao/m/0s&AM附附flf/^y )、麥二叉辨(iSc/j&fl/ /r&gm附/"w附)或*匕坊、才帛 鈴蟲、粘蟲、夜蛾、莖杆鑽心蟲、線蟲、玉米鑽心蟲或玉米根蟲的方法。 可以通過本發明的方法來控制的具體玉米害蟲可以選自美洲棉鈴蟲、小地老虎(黑夜蛾)、歐洲玉米螟、玉米食根蟲(Z)Z"6TOft'cflspp.)和草地夜 蛾(秋粘蟲)。該方法包括向要保護的區域或植物施加本文定義的ISLP蛋 白質。這可以通過以本發明ISLP蛋白質接觸玉米植物來實現，例如通過種 植以本發明ISLP基因轉化的玉米植物，或噴灑含有本發明ISLP蛋白質的組 合物。本發明還涉及本發明ISLP蛋白質在抵抗鱗翅目玉米昆蟲害蟲以最小 化玉米植物損傷中的用途。
本發明還涉及控制鱗翅目或鞘翅目稻害蟲或攝取稻上的昆蟲如稻葉蟬 或稻蝗、稻(黑)蝽、稻鑽心蟲、稻苞蟲、稻夜蛾、稻粘蟲、稻螟蟲和稻 縱巻葉螟或蠐螬的方法。可以通過本發明的方法來控制的具體鱗翅目稻昆 蟲害蟲可以選自黃色螟蟲(三化螟)、稻縱巻葉螟、粉色螟蟲(大螟)和玉 米斑點螟(C7i/to/mWe//^)。該方法包括向要保護的區域或植物施加本文定 義的ISLP蛋白質。這可以通過以本發明ISLP蛋白質接觸稻植物來實現，例 如通過種植以本發明ISLP基因轉化的稻植物，或噴灑含有本發明ISLP蛋白 質的組合物。本發明還涉及本發明ISLP蛋白質在抵抗鱗翅目、椅蟲或鞘翅 目稻昆蟲害蟲以最小化稻植物損傷中的用途。
本發明還涉及控制鱗翅目、辨蟲或鞘翅目大豆害蟲的方法。可以通過 本發明的方法來控制的具體大豆害蟲可以選自黎豆夜蛾、大豆夜蛾、甜 茱夜蛾、黃斑粘蟲(黃斑夜蛾)、美洲棉鈴蟲、大豆食心蟲(五/ Z/iW/" fl/w"附a) 和及"c/h》/Mw'a wm。該方法包括向要保護的區域或植物施加本文定義的ISLP 蛋白質如ISLP1。這可以通過以本發明ISLP蛋白質接觸大豆植物來實現， 例如通過種植以本發明ISLP基因轉化的大豆植物，或噴灑含有本發明ISLP 蛋白質的組合物。本發明還涉及本發明ISLP蛋白質在抵抗鱗翅目大豆昆蟲 害蟲以最小化大豆植物損傷中的用途。
為獲得ISLP毒素或蛋白質，可以用常規方式在適當的培養基中培養表 達ISLP蛋白質的重組宿主細胞。產生的ISLP蛋白質可以分離和純化自裂解 的細胞或(當分泌時)來自培養基。如果蛋白質不是分泌的，細胞能夠用 常規方法如酶降解、通過超聲或通過使用去垢劑等來裂解。然後可以通過 標準技術例如層析、提取、電泳等來分離和純化ISLP蛋白質。本文使用的術語"基因"意味著包含可以在細胞內被轉錄成RNA分子 (如mRNA)的區域("轉錄區")的任何DNA或RNA片段，有效連接於 合適的調控區域例如植物可表達啟動子。因而基因可能包含數個有效連接 的片段如啟動子、5'前導序列、編碼區和含有多腺苷酸化位點的3，非翻譯 序列。特定生物體(如植物物種或細菌菌林)的內源基因是天然地見於該 生物體的基因。當提及本發明ISLP DNA時，"嵌合基因"指具有不同於 天然存在的、驅動ZWJ^基因在其天然宿主細胞中表達的細菌5，和/或3，調 控序列的5，和/或3，調控序列的ISLP DNA序列。
當提及本發明ISLP基因時，術語"基因表達"意指在其中DNA編碼區 有效連接於合適的調控區如啟動子、被轉錄並翻譯成蛋白質的過程。
為本發明目的，兩個相關核苷酸或胺基酸序列的"序列同一性"表達
為百分數，意指在兩個最佳比對的序列中具有相同的殘基的位置數(xioO) 除以比較的位置數。空位，即比對中殘基於一條序列中存在但不在另一條 中存在的位置，被認為是具有不同殘基的位置(對於不同長度的序列，大 小等於最短序列的大小，例如在比對ISLP片段和全長S層蛋白質的情況下， 比較相對於S層蛋白質中相同大小的對應部分)。為本發明目的要計算兩 個序列間的序列同一性，可以使用GAP程序，它使用Needleman和Wunsch 算法(1970 )並由威斯康星包(第10,2版，遺傳學計算機組(GCG)， 575 Science Drive,麥迪遜，威斯康星53711，美國)提供。使用的GAP參數為 空位建立罰分=50 (核苷酸)/8 (胺基酸)，空位延伸罰分=3 (核苷 酸)/ 2 (胺基酸)，並且評分矩陣為"nwsgapdna"(核苷酸)或"blosum62" (胺基酸)。GAP使用Needleman和Wunsch全球比對算法來在其整個長度 上比對兩個序列，最大化匹配的數目並最小化空位的數目。預設的參數為 空位建立罰分=50 (核苷酸)/8 (蛋白質)和空位延伸罰分=3 (核苷酸) /2 (蛋白質)。對於核酸，使用的預設的評分矩陣是"nwsgapdna"，而 對於蛋白質預設的評分矩陣是"blosum62" ( Henikoff & Henikoff， 1992)。 類似的，序列相似性百分數可以在這類比對中用標準軟體獲得，它不僅顯 示相同殘基的百分數還包括不同但具有相似性質(例如本文定義的對於蛋白質比對中保守胺基酸的差異)的殘基。適用於確定序列同一性百分數和
序列相似性百分數的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，在Altschul 等(1977)和Altschul等(1990)中有描述。
本發明的這些和/或其他實施方案在權利要求書中有所反映，權利要求 書構成本發明說明書的一部分。
序列表說明
下述實施例舉例說明了本發明，並不是提供來限制本發明或要求保護 的範圍的。在實施例、權利要求書和說明書中提及的序列如下所述 SEQIDNO: 1: &// 7基因的DNA編碼序列和胺基酸序列 SEQIDNO: 2: ISLP1蛋白質的胺基酸序列 SEQIDNO: 3: PCR引物ISLPlXder SEQIDNO: 4: PCR引物ISLPlXrev SEQIDNO: 5: PCR引物BSLX-1 SEQIDNO: 6: PCR引物BSLX-4 SEQIDNO: 7: PCR引物BSLX-3 SEQIDNO: 8: PCR引物BSLX-2 SEQIDNO: 9: PCR引物BSLN-5 SEQIDNO:10: PCR引物BSLN-6 SEQIDNO:ll: PCR引物BSLP-8 SEQIDNO:12: PCR引物BSLP畫7 SEQIDNO:13: PCR引物EAGB-4
SEQIDNO: 14:分離的成熟ISLPl蛋白質N-末端的胺基酸序列 SEQ ID NO: 15: ISLPl蛋白質N-末端大約50 kDa胰蛋白酶片段的氨基 酸序列
除非在實施例中另外規定，所有重組DNA技術按照標準方法進行，見 述於Sambrook和Russell U001)《分子克隆實驗室指南》第三版，冷泉港實驗室出版社，紐約；Ausubel等(1994 )《現代分子生物學通用方法》 第l、 2巻，美國及Brown (1998 ) Mo/"w/"r BiW( g);Zfl6Fflx第二版，巻I、 II, Academic Press (UK)。用於植物分子操作的標準材料和方法見述於 R.D.D. Croy的屍/fl"ZAfo/""/"r5/ofo^Ia6/ax ( 1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd ( UK)與Blackwell Scientific Publications, UK聯合出版。
(1995)《戶C7 f/浙.'義^^皇措/^》，冷泉港實驗室出版社和McPherson 等(2000 )屍C/ 匿5fls/a.. Fra附fiflc&ramii/ to Sewc/i,第一版，德國施普 林格出版社中找到。
應該了解前述的僅僅是本發明具體實施方案的詳細描述，並且對於公 布的實施方案的眾多改動可以根據本文的公開來進行而不悖離本發明的精 神或範圍。因此前面的描述不意味著限制本發明的範圍。更準確的是，本 發明的範圍只由附加的權利要求書和其等同物來決定。
實施例 辨橫才法
細菌菌林蘇雲金芽孢桿菌(Bt)通過醋酸選擇法(Travers等，1987) 分離自死昆蟲(墨西哥豆瓢蟲)樣品。在均質化和分離Bt菌林之前，墨西 哥豆胍蟲死屍以1%次氯酸鈉和滅菌水洗滌兩次。
生物測定使用葉浸技術用芽孢/晶體懸液進行抗墨西哥豆瓢蟲的生 物測定。茱豆(/^"M( /wsvw/gaWs)植物的葉子浸泡在毒素稀釋液中，然後使 之乾燥。每個處理的葉子用一齡的五隻幼蟲測試不同的蛋白質濃度。每個 濃度進行四次重複。6天後確定死亡率和葉子的損傷。如前所述(Bravo等， 1998 )在人工食料中進行抗菸草天蛾(Af做滷oi ^x似)或草地夜蛾一齡幼蟲 的生物測定。如lbarra等(2003)所述在100ml水中進行抗埃及伊蚊(j^fes fl^^pri)幼蟲的生物測定。
純化ISLP1菌林中存在的晶體包涵體ISLP1菌林在含固體營養肉 湯芽孢形成培養基(Lereclus等，1995)的皮氏培養皿中生長。芽孢/晶體混合物收集於5 ml滅菌水中，在IO，OOO rpm離心10分鐘，回收上清並丟棄 只含芽孢的沉澱。為從上清中去除所有芽孢，重複此步驟5次。最後晶體包 涵體通過在19，000 rpm離心30分4中回收。晶體蛋白質溶解於pH 10.5的50 mM Na2C03 、 0.2%卩-巰基乙醇中並通過在Q-seph arose柱FPLC Pharmacia (Q-瓊脂糖柱快速液相色譜，法瑪西亞)陰離子交換層析來純化 (Hill, 1983 )。
N-末端測序在7% SDS-PAGE電泳並如廠商指示在半乾式轉膜室中 將其轉移至聚偏二乙烯二氟膜(麻薩諸塞州貝德福德密理博公司Millipore Co.， Bedford, MA)上後，ISLP1菌林產生蛋白質的N端測序在美國馬薩 諸塞州劍橋市哈佛大學的哈佛大學微量化學研究室(Harvard Microchemistry Facility)進行。還對利用HPLC分子篩層析(Gtiereca和 Bravo, 1999)純化的ISLP1晶體蛋白質的胰蛋白酶片段的N端序列進行了 分析。
免疫兔子通過皮下注射以ISLP1蛋白質免疫紐西蘭白兔。溶於PBS 中的l毫克ISLP1蛋白質以弗氏完全佐劑乳化後注射在兔子背部的五個位 點。兔子以用不完全佐劑混合的1毫克ISLP1蛋白質加強免疫3次，每次間 隔15天。在首次免疫後40天分離血液樣品。
確定ISLP1基因的DNA序列基於ISLP1蛋白質的N端序列，設計了 擴增1536 bp PCR產物的兩個PCR引物，ISLPlXder (ACGCTCTAGATAGCAGGTAAATCATTCCCAGACG， SEQ ID NO. 3) 和ISLPlXrev (ACGCTCTAGATCGCCGTATTGGTCAGTTGTTAC， SEQ ID NO. 4)。通過標準技術(Sambrook等，1989 )用屍/" DNA聚合酶 (Stratagene La Jolla， CA,因為其高保真性)進行了PCR反應。總DNA 提取自ISLP1菌林(Msadek等，1990)並用作所有PCR反應的模板。PCR 產物用來做Blast分析，並得到了兩個S層基因相關序列(登錄號u38842和 x99724)。比對這些序列證明了它們具有相似的5，和3，末端。從這些S層基 因的5，和3，末端及從ISLP1擴增片段的內部序列設計了 4條PCR引物。引物 BSLX-1 (GCTCTAGATGAGAGTGCTTTATAGGAAAAT, SEQ ID NO:5)和BSLX-4 (GCTCTAGATCTTCAGCCGGAGCGTATGTACC， SEQ ID NO:6)擴增553bp的5，端片段，而引物BSLX畫3
(GCTCTAGATACTGCTGAGGCTGCTGGTGAGG， SEQ ID NO: 7 )和 BSLX-2 ( GCTCTAGATCCTCGACCTGCTTCACTATCA， SEQ ID NO: 8)擴增1372 bp的3，片段。每個PCR片段用WW (美國麻薩諸塞州貝弗 利紐英倫生物技術公司New England BioLabs， Beverly, MA )消化，並克 隆進事先經X6"i消化的pBluescript SK ( Stratagene， La Jolla， CA )。連 接產物通過酚/氯仿提取純化、乙醇沉澱並電轉化到TGl大腸桿菌電感受態 細胞(Leredus等，1989 )。轉化子克隆生長在補加有氨節青黴素(100 ng/ml) 的LB瓊脂平板上，菌落與甘油(20%)混合併儲存在-70。C。這些質粒命 名為ISLP1-SL1 、 ISLP1-SL2和ISLP1-SL3 ，並對它們的插入DNA用自動 DNA測序裝置進行了測序。
在蘇雲金芽孢桿菌中克隆和表達ISLP1蛋白質完整的Wpl基因 通過克隆三個PCR片段到質粒pHT315 (Lereclus等，1989)中重構。第一 個PCR產物包含啟動子區域，用引物BSLX-1和BSLN-5
(TCTTTGCCATGGTATAAATTTCCTCCTTC， SEQ ID NO: 9 )得到。 引物BSLX-1在5，端具有多出的IO bp,包含AT6W限制性位點，而引物 BSLN-5具有內部的7Vo^限制性位點。第二個PCR片段用含有內部7V"/限 制性位點的引物BSLN畫6 ( TTATACCATGGCAAAGACTAACTCTTAC， SEQ ID NO: 10)和包括&// /基因的獨特A"限制性位點的引物BSLP-8
(AAAACTGCAGAAGTACCGTCAGCACTTGCTTC， SEQ ID NO: 11 ) 獲得。最後，笫三個PCR片段用也是用包括獨特A"限制性位點的引物 BSLP-7 ( AACGCTGCAGTTGTAACACTTGGTGGTAAAG, SEQ ID NO: 12 )和類似於BSLX-2但在5，端具有包含Bfl附fl7限制性位點的多餘8 bp的引 物EAGB畫4 ( CGGGATCCTCCTCGACCTGCGTCACTATCA， SEQ ID NO:13)擴增。純化每個PCR產物並用相應的限制性酶消化，並分別亞克 隆到pBluescript KS。純化這些質粒中包含的DNA片段、連接並插入至事 先以JVT6"/和5fl/iifl/消化的質粒pHT315中。連接反應的產物直接轉化到由Didier Lereclus博士 (法國巴斯德研究所Pasteur Institute, France )友情 提供的晶體缺陷型(acrystalliferous )蘇雲金芽孢桿菌菌株407 ( Lereclus 等，1989)中，並在30'C生長於補加7.5ng/ml紅黴素的LB中。產生的質粒 命名為pHT-ISLPl。包含pHT-ISLPl的Bt菌林生長在含補加了紅黴素的固 體HCT培養基的皮氏平板中。芽孢/晶體混合物收集於2 ml滅菌水並用於 Western印跡試驗。如廠家所述，用抗SL-ISLP1多克隆抗體(1/10,000; 1 小時)進行檢測，並用偶聯有辣根過氧化物酶(HR )的山羊抗兔抗體(Sigma, St. Louis, MO ) (1/7,500; l小時)繼以SuperSignal化學發光底物(Pierce, Rockford，Il)來顯現。
S層蛋白質的化學提取 ISLP1菌林即含pHT-ISLPl的Bt菌株及晶體缺陷型的Bt菌抹407生長 於BHI (Difco)肉湯培養基中至600 nm O.D.值達0.9，以獲得全部為旺 盛生長的細胞。通過離心(10,000 rpml0分鐘)來沉澱細月包。如Luckevich 和Beveridge ( 1989 )所述洗塗沉澱，並重懸於初始體積的1/50的1、 1.5 或2M鹽酸胍(pH2.5)中，來特異性地提取細胞表面錨定的蛋白質。樣 品在IO，OOO rpm離心10分4中，含細菌細月包的沉澱和含提取蛋白質的上清4妄 著通過加入三氯乙酸(TCA)到終濃度10% (20分鐘，-20°C )來沉澱， 在IO，OOO rpm離心10分鐘，以水洗塗兩次並懸浮於0.03 N NaOH。 力口入等 體積的Laemmli2x樣品上樣緩衝液。樣品煮沸5分鐘，並上樣於兩塊10%
SDS-PAGE膠。 一塊膠以考馬斯亮藍染色，而另一塊重複的膠電轉至聚偏 二乙烯二氟(PVDF) Immobilon(止動劑)膜(安瑪西亞生物技術公司 Amersham Biosciences )上，如上所述使用抗SL-ISLP1多克隆抗體來進行 Western印跡檢測。
趙
分離對墨西哥豆瓢蟲有活性的Bt菌林在墨西哥從墨西哥豆瓢蟲死 屍上分離的四個Bt菌林被用於抗墨西哥豆瓢蟲幼蟲(鞘翅目瓢蟲科(Coccinellidae))的毒性測定。這些菌株非常相似，因為它們全都生產 相似的由100 kDa蛋白質構成的晶體，並具有相同的總蛋白質模式。當以 100和IOOO ng/cn^進行測試時，四林菌顯示了對於墨西哥豆孤蟲幼蟲 100%的致死率。我們選擇了這些菌株中的一個，命名為ISLP1，並如材料 和方法中所述，通過連續的離心繼以陰離子交換層析來純化晶體包涵體。 用此菌林的芽孢/晶體混合物進行的抗墨西哥豆瓢蟲幼蟲的生物測試顯示 16ng/cii^的致死濃度(LC5。 ) ( 7-25的95%置信限度)，發現使用純晶體 蛋白質的LC鄰為8.6 ng/cm2 ( 4-14的95%置信限度)。純晶體或芽孢/晶 體混合物(高達IO,OOO ng/cm2)對於鱗翅目昆蟲菸草天蛾或草地夜蛾的一 齡幼蟲不顯示毒性，且對於雙翅目埃及伊蚊的四齡幼蟲未發現 毒性。
通過寸吏用通用的和特異於formula see original document page 37c/j9 、 cfj/7 、 cfj/J 、 cfjW和O，"爿基因的引物的PCR反應來表徵 ISLP1菌林(Bravo等，1998; Ceron等，1994; Ceron等,1995)，所有 PCR反應均為陰性。然後使用Aguino de Muro和Priest ( Aguino de Muro 和Priest, 1993 )設計的引物擴增了ISLP1菌林的16S RNAr基因，該16S DNA序列的Blast分析證實了該ISLP1菌林屬於蘇雲金芽孢桿菌類。
表徵在晶體包涵體中發現的ISLP1蛋白質 ISLP1菌林產生的100 kDa蛋白質通過陰離子交換層析純化後，轉膜到 Immobilon PSQ，並得到了蛋白質的氨基端序列。此胺基酸序列 (AGKSFPDVPAGH， SEQ ID NO: 14 )對應于于來自地衣芽孢桿菌OlpA (GenBank登錄號U38842, Ge11Pept登錄號AAC44405 )和炭疽芽孢桿菌 EA1 (GenBank登錄號X99724， GenPept登錄號CAA68063)的S層蛋白質 前體前導肽之後的頭12個胺基酸。進行了純ISLP1蛋白質的胰蛋白酶消化， 並通過HPLC分子篩層析純化了約50 kDa的片段。獲得的內部18個胺基酸 的序列也見於Olpl和EAl S層蛋白質KLPVTFVTTDQYGDPYGAN (SEQ ID NO: 15)。根據此蛋白質得到的兩個N-末端序列設計了PCR引物(ISLPlXder和 ISLPlXrev)，並用於擴增經DNA測序的內部片段。所產生序列的Blast分 析顯示與兩個S層基因o/;;A和e"g ( GenBank登錄號u38842和x99724 )序列 具有高分。使用此信息及這些基因的DNA序列比對，設計了新的PCR引物， 用於擴增兩個其它的重疊PCR產物。 一個包括ATG密碼子的上遊500bp， 以含有推定的啟動子，而另一個包括推定的終止密碼子之後的200 bp。獲 得了完整的&// /基因的序列(SEQIDNO: 1)，此序列中發現的開放閱 讀框(ORF)包含2，589個核苷酸，它之前為Shine-Dalgarno序列。在終止 密碼子下遊的22個核苷酸處觀察到迴文結構。比較測序蛋白質的N-末端和 從核苷酸序列推斷的胺基酸序列的N-末端，證實了此蛋白質也是合成為具 有29個胺基酸信號肽的前體多肽。切除信號序列的成熟蛋白質的N-末端在 SEQ ID NO: 2第30位胺基酸位點處。在蛋白質序列中存在3個S層同源基序 (SLH)，觀察到第一個位於笫34-76位胺基酸區域，第二個位於第95-136 位胺基酸區域，而第三個在第162-198位胺基酸區域(全部為SEQ ID NO: 2 中的胺基酸位點)。
最後，如在材料和方法中所述，通過分別擴增三個在A^ /和戶W/限 制性位點重疊的PCR片段，完整的&//;7基因被直接克隆進晶體缺陷型蘇雲 金芽孢桿菌菌林407。不可能得到含有此構建體的大腸桿菌轉化子。其他作 者發現在許多情況下在大腸桿菌中克隆具有其調控區的S層基因會導致問 題(Mesnage等，2001; Sun等，2001 )。產生的表達ISLPl蛋白質的Bt 菌林通過用針對純ISLP1蛋白質生產的多克隆抗體免疫檢測蛋白質來判 斷。當在IOO和IOOO ng/en^測定時，相比於轉化有pHT315穿梭載體、不 表達ISLP1蛋白質、對墨西哥豆瓢蟲幼蟲不顯示任何毒性的對照菌株，此 菌林的生孢培養物顯示了對於墨西哥豆瓢蟲幼蟲的100%致死率。
在ISLP1菌抹中表達ISLP1 我們分析了在SP芽孢形成培養基中生長期間ISLP1蛋白質的表達。此 蛋白質表達於營養生長期和芽孢形成期。在營養生長期，該蛋白質和細菌締合，因為所有通過Western印跡檢測到的蛋白質都發現在離心培養物後 獲得的細菌沉澱裡。然而，在芽孢形成期ISLP1蛋白質也發現在離心培養 物的上清中。
Luckevich和Beveridge (1989 )描述了用於蘇雲金芽孢桿菌蠟螟亞種S 層蛋白質的特異性提取方法。我們使用此方法來檢測是否ISLP1具有結合 來自初始菌林和轉化菌林的細胞表面的能力。在低pH條件下用2 M離液 劑處理營養生長期細胞，導致SL-ISLP1蛋白質的特異性提取，這通過 SDS-PAGE和Western印跡分析提取蛋白質可以判斷。SL-ISLP1蛋白質只 存在於ISLPl菌林和Bt轉化子菌林中，此蛋白質在407晶體缺陷型菌林中沒 有。與Luckevich和Beveridge (1989)報導類似的是，只有用2M離液劑處 理才能提取該ISLP1蛋白質，用低些濃度的離液劑(l-1.5M)不能從細菌 細胞中提取該蛋白質。
也在其它Bt菌林如Bt庫斯塔克(A:wrato/t/)亞種HDl和HD73、 Bt以色列 (&raW"s的亞種HD567、 Bt鯰澤(似'z"nW)亞種HD137、 Bt多窩(to/ww幼/)亞 種HD125、 Bt莫裡遜(附M他卵/)擬步行甲(&wWW柳&)亞種中進行了此蛋白 質的Western印跡檢測，顯示此蛋白質並不產生於這些菌株。使用引物 ISLPlXder和ISLPlXrev來PCR分析這些菌林也證實了這些Bt菌林不含 ISLP1編碼序列。
ISLP1蛋白質(SEQ ID NO: 2)與來自炭疽芽孢桿菌的EA1 S層蛋白 質(對於包括信號肽的蛋白質有92%的序列同一性)及在蘇雲金芽孢桿菌 中報導的CTC2蛋白質(對於包括信號肽的蛋白質有89。/。的序列同一性) 具有高度的序列同一性。ISLP1蛋白質與另一炭疽芽孢桿菌S層蛋白質 SAP的胺基酸序列同源性只有32 %。參考文獻Aguino de Muro和Priest. (1993) FEMS Microbiol Lett. 112: 205-210.Altschul等(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402.Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.An等(1996) Plant J. 10， 107.Aoyama和Chua (1997) Plant Journal 11:605-612Ausubel等 (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols,巻1和2，USA.Bennetzen & Hall (1982) J. Biol. Chem. 257， 3026-3031 Bendtsen等(2004) J. Mol. Biol" 340:783-795.Bernhard， K.和Utz， R. (1993) "Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses", In Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice, 255-267頁，編輯Entwistle, P.F.， Cory， J.S.， Bailey， M.J.和Higgs， S.， John Wiley and Sons, New York.Beveridge等(1997) FEMS Microbiol Rev 20: 99-149Bih等(1999)， J. Biol. Chem. 274， 22884-22894.Bravo等(1998) Appl. Environm. Microbiol. 64: 4965-4972Brown (1998) Afo/ecw/flr必zV fogy厶fl6Fox,巻I和II， 第二版，Academic Press (UK)Callis等(1987) Genes Developm. 1:1183-1200 Cer6n等(1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 353-356. Cer6n等(1995) Appl. Environ. Microbiol. 61: 3826-3831. Christensen等(1992) Plant Mol. Biol. 18, 675-689. Cordera等(1994) The Plant Journal 6,141. Cornejo等(1993) Plant Mol. Biol. 23, 567-581. Cornelissen等(1986) EMBO J. 5， 37-40.Crickmore等(1998》Microbiology and Molecular Biology Reviews 62: 807-813.Crickmore 等 (2005),http:〃www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/Bt/index.html Croy R.D.D. (1993) Plant Molecular Biology Labfax，由BIOS ScientificPublications Ltd (UK)和Blackwdl Scientific Publications, UK聯合出版 Datta等(19卯)Bio/Technology 8， 736-740. De Pater等(1992) Plant J. 2， 834-844. Depicker等(1982) J. Molec. Appl. Genetics 1， 561-573. Dieffenbach和Dveksler (1995) PC/ 戶n'附w ^ Z^"60f"勿fy Af"認fl/， ColdSpring Harbor Laboratory Press Dulmage， H.T. (1981) "Production of Bacteria for Biological Control ofInsects" in Biological Control in Crop Production,編輯Paparizas， D.C.,Osmim Publishers, Totowa, N.J.， USA, 129-141頁.struch等(1996) ProcNatl Acad Sci USA 93， 5389-94. Estruch等(1996) PNAS USA 93(11)， 5389-5394. Franck等(1980) Cell 21， 285-294, French等(1986) Anal.Biochem. 156， 417-423 Ffrench-Constant和Bowen (2000) Cell Mol Life Sci 57, 828-33. Fromm等(1990) Bio/Technology 8， 833-839 Gardner等(1981) Nucleic Acids Research 9， 2871-2887 Gielen等(1984) EMBO J 3， 835-845 Gordon-Kamm等(19卯)The Plant Cell 2， 603-618 Gould等(1991) Plant Physiol. 95, 426-434 Gtiereca和Bravo. (1999) Biochim, Biophys. Acta. 1429: 342-350 Harlow和Lane (1988) Antibodies: A Manual Laboratory, Cold SpringHarbor Lab Press NY Henikoff和Henikoff (1992) Proc. Natl. Academy Science 89 (10):915—919Hesse等(1989)， EMBO J. 8 2453-2461.Hill (1983)五/;Z/flc/r冊5pp. In: Agricultural Insect pests of the tropics andtheir control. Cambridge University press. 438頁.ISBN 0 521 24638 5. Ho等(1989). Gene 77， 51-59.H6fte等(1988) Appl. and Environm. Microbiol. 54， 2010-2017 Hull和Howell (1987) Virology 86， 482-493 Ibarra等(2003) Appl. Environm Microbiol. 69:5269-5274 Itakura等(1977). Science 198， 1056-1063. Keil等(1986), Nucl. Acids Res. 14， 5641-5650. KWsgen等(1989)， Mol. Gen. Genet. 217， 155-161. Kldsgen和Weil (1991)， Mol. Gen. Genet. 225， 297-304. Kota等(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96， 1840-1845. Kotiranta等(1998) Infect Immunol. 66.' 4895畫4卯2. Last等(1990) Theor. Appl. Genet. 81， 581-588 Lereclus等(1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218. Lereelus等(1995) Bio/Technology 13， 67-71. Luckevich和Beveridge (1989) J. Bacteriol. 171， 6656-6667. Mahillon等(1989)， FEMS Microbiol. Letters 60， 205-210. Maxam和Gilbert (1980) Methods in Enzymol. 65， 499-560. McBride等(1995) Bio/Technology 13， 362McPherson等(2000) PC及-jB"wcs,. Fn>/ Btfc紐n wwflf似"ewcA，第 一版，Springer Verlag， Germany Mesnage等(1998) J. Bacteriol. 180: 52-58 Mesnage, S.等(2001) Microbiology 147: 1343-1351 Mignot等(2002) Mol. Microbiol. 43: 1615-1627 Morris等(1999)， Biochem， Biophys. Res. Commun. 255， 328-333. Msadek等(1990) J. Bacteriol. 172: 824-834 Murray等(1989) Nucleic Acids Research 17(2)， 477-498.Nakam眼等(2000) Nucl. Acids Res. 28， 292. Needleman和Wunsch algorithm (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453 Neuhaus & Rogers (1998) Plant Mol. Biol. 38， 127-144. Odell等(1985) Nature 313， 810-812. Oelmuller等(1993) Mol. Gen. Genet. 237， 261-272. Park等(1997) J. Biol. Chem. 272， 6876-6881. Pei和Blaser. (1990) J. Clin Invest. 85: 1036-1043Sambrook等(1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press. Sambrook和Russell (2001) Afo/ecw/"r C7卵/rtgv la^/Yift fj Maw /，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY Sanger (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74(12)， 5463-5467. Sdra和Sleytr (2000) J. Bacteriol. 182: 859-868 Schnepf等(1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 775-806. Shcherban等(1995)， Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 9245-9249. Shimamoto等(1989) Nature 338, 274-276 Sleytr和Beveridge (1999) Trends in Microbiology 7， 253-260. Stanssens等(1989) Nucleic Acids Research 12， 4441-4454. Sun等(2001) Acta Microbiol Sin. 41: 141-147. Sutliff等(1991) Plant Molec. Biol. 16, 579-591. Tavladoraki等(1998)， FEBS Lett. 426， 62-66. Terashima等(1999)， Appl. Microbiol. Biotechnol. 52， 516-523. Travers等(1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1263-1266. Vaeck等(1987) Nature 328， 33-37. Van Den Broeck等(1985) Nature 313, 358. Van Rie等(1990) Science 247， 72. Velten等(1984) EMBO J 3， 2723-2730 Velten和Schell (1985)， Nucleic Acids Research 13， 6981-6998Verdaguer等(1998)， Plant Mol. Biol. 37， 1055-1067Von Heijne， Gunnar (1986) Nucleic Acids Research. 14:11， 4683-4690Wada等(1990). Nucl. Acids Res. 18， 2367-1411.Waterfield等(2001) Trends Microbiol 9， 185-91.White等(1989). Trends in Genet. 5， 185-189Wong等(1992)， Plant Molec. Biol.20， 81-93.Xu等(2004) Parasitology Research 92(l):53-7.Zhang等(1991) The Plant Cell 3， 1155-1165.
權利要求
1.分離的殺蟲蛋白質，其特徵在於a)對於一些害蟲具有特異性殺蟲活性，而對於其它害蟲沒有，且b)與細菌S層蛋白質具有至少50％的序列同一性。
2. 權利要求l的蛋白質，其特徵在於a) 對於一些昆蟲具有特異性殺昆蟲活性，而對於其它昆蟲沒有，b) 與細菌S層蛋白質具有至少70。/。的序列同一性，c) 大約50到大約U0kDa的分子量。
3. 權利要求l的蛋白質，其與SEQIDNO: 2的蛋白質或其毒性片段具 有至少50%的序列同一性，並且其分子量為大約50到大約120kDa。
4. 權利要求2的蛋白質，其與SEQIDNO:2的蛋白質或其毒性片段具 有至少50%的序列同一性，並且其分子量為大約50到大約120kDa。
5. 權利要求4的蛋白質，包含SEQIDNO:2中始於第l位胺基酸和笫31 位胺基酸之間的胺基酸止於第863位胺基酸的胺基酸序列。
6. 權利要求4的蛋白質，包含SEQ ID NO: 2中始於第1位胺基酸和笫 531位胺基酸之間的胺基酸止於第863位胺基酸的胺基酸序列。
7. 權利要求4的蛋白質，包含SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
8. 分離的DNA，編碼權利要求1到7中任一項的蛋白質。
9. 嵌合基因，包含a) 包含權利要求8的DNA的編碼序列，及b) 允許在植物細胞中表達的啟動子。
10. 權利要求9的嵌合基因，其中所述編碼序列是經優化的合成DNA 序列，以便在宿主植物中進行表達。
11. 權利要求10的嵌合基因，其中所述宿主植物選自玉米、棉花、大 豆、稻、油菜、花椰菜和甘藍。
12. 植物轉化載體，包含權利要求9到11中任一項的嵌合基因。
13. 轉基因植物、種子或植物細胞，包含權利要求9到11中任一項的嵌合基因。
14.權利要求13的植物、種子或細胞，其中所述植物選自玉米、棉花、 大豆、稻、油菜、花椰菜和甘藍。
15. 保護植物抵抗由以所述植物所屬的植物物種為食的植物害蟲如昆蟲害蟲導致的損傷的方法，包括在所述植物的細胞中表達權利要求9到11 中任一項的嵌合基因的步驟。
16. 保護植物抵抗由以所述植物所屬的植物物種為食的植物害蟲如昆蟲害蟲導致的損傷的方法，包括以權利要求9到11中任一項的嵌合基因轉化植物細胞，將所述細胞再生為植物，和獲得含有所述嵌合基因的所述植物 的後代和繁殖材料如種子的步驟。
17. 殺死害蟲的方法，包括用權利要求1到7中任一項的蛋白質接觸所 述害蟲。
18. 權利要求17的方法，其中所述害蟲是昆蟲害蟲。
19. 權利要求8的DNA在控制或殺死害蟲如昆蟲害蟲中的用途。
20. 權利要求9到11中任一項的嵌合基因在控制或殺死害蟲如昆蟲害 蟲中的用途。
21. 權利要求1到7中任一項的蛋白質在控制或殺死害蟲如昆蟲害蟲中 的用途。
22. 保護田間植物免受害蟲如昆蟲損傷的方法，包括或者以包含權 利要求l到7中任一項的蛋白質的殺蟲組合物的形式，或者以表達所述蛋白 質的重組生物體的形式，對田間植物應用權利要求l到7中任一項的蛋白質。
23. 權利要求21的方法，其中所述重組生物體是表達權利要求1到7中 任一項的蛋白質的轉基因植物。
全文摘要
本發明提供了類似S層蛋白質的殺蟲特別是殺昆蟲蛋白質，還有其變體或突變體及編碼它們的DNA。還提供了使用所述DNA或蛋白質用於控制害蟲特別是植物昆蟲害蟲的方法和手段。
文檔編號C12N15/82GK101300268SQ200680032864
公開日2008年11月5日 申請日期2006年7月4日 優先權日2005年7月8日
發明者A·布拉沃-德-拉-帕拉, M·索貝隆恰維斯 申請人:墨西哥國立自治大學