編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列的製作方法

2023-06-17 14:28:31 2

專利名稱：編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物基因技術領域的基因序列，具體涉及一種編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列。
背景技術：
在多細胞動物中，乙醯膽鹼酯酶(簡稱AChE)位於神經元間、神經元與肌肉細胞間的化學突觸上，是主要的信號傳遞分子，行使水解膽鹼酯的功能。研究表明，多種化合物可抑制AChE活性，導致有機體類膽鹼代謝途徑過度，膽鹼酯不能被有效水解，大量積累於神經末梢，有機體表現出肌肉抽搐，中樞神經系統功能紊亂等症狀，嚴重者甚至死亡。在眾多抑制劑中，有機磷和氨基甲酸酯類被認為是AChE的專性抑制劑，它們可使昆蟲神經系統中的AChE的絲氨酸羥基基團發生磷酸化或甲氨醯化，從而AChE失去活性，不能迅速水解乙醯膽鹼，致使昆蟲死亡，因而被大量用作農業殺蟲劑。農產品表面殘留的有機磷或氨基甲酸酯類是否抑制人體神經系統的AChE，對人體產生危害？這一問題隨著人民食品安全意識的普遍提高正受到研究人員的關注。人體主要存在兩種膽鹼酯酶，AChE和丁醯膽鹼酯酶(簡稱BuChE)。AChE除主要分布於神經系統，還結合於紅血細胞表面，BuChE主要分布在血清中。當有機磷或氨基甲酸酯類侵入機體時，這些分散在循環系統中的膽鹼酯酶優先結合它們，從而使神經系統中的AChE免受磷酸化的威脅。然而，若抑制劑含量超出機體可耐受範圍，充當信號傳遞分子的AChE將被破壞。
農藥殘留檢測方法主要有兩大類-色譜檢測法和快速檢測法。色譜檢測法因為其監測數據的精確性和準確性可為農藥殘留執法提供有力的參考依據。但其操作程序複雜、需要高技術專業檢測人員，檢測儀器和費用都相當昂貴。快速檢測法操作簡便、不需昂貴儀器，適合於現場檢測及大批樣品的篩選檢測，主要用來防止有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留嚴重超標的蔬菜和水果流入市場。其中應用最為廣泛的是酶抑制法，原理即是乙醯膽鹼酯酶的活性受有機磷和氨基甲酸酯類農藥抑制。近幾年來，國內一些公司已研製出酶抑制法檢測儀器和試紙，並在一些城市的市場中推廣應用。這表明，我國的農藥生物學檢測手段已不再依賴於國外進口的試劑盒。不足的是，這些產品使用的酶原料主要是生物體的蛋白提取液，除AChE外，其它蛋白也存在其中，這在很大程度上影響了檢測結果的重複性；同時，酶原料的多少受限於供體生物的數量，這極大地限制了這些產品的大量生產應用。
經對現有技術文獻的檢索發現，美國專利相關報導US Patent No.6770799，Expression of recombinant human Acetylcholinesterase in transgenic plants(美國專利號6770799，人源性乙醯膽鹼脂酶在轉基因植物中的重組表達)；USPatent No.5595903，Genetically engineered human Acetylcholinesterase(美國專利號5595903，基因工程人源性乙醯膽鹼脂酶)。研究者利用這些重組蛋白注射老鼠、豚鼠和靈長類，證明其在有機磷中毒事件中取得了良好的預防與治療效果。關於果蠅AChE基因的重組表達、以及在農藥殘留檢測方面的應用，國外自90年代起已開展了大量研究工作，但至今未發現與本發明主題密切聯繫的文獻與專利的報導。不同生物來源的AChE對抑制劑的敏感程度不同。果蠅的AChE發生磷酸化與甲氨醯化的速度高於其它生物的酶，也就是說，它對有機磷和氨基甲酸酯類農藥是最為敏感的。因此，它是農藥殘留檢測的理想生物學材料。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種編碼果蠅AChE蛋白的核苷酸基因序列。使其在酵母細胞中得到高效表達，蛋白分泌至培養液中，易於分離純化，為檢測農藥殘留提供了優良的基因工程酶；進一步在甲醇酵母中表達對有機磷和氨基甲酸酯類農藥敏感的AChE蛋白，為開發農藥生物學檢測產品提供豐富的蛋白原料。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明編碼具有AChE活性的蛋白質，且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5相同。所述的編碼，果蠅AChE蛋白的信號肽與糖磷脂錨定信號的核苷酸被切除，且剩餘的核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同。
所述的蛋白質，其胺基酸序列與SEQ ID NO.7相同。
米氏常數Km＝12.3±3.7μM，近似於從果蠅提取的AChE的Km值(17.0±3μM)。
提取果蠅總RNA，以oligo dT為引物，反轉錄獲得果蠅總cDNA。以果蠅總cDNA為模板，用引物1(核苷酸序列與SEQ ID NO1相同)和引物2(核苷酸序列與SEQ ID NO2相同)進行PCR擴增，獲得AChE的cDNA擴增產物，為1950bp。將果蠅AChE cDNA與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含AChE cDNA的大腸桿菌克隆。以抽提大腸桿菌的質粒pT-AChE為模板，用引物3(核苷酸序列與SEQ ID NO3相同)和引物4(核苷酸序列與SEQ ID NO4相同)進行PCR擴增，獲得切除信號肽序列及糖磷脂錨定序列後的AChE cDNA擴增產物，為1749bp。用限制性內切酶ECoR1與Not1酶切改造後的AChE cDNA和酵母表達載體pPIC9K，連接兩者酶切後的片段，轉化大腸桿菌DH5α，獲得含改造後的AChE cDNA的大腸桿菌克隆。
甲醇酵母表達載體pPIC9K-AChE，含有與SEQ ID NO6相同的核苷酸序列，且含有該表達載體的甲醇酵母可表達果蠅乙醯膽鹼酯酶，並將乙醯膽鹼酯酶分泌至酵母培養液中。抽提大腸桿菌的重組質粒pPIC9K-AChE，用限制性內切酶Sal1酶切，使其線性化。線性化質粒pPIC9K-AChE-L電轉化甲醇酵母GS115，獲得重組菌株。以甲醇誘導甲醇酵母重組菌株表達乙醯膽鹼酯酶，收集培養液，通過測定乙醯膽鹼酯酶活性，在1000個重組子中篩選出表達0.307U/mg乙醯膽鹼酯酶的菌株AChE*-GS115。以甲醇誘導甲醇酵母菌株ACHE*-GS115表達乙醯膽鹼酯酶，離心收集培養液，濃縮脫鹽，得到乙醯膽鹼酯酶粗酶液。
通過測定粗酶液活性，計算重組蛋白的Km值；計算敵敵畏，樂果，毒死蜱，抗蚜威對乙醯膽鹼酯酶的抑制常數Ki。
以下進一步對本發明中的技術術語作出說明1.外源基因插入酵母基因組外源DNA轉化甲醇酵母時，經線性化處理的該DNA片段將在酵母基因組的同源區域重組，使酵母的某一營養表型恢復，產生重組菌株。與重組有關的酵母基因組區域有兩個AOX1區和his4區。
(1)外源基因在his4基因區的單點插入，外源基因插入到his4基因座中，載體中HIS4表達框的一部分序列與基因組his4基因的一部分結合，組成可表達組氨醇脫氫酶的表達框。由於這種基因重組未涉及AOX1基因區，該重組子的表型是Mut+。
(2)外源基因在AOX1基因區的單點插入，外源基因插入到AOX1基因座的3』端，可產生Mut+表型的重組子。同時，外源片段也可插入到AOX1基因座的5』端，這取決於線性化DNA時所用的酶。環狀DNA亦可插入酵母基因組中，但頻率很低。
(3)外源基因在基因組中的多拷貝插入。多拷貝插入是自發產生的，在AOX1基因座或his4基因座上皆可發生，它的頻率較低，一般佔所獲得重組子的1-10％。
(4)外源基因替換基因組中AOX1基因區插入或替換由線性化外源DNA所用的酶決定。對於pPIC9K，SacI酶切後的DNA將插入AOX1基因座，SalI酶切後的DNA將插入his4基因座，而DraI酶切後的DNA則會替換AOX1基因座。與插入不同，替換發生時整個AOX1基因座完全被外源基因替代，其表型是Muts。
2.甲醇酵母表達系統——誘導表達外源蛋白甲醇酵母體內，AOX1基因和AOX2基因皆編碼產生醇氧化酶(簡稱AOX)，這是甲醇代謝途徑的關鍵酶。其中，AOX1基因啟動子專一性受甲醇誘導，產生的AOX可達細胞可溶性蛋白的30％，含量很高，這使得甲醇酵母能在以甲醇為碳源的培養基中快速生長。AOX1啟動子後接外源基因時，外源基因在甲醇以外的碳源(如葡萄糖、甘油或乙醇)中處於非表達狀態，當在培養液中加入甲醇後，即被誘導表達。AOX1與AOX2的同源性達97％，但後者產物代謝甲醇的活性很弱，這一特徵被用於分離Muts表型的菌株。
3.Ellman方法測定AChE活性AChE可水解乙醯硫代膽鹼，生成硫代膽鹼和乙酸鹽。硫代膽鹼還原二硫二硝基苯甲酸形成硝基苯甲酸鹽，這種黃色物質在405nm具吸收峰值。這是AChE活性測定的通用方法，有機磷或氨基甲酸酯抑制了AChE活性，其抑制程度也可根據該方法計算出。
4.酶反應動力學參數(1)米氏常數Km米氏常數即為反應速度達到最大反應速度一半時的作用物濃度。它是酶的特徵性常數，表示酶與作用物的親和力大小。Km越大，酶與作用物的親和力越小。這個常數可以通過反應速度及作用物濃度的雙倒數作圖獲得。
(2)抑制常數Ki酶抑制劑分為兩類不可逆抑制劑與可逆性抑制劑。有機磷及氨基甲酸酯類農藥被認為是AChE的不可逆抑制劑，它們使AChE活性中心的絲氨酸發生磷酸化或甲氨醯化，抑制機制可表示為
E酶，PX抑制劑，X抑制劑中除有機磷或氨基甲酸酯外的基團。Ki表示酶被抑制的程度。有機磷或氨基甲酸酯抑制AChE的模型公式如下[E][E0]=([PX0]-[E0])e-Kit([PX0]-[E0])[PX0]-[E0]e-Kit([PX0]-[E0])]]>t代表酶與抑制劑反應的時間；[PX0]和[E0]分別是抑制劑與酶的初始濃度；[E]代表酶在反應不同時間後的殘餘濃度。
本發明獲得了含果蠅乙醯膽鹼酯酶cDNA的大腸桿菌克隆，在此基礎上，獲得了含改造後的果蠅乙醯膽鹼酯酶cDNA的大腸桿菌克隆，將乙醯膽鹼酯酶基因插入甲醇酵母GS115基因組後，本發明在1000個重組子中篩選獲得了可表達活性為0.307U/mg乙醯膽鹼酯酶的酵母重組子AChE*-GS115。1個酶單位定義為在室溫(25℃)，一分鐘內水解1mM底物的酶量。1M發色團DTNB的消光係數＝13.6×104。經甲醇誘導後，AChE*-GS115表達的乙醯膽鹼酯酶分泌在酵母培養液中。而不同抑制劑對乙醯膽鹼酯酶的抑制常數不相同，說明抑制劑的抑制能力不同(表1)。這表明，甲醇酵母表達的乙醯膽鹼酯酶可被用於有機磷與氨基甲酸酯類農藥的檢測。此外，重組乙醯膽鹼酯酶還可為農藥殘留檢測生物傳感器、試紙條的研製等提供靈敏的生物學材料。
表1 甲醇酵母表達的重組AChE蛋白受各種抑制劑抑制的抑制常數




圖1本發明的技術流程圖。
圖2以引物1(核苷酸序列與SEQ ID NO1相同)和引物2(核苷酸序列與SEQ ID NO2相同)擴增含果蠅AChE cDNA的大腸桿菌所產生的片段。泳道1DNA分子量標記；泳道2擴增陽性克隆產生的目的片段，1950bp。
圖3用限制性內切酶ECoR 1和Sal 1酶切質粒pPIC9K-AChE，鑑定含改造後的果蠅AChE cDNA的大腸桿菌克隆。泳道1pPIC9K質粒，酶切後有2.0kb片段切出；泳道2pPIC9K-AChE質粒，酶切後有3.7kb片段切出；泳道3DNA分子量標記。
具體實施例方式
以下結合附圖對本發明的實施方式作出詳細具體的描述1.實驗材料1.1黑腹果蠅黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)購自復旦大學遺傳學實驗室。
1.2菌株與質粒大腸桿菌和酵母菌株由上海農科院生物中心基因工程實驗室提供。
甲醇酵母表達載體pPIC9K由上海農科院生物中心基因工程實驗室提供，大腸桿菌載體pMD18-T購自日本TAKARA公司。
1.3引物、酶與試劑PCR引物由上海博亞生物公司合成，詳細序列信息見SEQ ID NO1-4；限制性內切酶、PyrobestTM DNA聚合酶、T4 DNA連接酶等購自日本TAKARA公司；Trizol試劑盒購自北京塞百盛基因技術有限公司；反轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒購自杭州V-gene生物技術公司；
YNB購自上海普飛生物技術公司；Ellman試劑成分(Acetylthiocholine iodide，DTNB)購自美國Sigma公司；甲醇、山梨醇、甘油、各種胺基酸等生化試劑均為國產分析純或進口分裝。
2.操作過程2.1提取果蠅總RNA，並用Oligo-dT引物進行反轉錄按TRIZOL方法(Molecular Research Center，Inc.，USA)提取總RNA。反轉錄操作參照試劑盒說明書。取1-5μg果蠅總RNA，與1μl 10mM的oligodT引物混合，加Rnase free水至20μl總體積，80℃保溫5min，然後置於冰上；加入4μl 5×Reaction Buffer，2μl 10mM dNTP，1μl RNase inhibitor，37℃溫育5min，置於冰上；加入1μl Reverse Transcriptase，42℃溫育30-60min；最後80℃保溫10min，反轉錄產物為果蠅總cDNA的第一條鏈。
2.2PCR擴增在無菌PCR管中加入5μl 10×PyrobestTM PCR緩衝液，5μl 2mM 4dNTPs，20μM上遊及下遊引物各1μl，模板DNA，2U PyrobestTM DNA聚合酶，加水至50μl總體積，最後加適量礦物油以防止蒸發。反應條件如下94℃，3min；94℃30sec，56℃30Sec，72℃2min(退火溫度及延伸時間根據引物及擴增產物長度不同作相應改變)，30個循環；終延伸72℃10min。
反應結束後，在PCR體系中加入1U Taq DNA聚合酶，72℃1h。
2.3TBE-瓊脂糖凝膠電泳和回收PCR產物用1％瓊脂糖凝膠(含10ng/ml EB)電泳分離PCR產物，電泳結束，將凝膠置於紫外分析儀內，切取含PCR產物的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒回收，PCR產物最終溶於25-30μl的Eluent Buffer中。
2.4DNA連接反應在無菌Eppendorf管中加入1μl 10×T4 DNA ligase Buffer，8μl回收的PCR產物，0.25μl pMD18-T載體，1μl T4 DNA連接酶，總體積為10μl。將各組分混勻，4℃中連接16h。當PCR產物與載體DNA片段通過酶切形成的互補粘端相連時，兩者之間的質量比為5∶1。
2.5製備大腸桿菌感受態細胞在LB平板上劃線接種大腸桿菌DH5α，37℃培養過夜。用接種環挑取10-12個單菌落(2-3mm直徑)，接種於250mL的SOB培養液中。振蕩培養(18℃，200-250rpm)，至OD600＝0.6。菌液置於冰上10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細胞。用80ml預冷的TB溶液重懸細胞，冰浴10min。離心(4℃，3000rpm，10min)，收集細胞。用20ml預冷的TB輕輕地重懸細胞，加入DMS0至終濃度7％，輕輕混勻，置於冰上。10min後，按每管500μl分裝細胞懸液於無菌的eppendorf管中。用液氮快速冷凍，儲存於-70℃。
2.6DNA連接產物轉化大腸桿菌在1.5ml eppendorf管中加入200μl的感受態細胞與10μl的DNA連接產物，手指輕彈管壁，混勻混合物。冰浴30min。42℃，溫育混合物90sec。迅速放回冰上，冰浴10min。加入800μl SOC培養液，37℃，劇烈振蕩混合液1h。將混合液塗布在選擇性培養基上，37℃培養過夜。
2.7DNA序列分析採用ABI377型測序儀(購自美國ABI公司)測定DNA序列，用PCGENE軟體分析序列，由上海博亞生物公司完成。
2.8小量製備質粒DNA從培養基平板上挑取含目的質粒的單菌落，接種於3ml含相應抗生素的LB液體培養基中，振蕩培養過夜(37℃，200rpm，)。在1.5ml離心管中，倒入1.5ml菌液，離心(4℃，13000rpm，30sec)，倒去上清，收集菌體，將離心管倒扣在紙巾上，晾乾管壁上的殘餘液滴。加入100μl預冷的溶液I，劇烈震蕩，懸浮菌體；加入200μl新鮮的溶液II，將蓋關閉，迅速顛倒5次，混勻混合物，注意不要旋轉離心管；加入150μl溶液III，將蓋關閉，顛倒數次，使溶液III均勻分散在粘稠的菌裂解液中，冰浴3-5min。離心(4℃，13000rpm，5min)，將上清轉移到新的離心管中，加入2倍體積無水乙醇，混勻，常溫放置10min，離心(4℃，13000rpm，5min)，倒去上清，加入1ml 70％乙醇，將蓋關閉，顛倒數次，離心(4℃，13000rpm，2min)。倒去上清，將離心管倒扣在紙巾上，室溫放置數分鐘，待管壁上的殘餘乙醇液滴完全揮發，用30μl TE(pH8.0，含20μg/ml DNase-free RNase A)溶解DNA沉澱，37℃保溫30min，DNA保存於-20℃備用。
2.9限制性內切酶酶切DNA
酶切反應參照限制性內切酶試劑盒(購自TAKARA公司)說明書中的具體操作進行。反應結束，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，回收操作與PCR產物回收相同。
2.10線性化質粒電轉化甲醇酵母在50ml三角瓶中加入5ml YPD，將GS115酵母單菌落接種其中，振蕩培養過夜(30℃，200rpm)。取0.1-0.5ml菌液，接種在100ml新鮮培養液中，再次劇烈振蕩培養過夜，至OD600＝1.3-1.5。離心(4℃，5000rpm，5min)，用100ml預冷的無菌水重懸細胞沉澱。離心(4℃，5000rpm，5min)，用50ml預冷的無菌水重懸細胞沉澱。離心(4℃，5000rpm，5min)，用4ml預冷的1M山梨醇重懸細胞沉澱。離心(4℃，5000rpm，5min)，用200μl預冷的1M山梨醇重懸細胞沉澱。
取80μl經上述處理的酵母細胞懸液，與線性化質粒(5-20μg)混合。將混合物轉移至預冷的電轉化杯中。冰上放置5min。用電轉化儀(購自美國Bio-rad公司)進行電轉化(參數2KV，200Ω，25μF)。在電轉化杯中迅速加入1ml預冷的1M山梨醇，顛倒數次，以混勻細胞，冰浴數分鐘，取250μl等份，塗布於MD平板，溫育(30℃，3-4d)至菌落出現。
2.11誘導甲醇酵母細胞表達AChE蛋白即使在同一個轉化事件中，外源基因也可能以多種形式發生重組，不同的重組子表達外源蛋白的效率不同。實驗中，挑選1000個酵母重組子，誘導其表達AChE，篩選表達水平高的重組子。為保證表達活力，從平板上挑取新鮮的單菌落，或從-70℃凍存的菌種中挑取一部分培養。誘導外源蛋白表達過程如下從MD平板上挑取單菌落，接種於25ml的BMGY中，振蕩培養(28℃，250rpm)，至OD600＝2(約18h)，細胞處於對數增長期。離心(室溫，5000rpm，5min)，收集細胞。用50ml BMMY重懸細胞沉澱，至OD600＝1。將菌液轉移至另一個三角瓶，用兩層紗布蓋住瓶口，繼續振蕩培養。為持續誘導表達，每24h補充甲醇，終濃度為0.5％。為確定最佳誘導時間，分別在誘導後第48、72、96、120、144小時，收集500μl培養物，轉入1.5ml離心管，離心(室溫，13000rpm，2min)，將上清轉移至另一離心管。所有樣品用液氮快速冷凍後，保存於一70℃。
2.12用Ellman方法檢測AChE活性吸取50μl酵母培養液，加入96孔酶標板的對應微孔中，25℃，放置5min。在孔中加入250μl Ellman試劑(1mM AsCh，0.3mM DTNB，0.1M磷酸鈉緩衝液)，混勻，立即將96孔板置於酶標儀(購自美國Bio-tech公司)中，測定405nm波長下前3min吸光值的變化(ΔOD/min)。陰性對照是以50μl的磷酸緩衝液代替酵母培養液。每個時間點的收集樣品平行測定2次。
2.13提取AChE粗酶液挑取新鮮的AChE*-GS115單菌落，在100ml BMMY培養液中持續誘導AChE表達144h。離心(4℃，13000rpm，5min)，收集上清。用0.22μm的濾膜過濾上清，除去殘留的酵母細胞。將上清轉移至半透膜中，兩端以袋夾夾緊，放入表面皿，在膜的上表面及兩側撒上適量的聚乙二醇粉末，8h後，由於聚乙二醇的吸水性，培養液的大多數水分子被吸出半透膜，培養液被濃縮10倍。將盛有濃縮液的半透膜轉移至Tris緩衝液(0.1M，pH7.4)，透析(4℃，2-3h)，即得濃縮脫鹽的AChE粗酶液。
2.14計算重組AChE蛋白的米氏常數Km將六個濃度(0.05，0.1，1，5，10，50mM)的AsCh，分別與五個濃度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，25℃，測定酶的反應速度，計算Km值。
2.15計算重組AChE蛋白的抑制常數Ki將三個不同濃度(10-6，10-8，10-10M)的抑制劑與五個不同濃度(5，10，20，40，50nM)的酶液混合，分別在兩者反應的第15sec、1min、3min、5min，10min、15min、20min、30min時收集等量混合液，25℃，以1mM AsCh測定其殘餘酶的濃度，最後計算Ki值。
根據上述實驗條件和具體技術要求進一步結合具體實施闡述本發明。這些實施僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例1——酵母表達的重組AChE蛋白的活性受微量敵敵畏的抑制1.溶液、試劑(1)BMGY溶液在700ml水中溶解10g酵母提取物與20g蛋白腖，高壓滅菌(20min)；溶液溫度降至室溫後，分別加入100ml磷酸鉀緩衝液(1M，pH6.0)、100ml10×YNB、2ml 500×B、100ml 10×GY；溶液在4℃的保質期為兩個月。
(2)BMMY溶液將BMGY溶液中的10×GY換為10×M，其餘成分不變。溶液在4℃的保質期為兩個月。
(3)敵敵畏溶液稱量0.11g敵敵畏(MW＝220.98)晶體，溶於5ml丙酮中，此時敵敵畏濃度為0.1M。以10的倍數逐級稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
(4)Ellman試劑稱量0.426g Na2HPO4(MW＝142)溶於30mL水中，調節pH＝7.0，配製成100mM磷酸鈉溶液；稱量0.0396g DTNB溶於10mL Na2HPO4溶液中，加入15mg NaHCO3，混勻後，用鋁箔包裹，避光。配製好後置於冰上，使用時間不超過一天；稱量0.0217g ACThI，溶於1mL水中，用鋁箔包裹，避光。配製好後置於冰上，使用時間不超過一天。按15mL∶500uL∶200uL混合磷酸鈉溶液、DTNB與ACThI溶液，即得Ellman試劑。
2.操作步驟(1)挑取新鮮的AChE*-GS115單菌落，接種於25ml的BMGY液中，振蕩培養(28℃，200rpm)。
(2)18h後，離心(室溫，5000rpm，5min)，收集菌體，倒去上清，用50ml BMMY液懸浮菌體，用兩層紗布封住三角瓶瓶口，振蕩培養(28℃，250rpm)。每隔24h，向培養液中加入甲醇，終濃度為0.5％。在第144h，收集菌液，離心(4℃，12000rpm，10min)，將上清(45ml)轉移至無菌三角瓶中，置於冰上。
(3)取出一段無菌的半透膜，一端用夾子夾緊，將全部上清倒入膜內，再夾緊另一端，確認沒有液體滲漏後，把它放入表面皿中，在膜的上下表面鋪撒聚乙二醇，靜置(4℃，8h)，用水衝洗膜表面殘留的聚乙二醇後，將它放入500ml的Tris緩衝液(0.1M，pH7.4)，透析(4℃，3h)，打開一端的夾子，用移液器吸取膜內粗酶液，按1ml/管分裝在無菌Eppendorf管中，取1管，在冰上放置，其餘用液氮速凍，保存於-70℃，備用。
(4)用丙酮溶解敵敵畏晶體，配製成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時設置對照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的酶標板孔中，輕輕搖動以混勻，立即用酶標儀測定405nm處3min內樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對照組)，分別測定三次，取平均值。
(5)按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計算酶受敵敵畏抑制的抑制率。其中，Ri代表抑制率，ΔA0代表活性未受抑制的酶引起的吸光度變化值，ΔA代表酶受抑制後引起的吸光度變化值。
結果表明，低濃度的敵敵畏對AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表2所示。
表2 甲醇酵母表達的重組AChE蛋白受敵敵畏抑制的抑制率(％)

實施例2——酵母表達的重組AChE蛋白的活性受微量毒死蜱的抑制1.溶液(1)毒死蜱溶液稱量0.175g毒死蜱(MW＝350.6)晶體，溶於5ml丙酮中，此時毒死蜱濃度為0.1M。以10的倍數逐級稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
其餘溶液、試劑配方同實施例1。
2.操作步驟操作與實施例1基本相同。用丙酮溶解毒死蜱晶體，配製成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時設置對照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的酶標板孔中，輕輕搖動以混勻，立即用酶標儀測定405nm處3min內樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對照組)，分別測定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計算酶受毒死蜱抑制的抑制率。
結果表明，低濃度的毒死蜱對AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表3所示。
表3 甲醇酵母表達的重組AChE蛋白受毒死蜱抑制的抑制率(％)


實施例3——酵母表達的重組AChE蛋白的活性受微量抗蚜威的抑制1.溶液(1)抗蚜威溶液稱量0.119g抗蚜威(MW＝238.33)晶體，溶於5ml丙酮中，此時抗蚜威濃度為0.1M。以10的倍數逐級稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
其餘溶液、試劑配方同實施例1。
2.操作步驟操作與實施例1基本相同。用丙酮溶解抗蚜威晶體，配製成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時設置對照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的微孔中，輕輕搖動以混勻，立即用酶標儀測定405nm處3min內樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對照組)，分別測定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計算酶受抗蚜威抑制的抑制率。
結果表明，低濃度的抗蚜威對AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表4所示。
表4 甲醇酵母表達的重組AChE蛋白受抗蚜威抑制的抑制率(％)

實施例4——酵母表達的重組AChE蛋白的活性受微量樂果的抑制1.溶液(1)樂果溶液稱量0.115g樂果(MW＝229.12)晶體，溶於5ml丙酮中，此時樂果濃度為0.1M。以10的倍數逐級稀釋溶液至10-5、10-6、10-7M。
其餘溶液、試劑配方同實施例1。
2.操作步驟操作與實施例1基本相同。用丙酮溶解樂果晶體，配製成濃度為10-5，10-6，10-7M的溶液。分別取3μl與50μl的粗酶液混合，溫育(25℃，15min)。同時設置對照組，由3μl丙酮與50μl的粗酶液混合而成。將混合液加入盛有250μl Ellman試劑的微孔中，輕輕搖動以混勻，立即用酶標儀測定405nm處3min內樣品的吸光度變化值，記為ΔA，ΔA0(對照組)，分別測定三次，取平均值。按公式Ri(％)＝(ΔA0-ΔA)/ΔA0計算酶受樂果抑制的抑制率。
結果表明，低濃度的樂果對AChE蛋白有明顯的抑制效果，如表5所示。
表5 甲醇酵母表達的重組AChE蛋白受樂果抑制的抑制率(％)

本發明的各個實施例獲得了含果蠅AChE cDNA的大腸桿菌克隆，如圖2；在此基礎上，獲得了含改造後的果蠅AChE cDNA的大腸桿菌克隆，如圖3。
本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特徵(A)長度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1atggccatctcctgtcggcag(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特徵(A)長度26bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2ttagaaaacccttttggttcgcaatg(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特徵(A)長度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3agaattcgtcatcgatcgcctggtcgtgca(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特徵(A)長度42bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.4agcggccgcttattacgacgaatcgccatcgcaagtacctgc(5)SEQ ID NO.5-7的信息110上海交通大學120果蠅乙醯膽鹼酯酶基因的克隆、改造及其在甲醇酵母中的表達140
1412005-05-011607170PatentIn version 3.1
21052111950212DNA213Drosophila AChE蛋白4005atggccatct cctgtcggca gagcagagtc ctgcccatgt ccttgcccct gcctctgacc 60atcccgctgc ccctggtgct ggtgctatca ctgcacctgt ccggcgtctg cggcgtcatc120gatcgcctgg tcgtgcagac atcctccgga cctgtacgcg gtcgctccgt gacggtgcag180ggcagggagg tgcatgtcta cacgggcatc ccctacgcca agccgcccgt cgaggacctg240cgcttccgaa agccggttcc cgcggagcca tggcacggcg tcctcgacgc cacgcggtta300tccgccacct gcgtccaata ccgtgacgag tacttccccg gcttctccgg cgaggagatc360tggaacccca acaccaacgt gtccgaggac tgcctctaca taaatgtctg ggcgccggca420aaggcccgac ttcgccatgg tcggggtgcc aacgggggtg agcaccccaa tggcaaacag480gcggacactg accatctcat ccacaacgga aatccgcaga acacgaccaa cggactgccg540attctgatct ggatctatgg cggtggcttc atgaccggat cggccaccct ggacatctac600aatgcggata tcatggccgc cgtgggcaat gtaatagtgg cctccttcca gtatcgagtg660ggagcctttg ggttcttgca cctggcgccg gaaatgccgt cggagtttgc ggaagaggcg720cccggcaatg tgggcctatg ggatcaggca ctcgccattc gctggctgaa ggacaacgct780catgccttcg gcggaaatcc ggagtggatg acactgttcg gagagtcggc tggatccagt840tcggtgaatg cccagctcat gtcgccggtg acgaggggtc tggtcaagcg cggaatgatg900cagtcgggca ctatgaacgc cccctggagc cacatgacct ccgagaaggc cgtggagatc960ggcaaggcgc tgatcaacga ctgcaactgc aatgcatcta tgctgaagac caatcccgct 1020cacgtgatga gctgcatgcg ttccgtggac gccaagacca tatcggtgca gcagtggaac 1080tcctactcgg gcatcctcag ctttccctcg gcgcccacca ttgatggtgc gttcctgccg 1140gcggatccca tgacgctgat gaagacggcg gatctgaagg actacgacat cctgatggga 1200aatgtcaggg atgagggcac ttacttcttg ctgtacgatt tcatcgatta cttcgataag 1260gacgatgcca cggccctgcc acgggacaaa tacctggaaa ttatgaacaa tatttttggc 1320aaggcaacgc aagcggaacg cgaggccatc attttccagt ataccagttg ggaaggcaat 1380cctggctatc agaaccagca gcaaatcgga cgcgccgtgg gcgatcactt cttcacctgc 1440cccaccaacg agtatgccca ggctctggcg gagcgaggcg cttccgtgca ctactactac 1500tttacacacc gcacaagcac ctcattgtgg ggcgaatgga tgggcgtgct gcacggcgat 1560gagatcgaat acttctttgg ccagccgctg aacaactccc tgcagtatcg acctgtggag 1620cgtgagctgg gcaagcgtat gctcagtgcg gtcatcgagt ttgctaagac gggaaatccc 1680gctcaggatg gcgaggagtg gcccaacttc tccaaggagg atcccgtcta ctatattttc 1740agcaccgacg ataagatcga gaaattggcc aggggtcctt tggcggctcg ctgctcgttc 1800tggaatgatt acttgccaaa agtcaggagt tgggcaggta cttgcgatgg cgattcggga 1860agtgcttcca tatccccgag gctccagctc cttggaatcg ctgctctgat ctacatctgc 1920gccgcattgc gaaccaaaag ggttttctaa1950
21062111749212DNA213Drosophila AChE蛋白4006gtcatcgatc gcctggtcgt gcagacatcc tccggacctg tacgcggtcg ctccgtgacg 60gtgcagggca gggaggtgca tgtctacacg ggcatcccct acgccaagcc gcccgtcgag120gacctgcgct tccgaaagcc ggttcccgcg gagccatggc acggcgtcct cgacgccacg180cggttatccg ccacctgcgt ccaataccgt gacgagtact tccccggctt ctccggcgag240gagatctgga accccaacac caacgtgtcc gaggactgcc tctacataaa tgtctgggcg300ccggcaaagg cccgacttcg ccatggtcgg ggtgccaacg ggggtgagca ccccaatggc360aaacaggcgg acactgacca tctcatccac aacggaaatc cgcagaacac gaccaacgga420ctgccgattc tgatctggat ctatggcggt ggcttcatga ccggatcggc caccctggac480atctacaatg cggatatcat ggccgccgtg ggcaatgtaa tagtggcctc cttccagtat540cgagtgggag cctttgggtt cttgcacctg gcgccggaaa tgccgtcgga gtttgcggaa600gaggcgcccg gcaatgtggg cctatgggat caggcactcg ccattcgctg gctgaaggac660aacgctcatg ccttcggcgg aaatccggag tggatgacac tgttcggaga gtcggctgga720tccagttcgg tgaatgccca gctcatgtcg ccggtgacga ggggtctggt caagcgcgga780atgatgcagt cgggcactat gaacgccccc tggagccaca tgacctccga gaaggccgtg840gagatcggca aggcgctgat caacgactgc aactgcaatg catctatgct gaagaccaat900cccgctcacg tgatgagctg catgcgttcc gtggacgcca agaccatatc ggtgcagcag960tggaactcct actcgggcat cctcagcttt ccctcggcgc ccaccattga tggtgcgttc 1020ctgccggcgg atcccatgac gctgatgaag acggcggatc tgaaggacta cgacatcctg 1080atgggaaatg tcagggatga gggcacttac ttcttgctgt acgatttcat cgattacttc 1140gataaggacg atgccacggc cctgccacgg gacaaatacc tggaaattat gaacaatatt 1200tttggcaagg caacgcaagc ggaacgcgag gccatcattt tccagtatac cagttgggaa 1260ggcaatcctg gctatcagaa ccagcagcaa atcggacgcg ccgtgggcga tcacttcttc 1320acctgcccca ccaacgagta tgcccaggct ctggcggagc gaggcgcttc cgtgcactac 1380tactacttta cacaccgcac aagcacctca ttgtggggcg aatggatggg cgtgctgcac 1440ggcgatgaga tcgaatactt ctttggccag ccgctgaaca actccctgca gtatcgacct 1500gtggagcgtg agctgggcaa gcgtatgctc agtgcggtca tcgagtttgc taagacggga 1560aatcccgctc aggatggcga ggagtggccc aacttctcca aggaggatcc cgtctactat 1620attttcagca ccgacgataa gatcgagaaa ttggccaggg gtcctttggc ggctcgctgc 1680tcgttctgga atgattactt gccaaaagtc aggagttggg caggtacttg cgatggcgat 1740tcgtcgtaa 17492107211582212PRT
213Drosophila AChE蛋白4007vidrlvvqts sgpvrgrsvt vqgrevhvyt gipyakppve dlrfrkpvpa epwhgvldat 60rlsatcvqyr deyfpgfsge eiwnpntnvs edclyinvwa pakarlrhgr ganggehpng 120kqadtdhlih ngnpqnttng lpiliwiygg gfmtgsatld iynadimaav gnvivasfqy 180rvgafgflhl apempsefae eapgnvglwd qalairwlkd nahafggnpe wmtlfgesag 240sssvnaqlms pvtrglvkrg mmqsgtmnap wshmtsekav eigkalindc ncnasmlktn 300pahvmscmrs vdaktisvqq wnsysgilsf psaptidgaf lpadpmtlmk tadlkdydil 360mgnvrdegty fllydfidyf dkddatalpr dkyleimnni fgkatqaere aiifqytswe 420gnpgyqnqqq igravgdhff tcptneyaqa laergasvhy yyfthrtsts lwgewmgvlh 480gdeieyffgq plnnslqyrp verelgkrml saviefaktg npaqdgeewp nfskedpvyy 540ifstddkiek largplaarc sfwndylpkv rswagtcdgd ss58權利要求
1.一種編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列，其特徵在於，編碼具有乙醯膽鹼酯酶活性的蛋白質，且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5相同。
2.根據權利要求1所述的編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列，其特徵是，所述的編碼，果蠅乙醯膽鹼酯酶的信號肽與糖磷脂錨定信號的核苷酸被切除，且剩餘的核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同。
3.根據權利要求1所述的編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列，其特徵是，所述的蛋白質，其胺基酸序列與SEQ ID NO.7相同。
4.根據權利要求2所述的編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列，其特徵是，所述的果蠅，以其總cDNA為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO1相同引物1和核苷酸序列與SEQ ID NO2相同引物2進行PCR擴增，獲得乙醯膽鹼酯酶的cDNA擴增產物，為1950bp，以抽提大腸桿菌的質粒pT-AChE為模板，用核苷酸序列與SEQ ID NO3相同引物3和核苷酸序列與SEQ ID NO4相同引物4進行PCR擴增，獲得切除信號肽序列及糖磷脂錨定序列後的乙醯膽鹼酯酶的cDNA擴增產物，為1749bp。
5.根據權利要求1或者2或者4所述的編碼果蠅乙醯膽鹼酯酶的核苷酸基因序列，其特徵是，所述的乙醯膽鹼酯酶，米氏常數Km＝12.3±3.7μM。
全文摘要
本發明涉及果蠅乙醯膽鹼酯酶的基因，屬於分子生物基因技術領域。編碼具有乙醯膽鹼酯酶活性的蛋白質，且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.5相同。所述的編碼，果蠅乙醯膽鹼酯酶的信號肽與糖磷脂錨定信號的核苷酸被切除，且剩餘的核苷酸序列與SEQ ID NO.6相同。該基因在甲醇酵母細胞中得到表達，產物具有乙醯膽鹼酯酶活性且分泌於酵母培養基中。本發明對低濃度的有機磷及氨基甲酸酯農藥具有顯著的敏感性，該基因的表達產物可以用於農產品中農藥殘留的檢測，並為研製農藥生物學檢測產品提供靈敏的蛋白酶材料，具有很大的應用價值。
文檔編號C12N9/16GK1727487SQ20051002594
公開日2006年2月1日 申請日期2005年5月19日 優先權日2005年5月19日
發明者張大兵, 許誦辭, 武愛波, 梁婉琪, 潘愛虎 申請人:上海交通大學