Fk506結合蛋白4的應用的製作方法
2023-06-25 22:54:11 2
專利名稱：Fk506結合蛋白4的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種FK506結合蛋白4用作檢測肝癌的蛋白質分子標記的應用。
背景技術：
肝癌是一種嚴重危害人類的疾病。西方發達國家肝癌的發病率較低，國際上對肝癌的基礎研究仍較為薄弱，而我國是肝癌高發國家，發病率和死亡率呈現上升趨勢，且發病年齡構成年輕化，每年用於肝癌治療的醫療支出大為增加，肝癌成了嚴重危害我國人民生命財產安全的頭號敵人，並且是影響社會經濟發展的一個重要因素，加大力度進行我國肝癌的基礎研究具有戰略意義，而分離和鑑定新的肝癌相關基因是目前肝癌基礎研究中的前沿課題。
到目前為止，已有不下20種的基因異常表達被確定與肝癌的發生發展有關，但已確定的肝癌相關基因在肝癌中的異常表達率並不高，肝癌的發病機制至今仍未闡明，肝癌的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統的肝癌手術加化療以及近年來配合使用的多種基因治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關基因、尤其是肝癌高表達基因對於探討肝癌的發病機制具有重要意義。
因此，為治療和診斷目的研究和開發在肝癌中高表達的基因和/或蛋白具有重要意義。本領域迫切需要新的在肝癌中高表達的基因和/或蛋白。
FK506結合蛋白4(FK506-binding protein 4；Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase；PPIase；Rotamase；p59 protein；HSP binding immunophilin；HBI；FKBP52 protein；52kDa FK506binding protein；FKBP59；FKBP4)的Genebank登錄號為gi|4503729，NCBI的登錄號為NP_002005。它是一種免疫抑制劑(FK506或rapamycin)結合蛋白，在體外具有肽基脯氨醯異構酶(peptidyl prolyl isomerase)和似分子伴侶活性(chaperone-like activity)，體內的FK506結合蛋白4則屬於類固醇激素受體複合物(steroid hormone receptorcomplexes)，它在免疫調控、蛋白摺疊與運輸等基礎細胞學過程中發揮重要功能。
FK506和rapamycin是結構相關的高效的免疫抑制劑，它們阻斷不同的胞內信號傳導途徑並受結合它們的親免素蛋白家族(immunophilin protein family)成員調控。人類的親免素蛋白家族成員包括FKBP12(FKBP1)、FKBP13(FKBP2)、FKBP25(FKBP3)和FK506結合蛋白4(FKBP4)(Peattie，D.A.et al.Proc.Nat.Acad.Sci.8910974-10978，1992)。
FK506結合蛋白4是一個「巨大的」親免素，它的N端結構域與FKBP12在結構和功能上高度保守。和FKBP12不同的是，它與FK506結合形成的複合物沒有免疫抑制劑活性。酵母雙雜交實驗顯示一種過氧化物酶phytanoyl-CoA alpha-hydroxylase(PHYH)特異性結合FK506結合蛋白4的N端結構域(Chambraud，B.et al.Proc.Nat.Acad.Sci.962104-2109，1999)。
FK506結合蛋白4還同兩種熱休克蛋白hsp90和hsp70相互作用，它們都是類固醇激素受體複合物成員(Sanchez ER，Faber LE，Henzel WJ，Pratt WB.Biochemistry.1990 May 29；29(21)5145-52)。FK506結合蛋白4包含一個酪蛋白激酶II(casein kinase II，CK2)的保守磷酸化作用位點Thr143(Miyata Y.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997 Dec 23；94(26)14500-5)，這一修飾調節FK506結合蛋白4與熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)的結合與否，CK2磷酸化的FK506結合蛋白4不再具有HSP90結合活性，這是一種改變複合物組成(如類固醇受體和蛋白激酶)的調控方式。
另外，FK506結合蛋白4還與二型腺相關病毒載體(adeno-associated virus type 2vectors，AAV)有強烈相互作用，在人細胞系中表現為能顯著刺激AAV相關的基因表達，從而體現了FK506結合蛋白4在人類基因治療領域中良好的應用前景(Qing K.et al.J.Virol.2001 Oct；75(19)8968-76)。
最近的一篇文獻表明，人結腸癌細胞系DLD-1中，FK506結合蛋白4與HSP90、P53等相互作用並使得腫瘤抑制蛋白P53從細胞核移位至細胞質是P53蛋白喪失腫瘤抑制功能的可能機制(Galigniana MD.，et al.J.Biol Chem.2004 May 21；279(21)22483-9.Epub 2004Mar 5)。另外，乳腺癌細胞系MCF-7中也報導過FK506結合蛋白4在mRNA水平的高表達情況(Kumar P.，et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.2001 Jun 1；284(1)219-25)。但截止目前，還沒有FK506結合蛋白4與肝細胞癌的相關報導。
發明內容
通過篩選在肝細胞癌癌組織以及肝細胞癌癌旁組織中差異表達的蛋白質，本申請的發明人找到了一種在肝細胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達的蛋白質(在癌組織中上調表達)，經質譜鑑定為FK506結合蛋白4。進一步的免疫印跡實驗證實，FK506結合蛋白4的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(在癌組織中上調表達)。
基於FK506結合蛋白4與肝細胞癌的這種相關性，以該蛋白作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用於檢測肝癌。
因此，本發明的首要目的即在於提供一種FK506結合蛋白4用作檢測肝癌的蛋白質分子標記的應用。
本發明的另一個目的在於提供一種抗FK506結合蛋白4的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用於製備檢測肝癌的製劑的應用。
本發明的再一個目的還在於提供一種抗FK506結合蛋白4的抗體，包括單克隆抗體和多克隆抗體，用於製備檢測肝癌的試劑盒的應用。
本發明的又一個目的在於提供一種體外檢測肝細胞組織中FK506結合蛋白4的表達是否異常的方法，該方法包括以下步驟A、用特異性抗FK506結合蛋白4的抗體檢測待測肝細胞中FK506結合蛋白4的數量；B、將步驟A測得的FK506結合蛋白4的數量與正常肝組織中的FK506結合蛋白4的數量進行比較，如測得的蛋白數量高於正常值，則表示被檢測肝組織中FK506結合蛋白4的表達異常。
雖然在現有技術中有關於FK506結合蛋白4在人結腸癌細胞系以及乳腺癌中高表達的報導，但是到目前為止，還沒有FK506結合蛋白4與肝細胞癌的相關性的報導，因此，本發明的這一發現將為肝細胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。
圖1為FK506結合蛋白4在癌組織和癌旁組織的2-DE圖譜中的量變示意圖，顯示了蛋白質點SSP 2614(經質譜鑑定的FK506結合蛋白4)在肝細胞癌患者的癌組織中的表達相比在癌旁組織中的表達明顯上調。
圖2為FK506結合蛋白4的免疫印跡分析結果示意圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
本申請的發明人用非酶解樣品製備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)製備了肝細胞癌的癌組織與癌旁組織的蛋白質樣品，以雙向凝膠電泳(2-DE)技術篩選在癌組織與癌旁組織中差異表達的蛋白質點並質譜鑑定，結果發現FK506結合蛋白4在肝細胞癌癌組織中上調表達。免疫印跡實驗進一步證實FK506結合蛋白4的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達。
因此，以FK506結合蛋白4作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用於檢測肝癌，也即FK506結合蛋白4可以用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
實施例1、肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質樣品的製備本實施例中所使用的尿素、3-[(3-膽醯胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、苯甲基磺醯氟(PMSF)、二硫蘇糖醇(DTT)均購自Sigma公司。
本實施例以非酶解樣品製備法(nonenzymatic sample preparation，NESP)製備肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣品，具體如下手術切除的新鮮組織塊迅速置於冰上，快速切成幾個肉眼可見、無壞死區域的小塊。用預冷的不含穀氨醯胺的RPMI1640培養基(5％胎牛血清，0.2mM PMSF，1mM EDTA，苯甲異噁唑青黴素25mg/mL，慶大黴素50mg/mL，青黴素100U/mL，鏈黴素100mg/mL，兩性黴素B 0.25mg/mL，制黴菌素50U/mL)洗滌組織小塊數次後，在液氮中快速研磨成細胞沉澱，細胞沉澱分別溶於適量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超聲細胞破碎儀(Soniprep 150，英國，MSE)冰浴間歇超聲2min，15000r/min、4℃離心1h。取上清，以改良的Bradford法(見Bio-Rad公司產品說明書)進行總蛋白質定量，製備好的肝細胞癌癌組織及相應癌旁組織的蛋白質樣品分裝，-80℃保存備用。
以上述方法製備16對肝細胞癌癌組織及癌旁組織蛋白質樣品。16例肝細胞癌標本均來自東方肝膽外科醫院，由2個病理科醫生明確為肝細胞癌。均為男性，平均年齡49.4歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，16例(100％)屬臨床分級(TNM分級)III級。其中，甲胎蛋白(AFP)高於25μg/L的15例(93.75％)；14例腫瘤大於5cm。16例肝細胞癌標本的病理資料詳見以下表1。
表1、16例肝細胞癌標本的病理資料
本實施例所用癌組織及癌旁組織樣品均為取自同一肝細胞癌患者的成對樣品，所有16例肝細胞癌病例有極相似的病例診斷指標均為男性，平均年齡49.4歲(31～65歲)，血清檢測hepatitis B病毒感染陽性，16例(100％)屬TNM分級III級。其中，AFP高於25μg/L的15例(93.75％)；14例腫瘤大於5cm。這種取樣方法有利於降低個體間差別對實驗分析工作的影響。
實施例2、差異表達蛋白的篩選本實施例中使用的尿素、3-[(3-膽醯胺丙基)-二乙銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司；碘乙醯胺(IAA)、丙烯醯胺、N，N-甲叉雙丙烯醯胺等購自Fluka公司。
過硫酸胺(AP)、Tri-n-butylphosphat(TBP)、PDQuest軟體等為Bio-Rad產品。
LCQTMDeca XP system和ProteomeXTMWorkstation購自Thermo Finnigan公司。
非線性固相pH梯度預製膠條(IPG幹膠條，pH3-10NL，130×3×0.5mm)、IPG緩衝液、IPGphore等電聚焦系統(Amersham Pharmacia Biotech)、Amersham Pharmacia EttanDalt II systems等為Amersham Bioscience公司產品。
取實施例1得到的16對肝細胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質樣品中的10對(表1中f31、f32、f33、f39、3 27、3 28、4 15、4 18、4 22和3 17)，採用雙向凝膠電泳法對其中的差異表達蛋白進行篩選，雙向凝膠電泳主要按Sanchez等人的改進方法(Sanchez，J.C.et al.Electrophoresis 1997，18，324-327)進行，具體如下首先採用分析型雙向凝膠電泳，將60μg蛋白質樣品與重泡漲液(8mol/L尿素、2％CHAPS、0.5％IPG緩衝液、18mmol/L DTT和痕量溴酚藍)混合，總體積250μl，使用130×3×0.5mm pH3-10 NL膠條，在IPGphore等電聚焦系統上進行一向分離，總電壓小時約為80000Vhrs。等電聚焦後膠條依次在平衡液I(6M尿素、30％甘油、2％SDS、1％DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％IAA代替)中平衡，每次15min。膠條轉移至十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE，膠濃度12％)上緣，電泳條件為15mA/膠30min，然後30mA/膠保持至溴酚藍離膠下緣0.5cm。
然後，採用銀染使膠條生成圖像，並以GS-710圖像掃描儀(Bio-Rad)透射模式掃描膠圖像，解析度為84.7μm/pixel。點的檢測和匹配用PDQuest軟體分析。蛋白質點的等電點pI和分子量Mr以2-DE標準蛋白質(Bio-Rad)的作為Marker，輸入軟體用於分析其它蛋白的pI和Mr。
本實施例以非酶解樣品製備法共製備10對肝細胞癌患者的癌組織與相應癌旁組織的蛋白質樣品，共得到2-DE圖譜40餘幅，其中5對樣品重複3次PDQuest軟體進行了癌組織與癌旁組織的蛋白質差別表達譜分析，分析結果見以下表2。
表2、PDQuest軟體分析結果(部分)
注在T中更多＝在肝癌組織中表達上調的蛋白質點；在N中更多＝在肝癌組織中表達下調的蛋白質點；僅在T中＝僅在肝癌組織中檢測到的蛋白質點；僅在N中＝僅在非肝癌組織中檢測到的蛋白質點；T-T＝腫瘤之間的相關係數；N-N＝成對的非腫瘤之間相關係數；T-N＝腫瘤組織和成對的非腫瘤組織之間的相關係數。
在pH3-10膠條上，銀染條件下兩類組織樣品均顯示約1200個銀染點。癌組織間銀染點匹配率為0.75～0.86，癌組織與癌旁組織間銀染點匹配率為0.60～0.76，一定程度上說明兩類組織樣品取樣方法的科學性。
圖譜分析之後，本實施例又採用製備型雙向凝膠電泳，上樣量為1.5mg，總Vhrs約為90000，採用可與質譜兼容的考瑪斯亮藍法檢測，其它與分析型雙向凝膠電泳方法相同。
接下來的膠內酶解與質譜鑑定過程如下蛋白質點由質譜兼容的考瑪斯亮藍染色的製備型電泳凝膠上手工切取，在100mM NH4HCO3、30％乙腈中脫色，真空冷凍乾燥，5μl50mmol/L NH4HCO3(pH8.3，蛋白質∶胰蛋白酶＝1∶5，w/w)中4℃放置2hr，加入20μl 50mmol/L NH4HCO3(pH8.3)，37℃酶解過夜。抽提蛋白(60％乙腈、0.1％三氟乙酸)，真空冷凍乾燥。LCQTMDeca XP系統鑑定酶解好的樣品，Bioworks軟體(Thermofinnigan公司)進行資料庫搜索。
應用雙向凝膠電泳技術、膠內酶解技術、質譜技術，本實施例鑑別出了116個差別點，對應102種差別表達的蛋白質。其中，肝細胞癌癌組織中高表達或僅在其中表達的為61個差別點，對應54種蛋白質；肝細胞癌癌旁組織中高表達或僅在其中表達的為55個差別點，對應48種蛋白質。
在差異表達譜中，點SSP 2614(圖1)在癌組織中表達明顯上調，經切點、膠內酶解，點SSP 2614用1D-LC-MS/MS質譜鑑定和資料庫搜索得15個非重複肽段(共鑑定到29個肽段)與FK506結合蛋白4相符並滿足打分條件(Delta Cn值≥0.1，並且X corr值若為1個電荷≥1.9，若為2個電荷≥2.2，若為3個電荷≥3.75)，胺基酸覆蓋率為40.96％，具體結果詳見以下表3
表3、點SSP2614的質譜鑑定結果
並且，根據PDQuest軟體對已有2-DE圖譜的分析，通過比較點SSP 2614在不同肝細胞癌患者的癌組織與癌旁組織的2-DE圖譜中的表達情況，發現SSP 2614以下5例不同病例中的都是在癌組織中高表達(表4)表4、點SSP2614在癌組織中的上調表達在5例不同病例中的重複情況
因而，2-DE圖譜分析顯示點SSP2614在癌組織中的上調表達在不同肝細胞癌患者的癌組織與癌旁組織的2-DE圖譜中得到良好的重複(50％)。
實施例3、FK506結合蛋白4差異表達的免疫印跡驗證為確認FK506結合蛋白4在雙向凝膠電泳中的差異表達，取10位肝細胞癌患者的癌組織及相應癌旁組織蛋白質樣品(表1中3 17，3 27，4 2，4 5，4 8，4 9，4 15，4 18，422和4 24)，用購買的抗FK506結合蛋白4抗體進行免疫印跡分析，具體過程簡述如下每個樣品取20μg蛋白質樣品用12％SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜(購自Amersham Biosciences公司)上，一抗使用鼠抗人FK506結合蛋白4單抗(購自StressgenBiotechnologies公司，1∶1000)，室溫孵育2小時，用TBST(每升含Tris 2.42g，氯化鈉8g，Tween 20 1ml，用HCl調節pH到7.6)洗滌三次，每次5分鐘，二抗為抗鼠抗體(購自Santa Cruz公司，1∶10000)室溫孵育1小時，再用TBST洗滌三次，每次10分鐘，最後用ECL plus試劑(Amersham Biosciences)反應5分鐘後，以X-光片曝光檢測，檢測結果如圖2所示。
圖2的免疫印跡結果顯示，10對癌組織與癌旁組織中無一例外的呈現這樣的現象癌組織中FK506結合蛋白4的雜交條帶的濃度都明顯高於相應的癌旁組織；可見FK506結合蛋白4在肝細胞癌的癌組織中存在高表達，該結果與雙向凝膠電泳結果一致。
綜上所述，FK506結合蛋白4在肝細胞癌的癌組織及癌旁組織中存在明顯的差異表達，顯然與肝細胞癌的發生發展有著密切的相關性，因此，以FK506結合蛋白4作為一個蛋白質分子標記對其表達量進行檢測可以用於檢測肝細胞癌。相應的，特異性抗FK506結合蛋白4的抗體，包括各種抗FK506結合蛋白4的單克隆抗體和多克隆抗體，由於其能夠用於檢測FK506結合蛋白4的表達量，因而可以用於檢測肝癌，或者用於製備檢測肝癌的製劑或試劑盒等，這對於本領域的技術人員來說是顯而易見的。
雖然有關FK506結合蛋白4動態的生物學功能及腫瘤相關機制還有待進一步研究，但是將其作為檢測肝癌的標記物卻是肯定的。FK506結合蛋白4可作為肝細胞癌的潛在標誌，而其在胞內的生物學功能提示FK506結合蛋白4可能作為肝癌的預後分子標記和臨床治療的靶分子。
權利要求
1.一種FK506結合蛋白4的應用，其特徵在於，用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述用作檢測肝癌的蛋白質分子標記是檢測該蛋白在肝細胞組織中的表達量。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述檢測該蛋白在肝細胞組織中的表達量是檢測該蛋白在肝細胞組織中是否存在上調表達。
4.一種抗FK506結合蛋白4的抗體的應用，其特徵在於，用於製備檢測肝癌的製劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述抗FK506結合蛋白4的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗FK506結合蛋白4的抗體的應用，其特徵在於，用於製備檢測肝癌的試劑盒。
7.如權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述抗FK506結合蛋白4的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
8.一種體外檢測肝細胞組織中FK506結合蛋白4的表達是否異常的方法，其特徵在於包括以下步驟A、用特異性抗FK506結合蛋白4的抗體檢測待測肝細胞中FK506結合蛋白4的數量；B、將步驟A測得的FK506結合蛋白4的數量與正常肝組織中的FK506結合蛋白4的數量進行比較，如測得的蛋白數量高於正常值，則表示被檢測肝組織中FK506結合蛋白4的表達異常。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述所述抗FK506結合蛋白4的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發明通過篩選在肝細胞癌的癌組織和癌旁組織中存在差異表達的蛋白，找到了一種在肝細胞癌的癌組織中高表達的蛋白，免疫印跡實驗進一步證實了FK506結合蛋白4的確在肝細胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達。鑑於FK506結合蛋白4與肝細胞癌的這種相關性，該蛋白可以用作檢測肝癌的蛋白質分子標記。
文檔編號G01N33/68GK1920566SQ200510029158
公開日2007年2月28日 申請日期2005年8月26日 優先權日2005年8月26日
發明者曾嶸, 李辰, 周曉, 袁新雨 申請人:中國科學院上海生命科學研究院