4′,5-二羥基-7-[4-(n,n-二乙氨基)丁氧基]異黃酮及其製備方法和應用的製作方法
2023-07-04 06:55:06 1
專利名稱：4′,5-二羥基-7-[4-(n,n-二乙氨基)丁氧基]異黃酮及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種染料木素衍生物及其製備方法和應用，具體地說，涉及4'，5- 二 羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮及其製備方法和應用。
背景技術：
阿爾茨海默病是一種常見的老年性腦神經退行性病變，發病率較高，已成為現代 社會嚴重威脅老年人生命和健康的疾病之一。該疾病典型的病理變化包括A澱粉樣蛋白 沉積形成老年斑，神經纖維纏結，基底前腦膽鹼能功能障礙和皮層、海馬廣泛的神經元丟失 禾口突角蟲形態的改變(參見Roberson ED, Mucke L. 100 years and counting: prospects for defeating Alzheimer's disease. Science 2006;314(5800):781-4)。研究發現阿爾茨海默病患者腦內皮層及海馬區的病變比較明顯，以前腦 基底核膽鹼能神經元破壞最多。因此，通過增加乙醯膽鹼的含量，或作用於膽鹼受 體，可增強和改善中樞膽鹼能系統的功能，從而達到促智治病的目的(Baskin DS, Browning JLj Pirozzolo FJj Korporaal S， Baskin JAj Appel SH. Brain choline acetyltransferase and mental function in Alzheimer disease. Archives of Neurology 1999; 56 (9) : 1121-3)。乙醯膽鹼酯酶抑制劑就是建立在這種理論基礎上幵發 出來的臨床上用於阿爾茨海默病治療的最早最成熟的一類藥物(Taylor P. Development of acetylcholinesterase inhibitors in the therapy of Alzheimer's disease. Neurology 1998; 51 (Supplement 1)，S30 - S35)，該類藥物對輕、中度阿爾茨海默病患者 療效確切，可使其認知功能及其它症狀得到部分改善。目前多種乙醯膽鹼酯酶抑制劑已經 用於阿爾茨海默病的治療。但乙醯膽鹼酯酶抑制類藥物的療效依賴於膽鹼能神經元的完整程度，不適於重度 病人。同時，該類藥物只能提高乙醯膽鹼的含量，不能阻止中樞膽鹼能神經元的進行性退化 死亡，隨著病情的發展，中樞膽鹼能神經元進行性退化死亡，乙醯膽鹼酯酶抑制劑的藥效也 會逐漸降低。因此，尋找既能抑制乙醯膽鹼酯酶活性又能阻止中樞膽鹼能神經元退化死亡 的新型乙醯膽鹼酯酶抑制劑成為尋找阿爾茨海默病治療藥物的關鍵。β澱粉樣蛋白堆積造成了老年斑的形成，促進了炎症反應活化了神經毒性途 徑，導致了神經細胞的功能紊亂和死亡，是形成老年斑，造成神經細胞退行性病變的主 要原因之一(Riviere C, Richard Τ, Vitrac X，Merillon JM, Valls J, Monti JP. New polyphenols active on beta-amyloid aggregation. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2008; 18 (2) : 828-31 )0研究表明，雌激素能夠抑制A澱粉樣蛋白誘導 的神經細胞死亡，具有很好的神經細胞保護作用。但是雌激素在治療阿爾茨海默病時引起 雌激素相關的非神經細胞如乳腺細胞和子宮內膜細胞的增生和癌變，因此在臨床應用中受 到限制(Bang 0Y, Hong HS, Kim DH, Kim H, Boo JH, Huh K, et al. Neuroprotective effect of genistein against beta amyloid-induced neurotoxicity. Neurobiology ofDisease 2004;16(1):21_8)。染料木素(4』，5，7-三羥基異黃酮)是大豆異黃酮的主要生物活性物質，該化合物 具有較強的雌激素活性。研究表明，染料木素既能夠抑制A澱粉樣蛋白誘導的神經細胞死 亡又不會像雌激素那樣引起正常細胞的癌變，在阿爾茨海默病的治療中具有很好的應用前 景。但該化合物不具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性，其應用受到一定的限制。考慮到阿爾茨海默病的發生發展是由多個因素引起的，「multi-target-directed drug design strategy"(即一個化合物分子可以和阿爾茨海默病發生發展中的多個靶標 相作用的設計理念)被引入阿爾茨海默病治療藥物的研發中(Bolognesi ML, Cavalli A,
Valgimigli L, Bartolini Μ, Rosini Μ, Andrisano V, et al. Multi-target-directed drug design strategy: from a dual binding site acetylcholinesterase inhibitor to a trifunctional compound against Alzheimer's disease. Journal of Medicinal
Chemistry 2007; 50 (26) :6446_9)。能同時作用於多個靶點的阿爾茨海默病治療藥物已經 成為阿爾茨海默病藥物研發的趨勢。對染料木素進行化學修飾，得到同時具有雌激素活性 和乙醯膽鹼酯酶抑制活性的多作用靶點化合物將在阿爾茨海默病治療中具有很好的應用
發明內容
本發明的目的在於提供一種同時具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性和雌激素活性的染 料木素衍生物，具體為4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮，以及該化 合物的製備方法和用於製備治療阿爾茨海默病藥物的應用。本發明採用如下技術方案一種染料木素衍生物，具有式(I )所示的結構所述的染料木素衍生物4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃 酮可按如下方法合成，將染料木素與1，4_ 二溴代丁烷反應製得中間產物4'，5- 二羥 基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮，所得到的中間產物與二乙胺反應製得目的物染料木素衍生 物。所述的方法具體包括以下步驟
1)4'，5-二羥基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮的製備
染料木素(0. 27 g, 1 mmol)，1，4- 二溴丁烷(5. 4 g, 25 mmol)，K2CO 3 (0. 07 g, 0.5 mmol)溶解在60 mL的無水DMF中，40 °C _50°C下超聲反應1_2小時。反應完成後， 反應混合物冷卻到室溫，濾除不溶物後，濾液減壓蒸餾得到淡黃色固體，丙酮中重結晶得到 淺黃色針狀晶體。2)4'，5-二羥基-7-[4_(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮的製備
將化合物4'，5-二羥基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮(0.40 g, 1 mmol)溶於5 mL無 水DMF中，慢慢滴加二乙胺(0. 37 g, 5 mmol),80°C _90°C下攪拌1-2小時，反應產物慢慢 傾入IOOmL冰水混合物中，靜置過夜，濾出固體，丙酮重結晶。通過對該化合物的生物學活性進行研究，發現該化合物具有較強的乙醯膽鹼酯酶 抑制作用、與母體化合物染料木素相當的雌激素活性及對β-澱粉樣蛋白誘導的神經細胞損傷的保護作用。因此，該化合物可以作為多靶點的抗阿爾茨海默病化合物，用於防治阿爾 茨海默病藥物的製備。本發明還涉及所述的染料木素衍生物在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮作為一種多作用靶點的新 型抗阿爾茨海默病的化合物，能夠同時具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性、雌激素活性和神經細 胞保護作用，用於製備治療阿爾茨海默病的藥物中，對阿爾茨海默病具有良好的治療效果。本發明通過對染料木素進行化學修飾得到的染料木素衍生物4'，5-二羥 基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮，同時具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性和雌激素活 性，對於澱粉樣蛋白誘導的神經細胞損傷具有保護作用，可作為一種多作用靶點的新 型抗阿爾茨海默病的化合物，用於製備治療阿爾茨海默病藥物中。以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但本發明的保護範圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
具體實施例方式實施例1 :4'，5- 二羥基-7-[4_(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮)及其製備 製備染料木素衍生物4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮，包括以
下步驟
1、4'，5-二羥基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮的製備
染料木素(0. 27 g, 1 mmol)，1，4- 二溴丁烷(5. 4 g, 25 mmol)，K2CO 3 (0. 07 g, 0.5 mmol)溶解在60 mL的無水DMF中，40 °C下超聲反應1. 5小時。反應完成後，反應混 合物冷卻到室溫，濾除不溶物後，濾液減壓蒸餾得到淡黃色固體，丙酮中重結晶得到淺黃色 針狀晶體，產率86 %，熔點130-131 °C。1 H NMR (DMSO-Cl6) 1. 83 (m, 2H), 1. 94 (m, 2H)，3. 60 (t, J = 6. 2 Hz, 2H), 4. 12 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 6. 40 (d, J = 2. 0 Hz, 1H)，6. 65 (d, J = 2. 0 Hz, 1H)， 6.80 (d, J = 8.5 Hz, 2H)，7. 38 (d, J = 8. 5 Hz, 2H), 8.40 (s, 1H), 9.65 (s, 1H), 12. 95 (s, 1H). ESI-MS C19H17BrO5 [M+H]+ 405. Anal. Calcd for C19H17 BrO5: C, 56.31; H, 4. 23. Found: C, 56. 28; H, 4.27。2,4'，5-二羥基-7-[4_(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮的製備
將化合物4'，5-二羥基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮(0.40 g, 1 mmol)溶於5 mL無 水DMF中，慢慢滴加二乙胺(0. 37 g, 5 mmol)，80°C _90°C下攪拌1小時，反應產物慢慢傾 入IOOmL冰水混合物中，靜置過夜，濾出固體，丙酮重結晶，產率82 %，熔點170_171°C。1H匪R(DMS0-d6 )0.94 (t, J=7. 2 Hz, 6H):,1.52 (m, 2H),1. 72(m,2H)2. 40 (m,2H)，3.33 (t, J =7.0 Hz, 4H)，4. 10 (t, J=6. 5 Hz, 2H)，6. 39(d,J2. 0 Hz,1H)，6.64 (d, J =2. 0 Hz, 1H),6. 82 (d, J =；8. 5 Hz, 2H)，7,.39 (d,J ==8.
Hz, 2H), 8.40 (s，1H), 9.60 (s, 1H)，12.93 (s, 1H) · ESI-MS C23H27NO5 [Μ+Η]+398· Anal. calc. for C23H27 NO5 : C, 69.50; H, 6.85; N, 3. 52. Found: C, 69.60; H, 6. 79; N, 3.58。 實施例2 :染料木素衍生物4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃 酮的乙醯膽鹼酯酶抑制活性
51、4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮對電鰻乙醯膽鹼酯酶抑制
活性
酶反應在25 °C，0. 1 M pH8. 0的磷酸緩衝液中進行，總反應體積為200 μ L，內含 3. 33 mM 5，5，- 二硫-聯(2-硝基苯甲酸)20 μ L, 0. 35 U/mL乙醯膽鹼酯酶溶液20 μ L 和5. 3 mM碘化硫代乙醯膽鹼溶液20 μ L，測試該化合物溶液10 μ L，在412 nm用酶標儀 (Sunrise, Tecan, Austria)檢測5 min。樣品重複三次。以未加化合物孔的光密度值作 為100%，化合物測定孔的光密度與之比較，降低的百分率即為酶抑制率。該化合物至少測 5個濃度梯度對乙醯膽鹼酯酶的抑制活性，通過化合物濃度對數對抑制率作圖求IC5tl值(抑 制50%酶活性時化合物的濃度)。本發明測試了 4'，5- 二羥基-7-[4_(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮的乙醯膽 鹼酯酶抑制活性。該化合物具有顯著的乙醯膽鹼酯酶抑制活性，其抑制乙醯膽鹼酯酶的IC5tl 值為0.17 μ M，與陽性對照他克林相當(IC5tl值0.17 μ Μ)，而其母體化合物染料木素在該 100 μ M濃度下無明顯乙醯膽鹼酯酶抑制活性。2,4'，5- 二羥基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮抑制電鰻乙醯膽鹼酯 酶動力學
在25° C時，分別測定該化合物在0 μΜ，10 μ Μ, 20 μ M和40 μ Μ，底物濃度為50 μ Μ, 100 μ Μ, 200 μ Μ, 300 μ M 禾口 400 μ M 時 AChE 的活性。測得的數據用 Lineweaver -Burk方法雙倒數作圖，觀察酶的抑制類型。Lineweaver-Burk圖斜率對該化合物的濃度二 次作圖求Ki值(化合物與酶結合的解離常數)。雙倒數作圖顯示，該化合物是乙醯膽鹼酯 酶的非競爭性抑制劑。二次作圖求得該化合物抑制乙醯膽鹼酯酶的Ki值為0.23 士 0.01 U M (η=6)。3、計算機模擬4'，5- 二羥基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮與乙醯膽 鹼酯酶的相互作用
電鰻AChE的晶體結構從PDB資料庫中下載(PDB編號分別為1C2B)，並用Amber9軟體 對其進行能量優化。化合物的三維結構用ChemofTice 3D軟體構建與優化。用AUT0D0CK 4.0軟體進行分子對接。分子對接顯示，該化合物能夠與乙醯膽鹼酯酶的遠端陰離子結合位 點相結合，該化合物的4'-OH與遠端陰離子結合位點的S289形成氫鍵，其他部分可通過疏 水相互作用與乙醯膽鹼酯酶遠端陰離子結合位點及其附近的182、￥120、1觀2、1 292、￥333、 F334, Y337、H443殘基發生相互作用。
實施例3 染料木素衍生物4'，5- 二羥基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮 的雌激素活性
1、4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮促進雌激素依賴的MCF-7 細胞增殖的作用
MCF-7細胞以1. 5 X IO4濃度種於96孔板中。細胞培養對h貼壁後吸去原來的培養基， 更換含有5%活性炭/葡聚糖處理胎牛血清的1640培養基。繼續培養48 h使細胞中的雌激 素消耗盡。試驗分為空白對照組、藥物處理組、陽性對照組。空白組更換含5%活性炭/葡聚 糖處理胎牛血清的1640培養基；藥物處理組更換含濃度為100 μΜ,50 μ Μ, 10 μ Μ, 1 μ Μ, 0.1 μΜ,Ο. 01 μΜ,Ο. 001 μΜ,Ο. 0001 μ M和0· 00001 μ M 4'，5-二羥基-7-[4-(N, N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮的1640培養基(含5%活性炭/葡聚糖處理胎牛血清)；陽性對 照組更換含濃度為 100 μΜ，50 μ Μ, 10 μ Μ, 1 μΜ,Ο. 1 μ Μ，0.01 μ Μ，0.001 μ Μ，0.0001 μ M和0. 00001 μ M染料木素的1640培養基(含5%活性炭/葡聚糖處理胎牛血清)。培 養96 h後，MTT檢測細胞存活率。細胞增殖率(%) = AOD藥物處理/ Δ OD空白對照X 100。 實驗結果見表1。 表1 4 『，5- 二羥基-7- [4- (N, N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮對MCF-7細胞增 殖的促進作用(η=6)，細胞存活率(％)
濃度(μΜ)4'，5- 二羥基-7-[4-(N, N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮染料木素1001. 02±1. 3648. 73±7. 27500. 87±1. 4384. 23±8. 831035. 44 ±4. 99121. 51±9. 921136. 74±0. 74136. 42 ±5. 400. 1135. 83±6. 68136. 54±8. 970. 01134. 87±9. 85129. 32±13. 640. 001137. :L9±4. 75131. 84±13. 590. 0001127. 61±10. 23126. 52±18. 730.00001121. 02±6. 08131. 67±7. 48
由表1可以看出，當化合物濃度低於1 μ M時，該化合物和染料木素都能促進雌激 素依賴的MCF-7細胞增殖，即具有雌激素活性。在1 μ M時，該化合物和染料木素對MCF-7 細胞生長促進作用較強，且這兩個化合物對MCF-7細胞的增殖作用基本相當。但高於該濃 度時由於該化合物和染料木素對MCF-7細胞的細胞毒作用，存活細胞數目減少。在化合物 濃度為0. 01和0. 001 μ M時，該化合物處理的MCF-7細胞的存活率比染料木素處理的細胞 存活率略高，推測該化合物的雌激素活性強於其母體化合物染料木素。2、計算機模擬4'，5- 二羥基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮與雌激素 受體的相互作用
ER^和ERA的晶體結構從PDB資料庫中下載(PDB編號分別為2I0J和2I0G)，並用 AmberQ軟體對其進行能量優化。4'，5- 二羥基_7_[4_(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮 的三維結構用ChemofTice 3D軟體構建與優化。用AUT0D0CK 4. 0軟體進行分子對接。分 子對接顯示，該化合物與ERa和ERA都有相互作用。該化合物與ERa的結合能為-8. 18 kcal/mol遠高於其與ERA的結合能(-11.66 kcal/mol)。該化合物與ER"和ERA的解 離常數Ki分別為1.01ηΜ。因此該化合物與ERA的結合能力比ER"強約350
倍，對ERA具有高的選擇性(表2)。表2 4' ,5- 二羥基-7-[4-(N, N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮與ERσ與ERA 的相互作用的結合能與Ki值
參數ERffER^BindingEnergy-8. 18kcal/mol-11. 66kcal/molKi1. 01// M2.86nM
該化合物的4，-OH與ERA受體的N483形成氫鍵，7-0取代基上的N原子能與ERA受 體的E305形成氫鍵。該化合物的A環和7-0上連接的脂肪鏈通過疏水相互作用插入了由 M340，L339，L343，F356和L298形成的親脂的口袋中。B環的苯環通過疏水相互作用與L476 和M295相結合。 該化合物與ERα的相互作用比與ERA的相互作用要弱。該化合物通過疏水相互作用嵌入ERa由M;M3，L346, F404, M421，1424，L523組成的疏水口袋中，但是沒有較強的
氫鍵相互作用。
實施例4 4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮對澱粉樣蛋白 誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用
SH-SY5Y細胞以1 X IO4個/mL接種於多孔板，培養M h貼壁後更換含10 μ M視黃酸 (RA)的DMEM培養基。每兩天更換一次培養基，處理7天，誘導細胞分化。誘導分化的細胞，用 D-Hank』S液輕輕洗滌2次，試驗分為空白對照組、模型組、藥物處理組、陽性對照組。空白對 照組更換含10%活性炭/葡聚糖處理胎牛血清的無酚紅1640培養基；模型組加入終濃度 為15 μΜ的澱粉樣蛋白；藥物處理組在加入不同濃度的4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二 乙氨基)丁氧基]異黃酮預孵3 h後加入15 μΜ 澱粉樣蛋白；陽性對照組在加入雌激 素2 ηΜ或染料木素1 nM 3 h後加入澱粉樣蛋白。各處理組細胞培養72 h後用MTT 法檢測細胞存活率。實驗結果見表3。 表3 4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮對β-澱粉樣蛋 白誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用
權利要求
1. 一種具有式(I)所示結構的染料木素衍生物4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨 基)丁氧基]異黃酮，
2.—種權利要求1所述的染料木素衍生物的製備方法，其特徵在於將染料木素與1， 4-二溴代丁烷反應製得中間產物4'，5-二羥基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮，所得到的中 間產物與二乙胺反應製得4'，5- 二羥基-7-[4-(N，N- 二乙氨基)丁氧基]異黃酮。
3.根據權利要求2所述的染料木素衍生物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)4'，5-二羥基-7-(4-溴丁氧基)異黃酮的製備染料木素0.27 g，l，4- 二溴丁烷5.4 g,K2CO 3 0. 07 g溶解在60 mL的無水DMF中， 40 0C -50°C下超聲反應1-2小時；反應完成後，反應混合物冷卻到室溫，濾除不溶物後，濾 液減壓蒸餾得到淡黃色固體，丙酮中重結晶得到淺黃色針狀晶體；2)4'，5-二羥基-7-[4-(N，N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮的製備將步驟1)得到的化合物4'，5- 二羥基-7- (4-溴丁氧基)異黃酮0. 40 g溶於5 mL 無水DMF中，慢慢滴加二乙胺0. 37 g，80°C _90°C下攪拌1_2小時，反應產物慢慢傾入IOOmL 冰水混合物中，靜置過夜，濾出固體，丙酮重結晶。
4.一種權利要求1所述的染料木素衍生物在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的染料木素衍生物在製備治療阿爾茨海默病藥物中的應用， 其特徵在於所述的染料木素衍生物具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性、雌激素活性和神經細胞保 護作用。
全文摘要
本發明公開了一種染料木素衍生物4′,5-二羥基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮，及其製備方法和應用。通過對染料木素進行化學修飾所得到的4′,5-二羥基-7-[4-(N,N-二乙氨基)丁氧基]異黃酮，同時具有乙醯膽鹼酯酶抑制活性、雌激素活性和神經細胞保護作用；作為一種多作用靶點的化合物可用於製備抗阿爾茨海默病的藥物。
文檔編號A61P25/28GK102127046SQ20101057385
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月6日 優先權日2010年12月6日
發明者史大華, 吳俊華, 宴志強, 張麗娜, 王玉蓉, 譚仁祥 申請人:南京大學