Psod表達單元的製作方法

2023-06-17 12:54:16 1

專利名稱：Psod表達單元的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於調節基因轉錄和表達的核酸序列的用途、新啟動子及其表達單元、用於改變或影響基因轉錄速率和/或表達速率的方法、包含該表達單元的表達盒、具有改變的或受影響的轉錄速率和/或表達速率的基因修飾微生物及通過培育該基因修飾微生物製備生物合成產物的方法。
背景技術：
多種生物合成產物，例如精細化學品(尤其例如胺基酸、維生素)及蛋白質是通過天然代謝過程在細胞中產生的，並用於包括化妝品、飼料、食品及醫藥業的許多工業領域中。這些物質統稱為精細化學品/蛋白質，其尤其包含有機酸、生蛋白胺基酸和非生蛋白胺基酸(proteinogenic andnon-proteinogenic amino acid)、核苷酸和核苷、類脂類和脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素和輔因子以及蛋白質和酶。通過培養為了產生及分泌大量特定目的物質而開發出的細菌，這些物質的生產以工業規模上最有利的方式進行。特別適於該目的的生物為棒桿菌(coryneformbacteria)，其為革蘭氏陽性非病原菌。
已知通過棒桿菌菌株的發酵，尤其是穀氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)菌株的發酵來製備胺基酸。由於其重要性，在其生產過程的改良上進行了不懈的努力。該過程改良可與以下事宜相關發酵技術的手段，例如攪拌與供氧；或營養培養基的組成，例如發酵中的糖濃度；或用於獲得產物的處理，例如通過離子交換層析或噴霧乾燥；或微生物自身的內在性能特性。
通過擴增個別基因並研究其對精細化學品/蛋白質的生產的作用，重組DNA技術已在產生精細化學品/蛋白質的棒桿菌菌株的菌株改良中應用了許多年。
用於發展生產精細化學品、胺基酸或蛋白質的方法，或用於增加或提高已存在的生產精細化學品、胺基酸或蛋白質的方法的生產率的其他方式是增加或改變一種或多種基因的表達，和/或用合適的多核苷酸序列影響mRNA的翻譯。就此而言，影響可包括基因表達的增加、減少或其他限制因素，例如時序表達模式(chronological expression pattern)。
對於本領域的技術人員，細菌調節序列的各種組分是已知。對於以下結合位點已作出了區分調節物結合位點，也稱為操縱基因；RNA聚合酶全酶結合位點，也稱為-35與-10區及核糖體16S RNA結合位點，也稱為核糖體結合位點或Shine-Dalgarno序列。
基於本發明的目的，也稱為Shine-Dalgarno序列的核糖體結合位點序列是指位於翻譯起始密碼子上遊高達20個鹼基處的多核苷酸序列。
據文獻(E.coli和S.typhimurium，Neidhardt E.C.1995ASM Press)報導，Shine-Dalgarno序列的多核苷酸序列的組成和鹼基序列串及存在於Shine-Dalgarno序列中的多核苷酸序列的距離均對翻譯起始速率具有顯著影響。
具有啟動子活性的核酸序列可以多種方式影響mRNA的形成。其活性不依賴於生物的生理生長期的啟動子稱為組成型。而其他啟動子響應外部的化學及物理刺激，例如氧、代謝物、熱、pH等。而其他啟動子在不同生長期中顯示出對其活性的強依賴性。例如，文獻中描述的在微生物的指數生長期中或恰好在微生物生長的穩定期中顯示特別顯著的活性的啟動子。根據代謝途徑，啟動子的兩種特徵可對精細化學品及蛋白質的生產率具有有益的作用。
例如，在生長過程中關閉基因表達，但在最佳生長後又啟動基因表達的啟動子可用於調節控制代謝物產生的基因。於是，修飾的菌株顯示與起始菌株相同的生長參數，但每個細胞產生更多產物。該種類型的修飾可增加滴度(產物的克數/升)及C產率(產物的克數/C源的克數)。
已經可以從棒桿菌菌種中分離出那些可用於增強或減弱基因表達的核苷酸序列。根據細胞內部和/或外部條件，這些受調節的啟動子可提高或降低基因轉錄的速率。在某些情況下，被稱為誘導物的特定因子的存在可刺激從啟動子的轉錄速率。誘導物可直接或間接影響從啟動子的轉錄。被稱為抑制物的另一類因子能夠降低或抑制從啟動子的轉錄。類似於誘導物，該抑制物也可直接或間接地起作用。另一方面，溫度調節型啟動子也為已知的。因此，例如，可通過將生長溫度增至高於細胞的正常生長溫度來增強或減弱這類啟動子的轉錄水平。
至今已描述了少量源自穀氨酸棒桿菌的啟動子。DE 4440118中描述了源自穀氨酸棒桿菌的蘋果酸合酶基因的啟動子。該啟動子被插入到編碼蛋白質的結構基因的上遊。這種構建物轉化進入棒桿菌之後，對該啟動子下遊的結構基因的表達進行調節。一旦在培養基中添加適當的誘導物，就誘導該結構基因的表達。
Reinscheid等人在Microbiology 145503(1999)中描述了源自穀氨酸棒桿菌的pta-ack啟動子與報導基因(氯黴素乙醯轉移酶)之間的轉錄融合作用。包含這種轉錄融合作用的穀氨酸棒桿菌細胞在含有乙酸的培養基上生長時，呈現報導基因的增強表達。與此相比，在葡萄糖上生長的轉化細胞未顯示該報導基因的增強表達。
Pa’tek等人在Microbiology 1421297(1996)中描述了能夠增強報導基因在穀氨酸棒桿菌細胞中表達的某些源自穀氨酸棒桿菌的DNA序列。將這些序列在一起進行比較以便確定穀氨酸棒桿菌啟動子的共有序列。
專利WO 02/40679中已經描述了可用於調節基因表達的其他源自穀氨酸棒桿菌的DNA序列。這些分離的多核苷酸表現為可用於增加或降低基因表達的源自穀氨酸棒桿菌的表達單元。該專利還描述了重組質粒，在這些重組質粒上源自穀氨酸棒桿菌的表達單元與異源基因連接在一起。本文所描述的將源自穀氨酸棒桿菌的啟動子與異源基因融合的方法，尤其可用於調節胺基酸生物合成的基因。

發明內容
本發明的一個目的是提供具有利特性的其他啟動子和/或表達單元。
發明人已發現通過使用具有啟動子活性的核酸可實現該目的，該核酸包含以下用於基因轉錄的序列A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段(functionally equivalentfragment)。
根據本發明，「轉錄」是指從DNA模板開始產生互補RNA分子的過程。該過程涉及例如RNA聚合酶、所謂的σ因子及轉錄調節蛋白的蛋白質。接著，合成的RNA用作翻譯過程中的模板，其隨後產生生物合成活性蛋白質。
產生生物合成活性蛋白質的形成速率是轉錄速率與翻譯速率的結果。根據本發明，兩種速率均可改變，且因此改變微生物中產物的形成速率。
根據本發明，「啟動子」或「具有啟動子活性的核酸」是指以與待轉錄的核酸功能性連接的方式調節該核酸轉錄的核酸。
就此而言，「功能性連接」是指，例如一種具有啟動子活性的本發明的核酸和待轉錄的核酸序列以及適當條件下的其他調節元件(例如，確保核酸轉錄的核酸序列及終止子)的順序排列，這種方式使得各調節元件均可在該核酸序列的轉錄中發揮其功能。因此，化學意義上的直接連接並非絕對必要。例如增強子序列的遺傳控制序列能夠對甚至較遠位置，或甚至其他DNA分子的靶序列執行其功能。優選待轉錄的核酸序列位於本發明的啟動子序列之後(即，在3』末端)的排列，以便兩個序列共價連接在一起。就此而言，啟動子序列與待轉基因表達的核酸序列之間的距離優選小於200個鹼基對，特別優選小於100個鹼基對，進一步優選小於50個鹼基對。
根據本發明，「啟動子活性」是指在特定時間內由啟動子形成的RNA量，即指轉錄速率。
根據本發明，「特異啟動子活性」是指各啟動子在特定時間內由啟動子形成的RNA的量。
根據本發明，術語「野生型」是指合適的起始微生物。
視上下文而定，術語「微生物」是指起始微生物(野生型)或本發明的遺傳修飾微生物或其兩者。
優選地，尤其是在不能明確歸類微生物或野生型的情狀下，「野生型」是指在為了改變或影響啟動子活性或轉錄速率、為了改變或影響表達活性或表達速率及為了增加生物合成產物的含量的各個情況下的參考生物。
在一個優選實施方案中，該參考生物為穀氨酸棒桿菌ATCC 13032。
在一個優選實施方案中，所用的起始微生物已能夠產生所要精細化學品。就棒桿菌屬細菌的特別優選微生物及特別優選的精細化學品L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸而言，特別優選那些已能夠產生L-賴氨酸、L-甲硫氨酸和/或L-蘇氨酸的起始微生物通常。這些起始微生物特別優選為其中(例如)編碼天冬氨酸激酶的基因(ask基因)已去調節或反饋抑制作用已消除或降低的棒桿菌。這類細菌具有，例如在ask基因中導致反饋抑制作用降低或消除的突變，例如T311I突變。
因此，在與野生型相比，基因相關的「影響啟動子活性」或轉錄速率的情況下，導致與野生型相比在野生型中不以該方式存在的RNA的形成。
因此，在與野生型相比，基因相關的改變的啟動子活性或轉錄速率的情況下，與野生型相比特定時間內產生的RNA的量改變。
就此而言，「改變」優選指增加或降低。
例如，這可通過增加或降低本發明的內源啟動子的特異啟動子活性進行，例如通過使該啟動子突變，或通過刺激或抑制該啟動子。
實現啟動子活性或轉錄速率增加的另一種可能性是，例如通過具有啟動子活性的本發明的核酸或具有增加的特異啟動子活性的核酸調節來微生物中基因的轉錄，其中這些基因相對於這些具有啟動子活性的核酸是異源的。
通過具有啟動子活性的本發明的核酸或具有增加的特異啟動子活性的核酸調節微生物中基因的轉錄優選是通過以下方式實現
將一種或多種具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸的控制下進行一種或多種內源基因的轉錄；或將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的內源核酸的控制下進行一種或多種導入基因的轉錄；或將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸及與功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
具有啟動子活性的本發明的核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.1代表源自穀氨酸棒桿菌的超氧化物歧化酶(Psod)的啟動子序列。SEQ.ID.NO.1對應於野生型的啟動子序列。
本發明還涉及具有啟動子活性的核酸，其包含通過核苷酸的取代、插入或缺失從SEQ.ID.NO.1序列衍生的，且在核酸水平上與SEQ.ID.NO.1序列具有至少90％同一性的序列。
通過來自資料庫的核酸序列與上述序列SEQ ID NO1的同一性比較，本發明的啟動子的本發明的其他天然實例可容易地從例如基因組序列已知的多種生物中發現。
從序列SEQ ID NO1開始通過人工變異及突變(例如，通過核苷酸的取代、插入或缺失)可容易地得到本發明的人工啟動子序列。
本文中術語「取代」是指由一種或多種核苷酸置換一種或多種核苷酸。「缺失」是指通過直接連接來置換核苷酸。「插入」是指將核苷酸插入核酸序列中，伴隨一種或多種核苷酸對直接連接的形式置換。
兩種核酸間的同一性是指在各情況下核酸完整長度上的核苷酸同一性，具體地，同一性通過藉助Informax(美國)的Vector NTI Suite 7.1軟體，使用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fast and sensitive multiplesequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989年4月；5(2)151-1)進行比較計算出來的，其中參數設定如下多序列比對參數缺口開放罰分 10缺口拓展罰分 10缺口分離罰分範圍 8缺口分離罰分 關比對延遲同一性％ 40殘基特定缺口 關親水性殘基缺口 關過渡權重(transition weighing) 0雙序列比對參數FAST算法 開K-數組尺寸(tuplesize) 1缺口罰分 3窗口尺寸 5最佳對角線數目(Number of best diagonal)5因此，與序列SEQ ID NO1具有至少90％同一性的核酸序列是指當其序列與序列SEQ ID NO1比對時顯示至少90％同一性的核酸序列，所述比對具體指根據具有以上參數設定的上述程序設計的算法。
特別優選的啟動子顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.1的91％同一性，進一步優選為92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一性，特別優選為99％同一性。
此外，以本身已知方式，通過雜交技術可容易地發現啟動子的其他天然實例來源於上述核酸序列，尤其是來源於來自基因組序列未知的多種生物的序列SEQ.ID NO1。
因此，本發明的另一方面涉及具有啟動子活性的核酸，其包含在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.No.1雜交的核酸序列。該核酸序列包含至少10個核苷酸，更優選多於12、15、30、50個核苷酸或特別優選多於150個核苷酸。
根據本發明，在嚴格條件下進行雜交。這種雜交條件描述於例如Sambrook，J.，Fritsch，E.E.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57頁或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
嚴格雜交條件具體是指在由50％甲醯胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已變性、剪切的蛙精DNA組成的溶液中於42℃孵育過夜，隨後在65℃下用0.1×SSC洗滌濾膜。
「功能等效片段」是指具有與起始序列大體相同或更高的特異啟動子活性的啟動子活性片段的核酸序列。
「基本上一致」是指呈現起始序列的特異啟動子活性的至少50％、優選60％、更優選70％、更優選80％、更優選90％、特別優選95％的特異啟動子活性。
「片段」是指實施方案A)、B)或C)描述的具有啟動子活性的核酸的部分序列。這些片段優選具有多於10個、更優選多於12、15、30、50個或特別優選多於150個核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相連核苷酸。
特別優選使用核酸序列SEQ.ID.NO.1作為啟動子，即用於基因的轉錄。
Genbank條目AP005283已在未說明功能的情況下描述了SEQ.ID.NO.1。因此，本發明進一步涉及本發明的新的具有啟動子活性的核酸序列。
具體地，本發明涉及具有啟動子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
另外，可以本身已知方式，通過從核苷酸結構單位進行化學合成來製備上述具有啟動子活性的所有核酸，例如通過雙螺旋的單個重疊互補核酸結構單位的片段縮合。例如，通過亞磷醯胺方法(Voet，Voet，第2版，WileyPress New York，第896-897頁)由已知方式進行寡核苷酸的化學合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和連接反應以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及補平缺口。
本發明進一步涉及表達單元的用途，該表達單元包含一種具有啟動子活性的本發明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保用以基因表達的核糖核酸的翻譯。
根據本發明，表達單元是指具有表達活性的核酸，即以與待表達核酸功能性連接的方式調節表達的核酸或基因，其中所述表達即指該核酸或該基因的轉錄及翻譯。
就此而言，「以功能性連接」是指，例如一種本發明的表達單元與待轉基因表達的核酸序列以及適當條件下的其他調節元件(如終止子)的順序排列，這種方式使得各調節元件均可在該核酸序列的轉基因表達中發揮其功能。化學意義上的直接連接對此而言並非絕對必要。例如增強子序列的遺傳控制序列能夠對較遠位置，或甚至不同DNA分子的目標序列執行其功能。優選待轉基因表達的核酸序列位於本發明的表達單元序列後(即，在3』末端)的排列，以便這兩個序列共價連接在一起。在這種情況下，表達單元序列與待轉基因表達的核酸序列之間的距離優選小於200個鹼基對，特別優選小於100個鹼基對，進一步優選小於50個鹼基對。
根據本發明，「表達活性」是指在特定時間內由表達單元產生的蛋白質的量，即表達速率。
根據本發明，「特異表達活性」是指各表達單元在特定時間內由表達單元產生的的蛋白質的量。
因此，在與野生型相比，基因相關的「影響表達活性」或表達速率的情況下，導致與野生型相比在野生型中不以該方式存在的蛋白質的產生。
因此，在與野生型相比，基因相關的「改變的表達活性」或表達速率的情況下，與野生型相比特定時間內產生的蛋白質的量改變。
就此而言，「改變」優選指增加或降低。
例如，這可通過增加或降低內源表達單元的特異活性進行，例如通過使該表達單元突變或通過刺激或抑制該表達單元。
另外，例如通過本發明的表達單元或具有增加的特異表達活性的表達單元調節微生物中基因的表達可以實現增加表達活性或表達速率，其中這些基因相對於這些表達單元是異源的。
通過本發明的表達單元或具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元調節微生物中基因的表達優選是通過以下方式實現將一種或多種適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元的控制下進行一種或多種內源基因的表達；或將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入基因的表達；或將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元以及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
本發明的表達單元包含具有啟動子活性的上述本發明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
確保核糖核酸翻譯的該核酸序列優選包含核酸序列SEQ.ID.NO.42作為核糖體結合位點。
在一個優選實施方案中，本發明的表達單元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
核酸序列SEQ.ID.NO.2表示源自穀氨酸棒桿菌的超氧化物歧化酶(Psod)的表達單元的核酸序列。SEQ.ID.NO.2對應於野生型的表達單元的序列。
本發明還涉及表達單元，其包含通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列。
通過來自資料庫的該核酸序列與上述序列SEQ ID NO2的同一性比較，本發明的表達單元的本發明的其他天然實例可容易地從例如基因組序列已知的各種生物中發現。
可容易地發現本發明的表達單元的人工序列是通過人工變異及突變(例如，通過核苷酸的取代、插入或缺失)來源於序列SEQ ID NO2。
因此，與序列SEQ ID NO2具有至少90％同一性的核酸序列是指當其序列與序列SEQ ID NO2比對時顯示至少90％同一性的核酸序列，所述的比對具體指根據具有以上參數設定的上述程序設計的算法。
特別優選的表達單元顯示與核酸序列SEQ.ID.NO.2的91％同一性，進一步優選為92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％同一性，特別優選為99％同一性。
此外，以本身已知方式，通過雜交技術可容易地發現表達單元的其他天然實例來源於上述核酸序列，尤其是來源於來自基因組序列未知的各種生物的序列SEQ.ID NO2。
因此，本發明的另一方面涉及包含在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.No.2雜交的核酸序列的表達單元。該核酸序列包含至少10個核苷酸，更優選多於12、15、30、50個核苷酸或特別優選多於150個核苷酸。
「雜交作用」是指在嚴格條件下多核苷酸或寡核苷酸結合至實際互補序列，同時在這種條件下不進行非互補配對之間的非特異性結合的能力。就此而言，序列應當優選為90-100％互補。例如，在Northern或Southern印跡技術或在PCR或RT-PCR引物結合中使用這種互補序列能夠彼此特異結合的特性。
根據本發明，在嚴格條件下進行雜交。此種雜交條件描述於例如Sambrook，J.，Fritsch，E.E.，Maniatis，T.在Molecular Cloning(ALaboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57頁或者Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
嚴格雜交條件具體是指在由50％甲醯胺、5×SSC(750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖及20g/ml已變性、剪切的蛙精DNA組成的溶液中於42℃孵育過夜，隨後在65℃下用0.1×SSC洗滌濾膜。
本發明的核苷酸序列還可能產生可用於識別和/或克隆其他細胞類型及微生物中的同源序列的探針及引物。這類探針及引物通常包含在嚴格條件下，與本發明的核酸序列的有義鏈或對應反義鏈上至少約12個、優選至少約25個(例如約45、50或75個)連續核苷酸雜交的核酸序列區域。
根據本發明，包含所謂的沉默突變的核酸序列，或與具體涉及的序列相比，根據具體起始生物或宿主生物的密碼子選擇進行修飾的核酸序列及其天然存在的變體，如其剪接變體或等位變體也包含在本發明中。
「功能等效片段」是指具有與起始序列大體相同或更高的特異表達活性的表達單元片段。
「基本上一致」是指呈現起始序列的特異表達活性的至少50％、優選60％、更優選70％、更優選80％、更優選90％、特別優選95％的特異表達活性。
「片段」是指實施方案E)、F)或G)描述的表達單元的部分序列。這些片段優選具有多於10個、更優選多於12、15、30、50個或特別優選多於150個核酸序列SEQ.ID.NO.1中的相連核苷酸。
特別優選使用核酸序列SEQ.ID.NO.2作為表達單元，即用於基因的表達。
Genbank條目AP005283已在未說明功能的情況下描述了SEQ.ID.NO.2。因此，本發明進一步涉及本發明的新的表達單元。
具體地，本發明涉及表達單元，其包含具有啟動子活性的本發明的核酸及另外功能性連接的核酸序列，該核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
本發明特別優選涉及表達單元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，且在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
本發明的表達單元包含一種或多種以下遺傳元件負10(「-10」)序列、負35(「-35」)序列、轉錄序列起點、增強子區域及操縱基因區域。
這些遺傳元件優選是棒桿菌種特異的，尤其是穀氨酸棒桿菌特異的。
另外，可以本身已知方式，通過從核苷酸結構單位進行化學合成來製備上述所有表達單元，例如通過雙螺旋的單獨重疊互補核酸結構單位的片段縮合。例如，通過亞磷醯胺方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press NewYork，第896-897頁)由已知方式進行寡核苷酸的化學合成。Sambrook等人(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和連接反應以及通用克隆方法加入合成的寡核苷酸及補平缺口。
本申請中用於本發明的方法及技術是熟悉微生物及重組DNA技術的本領域技術人員所知的。用於培養細菌細胞、將分離的DNA分子插入宿主細胞中並分離，及分離的核酸分子的克隆及測序等的方法與技術為這類技術與方法的實例。許多標準文獻資料描述了這些方法Davis等人，BasicMethods In Molecular Biology(1986)；J.H.Miller，Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York(1972)；J.H.Miller，A Short Course in BacterialGenetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1992)；M.Singer與P.Berg，Genes Genomes，University ScienceBooks，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.E.Fritsch與T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufmann等人，Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biologyand Medicine，CRC Press，Boca Raton，Florida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick與J.E.Thompson編著，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)及P.E.Smith-Keary，MolecularGenetics of Escherichia coli，The Guilford Press，New York，NY(1989)。
本發明所有的核酸分子優選為分離的核酸分子的形式。「分離的」核酸分子是分離自存在於該核酸的天然來源中的其他核酸分子，另外，如果其是由重組技術製備的，則可基本上不含有其他細胞材料或培養基，或者如果其是經化學合成的，則可基本上不含化學前體或其他化學物。
另外，本發明包括與具體描述的核苷酸序列互補的核酸分子或其部分。
例如，如下所述，本發明的啟動子和/或表達單元可特別有利地用於通過下述發酵來製備生物合成產物的改進方法中。
具體地，本發明的啟動子和/或表達單元的優點在於其是通過應激(stress)在微生物中誘導的。可能通過對發酵過程進行適當控制來控制該特別用於增加目的基因的轉錄/表達速率的應激誘導。具體地，在L-賴氨酸產生中，極早達到該應激階段，以便在這種情況下極早達到目的基因的增加的轉錄/表達速率。
與野生型相比，具有啟動子活性的本發明的核酸可用於改變(即提高或降低)或影響微生物中基因的轉錄速率。
與野生型相比，本發明的表達單元可用於改變(即提高或降低)或影響微生物中基因的表達速率。
具有啟動子活性的本發明的核酸及本發明的表達單元也可用於調節及增強微生物中(尤其是在棒桿菌菌種中)例如精細化學品、蛋白質(尤其為胺基酸)的各種生物合成產物的產生。
因此，與野生型相比，本發明涉及通過以下方式改變或影響微生物中基因轉錄速率的方法a)與野生型相比，改變微生物中具有啟動子活性的本發明的內源核酸的特異啟動子活性，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或b)以具有啟動子活性的本發明的核酸，或以具有實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
根據實施方案a)，與野生型相比，可通過改變(即增加或降低)微生物中特異啟動子的活性來改變或影響的微生物中基因的轉錄速率。例如，這可通過具有啟動子活性的本發明的核酸序列的定向突變(即通過核苷酸的定向取代、缺失或插入)來進行。可通過置換RNA聚合酶全酶結合位點(本領域的技術人員也稱其為-10區與-35區)中的核苷酸來達到增加或降低啟動子的活性。此外，通過缺失核苷酸或插入核苷酸來縮小或擴大所述RNA聚合酶全酶結合位點彼此之間的距離。另外通過將調節蛋白質(本領域的技術人員也稱其為阻抑蛋白及激活蛋白)的結合位點(本領域的技術人員也稱其為操縱基因)插入RNA聚合酶全酶的結合位點的空間相鄰區域，使得在結合至啟動子序列後，這些調節物減弱或增強RNA聚合酶完全酶的結合及轉錄活性或使其處於新的調節影響下。
核酸序列SEQ.ID.NO.44優選代表本發明的表達單元的核糖體結合位點，且序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43代表本發明的表達單元的-10區。在這些區域中核酸序列的改變導致特異表達活性的改變。
因此，本發明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.44在表達單元中作為核糖體結合位點的用途，所述表達單元能使基因在棒桿菌屬或短桿菌(Brevibacterium)屬細菌中表達。
本發明進一步涉及核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43在表達單元中作為-10區的用途，所述表達單元能使基因在棒桿菌菌或短桿菌屬細菌中表達。
具體地，本發明涉及能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中表達的表達單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.44。在這種情況下，核酸序列SEQ.ID.NO.44優選用作核糖體結合位點。
本發明進一步涉及能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中表達的表達單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43。在這種情況下，核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43優選用作-10區。
就「特異啟動子活性」而言，與野生型相比的增加或降低是指與野生型的具有啟動子活性的本發明的核酸相比(即，例如與SEQ.ID.NO.1相比)，特異活性的增加或降低。
根據實施方案b)，微生物中基因轉錄速率與野生型相比的改變或影響，可通過以具有啟動子活性的本發明的核酸或以具有根據實施方案a)的改變的特異啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄來進行，其中這些基因與這些具有啟動子活性的核酸是異源的。
此優選通過以下方式實現b1)將一種或多種具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或b2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的內源核酸控制下進行一種或多種導入的基因的轉錄，或b3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
因此，可能通過以下方式改變(即提高或降低)野生型內源基因的轉錄速率根據實施方案b1)，將一種或多種具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或根據實施方案b2)，將一種或多種內源基因導入微生物基因組中，以便在具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的內源核酸控制下進行一種或多種導入的內源基因的轉錄，或根據實施方案b3)，將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉錄內源核酸。
因此，另外可能通過以下方式影響與野生型相比的外源基因的轉錄速率根據實施方案b2)，將一種或多種內源基因導入微生物基因組中，以便在具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的內源核酸控制下進行一種或多種導入的外源基因的轉錄，或根據實施方案b3)，將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的本發明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉錄外源核酸。
此外，可通過將基因整合至編碼區或非編碼區中來進行如實施方案b2)的基因插入。優選插入至非編碼區中。
此外，可在染色體上或染色體外進行如實施方案b3)的核酸構建物的插入。優選核酸構建物的染色體插入。「染色體」整合是將外源DNA片段插入至宿主細胞的染色體中。該術語也用於外源DNA片段與宿主細胞染色體上適當區域之間的同源重組。
在實施方案b)中，優選也使用具有如實施方案a)的改變的特異啟動子活性的本發明的核酸。在實施方案b)中，如實施方案a)中所述，這些核酸可在微生物中存在或製備，或將其以分離的形式導入微生物中。
「內源」是指已存在於野生型基因組中的遺傳信息，例如基因。
「外源」是指不存在於野生型基因組中的遺傳信息，例如基因。
與具有啟動子活性的本發明的核酸進行的轉錄調節有關的術語「基因」優選是指核酸，其包含待轉錄的區域(即，例如調節翻譯的區域)及編碼區，且適當條件下進一步包含例如終止子的調節元件。
如下所述，與本發明的表達單元進行的表達調節有關的術語「基因」優選是指核酸，其包含編碼區，且適當條件下進一步包含例如終止子的調節元件。
「編碼區」是指編碼蛋白質的核酸序列。
相對於具有啟動子活性的核酸及基因而言的「異源性」是指所用基因在具有啟動子活性的本發明的核酸的調節下，在野生型中不轉錄，但是產生了在野生型中不存在的新的功能性連接及在野生型中不存在的具啟動子活性的本發明的核酸與特定基因的功能性組合。
相對於表達單元及基因而言的「異源性」是指所用基因在具有啟動子活性的本發明的表達單元的調節下，在野生型中不表達，但是產生了在野生型中不存在的新的功能性連接及在野生型中不存在的本發明的表達單元與特定基因的功能性組合。
在一個優選實施方案中，與野生型相比，本發明進一步涉及通過以下方式提高或影響微生物中基因的轉錄速率的方法ah)與野生型相比，增加具有啟動子活性的本發明的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或bh)以具有啟動子活性的本發明的核酸，或以具有實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的核酸調節微生物中的基因的轉錄，其中所述基因相對於具有啟動子活性的核酸而言是異源的。
以具有啟動子活性的本發明的核酸，或以增加根據實施方案ah)的具有的特異啟動子活性的本發明的核酸進行的微生物中基因轉錄的調節優選是通過以下方式實現bh1)將一種或多種具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的本發明的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的本發明的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或bh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的本發明的內源核酸控制下進行一種或多種導入的基因的轉錄，或bh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的本發明的核酸以及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
在一個優選實施方案中，與野生型相比，本發明進一步涉及通過以下方式降低微生物中基因的轉錄速率的方法ar)與野生型相比，降低具有啟動子活性的本發明的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或br)將具有實施方案a)所述的降低的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有降低的啟動子活性的核酸的控制下進行內源基因的轉錄。
與野生型相比，本發明進一步涉及通過以下方式改變或影響微生物中基因表達速率的方法c)與野生型相比，改變本發明的內源表達單元在微生物中的特異表達活性，所述內源表達單元調節內源基因的表達，或d)以本發明的表達單元，或以具有實施方案c)所述的改變的特異表達活性的本發明的表達單元調節微生物中基因的表達，其中所述基因相對於所述表達單元而言是異源的。
根據實施方案c)，與野生型相比，可通過改變(即增加或降低)微生物中的特異表達活性來改變或影響微生物中基因的表達速率。例如，這可通過具有啟動子活性的本發明的核酸序列的定向突變(即，通過核苷酸的定向取代、缺失或插入)來進行。例如，延長Shine-Dalgarno序列與翻譯起始密碼子之間的距離通常導致變化，該變化為特異表達活性的減弱或增強。也可通過缺失或插入核苷酸來縮短或延長Shine-Dalgarno區(核糖體結合位點)的序列與翻譯起始密碼子之間的距離，從而實現特異表達活性的改變。但是，還可通過使其與互補的3』端16S rRNA的同源性增強或減弱方式改變Shine-Dalgarno區的序列來實現。
就「特異表達活性」而言，與野生型相比的增加或降低是指與野生型的本發明的表達單元相比(即，例如與SEQ.ID.NO.2相比)，特異活性的增加或降低。
根據實施方案d)，可通過本發明的表達單元，或具有根據實施方案c)的改變的特異表達活性的本發明的表達單元調節微生物中基因的表達，從而改變或影響微生物中與野生型相比的基因的表達速率，其中這些基因相對於這些表達單元而言是異源的。
該優選通過以下方式達到d1)將一種或多種適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物的基因組中，以便在導入的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或d2)將一種或多種基因導入微生物的基因組中，以便在適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入的基因的表達，或d3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元以及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
因此，可能通過以下方式改變(提高或降低)野生型內源基因的表達速率根據實施方案d1)，將一種或多種適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物的基因組中，以便在導入的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或根據實施方案d2)，將一種或多種基因導入微生物的基因組中，以便在適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入的基因的表達，或根據實施方案d3)，將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元以及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
因此，另外可能通過以下方式影響與野生型相比的內源基因的表達速率根據實施方案d2)，將一種或多種基因導入微生物的基因組中，以便在適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入的基因的表達，或根據實施方案d3)，將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的本發明的表達單元以及功能性連接的一種或多種待表達外源核酸。
此外，可通過將基因整合至編碼區或非編碼區中來進行根據實施方案d2)的基因插入。優選插入至非編碼區中。
此外，可在染色體上或染色體外進行如實施方案d3)的核酸構建物的插入。優選核酸構建物的染色體插入。
在下文中，核酸構建物也稱作表達盒。
在實施方案d)中，優選也使用具有根據實施方案c)的改變的特異表達活性的本發明的表達單元。在實施方案d)中，如實施方案c)中所述，這些表達單元可在微生物中存在或製備，或以分離的形式導入微生物中。
在一個優選實施方案中，與野生型相比，本發明進一步涉及通過以下方式提高或影響微生物中基因表達速率的方法ch)與野生型相比，增加本發明的內源表達單元在微生物中的特異表達活性，所述表達單元調節內源基因的表達，或dh)以本發明的表達單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達活性的表達單元來調節微生物中基因的表達，其中所述基因相對於所述表達單元而言是異源的。
以本發明的表達單元，或以具有實施方案c)所述的增加的特異表達活性的表達單元進行的微生物中基因表達的調節優選是通過以下方式實現dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的，適當條件下具有增加的特異表達活性的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或dh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元以及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
與野生型相比，本發明進一步涉及通過以下方式降低微生物中基因表達速率的方法cr)與野生型相比，降低本發明的內源表達單元在微生物中的特異表達活性，所述內源表達單元調節內源基因的表達，或dr)將實施方案cr)所述的具有降低的特異表達活性的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的具有降低的表達活性的表達單元的控制下進行內源基因的表達。
在用於改變或影響微生物中基因的轉錄速率和/或表達速率的上述本發明方法的一個優選實施方案中，這些基因選自編碼來自精細化學品的生物合成途徑的蛋白質的核酸，其中這些基因任選包含其他調節元件。
在用於改變或影響微生物中基因的轉錄速率和/或表達速率的上述本發明方法的特別優選的實施方案中，這些基因選自核酸編碼來自蛋白型與非生蛋白胺基酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質的核酸，其中這些基因任選包含其他調節元件。
在一個特別優選的實施方案中，來自胺基酸的生物合成途徑的蛋白質選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸(dihydrodipicolinate)合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、磷酸丙糖異構酶、轉錄調節物LuxR、轉錄調節物LysR1、轉錄調節物LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉酮酶、轉醛酶、高絲氨酸O-乙醯轉移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉移酶、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙醯轉移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體(exporter carrier)、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷醯轉移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調節物、RXN2910調節物、精氨醯-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白(efflux protein)、絲氨酸羥甲基轉移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247、蛋白質OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
優選的蛋白質及編碼源自胺基酸生物合成途徑的上述這些蛋白質的優選蛋白質的核酸分別為微生物來源的蛋白質序列及核酸序列，優選源自棒桿菌屬或短桿菌屬細菌，優選源自棒桿菌，特別優選源自穀氨酸棒桿菌。
來自胺基酸生物合成途徑的這些蛋白質的特別優選蛋白質序列及編碼這些蛋白質的相應核酸序列的實例、其參考文獻及其在參考文獻中的編號列於表1中
表1





特別優選的來自胺基酸生物合成途徑的蛋白質序列及編碼該蛋白質對應的核酸序列的其他實例為果糖-1，6-二磷酸酶2(也稱作fbr2)的序列(SEQ.ID.NO.41)及對應的編碼果糖-1，6-二磷酸酶2(SEQ.ID.NO.40)的核酸序列。
特別優選的來自胺基酸生物合成途徑的蛋白質序列及編碼該蛋白質的對應核酸序列的其他實例為硫酸鹽還原作用中的蛋白質(也稱作RXA077)的序列(SEQ.ID.NO.4)及對應的編碼硫酸鹽還原作用中的蛋白質的核酸序列(SEQ.ID.NO.3)。
其他特別優選的來自胺基酸生物合成途徑的蛋白質序列在各種情況下均具有該蛋白質在表1中所示的胺基酸序列，其中表2/第2列中所示的每個蛋白質的胺基酸序列的胺基酸位置中的至少一個上具有與表2/第3列同一行中所示的各胺基酸不同的生蛋白胺基酸。在另一個優選實施方案中，表2/第2列中所示的蛋白質的胺基酸序列的胺基酸位置中的至少一個上具有表2/第4列同一行中所示的胺基酸。表2中所示的蛋白質是胺基酸生物合成途徑的突變蛋白，其具有特別有益的特性並因此特別適合通過本發明的啟動子表達對應的核酸，並產生胺基酸。例如，T311I突變導致ask的反饋抑制被中止。
編碼表2中的上述突變蛋白的對應核酸可以通過常規方法製備。
用於製備編碼突變蛋白的核酸序列的適合出發點是，例如以保藏號ATCC 13032獲自美國典型培養物保藏中心的穀氨酸棒桿菌菌株的基因組，或表1中提及的核酸序列。為了將突變蛋白的胺基酸序列逆翻譯成編碼這些蛋白質的核酸序列，最好使用該核酸序列將被導入的生物的密碼子選擇，或該核酸序列存在於其中的生物的密碼子選擇。例如，就穀氨酸棒桿菌而言，最好使用穀氨酸棒桿菌的密碼子選擇。可以本身已知的方式從資料庫或專利申請中確定具體生物的密碼子選擇，所述專利申請描述了目的生物中的至少一種蛋白質及一種編碼這種蛋白質的基因。
以如下方式理解表2中的信息第1列「符號」中指明與表1有關的各序列的明確名稱。
第2列「AA位置」中，各數字是指來自表1的對應多肽序列的胺基酸位置。因此，「AA位置」列中「26」是指對應的所示多肽序列的胺基酸的第26位。位置的編號是由N末端+1起始。
第3列「AA野生型」中各個字母表示表1中相應野生型菌株序列上在第2列所示位置上的胺基酸，其以單字母代碼表示。
第4列「AA突變型」中各字母表示對應突變型菌株中第2列中所示位置上的胺基酸，其以單字母代碼表示。
第5列「功能」中指明對應多肽序列的生理功能。
就具有特定功能(第5列)及特定起始胺基酸序列(表1)的突變蛋白而言，第2、3及4列描述了至少一個突變及某些序列的多個突變。該多個突變始終是指在各情況下最接近的上述起始胺基酸序列(表1)。術語特定胺基酸序列的「胺基酸位置中的至少一個」優選是指該胺基酸序列在第2、3及4列中所述的至少一個突變。
生蛋白胺基酸的單字母代碼A 丙氨酸C 半胱氨酸D 天冬氨酸E 穀氨酸F 苯丙氨酸G 甘氨酸H 組氨酸I 異亮氨酸K 賴氨酸L 亮氨酸M 甲硫氨酸N 天冬醯胺P 脯氨酸Q 穀氨醯胺R 精氨酸S 絲氨酸T 蘇氨酸V 纈氨酸W 色氨酸Y 酪氨酸表2




在用於改變或影響微生物中基因的轉錄速率和/或表達速率的上述本發明方法及用於產生基因修飾微生物(下面稱為基因修飾微生物)的下述方法及用於產生生物合成產物的下述方法中，優選以SacB方法將具有啟動子活性的本發明的核酸、本發明的表達單元、上述基因及上述核酸構建物或表達盒導入微生物中，具體地，將它們導入棒桿菌中。
SacB方法是本領域的技術人員所知道的，且描述於，例如Schfer A，Tauch A，Jger W，Kalinowski J，Thierbach G，Piihler A.；Smallmobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichiacoli plasmids pK18 and pK19selection of defined deletions in thechromosome of Corynebacterium glutamicum，Gene.1994年7月22日；145(1)69-73及Blomfield IC，Vaughn V，Rest RE，Eisenstein BL.；Allelicexchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and atemperature-sensitive pSC101 replicon；Mol Microbiol.1991年6月；5(6)1447-57中。
在上述本發明方法的一個優選實施方案中，通過將具有啟動子活性的本發明的核酸或本發明的表達單元導入微生物中來改變或影響微生物中基因的轉錄速率和/或表達速率。
在上述本發明方法的另一個優選實施方案中，通過將上述核酸構建物或表達盒導入微生物中來改變或影響微生物中基因的轉錄速率和/或表達速率。
因此，本發明也涉及表達盒，其包含至少一種本發明的表達單元，至少一種其他待表達核酸序列，即待表達基因，及適當條件下的其他遺傳控制元件，例如終止子。
其中至少一種表達單元與其他待表達核酸序列功能性連接在一起，且所述的其他待表達核酸序列相對於該表達單元而言是異源的。
待表達核酸序列優選為編碼來自精細化學品生物合成途徑的蛋白質的核酸中的至少一種。
待表達核酸序列特別優選選自編碼來自蛋白型與非生蛋白胺基酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質的核酸。
來自胺基酸的生物合成途徑的優選蛋白質描述如上，且其實例描述於表1與2中。
選擇本發明的表達盒中表達單元相對於待表達基因的物理位置，以便表達單元調節轉錄，並優選也調節待表達基因的翻譯，且因此能夠產生一種或多種蛋白質。就此而言，「能夠產生」包括產生過程中的組成型增加、在特定條件下產生的減少或阻斷和/或在特定條件下產生的增加。就此而言，「條件」包含(1)向培養基中添加組分，(2)從培養基移除組分，(3)以另一種成份置換培養基中的一種組分，(4)提高培養基的溫度，(5)降低培養基的溫度及(6)調節大氣條件，例如，培養基所處的氧或氮濃度。
本發明進一步涉及包含上述本發明的表達盒的表達載體。
載體為本領域技術人員熟知且可在「Cloning Vectors」(Pouwels P.H.等人，編者，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中發現。除質粒以外，載體也指本領域的技術人員已知的所有其他載體，例如噬菌體、轉座子、IS元件、噬粒、粘粒及線性或環狀DNA。這些載體可在宿主生物中自主複製或進行染色體複製。
適合且特別優選的質粒為那些在棒桿菌中複製的質粒。例如pZ1(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology(1989)64549-554)、pEKEx1(Eikmanns等人，Gene 10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等人，Gene 10769-74(1991))的眾多已知質粒載體基於隱蔽性質粒pHM1519、pBL1或pGA1。可用相同方式使用其他質粒載體，例如pCLiK5MCS或那些基於pCG4(US-A 4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等人，FEMS Microbiology Letters 66，119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的質粒載體。
藉助於染色體整合的基因擴增方法的那些質粒載體也同樣適合用於複製及擴增hom-thrB操縱子，所述質粒載體，例如Reinscheid等人(Appliedand Environmental Microbiology 60，126-132(1994))所述。在該方法中，完整基因克隆至質粒載體中，該質粒載體能在宿主(通常為大腸桿菌(E.coli))中複製而不能在穀氨酸棒桿菌中複製。合適載體的實例為pSUP301(Sirnon等人，Bio/Technology 1，784-791(1983))、pK18mob或pK19mob(Schfer等人，Gene 145，69-73(1994)，Bernard等人，Journal of Molecular Biology，234534-541(1993))、pEM1(Schrumpf等人，1991，Journal of Bacteriology1734510-4516)或pBGS8(Spratt等人，1986，Gene 41337-342)。隨後通過轉化，將包含待擴增基因的質粒載體轉入目的穀氨酸棒桿菌菌株中。用於轉化的方法是，例如Thierbach等人(Applied Microbiology andBiotechnology 29，356-362(1988))、Dunican與Shivnan(Biotechnology 7，1067-1070(1989))及Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))中描述的方法。
本發明進一步涉及基因修飾微生物，其中該基因修飾作用導致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的轉錄速率，且其取決於a)改變至少一種第1項所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性，該內源核酸調節至少一種內源基因的轉錄，或b)以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的第1項所述的具有啟動子活性的核酸調節微生物中基因的轉錄，其中這些基因相對於這些具有啟動子活性的核酸而言是異源的。
就上述方法而言，以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的第1項所述的具有啟動子活性的核酸進行的微生物中基因轉錄的調節通過以下方式實現b1)將一種或多種第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸的控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或b2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的內源核酸的控制下進行一種或多種導入基因的轉錄，或b3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
本發明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的轉錄速率已提高或影響的基因修飾微生物，其中ah)與野生型相比，第1項所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性是增加的，這些內源核酸調節內源基因轉錄，或bh)以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案ah)所述的增加的特異啟動子活性的核酸調節微生物中基因的轉錄，其中這些基因相對於這些具有啟動子活性的核酸而言是異源的。
就上述方法而言，以第1項所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的第1項所述的具有啟動子活性的核酸進行的微生物中基因轉錄的調節通過以下方式實現bh1)將一種或多種第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸的控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或bh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的內源核酸的控制下進行一種或多種導入基因的轉錄，或bh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含第1項所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
本發明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的轉錄速率已降低的基因修飾微生物，其中ar)與野生型相比，至少一種第1項所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性是降低的，該內源核酸調節至少一種內源基因的轉錄，或br)將一種或多種實施方案a)所述的具有已降低的啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有已降低的啟動子活性的核酸的控制下進行至少一種內源基因的轉錄。
本發明進一步涉及基因修飾微生物，其中該基因修飾導致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的表達速率，且其取決於c)與野生型相比，改變至少一種第2或3項所述的內源表達單元在微生物中的特異表達活性，該內源表達單元調節至少一種內源基因的表達，或d)以第2或3項所述的表達單元，或以具有實施方案a)所述的改變的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元調節微生物中基因的表達，其中這些基因相對於這些表達單元而言是異源的。
就上述方法而言，以第2或3項所述的表達單元，或以如實施方案a)的具有改變的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元進行的微生物中基因表達的調節通過以下方式實現d1)將一種或多種適當條件下具有改變的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有改變的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元的控制下進行一種或多種內源基因的表達，或d2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有改變的特異表達活性的第2或3項所述的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或d3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
本發明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的表達速率已提高或受影響的基因修飾微生物，其中ch)與野生型相比，至少一種第2或3項所述的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是增加的，該內源表達單元調節內源基因表達，或dh)以第2或3項所述的表達單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元調節微生物中基因的表達，其中這些基因相對於這些表達單元而言是異源的。
就上述方法而言，以第2或3項所述的表達單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元進行的微生物中基因表達的調節通過以下方式實現dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有增加的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或dh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的第2或3項所述的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的第2或3項所述的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
本發明進一步涉及與野生型相比，具有至少一種基因的表達速率已降低的基因修飾微生物，其中cr)與野生型相比，至少一種第2或3項所述的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是降低的，該內源表達單元調節至少一種內源基因的表達，或dr)將一種或多種具有已降低的表達活性的第2或3項所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的具有已降低的表達活性的第2或3項所述的表達單元的控制下進行至少一種內源基因的表達。
本發明進一步涉及基因修飾微生物，其包含第2或3項所述的表達單元及功能性連接的待表達基因，其中該基因相對於表達單元而言是異源的。
該基因修飾微生物特別優選包含本發明的表達盒。
本發明特別優選涉及包含載體的基因修飾微生物，具體地是包含載體的棒桿菌，所述載體具體地是穿梭載體或質粒載體，該載體錨定至少一種如本發明所定義的重組核酸構建物。
在基因修飾微生物的一個優選實施方案中，上述基因為編碼來自精細化學品的生物合成途徑的蛋白質的核酸中的至少一種。
在基因修飾微生物的一個特別優選的實施方案中，上述基因選自編碼來自蛋白型與非生蛋白胺基酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質的核酸，其中這些基因可任選包含其他調節元件。
來自胺基酸的生物合成途徑的優選蛋白質選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構酶、轉錄調節物LuxR、轉錄調節物LysR1、轉錄調節物LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉酮酶、轉醛酶、高絲氨酸O-乙醯轉移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉移酶、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙醯轉移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷醯轉移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調節物、RXN2910調節物、精氨醯-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247、蛋白質OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
來自胺基酸生物合成途徑的蛋白質及基因的特別優選實例如上描述於表1及表2中。
優選的微生物或基因修飾微生物為細菌、藻類、真菌或酵母菌。
具體地，特別優選的微生物為棒桿菌。
優選的棒桿菌為棒桿菌屬細菌，尤其為穀氨酸棒桿菌菌種、乙醯穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)菌種、嗜乙醯乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)菌種、熱產氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)菌種、棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)菌種及有效棒桿菌(Corynebacteriumefficiens)菌種；或短桿菌屬細菌，尤其為黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)菌種、乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)菌種及叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum)菌種。
特別優選的棒桿菌屬與短桿菌屬細菌選自穀氨酸棒桿菌ATCC13032、乙醯穀氨酸棒桿菌ATCC 15806、嗜乙醯乙酸棒桿菌ATCC 13870、熱產氨棒桿菌FERM BP-1539、棲糖蜜棒桿菌ATCC 17965、有效棒桿菌DSM 44547、有效棒桿菌DSM 44548、有效棒桿菌DSM 44549、黃色短桿菌ATCC 14067、乳糖發酵短桿菌ATCC 13869、叉開短桿菌ATCC 14020、穀氨酸棒桿菌KFCC 10065及穀氨酸棒桿菌ATCC 21608。
縮寫KFCC是指韓國聯邦菌物保藏中心(Korean Federation ofCulture Collection)，縮寫ATCC是指美國典型培養物保藏中心及縮寫DSM是指德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikrorganismen)。
其他特別優選的棒桿菌屬與短桿菌屬細菌列於表3中









這些縮寫具有以下含義ATCC美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD，美國FERM發酵研究所，Chiba，日本NRRLARS保藏中心，北方農業研究所(Northern Regional ResearchLaboratory)，Peoria，IL，美國CECT西班牙典型培養物保藏中心(Coleccion Espanola de CultivosTipo)，Valencia，西班牙NCIMB國立工業和海洋微生物保藏有限公司，Aberdeen，英國CBS真菌菌種保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures)，Baarn，荷蘭NCTC國立典型培養物保藏中心，London，英國DSMZ德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，Braunschweig，德國。
通過具有啟動子活性的本發明的核酸及本發明的表達單元，可能藉助於上述本發明的方法調節上述本發明的基因修飾微生物中的特定生物合成產物的代謝路徑。
基於此目的，例如通過影響或提高某生物合成途徑的基因轉錄速率或表達速率來增強產生特定生物合成產物的這個代謝路徑，其中增加的蛋白質的量導致目的生物合成途徑的這些蛋白質的總活性增加，且因此導致通向目的生物合成產物的代謝通量增加。
此外，可通過降低某分支生物合成途徑的基因轉錄速率或表達速率來減弱從特定生物合成產物分支的代謝路徑，其中降低的蛋白質的量導致非目的生物合成途徑的那些蛋白質的總活性降低，且因此額外導致通向目的生物合成產物的增加。
本發明基因修飾微生物能夠產生，例如來自葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉、纖維素的生物合成產物或來自甘油與乙醇的生物合成產物。
因此，本發明涉及通過培育本發明的基因修飾微生物來產生生物合成產物的方法。
基於目的生物合成產物，必須提高或降低多種基因的轉錄速率或表達速率。通常，最好改變多個基因的轉錄速率或表達速率，即，提高基因組合的轉錄速率或表達速率和/或降低基因組合的轉錄速率或表達速率。
在本發明的基因修飾微生物中，至少一種基因的改變的(即提高的或降低的)轉錄速率或表達速率是歸因於具有啟動子活性的本發明的核酸或本發明的表達單元。
另外，基因修飾微生物中其他基因的額外改變的(即額外提高的或額外降低的)轉錄速率或表達速率可(但不是必需)來自具有啟動子活性的本發明的核酸或本發明的表達單元。
因此，本發明進一步涉及通過培育本發明的基因修飾微生物來產生生物合成產物的方法。
優選的生物合成產物為精細化學品。
術語「精細化學品」為本領域所知並且包括由生物產生且用於多種工業領域中的化合物，所述工業領域例如(但不限於)醫藥業、農業、化妝品業、食品業及飼料業。這些化合物包括例如酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸的有機酸及蛋白型與非生蛋白胺基酸、嘌呤鹼與嘧啶鹼、核苷與核苷酸(例如，Kuninaka，A.(1996)在Nucleotides and related compounds，第561-612頁，Biotechnology第6卷，Rehm等人，編者，VCHWeinheim中及其中所出現的參考文獻中所述的)、類脂類、飽和與不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)、二醇(例如丙二醇及丁二醇)、糖類(例如透明質酸及海藻糖)、芳香化合物(例如芳香胺、香草醛及靛藍)、維生素與輔因子(如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，第A27卷，「Vitamins」，第443-613頁(1996)VCHWeinheim及其中所出現的參考文獻中及Ong，A.S.，Niki，E.及Packer，L.(1995)「Nutrition，Lipids，Health and Disease」Proceedingsof the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日於馬來西亞檳城舉行，AOCS Press(1995)中所述的)、由Gutcho(1983)在Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086及其中所述的參考文獻中所述的酶及所有其他化學品。某些精細化學品的代謝及用途進一步解釋如下。
I.胺基酸的代謝及用途胺基酸包含所有蛋白質的基本結構單位且因此是正常細胞功能所必需的。術語「胺基酸」在本領域中是已知的。作為蛋白質的結構單位的生蛋白胺基酸有20種，其中它們通過肽鍵連接在一起，而非生蛋白胺基酸(其中數百種是已知的)通常不在蛋白質中出現(參閱Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第A2卷，第57-97頁VCHWeinheim(1985))。雖然L-胺基酸通常是天然存在的蛋白質中發現的僅有類型，但是胺基酸可以是D或L型。20種生蛋白胺基酸中每一種的生物合成和降解途徑已經在原核細胞和真核細胞中進行了很好表徵(例如參閱Stryer，L.Biochemistry，第三版，第578-590頁(1988))。由於其生物合成的複雜性，因此所謂的「必需」胺基酸(組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸及纈氨酸)必須由飲食攝取，它們通過簡單生物合成途徑轉化為其他11種「非必需」胺基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸及酪氨酸)。高等動物具有合成這些胺基酸中的一些胺基酸的能力，然而必需胺基酸必須與食物一起攝入來進行正常的蛋白質合成。
除了它們在蛋白質生物合成中的作用以外，這些胺基酸本身是令人感興趣的化合物，且已發現它們在食品、飼料、化學品、化妝品、農業及醫藥業中的多種用途。賴氨酸不僅是人類營養的重要胺基酸，也是例如家禽及豬的單胃物種的重要胺基酸。穀氨酸最常用作調味添加劑(穀氨酸單鈉，MSG)並且廣泛用於食品業，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸及半胱氨酸同樣如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸及色氨酸皆用於醫藥業中。穀氨醯胺、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸、絲氨酸及丙氨酸用於醫藥業及化妝品工業中。蘇氨酸、色氨酸及D/L-甲硫氨酸廣泛用作飼料添加劑(Leuchtenberger，W.(1996)Amino acids-technical production anduse，第466-502頁，Rehm等人，(編者)Biotechnology第6卷，第14a章，VCHWeinheim)。已發現這些胺基酸也適用於作為合成以下合成胺基酸及蛋白質的前體例如，N-乙醯半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羥色氨酸及Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第A2卷，第57-97頁，VCH，Weinheim，1985中所述的其他物質。
已經很好地表徵了這些天然胺基酸在能夠產生它們的生物(例如細菌)中的生物合成(回顧細菌胺基酸的生物合成及其調節，參閱Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606)。通過α-酮戊二酸(檸檬酸循環的中間產物)的還原性胺化作用合成穀氨酸。由穀氨酸相繼分別產生穀氨醯胺、脯氨酸及精氨酸。絲氨酸的生物合成是由一個3個步驟的方法進行，起始於3-磷酸甘油酸(糖酵解的中間產物)，且在氧化、轉氨基及水解步驟之後得到該胺基酸。由絲氨酸分別產生半胱氨酸及甘氨酸，前者通過高胱氨酸與絲氨酸的縮合得到，且後者通過在由絲氨酸轉羥甲基酶催化的反應中將側鏈β-碳原子轉移至四氫葉酸得到。苯丙氨酸及酪氨酸是在9個步驟的生物合成途徑中，由糖酵解及戊糖磷酸途徑的前體(赤蘚糖4-磷酸及磷酸烯醇丙酮酸)合成，兩者僅在預苯酸合成後的最後兩個步驟不同。色氨酸同樣是由這兩種起始分子產生，然而其合成在11個步驟的途徑中進行。也可在由苯丙氨酸羥化酶催化的反應反應中，由苯丙氨酸產生酪氨酸。丙氨酸、纈氨酸及亮氨酸分別為丙酮酸(糖酵解的最終產物)的生物合成產物。天冬氨酸由草醯乙酸(檸檬酸循環的中間產物)形成。通過天冬氨酸的轉化分別產生天冬醯胺、甲硫氨酸、蘇氨酸及賴氨酸。異亮氨酸由蘇氨酸形成。組氨酸在複雜的9個步驟的途徑中由5-磷酸核糖1-焦磷酸(活化糖)形成。
超過細胞中蛋白質生物合成所需量的胺基酸無法被儲存，而是被分解，以便提供細胞的主要代謝路徑的中間產物(回顧，參閱Stryer，L.，Biochemistry，第三版，第21章，「Amino Acid Degradation and the UreaCycle」；第495-516頁(1988))。雖然細胞能夠將不需要的胺基酸轉化為有用的代謝中間產物，然而就其合成所需的能量、前體分子及酶而言，胺基酸產生作用成本很高。因此，通過反饋抑制調節胺基酸的生物合成並不令人驚訝，其中具體胺基酸的出現減慢或完全終止其自身的產生(回顧胺基酸生物合成途徑中的反饋機制，參閱Stryer，L.，Biochemistry，第三版，第24章，「Biosynthesis of Amino Acids and Heme」，第575-600頁(1988))。因此，具體胺基酸的產量受細胞中該胺基酸量的限制。
II.維生素、輔因子及營養補充品(Nutraceutical)的代謝及用途維生素、輔因子及營養補充品包含另一類分子。雖然它們易於由其他生物(如細菌)合成，高等動物已喪失了合成它們的能力，因此需要攝取它們。這些分子本身為生物活性分子或在眾種代謝路徑中作為電子載體或中間產物的生物活性物質的前體。除了其營養價值外，這些化合物還具有作為著色劑、抗氧化劑及催化劑或其他加工助劑的明顯工業價值。(回顧這些化合物的結構、活性及工業應用，例如參閱Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，「Vitamins」，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996)。術語「維生素」為本領域所知並且包括生物體正常機能所必需的營養物，然而其不能由生物體自身合成。維生素類可包括輔因子及營養補充品化合物。術語「輔因子」包括正常酶活性的出現必需的非蛋白質化合物。這些化合物可以是有機或無機的；本發明的輔因子分子優選為有機的。術語「營養補充品」包括在植物和動物、特別是人中具有健康促進作用的食物添加劑。這些分子的實例為維生素、抗氧化劑及某些類脂類(例如多不飽和脂肪酸)。
這些分子在能夠生產它們的生物(如細菌)中的生物合成已被詳細地表徵(「Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，「Vitamins」，第A27卷，第443-613頁，VCHWeinheim，1996，Michal，G.(1999)BiochemicalPathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，John Wiley Sons；Ong，A.S.，Niki，E.與Packer，L.(1995)「Nutrition，Lipids，Health andDisease」Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific andTechnological Associations in Malaysia and the Society for free RadicalResearch-亞洲，1994年9月1-3日於馬來西亞檳城舉行，AOCS Press，Champaign，IL X，374S)。
通過嘧啶與噻唑單元的化學偶合形成硫胺素(維生素B1)。核黃素(維生素B2)是由5』-三磷酸鳥苷(GTP)與5-磷酸核糖合成。核黃素接著用於合成黃素單核苷酸(FMN)與黃素-腺嘌呤二核苷酸(FAD)。此化合物家族統稱為「維生素B6」(例如吡哆醇、吡哆胺、吡哆醛5』-磷酸和商業使用的鹽酸吡哆醇)，其皆為共同結構單元5-羥基-6-甲基吡啶的衍生物。可通過化學合成或通過發酵來產生泛酸(Pantothenate)(泛酸(pantothenic acid)，R-(+)-N-(2，4-二羥基-3，3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)。泛酸生物合成中的最後步驟由ATP-驅動的β-丙氨酸與泛解酸縮合組成。在轉化成泛解酸、轉化成β-丙氨酸及縮合成泛酸的生物合成步驟中發揮作用的酶是已知的。泛酸的代謝活性形式為輔酶A，其生物合成通過5個酶促步驟進行。泛酸、5-磷酸吡哆醛、半胱氨酸及ATP為輔酶A的前體。這些酶不僅催化泛酸的形成，而且也催化(R)-泛解酸、(R)-泛解酸內酯、(R)-泛醇(維生素原B5)、泛醯巰基乙胺(及其衍生物)及輔酶A的產生。
已詳細研究了微生物中自前體分子庚二醯-輔酶A進行的生物素的生物合成，且已經確定了幾個有關基因。已發現許多對應的蛋白質參與Fe簇(Fe cluster)合成中且屬於nifS蛋白質類。硫辛酸源自辛酸並且作為能量代謝中的輔酶，它成為丙酮酸脫氫酶複合物和α-酮戊二酸脫氫酶複合物的組成成分。葉酸類為全部衍生自葉酸的一類物質，而葉酸依次從L-穀氨酸、對氨基苯甲酸和6-甲基喋呤(methylpterin)衍生而來。已在某些微生物中詳細研究了起始自代謝中間產物5』-三磷酸鳥苷(GTP)、L-穀氨酸及對氨基苯甲酸的葉酸及其衍生物的生物合成。
類咕啉(例如鈷胺素，特別是維生素B12)及卟啉屬於以四吡咯環系統為特徵的一類化學品。維生素B12的生物合成是太過複雜以至於尚未完全了解，然而其涉及的大多數酶及底物如今是已知的。煙酸(nicotinic acid)(煙酸(nicotinate))及煙醯胺為吡啶衍生物，也將其稱作「尼克酸(niacin)」。尼克酸是重要的輔酶NAD(菸鹼醯氨-腺嘌呤二核苷酸)及NADP(菸鹼醯氨-腺嘌呤二核苷酸磷酸)及其還原形式的前體。
雖然這些化合物中的一些已通過大規模培養微生物來生產，例如核黃素、維生素B6、泛酸及生物素，但是這些化合物在工業規模上的生產主要基於無細胞的化學合成。只有維生素B12由於其合成的複雜性而只能通過發酵生產。體外方法需要相當大的材料花費和時間，並且成本常常很高。III.嘌呤、嘧啶、核苷與核苷酸的代謝及用途嘌呤與嘧啶代謝的基因及其對應的蛋白質是腫瘤疾病及病毒感染治療的重要目標。術語「嘌呤」或「嘧啶」包含含氮鹼基，其是核酸、輔酶及核苷酸的組分。術語「核苷酸」包含核酸分子的基本結構單位，其包括含氮鹼基、戊糖(RNA中該糖為核糖，且DNA中該糖為D-脫氧核糖)及磷酸。術語「核苷」包含作為核苷酸前體的分子，但與核苷酸相比，其不具有磷酸單元。通過抑制用於形成核酸分子的這些分子的生物合成或其活動來抑制RNA與DNA的合成是可能的；該活動在致癌細胞中的靶向抑制則能夠抑制腫瘤細胞分裂和複製的能力。
還存在不形成核酸分子但作為能量儲存物(AMP)或作為輔酶(即FAD與NAD)的核苷酸。
許多出版物已描述了這些化學品在那些嘌呤和/或嘧啶代謝受影響的醫學適應症中的用途(例如，Christopherson，R.I.和Lyons，S.D.(1990)「Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis aschemotherapeutic agents」，Med.Res.Reviews 10505-548)。嘌呤及嘧啶代謝中涉及的酶的研究集中於新藥的開發中，例如可用作免疫抑制劑或抗增殖劑(Smith，J.L.「Enzymes in Nucleotide Synthesis」Curr.Opin.Struct.Biol.5(1995)752-757；Biochem.Soc.Transact.23(1995)877-902)。然而，嘌呤鹼基及嘧啶鹼基、核苷及核苷酸也具有其他可能的用途作為各種精細化學品的生物合成的中間產物(例如硫胺素、S-腺苷甲硫氨酸、葉酸或核黃素)；作為細胞的能量載體(例如ATP或GTP)及作為化學品本身，其通常用作調味增強劑(例如IMP或GMP)，或用於許多醫學用途中(例如參閱Kuninaka，A.，(1996)「Nucleotides and Related Compounds」inBiotechnology，第6卷，Rehm等人，編者，VCHWeinheim，第561-612頁)。嘌呤、吡啶、核苷或核苷酸代謝中所涉及的酶也日益成為開發用於保護莊稼的化學品的目標，這些化學品包括殺真菌劑、除草劑及殺蟲劑。
這些化合物在細菌中的代謝已被表徵(回顧，例如參閱Zalkin，H.與Dixon，J.E.(1992)「De novo purine nucleotide biosynthesis」in Progress inNucleic Acids Research and Molecular biology，第42卷，Academic Press。第259-287頁和Michal，G.(1999)「Nucleotides and Nucleosides」；第8章，Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and Molecular Biology，Wiley，New York)。作為大量研究的主題的嘌呤代謝是細胞正常機能所必需的。高等動物中損嘌呤代謝受損可引起例如痛風的嚴重疾病。通過許多步驟從核糖5-磷酸經由中間化合物肌苷5』-磷酸(IMP)合成嘌呤核苷酸，，從而導致5』-單磷酸鳥苷(GMP)或5』-單磷酸腺苷(AMP)的產生，自此可易於製備作為核苷酸使用的其三磷酸鹽形式。這些化合物也用作能量儲存物，以便它們的降解作用為在細胞中許多不同生物化學過程提供能量。通過從5-磷酸核糖形成5』-單磷酸尿苷(UMP)來進行嘧啶的生物合成。接著UMP轉化為5』-三磷酸胞苷(CTP)。所有核苷酸的脫氧形式皆由核苷酸的二磷酸核糖形式在一步還原反應中製備而產生核苷酸的二磷酸脫氧核糖形式。在磷酸化作用之後，這些分子能夠參於DNA的合成。
IV.海藻糖的代謝及用途海藻糖由兩個通過α，α-1，1鍵連接在一起的葡萄糖分子組成。其通常在食品業中用作甜味劑、在乾燥或冷凍食品及飲料中作為添加劑。然而，其也用於醫藥業、化妝品業及生物工程業中(例如參閱Nishimoto等人，(1998)美國專利第5 759 610號；Singer，M.A.與Lindquist，S.Trends Biotech.16(1998)460-467；Paiva，C.L.A.與Panek，A.D.Biotech Ann.Rev.2(1996)293-314及Shiosaka，M.FFIJ.Japan 172(1997)97-102)。海藻糖由多種微生物的酶產生且以天然方式釋放至周圍的介基中，可通過本領域已知的方法將其從中分離。
特別優選的生物合成產物選自有機酸、蛋白質、核苷酸與核苷、蛋白型與非生蛋白胺基酸、類脂類與脂肪酸、二醇、糖類、芳香化合物、維生素與輔因子、酶及蛋白質。
優選的有機酸為酒石酸、衣康酸及二氨基庚二酸。
優選的核苷與核苷酸描述於，例如Kuninaka，A.(1996)Nucleotidesand related compounds，第561-612頁，Biotechnology，第6卷，Rehm等人，編者，VCHWeinheim及其中所出現的參考文獻中。
其他優選的生物合成產物是的類脂類、飽和及不飽和脂肪酸(例如花生四烯酸)、例如丙二醇及丁二醇的二醇、例如透明質酸及海藻糖的糖類、例如芳香胺、香草醛及靛藍的芳香化合物、例如Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry，第A27卷，「Vitamins」，第443-613頁(1996)VCHWeinheim與其中所出現的參考文獻及Ong，A.S.，Niki，E.與Packer，L.(1995)「Nutrition，Lipids，Health and Disease」Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia and the Society for Free Radical Research-Asia，1994年9月1-3日於馬來西亞檳城舉行，AOCS Press(1995))中描述的維生素及輔因子、酶、聚酮化合物(Cane等人(1998)Science 28263-68)及所有其他由Gutcho(1983)描述於Chemicals by Fermentation，Noyes Data Corporation，ISBN0818805086及其中所出現的參考文獻中的化學品。
特別優選的生物合成產物為胺基酸，特別優選必需胺基酸，具體地為L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨醯胺、L-穀氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、L-精氨酸、L-天冬醯胺、L-天冬氨酸及L-蘇氨酸、L-高絲氨酸，尤其為L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。例如賴氨酸、甲硫氨酸及蘇氨酸的胺基酸在下文的各種情況下均是指胺基酸的L及D型，優選為L型，即例如L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。
具體地，本發明涉及通過培養與野生型相比，具有至少一種基因的表達速率是提高的或受影響的基因修飾微生物來產生賴氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發明的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是增加的，該內源表達單元調節內源基因的表達，或dh)以本發明的表達單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達活性的表達單元調節微生物中的基因的表達，其中這些等基因相對於這些表達單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構酶的核酸、編碼轉錄調節物LuxR的核酸、編碼轉錄調節物LysR1的核酸、編碼轉錄調節物LysR2的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼轉酮酶的核酸、編碼轉醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨醯-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質OpcA的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸及編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。
就上述方法而言，以本發明的表達單元，或以具有實施方案ch)所述的增加的特異表達活性的本發明的表達單元進行的微生物中這些基因表達的調節是通過以下方式實現
dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元的控制下進行一種或多種內源基因的表達，或dh2)將這些基因中的一種或多種導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
用於製備賴氨酸的上述方法的另一個優選實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構酶活性、轉錄調節物LuxR的活性、轉錄調節物LysR1的活性、轉錄調節物LysR2的活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性、轉酮酶活性、轉醛酶活性、賴氨酸輸出子活性、精氨醯-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白質OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素連接酶活性。
用於製備賴氨酸的上述方法的另一個特別優選的實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙醯轉移酶活性、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出子活性、蘇氨酸排出蛋白活性、天冬醯胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性及蘇氨酸合酶活性。
可用(但不是必需)具有啟動子活性的本發明的核酸和/或本發明的表達單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。
本發明進一步涉及通過培養與野生型相比，具有至少一種基因的表達速率已提高的或受影響的基因修飾微生物來產生甲硫氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發明的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是增加的，該內源表達單元可調節內源基因的表達，或dh)以本發明的表達單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達活性的本發明的表達單元調節微生物中基因的表達，其中這些基因相對於這些表達單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙醯轉移酶的核酸、編碼胱硫醚γ合酶的核酸、編碼胱硫醚β裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的核酸、編碼O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙醯轉移酶的核酸、編碼半胱氨酸合酶I的核酸、編碼半胱氨酸合酶II的核酸、編碼輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼硫酸腺苷醯轉移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷醯硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH-還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247的核酸、編碼RXA0655調節物的核酸及編碼RXN2910調節物的核酸。
就上述方法而言，以本發明的表達單元，或以具有實施方案ch)所述的增加的特異表達活性的本發明的表達單元進行的微生物中這些基因表達的調節是通過以下方式實現dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元的控制下進行這些內源基因中的一種或多種的表達，或dh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
用於製備甲硫氨酸的上述方法的另一個優選實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構酶活性、高絲氨酸O-乙醯轉移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉移酶活性、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙醯轉移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷醯轉移酶活性、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH-還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247的活性、RXA655調節物的活性及RXN2910調節物的活性。
上述用於製備甲硫氨酸的方法的另一個特別優選的實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合酶活性、內消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
可用(但不是必需)具有啟動子活性的本發明的核酸和/或本發明的表達單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。
本發明進一步涉及通過培養與野生型相比，具有至少一種基因的表達速率已提高或影響的基因修飾微生物來製備蘇氨酸的方法，其中ch)與野生型相比，至少一種本發明的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是增加的，該內源表達單元調節內源基因的表達，或dh)以本發明的表達單元，或以具有實施方案a)所述的增加的特異表達活性的本發明的表達單元調節微生物中基因的表達，其中這些基因相對於這些表達單元而言是異源的，且其中這些基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出子載體的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉醛酶的核酸、編碼轉酮酶的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸排出蛋白的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白質的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸及編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。
就上述方法而言，以本發明的表達單元，或以具有實施方案ch)所述的增加的特異表達活性的本發明的表達單元調節微生物中這些基因的表達通過以下方式實現dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元的控制下進行這些內源基因中一種或多種的表達，或dh2)將這些基因中的一種或多種導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的內源表達單元的控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的本發明的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
上述用於製備蘇氨酸的方法的另一個優選實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，該活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構酶活性、蘇氨酸合酶活性、蘇氨酸輸出子載體活性、轉醛酶活性、轉酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸排出蛋白活性、蛋白質OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性及高絲氨酸脫氫酶活性。
上述用於製備蘇氨酸的方法的另一個特別優選的實施方案包含基因修飾微生物，其與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，該活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙醯轉移酶活性、絲氨酸羥甲基轉移酶活性、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶活性、內消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬醯胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出子活性、乙醯乳酸合酶活性、乙酮醇-酸還原異構酶活性、支鏈氨基轉移酶活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、二羥基-酸脫水酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
可用(但不是必需)具有啟動子活性的本發明的核酸和/或本發明的表達單元引起上述這些額外增加或降低的活性中的至少一種。
術語蛋白質的「活性」在酶的情況下是指對應蛋白質的酶活性，且在其他蛋白質，如結構蛋白或轉運蛋白的情況下是指蛋白質的生理活性。
酶通常能將底物轉化為產物，或催化該轉化步驟。
因此，酶的「活性」是指在特定時間內由酶轉化的底物的量，或所形成的產物的量。
因此，當與野生型相比活性增加時，在特定時間內由酶所轉化的底物的量或所形成的產物的量與野生型相比是增加的。
就本文中所述的所有活性而言，「活性」的增加優選達到「野生型活性」的至少5％、進一步優選為「野生型活性」的至少20％、進一步優選為「野生型活性」的至少50％、進一步優選為「野生型活性」的至少100％、更優選為「野生型活性」的至少300％、更進一步優選為「野生型活性」的至少500％、特別優選為「野生型活性」的至少600％。
因此，當與野生型相比活性降低時，在特定時間內由酶轉化的底物的量或形成的產物的量與野生型相比是減少的。
降低的活性優選是指微生物中此酶功能性會基於多種細胞生物學機制而部分或基本上完全抑制或阻斷。
活性的降低包含酶數量的減少至酶基本上完全沒有(即，缺乏對應活性的可檢測性或缺乏酶的免疫可檢測性)。與野生型相比，微生物中活性優選降低至少5％，進一步優選降低至少20％，進一步優選降低至少50％，進一步優選降低100％。具體地，「降低」也是指對應的活性的完全失去。
通過已知的方法，例如酶分析法可測定基因修飾微生物及野生型中特定酶的活性，且由此測定酶活性的增加或降低。
例如，丙酮酸羧化酶是指表現將丙酮酸轉化為草醯乙酸的酶活性的蛋白質。
因此，丙酮酸羧化酶活性是指在特定時間內由丙酮酸羧化酶蛋白轉化的丙酮酸的量或形成的草醯乙酸的量。
因此，當與野生型相比丙酮酸羧化酶活性增加時，在特定時間內由丙酮酸羧化酶蛋白轉化的丙酮酸的量或形成的草醯乙酸的量與野生型相比是增加的。
丙酮酸羧化酶活性的這種增加優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少5％、進一步優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少20％、進一步優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少50％、進一步優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少100％、更優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少300％、更進一步優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少500％、特別優選為野生型丙酮酸羧化酶活性的至少600％。
此外，例如烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的酶活性。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶是指表現將草醯乙酸轉化為磷酸烯醇丙酮酸的酶活性的蛋白質。
因此，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性是指在特定時間內由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白轉化的草醯乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量。
因此，當與野生型相比烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性降低時，在特定時間內由烯醇丙酮酸磷酸羧激酶蛋白轉化的草醯乙酸的量或形成的磷酸烯醇丙酮酸的量與野生型相比是降低的。
烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的降低包含烯醇丙酮酸磷酸羧激酶數量的降低至烯醇丙酮酸磷酸羧激酶基本上完全沒有(即，缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的可檢測性或缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的免疫可檢測性)。與野生型相比，烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性優選降低至少5％、進一步優選降低至少20％、進一步優選降低至少50％、進一步優選降低100％。具體地，「降低」也是指烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性的完全失去。
可以多種方式額外增加活性，例如通過在表達及蛋白質水平上關閉抑制調節機制，或通過增加與野生型相比的編碼上述蛋白質的核酸的基因表達。
同樣地，可以多種方式增加與野生型相比的編碼上述蛋白質的核酸的基因表達，例如通過激活物誘導該基因，或如上所述，通過增加啟動子活性或增加表達活性或通過將一種或多種基因拷貝導入微生物中。
根據本發明，增加編碼蛋白質的核酸的基因表達也是指操縱微生物內在的內源蛋白質的表達。
如上所述，這可通過例如改變啟動子和/或基因的表達單元序列來實現。例如，可通過缺失或插入DNA序列來進行這種改變，這種改變導致基因表達速率提高。
如上所述，通過施加外源刺激來改變內源蛋白質的表達是可能的。這可通過特定的生理條件進行，即通過外源物質的使用。
本領域的技術人員可藉助於其他不同的方法(單獨或組合)來實現基因表達的增加。因此，例如可增加合適基因的拷貝數，或可使啟動子及調節區或位於結構基因上遊的核糖體結合位點突變。另外，可能通過誘導型啟動子在發酵生產過程中增加表達。延長mRNA存在時間的方法可同樣增加表達。通過防止酶蛋白的降解同樣也可增強酶活性。基因或基因構建物可以不同拷貝數存在於質粒中，或整合到染色體中並擴增。或者，也可通過改變培養基的組成及對培養的管理來達到相關基因的過表達。
本領域的技術人員可尤其在Martin等人(Biotechnology 5，137-146(1987))、Guerrero等人(Gene 138，35-41(1994))、Tsuchiya與Morinaga(Bio/Technology 6，428-430(1988))、Eikmanns等人(Gene 102，93-98(1991))、歐洲專利第0472869號、美國專利第4,601,893號、Schwarzer與Piihler(Biotechnology 9，84-87(1991))、Reinscheid等人(Applied andEnvironmental Microbiology 60，126-132(1994))、LaBarre等人(Journal ofBacteriology 175，1001-1007(1993))、專利申請WO 96/15246、Malumbres等人(Gene 134，15-24(1993))、日本公開的說明書JP-A-10-229891、Jensen與Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58，191-195(1998))、Makrides(Microbiological Reviews 60512-538(1996))及眾所周知的遺傳與分子生物學教科書中發現對此的指導。
此外，除了基因的表達或增強作用，消除有害的副反應對產生生物合成產物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸是有利的(Nakayama「Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms」，Overproduction ofMicrobial Products，Krumph anzl，Sikyta，Vanek(編者)，Academic Press，London，英國，1982)。
在一個優選實施方案中，通過將至少一種編碼對應蛋白質的核酸導入微生物中來增加編碼上述蛋白質之一的核酸的基因表達。可在染色體上或染色體外進行核酸導入，即通過增加染色體上的拷貝數和/或增加在宿主微生物中複製的質粒上的基因的拷貝。
核酸的導入(例如，以包含該核酸的表達盒形式)優選在染色體上進行，具體地，通過上述SacB方法進行。
原則上，為了這個目的可能使用任何編碼上述蛋白質之一的基因。
在真核來源的包含內含子的基因組核酸序列的情況下，若宿主微生物不能表達對應蛋白質或不能使其表達對應蛋白質，則優選使用已經處理過的核酸序列，例如對應的cDNA。
對應基因的實例列於表1及表2中。
優選通過以下方法中的至少一種降低微生物中的上述活性·導入至少一種用於誘導共抑制的有義核糖核酸序列或確保其表達的表達盒·導入至少一種針對對應基因、RNA或蛋白質的DNA或蛋白質結合因子或確保其表達的表達盒·導入至少一種引起RNA降解的病毒核酸序列或確保其表達的表達盒·導入至少一種產生功能缺失的構建物，所述功能缺失是例如通過在基因中產生插入、缺失、倒置或突變在閱讀框內產生例如終止密碼子或移位。可能並優選通過同源重組來靶向插入至目的靶基因中，或導入針對靶基因的序列特異性核酸酶來產生敲除突變體。
·導入具有降低的啟動子活性的啟動子或導入具有降低的表達活性的表達單元。
本領域的技術人員知道在本發明的範疇內還可使用其他方法來降低其活性或功能。例如，導入蛋白質的顯性失活變體或確保其表達的表達盒也可是可行的。
此外，這些方法中的每一個均可能引起蛋白質的量、mRNA的量和/或蛋白質的活性降低。也可以想到這些方法的組合使用。其他方法對為本領域的技術人員而言是已知的，其包含阻止或抑制蛋白質的加工、蛋白質或其mRNA的轉運、抑制染色體附著、抑制RNA剪接、誘導降解RNA的酶和/或抑制翻譯延伸或終止。
在用於產生生物合成產物的本發明方法中，優選在培養基因修飾微生物的步驟之後從微生物和/或自發酵肉湯中分離生物合成產物。這些步驟可同時和/或優選在培育步驟之後進行。
可用分批法(分批培育)或補料分批法或重複補料分批法培養本發明的基因修飾微生物，連續或間斷地產生生物合成產物，特別是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。已知培育方法的概述可在Chmiel(BioprozeBtechnik1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))的教科書或Storhas(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))的教科書中發現。
待使用的培養基必須以適當地方式滿足每個菌株的要求。在「Manualof Methods for General Bacteriology」of the American Society forBacteriology(Washington D.C.，美國，1981)手冊中描述了用於各種微生物的培養基。
根據本發明，這些可使用的培養基通常包含一種或多種碳源、氮源、無機鹽、維生素和/或微量元素。
優選的碳源為例如單糖、二糖或多糖的糖。非常好的碳源的實例為葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、棉子糖、澱粉或纖維素。也可以例如糖蜜的複合化合物或糖精製的其他副產物將糖置於培養基中。添加各種碳源的混合物也是有益的。其他可能的碳源為油及脂肪，例如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂肪；脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸或亞油酸；醇，例如甘油、甲醇或乙醇以及有機酸，例如乙酸或乳酸。
氮源通常為有機或無機氮化合物或含有這些化合物的物質。氮源的實例包括氨氣或例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨或硝酸銨的銨鹽、硝酸鹽、尿素、胺基酸或例如玉米漿、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏及其他物質的複合氮源。氮源可單獨使用或作為混合物使用。
可存在於培養基中的無機鹽化合物包含鈣、鎂、鈉、鈷、鉬、鉀、錳、鋅、銅及鐵的氯化物、磷酸鹽或硫酸鹽。
為了產生精細化學品，尤其是甲硫氨酸，可能使用以下物質作為硫源例如硫酸鹽、亞硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、四硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化物的無機化合物及例如硫醇及某硫醇(thiol)的有機硫化合物。
可能使用以下物質作為磷源磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或對應的含鈉鹽。
為了使溶液中存在金屬離子，可將螯合劑添加到培養基中。尤其適合的螯合劑包含例如兒茶酚或原兒茶酸鹽的二羥基酚類(dihydroxyphenol)，或例如檸檬酸的有機酸。
根據本發明，所使用的發酵培養基通常也包含例如維生素或生長促進劑的其他生長因子，其包括，例如生物素、核黃素、硫胺素、葉酸、煙酸、泛酸及吡哆醇。生長因子及鹽常常來自例如酵母提取物、糖蜜、玉米漿及其類似物的培養基的複合成份。也可將合適的前體添加至培養基中。培養基中化合物的精確組成很大程度上視具體實驗而定，且將由各具體狀況分別確定。最優化的培養基的信息獲自教科書「Applied Microbiol.Physiology，A Practical Approach」(編者為P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73頁，ISBN 0 19 963577 3)。也可從例如Standard 1(Merck)或BHI(腦心浸出液，DIFCO)等商業供應商購得生長培養基。
將培養基的所有成分通過加熱(1.5巴和121℃下20分鐘)或無菌過濾滅菌。可將成分一起滅菌或視需要分開滅菌。所有培養基成分可在培養開始即存在或任選連續或分批加入。
培養物的溫度通常在15℃與45℃之間，優選在25℃至40℃，且在實驗過程中可保持恆定或變化。培養基的pH值應處於5至8.5的範圍內，優選為約7.0。在培養期間可通過添加例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水的鹼性化合物或例如磷酸或硫酸的酸性化合物來控制培養需要的pH值。可通過使用例如脂肪酸聚二乙醇酯的防泡劑來控制泡沫的形成。可通過向培養基中添加具有選擇作用的合適物質，例如抗生素來維持質粒的穩定性。通過向培養基中導入氧或含氧氣體混合物(例如周圍的空氣)來維持需氧條件。培養物的溫度通常為20℃至45℃。培養持續進行到目的產物的形成達到最大量。通常在10小時至160小時內達到該目標。
以該方式得到的發酵肉湯的乾物質含量通常為7.5至25重量％。
此外，最好至少還在發酵末期進行糖限制(sugar limitation)，但具體地，在超過經發酵時間的至少30％時進行。這是指在這段時間內發酵培養基中可利用的糖濃度保持在0至3g/l或是降低的。
根據目的生物合成產物及該生物合成的副產物的物理/化學特性，以本身已知方式從發酵肉湯和/或微生物中分離生物合成產物。
例如，可接著進一步處理髮酵肉湯。視需要而定，可用分離方法(例如離心、過濾、傾析或這些方法的組合)從發酵肉湯中全部或部分移除生物質或將其全部保留於其中。
接著可用已知方法濃縮發酵肉湯，例如藉助於旋轉蒸發器、薄膜蒸發器、降膜式蒸發器濃縮發酵肉湯通過逆滲透或納米過濾，。然後通過冷凍乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒或其他方法來處理該濃縮的發酵肉湯。
另外，也可能進一步純化生物合成產物，尤其是L-賴氨酸、L-甲硫氨酸及L-蘇氨酸。基於此目的，在除去生物質之後，使用適合的樹脂對含有產物的肉湯進行層析，目的產物或雜質全部或部分地保留於層析樹脂上。若需要，則可使用相同或不同層析樹脂重複進行這些層析步驟。本領域的技術人員精通於選擇適合的層析樹脂及其最有效的使用方法。純化的產物可通過過濾或超濾來濃縮，並保存於產物的穩定性最大的溫度下。
生物合成產物可以各種形式得到，例如以其鹽或酯的形式。
可用現有技術測定分離的化合物的特性及純度。這些現有技術包含高效液相層析法(HPLC)、光譜法、染色法、薄層層析法、NIRS、酶測定或微生物測定。這些分析方法概述於Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等人(1996)Biotekhnologiya 11 27-32及Schmidt等人(1998)Bioprocess Engineer.1967-70.Ulmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry(1996)第A27卷，VCHWeinheim，第89-90頁、第521-540頁、第540-547頁、第559-566頁、575-581頁及第581-587頁；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry and MolecularBiology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等人(1987)Applications of HPLCin Biochemistry inLaboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，第17卷中。
實施方案現通過以下非限定性實施例更詳細地描述本發明實施例1質粒pCIS lysC的構建在菌株構建的第一個步驟中，在穀氨酸棒桿菌ATCC 13032中進行lysC野生型基因的等位基因交換。在這種狀況下，在lysC基因中進行核苷酸交換以便在所得到的蛋白質中位置311上的胺基酸Thr被Ile替換。從作為PCR反應模板的來自ATCC 13032的染色體DNA起始，按照產品說明書藉助於Pfu-Turbo PCR系統(Stratagene USA)並使用寡核苷酸引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6擴增lysC。
SEQ ID NO55』-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3』SEQ ID NO65』-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3』如Tauch等人(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828所述從穀氨酸棒桿菌ATCC 13032製備染色體DNA。在擴增片段的5』端為SalI限制性位點且其3』端為MluI限制性位點。克隆之前，以這兩種限制性酶消化所擴增的片段並使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)純化。
通過SalI和MluI限制性位點將所得的多核苷酸克隆至下文中稱為pCIS的pCLIK5MCS整合型SacB(SEQ ID NO7)並轉化進入大腸桿菌XL-1blue中。通過塗布於含有卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上對含有質粒的細胞進行篩選。分離質粒且通過測序來證實預期核苷酸序列。通過多種方法並使用來自Qiagen的材料製備質粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy ofSciences USA 745463-5467所述進行測序反應。使用ABI prism 377(PEApplied Biosystems，Weiterstadt)對測序反應進行分離和測定。將所得到的質粒pCIS lysC列為SEQ ID NO8。
實施例2來自穀氨酸棒桿菌的lysC基因的誘變按照產品說明書使用Quickchange試劑盒(kit)(來自Stratagene/美國)將來自穀氨酸棒桿菌的lysC基因定向誘變。在質粒pCIS lysC(SEQ IDNO25)中進行誘變。為了通過Quickchange方法(Stratagene)由thr 311交換成311ile，合成以下寡核苷酸引物SEQ ID NO95』-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3』SEQ ID NO105』-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3』這些寡核苷酸引物在Quickchange反應中的使用導致在lysC基因SEQ ID NO11中932位上核苷酸的交換(由C交換成T)。在轉化進入大腸桿菌XL1-blue中並製備質粒之後，通過測序反應證實了lysC基因中發生胺基酸交換Thr311Ile。所得到的質粒命名為pCIS lysC thr311ile並列於SEQ ID NO12。
如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303所述，通過電穿孔將質粒pCIS lysC thr311ile轉化入穀氨酸棒桿菌ATCC 13032中。對該方案的修改描述於DE 10046870中。使用如Sambrook等人(1989)，Molecular cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor中所述的標準方法，通過Southern印跡及雜交來檢查各個轉化體lysC基因座上的染色體排列。此舉確保轉化體已通過同源重組在lysC基因座上整合了所轉化的質粒。此類菌落在不含抗生素的培養基中生長過夜之後，將細胞塗布於蔗糖CM瓊脂培養基(10g/l蛋白腖、5g/l牛肉膏、5g/l酵母提取物、2.5g/lNaCl、2g/l尿素、1％葡萄糖、10％蔗糖，pH 6.8)上並於30℃下培養24小時。
由於載體pCIS lysC thr311ile中所存在的sacB基因將蔗糖轉化為有毒產物，因此能夠生長的菌落僅僅為通過野生型lysC基因與所突變lysCthr311ile基因之間的第二個同源重組步驟而缺失sacB基因的那些菌落。在同源重組過程中，或者是野生型基因或者是突變的基因與sacB基因一起缺失。SacB基因與野生型基因的缺失導致產生突變的轉化體。
挑取生長菌落並研究其卡那黴素敏感性表型。缺失SacB基因的菌落必須同時顯示出卡那黴素敏感性生長行為。在搖瓶中研究此類卡那黴素敏感性克隆的賴氨酸生產力(見實施例6)。培養未經處理的穀氨酸棒桿菌ATCC 13032以用於對照。選擇與對照組相比賴氨酸生產提高的菌落，分離染色體DNA，通過PCR反應擴增lysC基因的相應區並測序。將具有增加的賴氨酸合成特性且在lysC的932位上具有所證實突變的該克隆稱作ATCC13032lysCfbr。
實施例3用於藉助於異源表達單元Psod(SEQ.ID.2)使lysC基因過表達整合型質粒的製備定義以下寡核苷酸用於擴編碼超氧化物歧化酶的基因的啟動子。
SEQ ID 13sod85′-accctggcggaaaccctgagtcg-3′SEQ ID 14sod15′-tacgaccagggccacgggtaaaaaatcctttcgtaggtttccgcaccgagcatatacatcttttg-3′
該引物與來自穀氨酸棒桿菌ATCC 13032的染色體DNA一起用於PCR反應。使用該方法可以擴增對應於預期大小(約657bp)的DNA片段。
定義以下寡核苷酸用於擴增編碼天冬氨酸激酶的基因。
SEQ ID 15lysC25′-cctacgaaaggattttttacccgtggccctggtcgtacag-3′SEQ ID 16lysC65′-gattagtggaacctcgtcgtc-3′引物與來自谷胺酸棒狀桿菌ATCC 13032lysCfbr的染色體DNA一起用於PCR反應中。可能用此方式擴增對應於預期大小(1638bp)的DNA片段。
引物sod1及ask2含有重疊序列且於5′末端彼此同源。
將以上所得的PCR產物用作下一個PCR的模板，在該PCR中使用以下引物。
SEQ ID 17sod45′-gcggcgcaggattttctaa-3′SEQ ID 18lysC45′-tcggttgcctgagtaatgtctt-3′以該方式擴增相當於預期大小(1811bp)的DNA片段是可能的。接著，將該Psod/lysC融合體克隆至載體pCR2.1(獲自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)中。在接下來的步驟中，來自質粒pCR2.1(獲自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)的該Psod/lysC融合體作為1773bp的EcoRI片段克隆至已經過限制性內切核酸酶EcoRI切割的整合載體pK19mob sacB SEQ ID NO 19中。將得到的質粒稱作pk19mob sacB Psod/lysC。
為了擴增lysC基因的5』區域，定義以下寡核苷酸SEQ ID 20lysC235′-caccgcggctttggacatcactgctac-3′SEQ ID 21lysC245′-cctggggctttagcggatgcgtctca-3′該引物與來自穀氨酸棒桿菌的染色體DNA一起用於PCR反應中。可以該方式擴增相當於預期大小(674bp)的DNA片段。將該DNA片段克隆至載體pCR2.1(獲自Invitrogen GmbH，Karlsruhe，Germany)中。隨後，接著將787bp的SpeI/XbaI片段克隆至已經過限制酶NheI消化的載體pK19mobsacB Psod lysC中。將得到的質粒稱作pK19mob sacB Psod lysC+US(SEQ.ID.NO.22)。至該步驟，所有的克隆均在大腸桿菌XL-1Blue(獲自Stratagene，Amsterdam，Netherlands)中進行。
接著，如Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303所述，使用轉化質粒pK19mob sacB Psod lysC+US與質粒pTc15AcglM一起轉化大腸桿菌Mn522(獲自Stratagene，Amsterdam，Netherlands)。根據穀氨酸棒桿菌的甲基化模式(DE 10046870)，質粒pTc15AcglM使得DNA能夠甲基化。隨後該步驟使穀氨酸棒桿菌與整合質粒pK19mob sacB Psod lysC+US一起經受電穿孔。該電穿孔及隨後在含有卡那黴素(25μg/ml)的CM平板上的選擇產生多個轉接合子。
為了對導致載體與lysC啟動子及lysC基因缺失的第二個同源重組步驟進行選擇，將這些轉接合子在不含卡那黴素的CM培養基中培養過夜，接著塗布在含有10％蔗糖的CM平板上進行選擇。載體pK19mob sacB中所存在的sacB基因編碼酶levansucrase，並導致生長在蔗糖上的微生物合成果聚糖。由於果聚糖對穀氨酸棒桿菌有毒，因此能夠生長在含蔗糖的培養基上的穀氨酸棒桿菌細胞僅僅是那些通過第二個同源重組步驟缺失整合質粒的細胞(Jger等人，Journal of Bacteriology 174(1992)5462-5466)。檢查100個抗蔗糖克隆的卡那黴素敏感性。可以證明57個所檢測的克隆不僅對蔗糖具有抗性且對卡那黴素具有敏感性。使用聚合酶鏈式反應(PCR)檢查Psod表達單元置換天然表達單元的期望置換是否發生。從起始菌株及用於該分析的20個克隆中分離染色體DNA。基於此目的，以牙籤將各個克隆自瓊脂平板上移出，懸浮於100μl H2O中，並於95℃下煮沸10分鐘。10μl所得溶液在PCR中用作模板。所用引物是與Psod表達單元及lysC基因同源的寡核苷酸。
PCR條件選擇如下95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒；55℃雜交30秒；72℃擴增2分鐘；30個循環；72℃最終延伸5分鐘。在具有起始菌株的DNA的混合物中，由於寡核苷酸的選擇不可能產生PCR產物。只有其中第二個同源重組步驟影響Psod對天然啟動子(PlysC)的置換的克隆出現期望的340bp大小的條帶。所測試的20個克隆中總共有2個為陽性。
實施例4天冬氨酸激酶(lysC)測定法在30℃下將包含帶有天然啟動子的lysCfbr基因的染色體拷貝或PeftulysCfbr構建物的染色體拷貝的穀氨酸棒桿菌株於CM培養基(10g/l蛋白腖、5g/l牛肉膏、5g/l酵母提取物、2.5g/l NaCl、2g/l尿素、1％葡萄糖，pH 6.8)中培養直至OD600為8。將細胞於4℃下旋轉離心，然後用冷的Tris-HCl緩衝液(0.1％，pH 8.0)將細胞洗滌兩次。重新離心之後，將細胞溶解於冷的Tris-HCl緩衝液(0.1％，pH 8.0)中並調整至OD600為160。為了使細胞破裂，將1ml該細胞懸浮液轉移至來自Hybaid的2ml Ribolyser管中，以6.0的旋轉設定值在來自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通過在4℃下以15,000轉/分於Eppendorf離心機中離心30分鐘使裂解物澄清，將上清液轉移至新的Eppendorf杯中。如Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72248-254中所述測定蛋白質含量。
天冬氨酸激酶的酶活性測定如下。在30℃下，將1ml反應混合物(含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、600mM羥胺HCl(用10NKOH調至pH 7.0)、4mM ATP、200mM天冬氨酸鹽(鈉鹽))與額外1mlH2O孵育10分鐘，通過加入個別蛋白質裂解物開始分析並且在30℃下孵育30分鐘。通過向反應混合物中加入1ml終止溶液(10％氯化鐵、3.3％三氯乙酸、0.7N NaCl)以終止反應。離心步驟之後，測量上清液的OD540。在該狀況下，1單位相當於每分鐘每mg蛋白質形成1nmol天冬氨酸異羥肟酸。
結果示於表1a。
表1a


可以通過將Psod lysC構建物整合入染色體中使天冬氨酸激酶活性加倍。
實施例5賴氨酸的生產為了研究Psod lysC構建物對賴氨酸生產的作用，在30℃下將菌株ATCC13032、ATCC13032lysCfbr或ATCC13032Psod lysCfbr於CM平板(10.0g/l D-葡萄糖、2.5g/l NaCl、2.0g/l尿素、10.0g/l細菌用胰蛋白腖(Difco)、5.0g/l酵母提取物(Difco)、5.0g/l牛肉膏(Difco)、22.0g/l瓊脂(Difco)，經高壓滅菌(121℃下20分鐘))上培養2天。接著將細胞從平板上刮下並懸浮於鹽水中。就主要培養物而言，將10ml培養基I及0.5g經高壓滅菌的CaCO3(Riedel de Haen)置於100ml Erlenmeyer燒瓶中，用細胞懸浮液接種直至OD600為1.5，在Infors AJ118(來自Infors，Bottmingen，瑞士)型搖床上於220轉/分培養39小時。然後確定分泌至培養基中的賴氨酸濃度。
培養基I40g/l 蔗糖60g/l 糖蜜(以100％糖含量計算)10g/l(NH4)2SO40.4g/l MgSO4·7H2O0.6g/l KH2PO40.3mg/l 硫胺素·HCl1mg/l 生物素(來自1mg/ml儲存溶液，該儲存溶液已通過過濾除菌並用NH4OH調整至pH 8.0)2mg/lFeSO4
2mg/lMnSO4用NH4OH調整至pH 7.8，高壓滅菌(121℃，20分鐘)。
此外，加入維生素B12(羥鈷胺素，Sigma Chemicals)儲存溶液(200μg/ml，通過過濾除菌)直至維生素B12終濃度為100μg/l。
在Agilent 1100系列LC系統HPLC上通過Agilent高壓液相層析測定胺基酸濃度。用鄰苯二甲醛進行柱前衍生化作用允許對所形成的胺基酸進行定量，並且在Hypersil AA柱(Agilent)上將胺基酸混合物分級分離。
研究結果示於表2a。
表2a

實施例6製備載體pCLiK5MCS首先，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO23與SEQ ID NO24，通過聚合酶鏈式反應(PCR)來擴增氨苄青黴素(ampicillin)抗性及載體pBR322的複製起點。
SEQ ID NO235』-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3』SEQ ID NO245』-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTCG-3』除了pBR322的互補序列外，寡核苷酸引物SEQ ID NO23沿5』-3』方向含有限制性內切核酸酶SmaI、BamHI、NheI及AscI的酶切位點，寡核苷酸引物SEQ ID NO24沿5』-3』方向含有限制性內切核酸酶XbaI、XhoI、NotI及DraI的酶切位點。通過例如Innis等人(PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press(1990))的標準方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，美國)進行PCR反應。根據產品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Gel Band purificationkit)(Amersham Pharmacia，Freiburg)純化得到的約2.1kb大小的DNA片段。根據產品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該DNA片段的平末端連接在一起，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有氨苄青黴素(50μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
根據產品說明書使用Qiaprep離心式小量製備試劑盒(Qiaprep spinmniprep kit)(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質粒DNA，且通過限制性內切酶消化來檢查。以該方式得到的質粒稱為pCLiK1。
從作為PCR反應模板的質粒pWLT1(Liebl等人，1992)開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO25與SEQ ID NO26擴增卡那黴素抗性盒。
SEQ ID NO255』-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3』SEQ ID NO265』-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3』除了pWLT1的互補序列外，寡核苷酸引物SEQ ID NO25沿5』-3』方向含有限制性內切核酸酶XbaI、SmaI、BamHI、NheI的酶切位點，寡核苷酸引物SEQ ID NO26沿5』-3』方向含有限制性內切核酸酶AscI及NheI的酶切位點。通過例如Innis等人(PCR Protocols.A Guide to Methods andApplications，Academic Press(1990))的標準方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，美國)進行PCR反應。根據產品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)純化得到的約1.3kb大小的DNA片段。根據產品說明書以限制性內切核酸酶XbaI及AscI(New England Biolabs，Beverly，美國)切割DNA片段，且隨後使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)再次進行純化。同樣地，根據產品說明書以限制性內切核酸酶XbaI及AscI切割載體pCLiK1，且用鹼性磷酸酶(I(Roche Diagnostics，Mannheim))去磷酸化。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之後，根據產品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)分離線性化的載體(約2.1kb)。根據產品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與經切割的PCR片段連接，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有氨苄青黴素(50μg/ml)及卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
根據產品說明書使用Qiaprep離心式小量製備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質粒DNA，且通過限制性內切酶消化來檢查。以該方式得到的質粒稱為pCLiK2。
以限制性內切核酸酶DraI(New England Biolabs，Beverly，美國)切割載體pCLiK2。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之後，根據產品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)分離約2.3kb大小的載體片段。根據產品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)再連接該載體片段，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
根據產品說明書使用Qiaprep離心式小量製備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質粒DNA，且通過限制性內切酶消化來檢查。以該方式得到的質粒稱為pCLiK3。
從作為PCR反應模板的質粒pWLQ2(Liebl等人，1992)開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO27與SEQ ID NO28擴增複製起點pHM1519。
SEQ ID NO275』-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3』SEQ ID NO285』-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3』除了pWLQ2的互補序列外，寡核苷酸引物SEQ ID NO27及SEQ IDNO28含有限制性內切核酸酶NotI的酶切位點。通過例如Innis等人(PCRProtocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press(1990))的標準方法，用PfuTurbo聚合酶(Stratagene，La Jolla，美國)進行PCR反應。根據產品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，Freiburg)純化得到的約2.7kb大小的DNA片段。根據產品說明書以限制性內切核酸酶NotI(New England Biolabs，Beverly，美國)切割該DNA片段，且以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，Freiburg)再次進行純化。同樣地，根據產品說明書以限制性內切核酸酶NotI切割載體pCLiK3，且用鹼性磷酸酶(I(Roche Diagnostics，Mannheim))去磷酸化。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之後，根據產品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)分離線性化的載體(約2.3kb)。根據產品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與經切割的PCR片段連接，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
根據產品說明書使用Qiaprep離心式小量製備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質粒DNA，且通過限制性內切酶消化來檢查。以該方式得到的質粒稱為pCLiK5。
為了以多克隆位點(MCS)延伸pCLiK5，將合成的基本上互補的寡核苷酸SEQ ID NO21與SEQ ID NO22在95℃下一起加熱並緩慢冷卻來結合，得到雙鏈DNA片段，所述寡核苷酸SEQ ID NO29與SEQ ID NO30含有限制性內切核酸酶SwaI、XhoI、AatI、ApaI、Asp718、MluI、NdeI、SpeI、EcoRV、SalI、ClaI、BamHI、XbaI及SmaI的酶切位點。
SEQ ID NO295』-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATATGACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAACAATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3』SEQ ID NO305』-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAGCATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCGGGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3』根據產品說明書以限制性內切核酸酶XhoI及BamHI(New EnglandBiolabs，Beverly，美國)切割載體pCLiK5，並用鹼性磷酸酶(I(RocheDiagnostics，Mannheim))去磷酸化。在0.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳之後，根據產品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(AmershamPharmacia，Freiburg)分離線性化的載體(約5.0kb)。根據產品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與合成的雙鏈DNA片段連接，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
根據產品說明書使用Qiaprep離心式小量製備試劑盒(Qiagen，Hilden)分離每個克隆的質粒DNA，且通過限制性內切酶消化來檢查。以該方式得到的質粒稱為pCLiK5MCS。
如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美國745463-5467的描述進行測序反應。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)對測序反應進行分離及測定。
將得到的質粒pCLiK5MCS列為SEQ ID NO31。
實施例7製備質粒PmetA metA如Tauch等人(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828所述，從穀氨酸棒桿菌ATCC 13032製備染色體DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO32及SEQ ID NO33、作為模板的染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶(獲自Stratagene)，通過如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Meth ods and Applications，AcademicPress描述的標準方法以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增包括5』非編碼區的metA基因。
SEQ ID NO325』-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3』及SEQ ID NO335』-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3』根據產品說明書使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)純化得到的約1.3kb大小的DNA片段。接著以限制酶Asp718及SpeI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割該DNA片段，並以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化。
以限制酶Asp718及SpeI切割載體pClik5MCS SEQ ID NO31，電泳分離之後，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒分離得到5kb大小的片段。
根據產品說明書使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將載體片段與PCR片段連接在一起，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的大腸桿菌XL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
以多種方法及使用來自Qiagen的材料製備質粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美國745463-5467的描述進行測序反應。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)對測序反應進行分離及測定。
將得到的質粒pCLiK5MCS PmetA metA列為SEQ ID NO34。
實施例8製備質粒pCLiK5MCS Psod metA如Tauch等人(1995)Plasmid 33168-179或Eikmanns等人(1994)Microbiology 1401817-1828所述，從穀氨酸棒桿菌ATCC 13032製備染色體DNA。使用寡核苷酸引物SEQ ID NO35與SEQ ID NO36、作為模板的染色體DNA及Pfu Turbo聚合酶(獲自Stratagene)，通過例如Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，AcademicPress的標準方法以聚合酶鏈式反應(PCR)擴增超氧化物歧化酶(Psod)的5』非編碼區(表達單元區)的約200個鹼基對的DNA片段。
SEQ ID NO355』-GAGACTCGAGAGCTGCCAATTATTCCGGG-3』及SEQ ID NO365』-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATGGGTAAAAAATCCTTTCG-3』
根據產品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)純化得到的DNA片段。
從作為PCR反應模板的質粒PmetA metA SEQ ID NO34開始，使用寡核苷酸引物SEQ ID NO37與SEQ ID NO38擴增一部分metA。
SEQ ID NO375』-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3』與SEQ ID NO385』-CTGGGTACATTGCGGCCC-3』根據產品說明書以GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化得到的約470個鹼基對的DNA片段。
在接下來的PCR反應中，將以上得到的兩個片段一起用作模板。由於與寡核苷酸引物SEQ ID NO36一起導入的序列及其與metA的同源性，因此在PCR反應中兩個片段彼此連接，且通過所用的聚合酶延伸得到連續的DNA鏈。通過在第二個循環開始時才向反應混合物中加入所用的SEQ IDNO35及SEQ ID NO38寡核苷酸引物來改良標準方法。
根據產品說明書，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒純化約675個鹼基對的擴增的DNA片段。接著，以限制酶XhoI及NcoI(RocheDiagnostics，Mannheim)切割該DNA片段且用凝膠電泳進行分離。隨後，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒(Amersham Pharmacia，Freiburg)，從瓊脂糖純化約620個鹼基對大小的DNA片段。以限制酶NcoI及SpeI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割質粒PmetA metA SEQ ID NO34。在通過凝膠電泳進行分離之後，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒從瓊脂糖中純化約0.7kb大小的metA片段。
以限制酶XhoI及SpeI(Roche Diagnostics，Mannheim)切割載體pClik5MCS SEQ ID NO31，且在通過電泳進行分離之後，使用GFXTMPCR、DNA及凝膠條帶純化試劑盒分離得到5kb大小的片段。
根據產品說明書，使用快速DNA連接試劑盒(Roche Diagnostics，Mannheim)將該載體片段與PCR片段及metA片段連接在一起，且通過如Sambrook等人(Molecular Cloning.A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，(1989))描述的標準方法將連接混合物轉化進入感受態的E.coliXL-1Blue(Stratagene，La Jolla，美國)中。通過塗布在含有卡那黴素(20μg/ml)的LB瓊脂(Lennox，1955，Virology，1190)上來篩選含有質粒的細胞。
以多種方法及使用來自Qiagen的材料製備質粒DNA。如Sanger等人(1977)Proceedings of the National Academy of Sciences美國745463-5467的描述進行測序反應。使用ABI prism 377(PE AppliedBiosystems，Weiterstadt)對測序反應進行分離及測定。
將得到的質粒pCLiK5MCS PSODmetA列為SEQ ID NO39。
實施例9MetA活性以(Liebl等人(1989)FEMS Microbiology Letters 53299-303)描述的方法，用質粒pClik5MCS、pClik MCS PmetA metA、pCLiK5MCS PsodmetA中的每一種轉化穀氨酸棒桿菌菌株ATCC 13032。將轉化混合物塗布在另外含有20mg/l卡那黴素的CM平板上來篩選含有質粒的細胞。挑取且分離得到的卡那黴素抗性克隆。
在30℃下將含有這些質粒構建物之一的穀氨酸棒桿菌菌株在MMA培養基(40g/l蔗糖、20g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、1g/l K2HPO4、0.25g/lMgSO4×7H2O、54g Aces、1ml CaCl2(10g/l)、1ml原兒茶酸鹽(300mg/10ml)、1ml微量元素溶液(10g/l FeSO4×7H2O、10g/l MnSO4×H2O、2g/lZnSO4×7H2O、0.2g/l CuSO4、0.02g/l NiCl2×6H2O)、100μg/l維生素B12、0.3mg/l硫胺素、1mM亮氨酸、1mg/l吡哆醛HCl、1ml生物素(100mg/l)，pH 7.0)中培養過夜。將細胞在4℃下離心，接著用冷的Tris-HCl緩衝液(0.1％，pH 8.0)洗滌兩次。重新離心之後，將細胞溶解在冷的Tris-HCl緩衝液(0.1％，pH 8.0)中，並調節至OD600為160。為了使細胞破裂，將1ml該細胞懸浮液轉移至獲自Hybaid的2ml Ribolyser管中，且以6.0的旋轉設定值在獲自Hybaid的Ribolyser中裂解三次，每次30秒。通過4℃下在Eppendorf離心機中15,000轉/分離心30分鐘來使裂解產物澄清，且將上清液轉移至新的Eppendorf杯中。如Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72248-254中所述，測定蛋白質的含量。
以如下方式測定metA的酶活性。1ml反應混合物含有100mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.5)、5mM MgCl2、100μM乙醯輔酶A、5mM L-高絲氨酸、500μM DTNB(Ellman’s試劑)及細胞提取物。通過加入每個蛋白質裂解產物啟始測定，並在室溫下孵育。接著在412nm處記錄動力學10分鐘。
這些結果顯示於表3a中。
表3a

可能通過使用異源表達單元來顯著增加MetA的活性。
序列表110巴斯福股份公司(BASF AKTIENGESELLSCHAFT)120Psod表達單元130PF 55185/Mec14020030320141
160442101211173212DNA213穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)220
223超氧化物歧化酶RXA031194001gctgccaatt attccgggct tgtgacccgc tacccgataa ataggtcggc tgaaaaattt 60cgttgcaata tcaacaaaaa ggcctatcat tgggaggtgt cgcaccaagt acttttgcga 120agcgccatct gacggatttt caaaagatgt atatgctcgg tgcggaaacc tac 1732102211191212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223超氧化物歧化酶RXA031194002agctgccaat tattccgggc ttgtgacccg ctacccgata aataggtcgg ctgaaaaatt 60tcgttgcaat atcaacaaaa aggcctatca ttgggaggtg tcgcaccaag tacttttgcg 120aagcgccatc tgacggattt tcaaaagatg tatatgctcg gtgcggaaac ctacgaaagg 180attttttacc c19121032111365212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223RXA000774003atgaatgatg agaatattca aagctccaac tatcagccat tcccgagttt tgacgattgg 60aaacagatcg aggtgtcgct cttagatgtc atcgaatcct cacgccattt ttctgatttg 120
aaagatagca ctgatcgttc tgcgttagat gctgcgctag agagagcaaa aagagctgcc 180gcagttgata ccaatgccat agaaggaatc ttccaaactg atcgcggttt tacccataca 240gttgcaacgc aggtaggggc ttgggagcaa caaatggcga tgaaaggcaa acatgttaag 300cctgcgtttg acgatactct agaaggcttt gagtatgttc tcgatgcagt aactggtaga 360actccaatct ctcagcaatg gattagaaat ttgcacgccg tcattctgcg gagccaagaa 420agccacgagg tttttacagc cgttggagtc caaaatcagg cgcttcagaa aggcgagtat 480aaaactcagc caaatagtcc acagcgctca gatggatctg tacatgcata cgccccagtt 540gaagatactc ctgctgaaat ggctagattt atttcagaac ttgaatctaa ggaattctta 600gcagccgaga aggttattca agctgcctat gcccactatg ctttcgtatg tattcatcct 660tttgcagatg ggaatggacg agttgcacga gccttggcta gtgtttttct atacaaagat 720cctggtgtcc ctctcgtaat ctaccaagat caacgcagag attacatcca tgctctagaa 780gcagcggaca agaataaccc gctcctgctg attagattct ttgctgaacg agtgaccgat 840actattaact ctattatcgt tgatctcact accccgatcg cgggtaaatc tggttcggct 900aagctttcgg atgcgctacg ccccactcgc gtattaccag aattacatga tgctgcacat 960aggctccaag aaagtttatt tacagaaatc cgatctcgat tggatgaaga aggaaaaagg 1020aatgggttgg agtttctact tcaacggatt tttatcggtt ccccattcaa tctgccagag 1080ggctataacg ctttccctga tagctattgt ctgaccttag ctttcaatag caactctcca 1140aaacaaatct tccacccgct atccatagta atagcagctc gagatgggaa aagagcgagc 1200agcgacctcg tggcagctac ttctattgga tacaactttc acgcttacgg acgtgaagtc 1260gagcctgttg ttactgaaag ctttcgagaa cgtgtgaaaa tttacgccga cgggattgta 1320gatcacttct taaccgaact ggctaaaaag tttcaacaga attaa 13652104211454212PRT213穀氨酸棒桿菌4004Met Asn Asp Glu Asn Ile Gln Ser Ser Asn Tyr Gln Pro Phe Pro Ser1 5 10 15Phe Asp Asp Trp Lys Gln Ile Glu Val Ser Leu Leu Asp Val Ile Glu20 25 30Ser Ser Arg His Phe Ser Asp Leu Lys Asp Ser Thr Asp Arg Ser Ala35 40 45
Leu Asp Ala Ala Leu Glu Arg Ala Lys Arg Ala Ala Ala Val Asp Thr50 55 60Asn Ala Ile Glu Gly Ile Phe Gln Thr Asp Arg Gly Phe Thr His Thr65 70 75 80Val Ala Thr Gln Val Gly Ala Trp Glu Gln Gln Met Ala Met Lys Gly85 90 95Lys His Val Lys Pro Ala Phe Asp Asp Thr Leu Glu Gly Phe Glu Tyr100 105 110Val Leu Asp Ala Val Thr Gly Arg Thr Pro Ile Ser Gln Gln Trp Ile115 120 125Arg Asn Leu His Ala Val Ile Leu Arg Ser Gln Glu Ser His Glu Val130 135 140Phe Thr Ala Val Gly Val Gln Asn Gln Ala Leu Gln Lys Gly Glu Tyr145 150 155 160Lys Thr Gln Pro Asn Ser Pro Gln Arg Ser Asp Gly Ser Val His Ala165 170 175Tyr Ala Pro Val Glu Asp Thr Pro Ala Glu Met Ala Arg Phe Ile Ser180 185 190Glu Leu Glu Ser Lys Glu Phe Leu Ala Ala Glu Lys Val Ile Gln Ala195 200 205Ala Tyr Ala His Tyr Ala Phe Val Cys Ile His Pro Phe Ala Asp Gly210 215 220Asn Gly Arg Val Ala Arg Ala Leu Ala Ser Val Phe Leu Tyr Lys Asp225 230 235 240Pro Gly Val Pro Leu Val Ile Tyr Gln Asp Gln Arg Arg Asp Tyr Ile245 250 255His Ala Leu Glu Ala Ala Asp Lys Asn Asn Pro Leu Leu Leu Ile Arg260 265 270Phe Phe Ala Glu Arg Val Thr Asp Thr Ile Asn Ser Ile Ile Val Asp275 280 285Leu Thr Thr Pro Ile Ala Gly Lys Ser Gly Ser Ala Lys Leu Ser Asp290 295 300Ala Leu Arg Pro Thr Arg Val Leu Pro Glu Leu His Asp Ala Ala His305 310 315 320Arg Leu Gln Glu Ser Leu Phe Thr Glu Ile Arg Ser Arg Leu Asp Glu325 330 335Glu Gly Lys Arg Asn Gly Leu Glu Phe Leu Leu Gln Arg Ile Phe Ile340 345 350Gly Ser Pro Phe Asn Leu Pro Glu Gly Tyr Asn Ala Phe Pro Asp Ser
355 360 365Tyr Cys Leu Thr Leu Ala Phe Asn Ser Asn Ser Pro Lys Gln Ile Phe370 375 380His Pro Leu Ser Ile Val Ile Ala Ala Arg Asp Gly Lys Arg Ala Ser385 390 395 400Ser Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Ile Gly Tyr Asn Phe His Ala Tyr405 410 415Gly Arg Glu Val Glu Pro Val Val Thr Glu Ser Phe Arg Glu Arg Val420 425 430Lys Ile Tyr Ala Asp Gly Ile Val Asp His Phe Leu Thr Glu Leu Ala435 440 445Lys Lys Phe Gln Gln Asn450210521135212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223SEQ_ID54005gagagagaga cgcgtcccag tggctgagac gcatc35210621134212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223SEQ_ID_64006ctctctctgt cgacgaattc aatcttacgg cctg 3421072114323212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223SEQ_ID_7220
221misc_feature222(457)..(1248)223KanR220
221misc_feature222(1515)..(2375)223Ori-EC (pMB)220
221misc_feature222(1515)..(2375)223Ori-EC (pMB)complement220
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221misc_feature222(3840)..(4302)223PsacB complement4007tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtacca cgcgtcatat gactagttcg gacctaggga 60tatcgtcgac atcgatgctc ttctgcgtta attaacaatt gggatcctct agacccggga 120tttaaatcgc tagcgggctg ctaaaggaag cggaacacgt agaaagccag tccgcagaaa 180cggtgctgac cccggatgaa tgtcagctac tgggctatct ggacaaggga aaacgcaagc 240gcaaagagaa agcaggtagc ttgcagtggg cttacatggc gatagctaga ctgggcggtt 300ttatggacag caagcgaacc ggaattgcca gctggggcgc cctctggtaa ggttgggaag 360ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg caggggatca 420agatctgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga ttgaacaaga tggattgcac 480gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca 540atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt 600gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg 660tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga 720agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct 780cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg 840gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg 900gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc 960gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat 1020ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac 1080tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt 1140gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct 1200
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223果糖-1，6-二磷酸酶40040atgaacctaa agaaccccga aacgccagac cgtaaccttg ctatggagct ggtgcgagtt 60acggaagcag ctgcactggc ttctggacgt tgggttggac gtggcatgaa gaatgaaggc 120gacggtgccg ctgttgacgc catgcgccag ctcatcaact cagtgaccat gaagggcgtc 180gttgttatcg gcgagggcga aaaagacgaa gctccaatgc tgtacaacgg cgaagaggtc 240ggaaccggct ttggacctga ggttgatatc gcagttgacc cagttgacgg caccaccctg 300atggctgagg gtcgccccaa cgcaatttcc attctcgcag ctgcagagcg tggcaccatg 360tacgatccat cctccgtctt ctacatgaag aagatcgccg tgggacctga ggccgcaggc 420aagatcgaca tcgaagctcc agttgcccac aacatcaacg cggtggcaaa gtccaaggga 480atcaaccctt ccgacgtcac cgttgtcgtg cttgaccgtc ctcgccacat cgaactgatc 540gcagacattc gtcgtgcagg cgcaaaggtt cgtctcatct ccgacggcga cgttgcaggt 600gcagttgcag cagctcagga ttccaactcc gtggacatca tgatgggcac cggcggaacc 660ccagaaggca tcatcactgc gtgcgccatg aagtgcatgg gtggcgaaat ccagggcatc 720ctggccccaa tgaacgattt cgagcgccag aaggcacacg acgctggtct ggttcttgat 780caggttctgc acaccaacga tctggtgagc tccgacaact gctacttcgt ggcaaccggt 840gtgaccaacg gtgacatgct ccgtggcgtt tcctaccgcg caaacggcgc aaccacccgt 900tccctggtta tgcgcgcaaa gtcaggcacc atccgccaca tcgagtctgt ccaccagctg 960tccaagctgc aggaatactc cgtggttgac tacaccaccg cgacc 100521041211335212PRT213穀氨酸棒桿菌40041Met Asn Leu Lys Asn Pro Glu Thr Pro Asp Arg Asn Leu Ala Met Glu1 5 10 15
Leu Val Arg Val Thr Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ser Gly Arg Trp Val20 25 30Gly Arg Gly Met Lys Asn Glu Gly Asp Gly Ala Ala Val Asp Ala Met35 40 45Arg Gln Leu Ile Asn Ser Val Thr Met Lys Gly Val Val Val Ile Gly50 55 60Glu Gly Glu Lys Asp Glu Ala Pro Met Leu Tyr Asn Gly Glu Glu Val65 70 75 80Gly Thr Gly Phe Gly Pro Glu Val Asp Ile Ala Val Asp Pro Val Asp85 90 95Gly Thr Thr Leu Met Ala Glu Gly Arg Pro Asn Ala Ile Ser Ile Leu100 105 110Ala Ala Ala Glu Arg Gly Thr Met Tyr Asp Pro Ser Ser Val Phe Tyr115 120 125Met Lys Lys Ile Ala Val Gly Pro Glu Ala Ala Gly Lys Ile Asp Ile130 135 140Glu Ala Pro Val Ala His Asn Ile Asn Ala Val Ala Lys Ser Lys Gly145 150 155 160Ile Asn Pro Ser Asp Val Thr Val Val Val Leu Asp Arg Pro Arg His165 170 175Ile Glu Leu Ile Ala Asp Ile Arg Arg Ala Gly Ala Lys Val Arg Leu180 185 190Ile Ser Asp Gly Asp Val Ala Gly Ala Val Ala Ala Ala Gln Asp Ser195 200 205Asn Ser Val Asp Ile Met Met Gly Thr Gly Gly Thr Pro Glu Gly Ile210 215 220Ile Thr Ala Cys Ala Met Lys Cys Met Gly Gly Glu Ile Gln Gly Ile225 230 235 240Leu Ala Pro Met Asn Asp Phe Glu Arg Gln Lys Ala His Asp Ala Gly245 250 255Leu Val Leu Asp Gln Val Leu His Thr Asn Asp Leu Val Ser Ser Asp260 265 270Asn Cys Tyr Phe Val Ala Thr Gly Val Thr Asn Gly Asp Met Leu Arg275 280 285Gly Val Ser Tyr Arg Ala Asn Gly Ala Thr Thr Arg Ser Leu Val Met290 295 300Arg Ala Lys Ser Gly Thr Ile Arg His Ile Glu Ser Val His Gln Leu305 310 315 320Ser Lys Leu Gln Glu Tyr Ser Val Val Asp Tyr Thr Thr Ala Thr325 330 335
210422116212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223POTENTIELLE_-10-區_140042tgcaat 6210432117212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223POTENTIELLE_-10-區_240043tatcatt7210442117212DNA213穀氨酸棒桿菌220
223RIBOSOMALE_BINDUNGSSTELLE\SHINE-DALGARNO40044gaaagga權利要求
1.一種具有啟動子活性的核酸在基因轉錄中的用途，所述核酸包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，並在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段。
2.一種表達單元在基因表達中的用途，所述表達單元包含根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸及額外的功能性連接的核酸序列，所述核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
3.根據權利要求2所述的用途，其中所述表達單元包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，並在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段。
4.根據權利要求3所述的用途，其中所述表達單元由核酸序列SEQ.ID.NO.2組成。
5.一種具有啟動子活性的核酸，其包含A)核酸序列SEQ.ID.NO.1，或B)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.1衍生的，並在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.1具有至少90％同一性的序列，或C)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.1雜交的核酸序列，或D)A)、B)或C)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.1的核酸。
6.一種表達單元，其包含根據權利要求5所述的具有啟動子活性的核酸及額外的功能性連接的核酸序列，所述核酸序列確保核糖核酸的翻譯。
7.根據權利要求6所述的表達單元，其包含E)核酸序列SEQ.ID.NO.2，或F)通過核苷酸的取代、插入或缺失從序列SEQ.ID.NO.2衍生的，並在核酸水平上與序列SEQ.ID.NO.2具有至少90％同一性的序列，或G)在嚴格條件下與核酸序列SEQ.ID.NO.2雜交的核酸序列，或H)E)、F)或G)序列的功能等效片段，其前體條件是排除包含序列SEQ.ID.NO.2的核酸。
8.一種與野生型相比，改變或影響微生物中基因轉錄速率的方法，其通過a)與野生型相比，改變微生物中根據權利要求1所述的具有啟動子活性的內源核酸的特異啟動子活性，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或b)以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
9.根據權利要求8所述的方法，其中以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄通過以下方式達到b1)將一種或多種根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或b2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的內源核酸控制下進行一種或多種導入基因的轉錄，或b3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其中與野生型相比，為了提高或影響微生物中基因的轉錄速率，ah)與野生型相比，根據權利要求1所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性是增加的，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或bh)以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
11.根據權利要求10所述的方法，其中以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄通過以下方式達到bh1)將一種或多種根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或bh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的內源核酸控制下進行一種或多種導入基因的轉錄，或bh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
12.根據權利要求8或9所述的方法，其中與野生型相比，為了降低微生物中基因的轉錄速率，ar)與野生型相比，根據權利要求1所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性是降低的，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或br)將具有根據實施方案a)所述的降低的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在所述導入的具有降低的啟動子活性的核酸控制下進行內源基因的轉錄。
13.一種與野生型相比，改變或影響微生物中基因表達速率的方法，其通過c)與野生型相比，改變微生物中根據權利要求2或3所述的內源表達單元的特異表達活性，所述內源表達單元調節內源基因的表達，或d)以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案c)所述的改變的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因的表達，其中所述基因與所述表達單元是異源的。
14.根據權利要求13所述的方法，其中以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因表達通過以下方式達到d1)將一種或多種適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或d2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或d3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
15.根據權利要求13或14所述的方法，其中與野生型相比，為了提高或影響微生物中基因的表達速率，ch)與野生型相比，根據權利要求2或3所述的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是增加的，所述內源表達單元調節所述內源基因的表達，或dh)以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因表達，其中所述基因與所述表達單元是異源的。
16.根據權利要求15所述的方法，其中以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因表達通過以下方式達到dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有增加的特異表達活性的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或dh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
17.根據權利要求13或14所述的方法，其中與野生型相比，為了降低微生物中基因的表達速率，cr)與野生型相比，根據權利要求2或3所述的內源表達單元在微生物中的特異表達活性是降低的，所述內源表達單元調節所述內源基因的表達，或dr)將根據實施方案cr)所述的具有降低的特異表達活性的表達單元導入微生物基因組中，以便在所述導入的具有降低的表達活性的表達單元控制下進行內源基因的表達。
18.根據權利要求8-17中任一項所述的方法，其中所述基因選自編碼來自蛋白型與非生蛋白胺基酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質的核酸，其中所述基因任選包含其他調節元件。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述來自胺基酸的生物合成途徑的蛋白質選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構酶、轉錄調節物LuxR、轉錄調節物LysR1、轉錄調節物LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉酮酶、轉醛酶、高絲氨酸O-乙醯轉移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉移酶、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙醯-轉移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷醯轉移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調節物、RXN2910調節物、精氨醯-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247、蛋白質OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
20.一種表達盒，其包含a)至少一種根據權利要求2或3所述的表達單元，及b)至少一種其他待表達核酸，及c)適當條件下其他遺傳控制元件，其中至少一種表達單元與其他待表達核酸序列功能性連接在一起，且所述其他待表達核酸序列與所述表達單元是異源的。
21.根據權利要求20所述的表達盒，其中所述其他待表達核酸序列選自編碼來自蛋白型與非生蛋白胺基酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質的核酸。
22.根據權利要求21所述的表達盒，其中所述來自胺基酸的生物合成途徑的蛋白質選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構酶、轉錄調節物LuxR、轉錄調節物LysR1、轉錄調節物LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉酮酶、轉醛酶、高絲氨酸O-乙醯轉移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉移酶、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙醯-轉移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷醯轉移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調節物、RXN2910調節物、精氨醯-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247、蛋白質OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
23.一種表達載體，其包含根據權利要求20至22中任一項所述的表達盒。
24.一種基因修飾微生物，其中所述基因修飾導致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的轉錄速率，並取決於a)改變微生物中至少一種根據權利要求1所述的具有啟動子活性的內源核酸的特異啟動子活性，所述內源核酸調節至少一種內源基因的轉錄，或b)以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調節微生物中基因轉錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
25.根據權利要求24所述的基因修飾微生物，其中以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異啟動子活性的權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄通過以下方式達到b1)將一種或多種根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或b2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的內源核酸控制下進行一種或多種導入基因的轉錄，或b3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有改變的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
26.根據權利要求24或25所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有提高或影響的轉錄速率，其中ah)與野生型相比，根據權利要求1所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性是增加的，所述內源核酸調節內源基因的轉錄，或bh)以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案ah)的增加的特異啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄，其中所述基因與所述具有啟動子活性的核酸是異源的。
27.根據權利要求26所述的基因修飾微生物，其中以根據權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異啟動子活性的權利要求1所述的具有啟動子活性的核酸來調節微生物中基因的轉錄通過以下方式達到bh1)將一種或多種根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在導入的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸控制下進行一種或多種內源基因的轉錄，或bh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的內源核酸控制下進行一種或多種導入基因的轉錄，或bh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含根據權利要求1所述的具有啟動子活性、適當條件下具有增加的特異啟動子活性的核酸及功能性連接的一種或多種待轉錄核酸。
28.根據權利要求24或25所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有降低的轉錄速率，其中ar)與野生型相比，至少一種根據權利要求1所述的具有啟動子活性的內源核酸在微生物中的特異啟動子活性是降低的，所述內源核酸調節至少一種內源基因的轉錄，或br)將一種或多種具有根據實施方案a)所述的降低的啟動子活性的核酸導入微生物基因組中，以便在所述導入的具有降低的啟動子活性的核酸控制下進行至少一種內源基因的轉錄。
29.一種基因修飾微生物，其中所述基因修飾導致與野生型相比，改變或影響至少一種基因的表達速率，並取決於c)與野生型相比，改變微生物中根據權利要求2或3所述的至少一種內源表達單元的特異表達活性，所述內源表達單元調節至少一種內源基因的表達，或d)以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因的表達，其中所述基因與所述表達單元是異源的。
30.根據權利要求29所述的基因修飾微生物，其中以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的改變的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因表達通過以下方式達到d1)將一種或多種適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在所述導入的適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或d2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在所述適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或d3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有改變的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
31.根據權利要求29或30所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有提高或影響的表達速率，其中ch)與野生型相比，根據權利要求2或3所述的至少一種內源表達單元在微生物中的特異表達活性是增加的，所述內源表達單元調節內源基因的表達，或dh)以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因的表達，其中所述基因與所述表達單元是異源的。
32.根據權利要求31的基因修飾微生物，其中以根據權利要求2或3所述的表達單元，或以具有根據實施方案a)所述的增加的特異表達活性的權利要求2或3所述的表達單元來調節微生物中基因的表達通過以下方式達到dh1)將一種或多種適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元控制下進行一種或多種內源基因的表達，或dh2)將一種或多種基因導入微生物基因組中，以便在適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的內源表達單元控制下進行一種或多種導入基因的表達，或dh3)將一種或多種核酸構建物導入微生物中，所述核酸構建物包含適當條件下具有增加的特異表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元及功能性連接的一種或多種待表達核酸。
33.根據權利要求29或30所述的基因修飾微生物，其與野生型相比，至少一種基因具有降低的表達速率，其中cr)與野生型相比，根據權利要求2或3所述的至少一種內源表達單元在微生物中的特異表達活性是降低的，所述內源表達單元調節至少一種內源基因的表達，或dr)將一種或多種具有降低的表達活性的根據權利要求2或3所述的表達單元導入微生物基因組中，以便在導入的具有降低的表達活性的權利要求2或3所述的表達單元控制下進行至少一種基因的表達。
34.一種基因修飾微生物，其包含根據權利要求2或3所述的表達單元及以功能性連接的待表達基因，其中所述基因與所述表達單元是異源的。
35.根據權利要求34所述的基因修飾微生物，其包含根據權利要求20至22中任一項所述的表達盒。
36.根據權利要求24-35中任一項所述的基因修飾微生物，其中所述基因選自編碼來自蛋白型與非生蛋白胺基酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自核苷酸與核苷的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自有機酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自類脂類與脂肪酸的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自二醇的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自糖類的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自芳香化合物的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自維生素的生物合成途徑的蛋白質的核酸、編碼來自輔因子的生物合成途徑的蛋白質的核酸及編碼來自酶的生物合成途徑的蛋白質的核酸，其中所述基因任選包含其他調節元件。
37.根據權利要求36所述的基因修飾微生物，其中所述來自胺基酸的生物合成途徑的蛋白質選自天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、二氨基庚二酸脫羧酶、二氫吡啶二羧酸合成酶、二氫吡啶二羧酸還原酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油酸激酶、丙酮酸羧化酶、丙糖磷酸異構酶、轉錄調節物LuxR、轉錄調節物LysR1、轉錄調節物LysR2、蘋果酸-醌氧化還原酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、6-磷酸葡糖酸脫氫酶、轉酮酶、轉醛酶、高絲氨酸O-乙醯轉移酶、胱硫醚γ合酶、胱硫醚β裂合酶、絲氨酸羥甲基轉移酶、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶、亞甲基四氫葉酸還原酶、磷酸絲氨酸氨基轉移酶、磷酸絲氨酸磷酸酶、絲氨酸乙醯轉移酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶、蘇氨酸輸出子載體、蘇氨酸脫水酶、丙酮酸氧化酶、賴氨酸輸出子、生物素連接酶、半胱氨酸合酶I、半胱氨酸合酶II、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶、硫酸腺苷醯轉移酶亞基1和2、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶、鐵氧還蛋白NADP還原酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、RXA00655調節物、RXN2910調節物、精氨醯-tRNA合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、蘇氨酸排出蛋白、絲氨酸羥甲基轉移酶、果糖-1，6-二磷酸酶、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247、蛋白質OpcA、1-磷酸果糖激酶及6-磷酸果糖激酶。
38.一種通過培養根據權利要求24至37中任一項所述的基因修飾微生物來製備生物合成產物的方法。
39.一種通過培養根據權利要求24、25、31或32中任一項所述的基因修飾微生物來製備賴氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫氫酶的核酸、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸合成酶的核酸、編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構酶的核酸、編碼轉錄調節物LuxR的核酸、編碼轉錄調節物LysR1的核酸、編碼轉錄調節物LysR2的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼轉酮酶的核酸、編碼轉醛酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼精氨醯-tRNA合成酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼蛋白質OpcA的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸及編碼6-磷酸果糖激酶的核酸。
40.根據權利要求39所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫氫酶活性、二氨基庚二酸脫羧酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構酶活性、轉錄調節物LuxR的活性、轉錄調節物LysR1的活性、轉錄調節物LysR2的活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性、轉酮酶活性、轉醛酶活性、賴氨酸輸出子活性、精氨醯-tRNA合成酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、蛋白質OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性及生物素連接酶活性。
41.根據權利要求39或40所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙醯轉移酶活性、O-乙醯-高絲氨酸硫化氫解酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、高絲氨酸激酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、蘇氨酸輸出子活性、蘇氨酸排出蛋白活性、天冬醯胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性及蘇氨酸合酶活性。
42.一種通過培養根據權利要求24、25、31或32中任一項所述的基因修飾微生物來製備甲硫氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構酶的核酸、編碼高絲氨酸O-乙醯轉移酶的核酸、編碼胱硫醚γ合酶的核酸、編碼胱硫醚β裂合酶的核酸、編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的核酸、編碼O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶的核酸、編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸氨基轉移酶的核酸、編碼磷酸絲氨酸磷酸酶的核酸、編碼絲氨酸乙醯轉移酶的核酸、編碼半胱氨酸合酶I的核酸、編碼半胱氨酸合酶II的核酸、編碼輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶的核酸、編碼硫酸腺苷醯轉移酶的核酸、編碼磷酸腺苷磷醯硫酸還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白NADPH-還原酶的核酸、編碼鐵氧還蛋白的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248的核酸、編碼硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247的核酸、編碼RXA0655調節物的核酸及編碼RXN2910調節物的核酸。
43.根據權利要求42所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、高絲氨酸脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構酶活性、高絲氨酸O-乙醯轉移酶活性、胱硫醚γ合酶活性、胱硫醚β裂合酶活性、絲氨酸羥甲基轉移酶活性、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶活性、亞甲基四氫葉酸還原酶活性、磷酸絲氨酸氨基轉移酶活性、磷酸絲氨酸磷酸酶活性、絲氨酸乙醯轉移酶活性、半胱氨酸合酶I活性、半胱氨酸合酶II活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、硫酸腺苷醯轉移酶活性、磷酸腺苷-磷醯硫酸還原酶活性、鐵氧還蛋白-亞硫酸鹽還原酶活性、鐵氧還蛋白NADPH-還原酶活性、鐵氧還蛋白活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA077的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA248的活性、硫酸鹽還原作用的蛋白質RXA247的活性、RXA655調節物的活性及RXN2910調節物的活性。
44.根據權利要求42或43所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自高絲氨酸激酶活性、蘇氨酸脫水酶活性、蘇氨酸合酶活性、內消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
45.一種通過培養根據權利要求24、25、31或32中任一項所述的基因修飾微生物來製備蘇氨酸的方法，其中所述基因選自編碼天冬氨酸激酶的核酸、編碼天冬氨酸-半醛脫氫酶的核酸、編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的核酸、編碼3-磷酸甘油酸激酶的核酸、編碼丙酮酸羧化酶的核酸、編碼丙糖磷酸異構酶的核酸、編碼高絲氨酸激酶的核酸、編碼蘇氨酸合酶的核酸、編碼蘇氨酸輸出子載體的核酸、編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的核酸、編碼轉醛酶的核酸、編碼轉酮酶的核酸、編碼蘋果酸-醌氧化還原酶的核酸、編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的核酸、編碼賴氨酸輸出子的核酸、編碼生物素連接酶的核酸、編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸、編碼蘇氨酸排出蛋白的核酸、編碼果糖-1，6-二磷酸酶的核酸、編碼OpcA蛋白質的核酸、編碼1-磷酸果糖激酶的核酸、編碼6-磷酸果糖激酶的核酸及編碼高絲氨酸脫氫酶的核酸。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有增加的下列活性中的至少一種，所述活性選自天冬氨酸激酶活性、天冬氨酸-半醛脫氫酶活性、甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、3-磷酸甘油酸激酶活性、丙酮酸羧化酶活性、丙糖磷酸異構酶活性、蘇氨酸合酶活性、蘇氨酸輸出子載體活性、轉醛酶活性、轉酮酶活性、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性、蘋果酸-醌氧化還原酶活性、高絲氨酸激酶活性、生物素連接酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性、蘇氨酸排出蛋白活性、蛋白質OpcA活性、1-磷酸果糖激酶活性、6-磷酸果糖激酶活性、果糖-1，6-二磷酸酶活性、6-磷酸葡糖酸脫氫酶活性及高絲氨酸脫氫酶活性。
47.根據權利要求45或46所述的方法，其中所述基因修飾微生物與野生型相比，額外具有降低的下列活性中的至少一種，所述活性選自蘇氨酸脫水酶活性、高絲氨酸O-乙醯轉移酶活性、絲氨酸羥甲基轉移酶活性、O-乙醯高絲氨酸硫化氫解酶活性、內消旋二氨基庚二酸D-脫氫酶活性、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶活性、丙酮酸氧化酶活性、二氫吡啶二羧酸合成酶活性、二氫吡啶二羧酸還原酶活性、天冬醯胺酶活性、天冬氨酸脫羧酶活性、賴氨酸輸出子活性、乙醯乳酸合酶活性、乙酮醇-酸還原異構酶活性、支鏈氨基轉移酶活性、輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、非輔酶B12依賴型甲硫氨酸合酶活性、二羥基-酸脫水酶活性及二氨基吡啶甲酸脫羧酶活性。
48.根據權利要求38-47中任一項所述的方法，其中所述生物合成產物在培養步驟後和/或培養步驟期間中從培養基中分離，且在適當條件下純化。
49.核酸序列SEQ.ID.NO.44作為能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中表達的表達單元中核糖體結合位點的用途。
50.核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43作為能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中表達的表達單元中-10區的用途。
51.一種能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中表達的表達單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.44。
52.根據權利要求51所述的表達單元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.44作為核糖體結合位點。
53.一種能使基因在棒桿菌屬或短桿菌屬細菌中表達的表達單元，其包含核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43中的至少一種。
54.根據權利要求53所述的表達單元，其中所述核酸序列SEQ.ID.NO.42或SEQ.ID.NO.43之一作為-10區。
全文摘要
本發明涉及用於調節基因轉錄和表達的核酸序列的用途、新啟動子及表達單元、用於改變或影響基因轉錄速率和/或表達速率的方法、包含所述表達單元的表達盒、具有改變的或受影響的轉錄速率和/或表達速率的基因修飾微生物及通過培育所述基因修飾微生物製備生物合成產物的方法。
文檔編號C12N1/21GK1894411SQ200480037881
公開日2007年1月10日 申請日期2004年12月16日 優先權日2003年12月18日
發明者B·克勒格爾, O·策爾德爾, C·克洛普羅格, H·施洛德, S·哈夫納 申請人:巴斯福股份公司