使用n-乙醯葡糖胺轉移酶的o-聯糖基化的製作方法

2023-07-03 23:09:56

專利名稱：使用n-乙醯葡糖胺轉移酶的o-聯糖基化的製作方法
相關申請的交叉引用
本申請根據35U.S.C.§119(e)要求2007年6月4日提交的美國臨時專利申請號60/941,926的優先權，所述專利申請通過提及而以其整體合併入本文以用於所有目的。
發明領域 本發明涉及通過糖基化來進行肽修飾的領域。具體地，本發明涉及包含聚合物修飾基團的肽綴合物，以及通過使用糖基化序列來製備經糖基化的肽的方法，所述糖基化序列被GlcNAc轉移酶識別為底物。

背景技術：
施用糖基化的和非糖基化的多肽以引起特定生理學應答是醫學領域中公知的。例如，純化的和重組的hGH都用於治療與hGH缺乏相關的病狀和疾病，如兒童中的侏儒症。其他例子涉及已知具有抗病毒活性的幹擾素，以及刺激白細胞產生的粒細胞集落刺激因子。
缺少可用於生產具有野生型糖基化模式的多肽的表達系統已經限制了將此類多肽用作治療劑。本領域已知，不正確或不完全糖基化的肽可能是免疫原性的，這導致該肽的中和和/或變態反應的形成。重組產生的糖肽的其他缺點包括亞最佳的功效和從血流中的快速清除。
一種解決在生產經糖基化的肽治療劑方面所固有的問題的方法是在其表達後在體外修飾這些肽。多肽的表達後體外修飾已經被用於修飾現有的聚糖結構和將糖基部分附著至非糖基化的胺基酸殘基。已經可以廣泛選擇重組真核生物糖基轉移酶，這使得在體外酶促合成具有定製的糖基化模式和糖基結構的哺乳動物糖綴合物成為可能。參見例如，美國專利號5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及WO/9831826；US2003180835；和WO 03/031464。
此外，多肽已經用一種或多種非糖修飾基團例如水溶性聚合物來進行衍生化。已經被綴合至肽的示例性聚合物是聚(乙二醇)(「PEG」)。PEG-綴合(其增加多肽的分子大小)已被用於降低免疫原性和延長PEG-綴合的多肽保持在循環中的時間。例如，Davis等人的美國專利號4,179,337公開了偶聯至聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)的非免疫原性多肽，如酶和肽-激素。
將PEG和其衍生物附著至多肽的主要方法涉及通過胺基酸殘基的非特異性鍵合(參見例如，美國專利號4,088,538、美國專利號4,496,689、美國專利號4,414,147、美國專利號4,055,635和PCT WO87/00056)。另一種PEG-綴合方法涉及糖肽的糖基殘基的非特異性氧化(參見例如，WO 94/05332)。
在這些非特異性方法中，PEG以隨機且非特異性的方式加入到在多肽主鏈上的反應性殘基上。該方法具有顯著缺點，包括終產物缺少同質性，和經修飾的多肽的生物學或酶活性可能會降低。因此，非常需要用於治療性肽的衍生化方法，其導致形成經特異性地標記的、可容易地表徵的和基本上同質的產物。
在體外通過使用酶可以產生經特異性地修飾的、同質的肽治療劑。不像用於將修飾基團(例如合成的聚合物)附著至肽的非特異性方法，基於酶的合成具有區域選擇性和立體選擇性的優點。用於合成經標記的肽的兩種主要類別的酶是糖基轉移酶(例如，唾液酸轉移酶、寡糖基轉移酶、N-乙醯葡糖胺轉移酶)和糖苷酶。這些酶可以用於特異地附著糖，該糖可以隨後被改變以包含修飾基團。備選地，糖基轉移酶和經修飾的糖苷酶可以用於將經修飾的糖直接轉移至肽主鏈(參見例如，美國專利6,399,336，和美國專利申請公開20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，它們各自通過提及而合併入本文)。組合了化學和酶促方法的方法也是已知的(參見例如，Yamamoto等人，Carbohydr.Res.305415-422(1998)，和美國專利申請公開20040137557，其通過提及而合併入本文)。
以幾種方法將碳水化合物連接至糖肽，其中N-連接至天冬醯胺和O-連接至絲氨酸和蘇氨酸對於重組糖蛋白治療劑是最相關的。在所有真核細胞的分泌型和細胞表面結合型糖蛋白上均發現O-聯糖基化。在通過O-聯糖基化產生的結構中具有很大的多樣性。通過存在於高爾基體中的數百種酶(糖基轉移酶)的催化活性而產生此類聚糖。多樣性存在於聚糖結構水平上和存在於O-聚糖與蛋白質主鏈附著的位置中。儘管具有高度的潛在多樣性，但是顯然O-聯糖基化是受高度調控的過程，其在多細胞生物中顯示出高度的保守性。
不幸的是，並不是所有的多肽都包含O-聯糖基化序列作為其胺基酸序列的一部分。此外，現有的糖基化序列對於將修飾基團附著至多肽可能並不合適。例如，此類修飾可以引起經修飾的多肽的生物活性的不希望的降低。因此，本領域需要允許精確地產生糖基化序列和能夠精確地指導對於那些位點的修飾的方法。本發明解決了這些和其他需求。
發明概述 本發明涉及多肽，優選地具有治療價值的多肽的糖基化和修飾，所述多肽包含O-聯糖基化序列，所述O-聯糖基化序列是葡糖胺轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)的底物。在一個實施方案中，所述多肽是包含O-聯糖基化序列的非天然存在的多肽，所述O-聯糖基化序列在相應的親本多肽中不存在或者在相應的親本多肽中的相同位置處不存在。
本發明描述了如下發現酶促糖綴合(glycoconjugation)和糖PEG化反應可以特異地靶向多肽內的某些O-聯糖基化序列。特別地，將葡糖胺部分(其任選地用聚合物修飾基團來進行衍生化)酶促轉移至多肽的胺基酸殘基。該胺基酸殘基是O-聯糖基化序列的一部分，所述O-聯糖基化序列被酶例如O-GlcNAc轉移酶(OGT)(在本文中也稱為GlcNAc轉移酶)識別為底物。
本發明的一個優點是，可以將經修飾的糖(其優選地是經修飾的葡糖胺部分)直接共價附著至多肽的胺基酸側鏈。出乎意料地，發明人發現，在該方法中所使用的某些糖基轉移酶不僅能將糖基殘基直接添加至多肽主鏈，而且最重要地，顯示出顯著的對於糖基供體分子(其被這些酶用作底物)的耐受性。例如，某些GlcNAc轉移酶能夠將葡糖胺部分(其用聚合物修飾基團進行修飾)直接添加至所述多肽的胺基酸殘基。因而，在用經修飾的糖殘基進行糖綴合之前多肽的糖基化不是必需的，然而是可能的。
本發明的另一個優點是，催化糖綴合反應(例如，糖PEG化)的糖基轉移酶可以使用細菌表達系統來產生。在特別優選的實施方案中，糖基轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)在大腸桿菌(E.coli)中表達。由於這些和其他優點，本發明提供了多肽綴合物的時間和成本有效益的生產途徑，所述多肽綴合物包含修飾基團，例如水溶性聚合物。
包含O-聯糖基化序列的多肽 在一個實施方案中，本發明的O-糖基化序列存在於親本多肽(例如，野生型多肽)中。在另一個實施方案中，通過突變將O-聯糖基化序列引入到親本多肽中。因此，本發明提供了非天然存在的多肽，其對應於親本多肽並且具有包含至少一個本發明的O-聯糖基化序列的胺基酸序列，所述O-聯糖基化序列在所述相應的親本多肽中不存在或者在所述相應的親本多肽中的相同位置處不存在。在一個實例中，每個O-聯糖基化序列是GlcNAc轉移酶的底物。在另一個實例中，O-聯糖基化序列包含作為選自式(I)-(VI)的成員的胺基酸序列 (B1)aP(B2)bUS(B3)c(I) (B1)aP(B2)bUT(B3)c(II) (B4)dPSZ(B5)e (III) (B4)dPTZ(B5)e (IV) (B6)fS(B7)gP(B8)h (V) (B6)fT(B7)gP(B8)h (VI)。
在式(I)至(VI)中，b和g是選自0至2的整數，並且a、c、d、e、f和h是選自0至5的整數。T是蘇氨酸，S是絲氨酸，P是脯氨酸，U是選自V、S、T、E、Q和不帶電荷的胺基酸的胺基酸，並且Z是選自P、E、Q、S、T和不帶電荷的胺基酸的胺基酸。B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8各自是獨立地選自胺基酸的成員。
此外，本發明提供了分離的核酸，其編碼本發明的非天然存在的多肽。本發明進一步提供了表達載體，以及包含上述核酸的細胞。本發明進一步提供了非天然存在的多肽的文庫，其中所述文庫的每個成員包含至少一個本發明的O-聯糖基化序列。還提供了製備和使用此類文庫的方法。
多肽綴合物 本發明進一步提供了非天然存在的多肽和聚合物修飾基團之間的共價綴合物，其中所述非天然存在的多肽對應於親本多肽並且具有包含外源O-聯糖基化序列的胺基酸序列，所述外源O-聯糖基化序列在所述相應的親本多肽中不存在或者在所述相應的親本多肽中的相同位置處不存在。在一個實例中，所述O-聯糖基化序列是GlcNAc轉移酶的底物並且包含至少一個具有羥基的胺基酸殘基。所述聚合物修飾基團通過糖基連接基團在所述O-聯糖基化序列的所述羥基處共價附著至所述多肽。所述親本多肽優選地為治療性多肽。
在示例性的實施方案中，本發明的多肽綴合物包含根據式(VII)的部分，其中q可以是0或1
在式(VII)中，w是選自0和4的整數。在一個實例中，w選自0和1。AA-O是從具有被羥基取代的側鏈的胺基酸(例如，絲氨酸或蘇氨酸)衍生而得的部分，其中所述胺基酸位於本發明的O-聯糖基化序列內。當q為1時，所述胺基酸是所述多肽的內部胺基酸，和當q為0時，所述胺基酸是N-末端或C-末端胺基酸。Z＊是選自葡糖胺部分、葡糖胺模擬部分、包含葡糖胺部分的寡糖和包含葡糖胺模擬部分的寡糖的成員。X＊是選自聚合物修飾基團和包含聚合物修飾基團的糖基連接基團的成員。在一個實例中，Z＊是葡糖胺部分(例如，GlcNAc或GlcNH)，和X＊是聚合物修飾基團。
本發明還提供了包含本發明的共價綴合物和可藥用載體的藥物組合物。
經修飾的糖核苷酸 本發明進一步提供了具有根據式(XI)的結構的化合物
其中，每個Q是獨立地選自H、負電荷和鹽抗衡離子(例如，陽離子)的成員。E是選自NH、O、S和CH2的成員。E1是選自O和S的成員。G是選自-CH2-和C＝A的成員，其中A是選自O、S和NR27的成員，其中R27是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員。R21、R22、R23和R24是獨立地選自H、OR25、SR25、NR25R26、NR25S(O)2R26、S(O)2NR25R26、NR25C(O)R26、C(O)NR25R26、C(O)OR25、醯基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員，其中R25和R26是獨立地選自H、醯基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員。在一個示例性的實施方案中，R21、R22、R23、R24和R27中的至少一個包含聚合物修飾基團。
形成多肽綴合物的方法 本發明進一步提供了形成多肽和聚合物修飾基團之間的共價綴合物的方法，其中所述多肽包含O-聯糖基化序列(例如，外源O-聯糖基化序列)，所述O-聯糖基化序列包含有著具有羥基的側鏈的胺基酸殘基。所述O-聯糖基化序列是GlcNAc轉移酶的底物。所述聚合物修飾基團通過葡糖胺連接基團共價連接至所述多肽，所述葡糖胺連接基團插入在所述多肽和所述修飾基團之間並且共價連接至所述多肽和所述修飾基團。所述方法包括下述步驟(i)在GlcNAc轉移酶存在下，使所述多肽與包含共價連接至聚合物修飾基團的葡糖胺部分的葡糖胺供體相接觸，這在對於所述GlcNAc轉移酶將所述葡糖胺部分從所述葡糖胺供體轉移到所述O-聯糖基化序列的所述羥基上來說足夠的條件下進行。示例性的葡糖胺部分包括GlcNAc和GlcNH。
根據下面的詳細描述，本發明的另外方面、優點和目的將會是顯而易見的。
附圖簡述

圖1是具有登錄號O15294的人OGT的示例性胺基酸序列(SEQID NO1)。
圖2是重組人OGT Δ176的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3是重組人OGT Δ182的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO3)。
圖4是重組人OGT Δ182-His8的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖5是重組人OGT Δ382的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO5)。
圖6是重組人OGT Δ382-His8的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO6)。
圖7是重組His7-人OGT Δ382的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO7)。
圖8是重組的帶有MBP標籤的人OGT Δ182的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO8)。
圖9是重組的帶有MBP標籤的人OGT Δ382的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO9)。
圖10是因子VIII的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO10)。
圖11是因子VIII的示例性胺基酸序列(SEQ ID NO11)。
圖12是示例性的因子VIII胺基酸序列，其中除去了B-結構域(胺基酸殘基741-1648)(SEQ ID NO12)。本發明的示例性多肽包括其中缺失的B-結構域被至少一個胺基酸殘基(B-結構域替代序列)替代的那些多肽。在一個實施方案中，在Arg740和Glu1649之間的B-結構域替代序列包含至少一個O-聯或N-聯糖基化序列。
圖13是B-結構域缺失的因子VIII的示例性胺基酸序列(SEQ IDNO13)。
圖14是B-結構域缺失的因子VIII的示例性胺基酸序列(SEQ IDNO14)。
圖15是B-結構域缺失的因子VIII的示例性胺基酸序列(SEQ IDNO15)。
圖16展示了人OGT構建體的細菌表達。通過SDS-PAGE來分析總細胞裂解物。重組OGT加有框。第一泳道分別代表分子量標準參照物，和第二泳道留空。圖16A在W3110和trxB gor supp突變型大腸桿菌中表達不帶標籤的人OGT Δ176(SEQ ID NO2)(圖16A，分別為泳道3和4)。圖16B在W3110和trxB gor supp突變型大腸桿菌中表達在C-末端帶有His8標籤的OGT Δ382(SEQ ID NO6)(圖16B，分別為泳道3和4)、帶有His8標籤的OGT Δ182(SEQ IDNO4，圖16B，泳道7)和在N-末端帶有His7標籤的OGT Δ382(SEQID NO7，圖16B，泳道5和6)。
發明詳述 I.縮寫 PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，巖藻糖或巖藻糖基；Gal，半乳糖或半乳糖基；GalNAc，N-乙醯半乳糖胺或N-乙醯半乳糖胺基；Glc，葡萄糖或葡萄糖基；GlcNAc，N-乙醯葡糖胺或N-乙醯葡糖胺基；GlcNH，葡糖胺或葡糖胺基；Man，甘露糖或甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺或甘露糖胺基乙酸酯；Sia，唾液酸或唾液酸基；和NeuAc，N-乙醯神經胺(N-acetylneuramine)或N-乙醯神經胺基(N-acetylneuraminyl)。
II.定義 除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語一般具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。通常，在細胞培養、分子遺傳學、有機化學以及核酸化學和雜交方面的本文所使用的命名以及實驗室操作程序是本領域熟知並通常採用的那些。標準技術用於核酸和肽合成。所述技術和操作程序通常根據本領域的常規方法和本文件中各處所提供的各種一般參考文獻(通常參見Sambrook等人，MOLECULAR CLONINGA LABORATORY MANUAL，第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，其通過提及而合併入本文)來進行。下面所描述的分析和合成有機化學方面的本文所使用的命名以及實驗室操作程序是本領域熟知並通常採用的那些。標準技術或其修改形式用於化學合成和化學分析。
本文所描述的所有寡糖以下列方式進行描述非還原糖的名稱或縮寫(即Gal)，接著是糖苷鍵的構型(α或β)、環鍵(1或2)、參與該鍵的還原糖的環位置(2、3、4、6或8)，然後是還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每種糖優選是吡喃糖。標準糖生物學命名法的綜述參見例如Essentials of Glycobiology Varki等人(編輯)，CSHL Press(1999)。
寡糖被認為具有還原端和非還原端，不論在還原端處的糖是否實際上為還原糖。
術語「糖基部分」是指衍生自糖殘基的任何基團。「糖基部分」包括單糖和寡糖並且包括「糖基模擬部分」。
如本文所使用的，術語「糖基模擬部分」是指結構上類似於糖基部分(例如，己糖或戊糖)的部分。「糖基模擬部分」的實例包括這樣的部分，其中糖基部分的糖苷氧原子或環氧原子或者兩者已經用鍵或另一原子(例如，硫)，或者另一部分例如含碳基團(例如，CH2)或含氮基團(例如，NH)替代。實例包括取代或未取代的環己基衍生物、環硫醚、環胺以及包含硫代糖苷鍵的部分，等等。「糖基模擬部分」的其他實例包括具有雙鍵的環結構，以及其中環碳原子之一攜帶羰基或另一種雙鍵取代基(例如腙部分)的環結構。在一個實例中，「糖基模擬部分」在酶催化的反應中轉移到多肽的胺基酸殘基或糖肽的糖基部分上。這可以例如通過下列方式來完成用離去基團例如滷素來活化「糖基模擬部分」。在一個優選的實施方案中，糖核苷酸的糖部分構成了糖基模擬部分，並且通過使用糖基轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)將該糖基模擬部分(其任選地用修飾基團來進行衍生化)從糖核苷酸(例如，經修飾的糖核苷酸)酶促轉移到多肽的胺基酸上。術語「糖基模擬部分」中的詞彙「糖基」可以用描述了具體的糖部分的詞彙來替代，並且所得的術語是指在結構上類似於該具體的糖部分的部分。例如，「GlcNAc模擬部分」是指類似於N-乙醯葡糖胺部分的「糖基模擬部分」。
術語「核酸」或「多核苷酸」指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非特別限制，該術語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述核酸具有與參考核酸相似的結合性質並且以與天然存在的核苷酸相似的方式被代謝。除非另外指出，特定的核酸序列還含蓄地包括其經保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互補序列以及明確指出的序列。具體地，可以通過下列方式來實現簡併密碼子取代產生其中一個或多個所選擇的(或所有)密碼子的第三個位置被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列(Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。術語核酸可以與基因、cDNA和由基因所編碼的mRNA互換使用。
術語「基因」是指參與產生多肽鏈的DNA區段。它可以包括編碼區之前和之後的區域(前導區和非轉錄尾區)以及各編碼區段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。
術語「分離的」，當應用於核酸或蛋白質時，表示該核酸或蛋白質基本上沒有在天然狀態下其所結合的其他細胞組分。其優選處於同質狀態，儘管它可以在無水或含水溶液中。通常使用分析化學技術例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定純度和同質性。為存在於製劑中的主要種類的蛋白質是基本上經純化的。具體地，分離的基因是與位於該基因側翼並且編碼除目的基因之外的其他蛋白質的開放閱讀框相分開的。術語「純化的」表示，核酸或蛋白質在電泳凝膠中產生基本上一條帶。具體地，它表示，該核酸或蛋白質為至少85％純的，更優選至少95％純的，和最優選至少99％純的。
術語「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸，以及以類似於天然存在的胺基酸的方式發揮功能的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及後來進行修飾的那些胺基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構(即，結合至氫、羧基、氨基和R基團的α碳)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或經修飾的肽主鏈，但是保留了與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。「胺基酸模擬物」是指這樣的化合物，所述化合物具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構但是以類似於天然存在的胺基酸的方式發揮功能。
術語「不帶電荷的胺基酸」是指不包含酸性官能團(例如，-COOH)或鹼性官能團(例如，-NH2)的胺基酸。鹼性胺基酸包括賴氨酸(K)和精氨酸(R)。酸性胺基酸包括天冬氨酸(D)和穀氨酸(E)。不帶電荷的胺基酸包括，例如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)，以及包含-OH或-SH基團的那些胺基酸(例如，蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、酪氨酸(Y)和半胱氨酸(C))。
本領域中有多種已知的方法允許在多肽鏈中以位點特異性方式摻入非天然胺基酸衍生物，參見例如，WO 02/086075。
在本文中，胺基酸可以通過公知的三字母符號或者通過IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission所推薦的單字母符號來表示。同樣地，核苷酸可以通過它們的所公認的單字母代碼來表示。
「經保守修飾的變體」應用於胺基酸和核酸序列。關於特定核酸序列，「經保守修飾的變體」是指編碼相同或基本上相同的胺基酸序列的那些核酸，或者當核酸不編碼胺基酸序列時，是指基本上相同的序列。由於遺傳密碼的簡併性，大量功能上相同的核酸編碼任意給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，在由密碼子指定了丙氨酸的每個位置處，該密碼子可以被改變成任何所描述的相應密碼子而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是「沉默變異」，其是經保守修飾的變異中的一個種類。編碼多肽的本文中的每個核酸序列也描述了該核酸的每種可能的沉默變異。技術人員將會認識到，核酸中的每個密碼子(除了AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密碼子)之外)可以被修飾以產生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變異暗含在每個所描述的序列中。
對於胺基酸序列，技術人員將會認識到，對核酸、肽、多肽或蛋白質序列的獨個取代、缺失或添加(其在所編碼的序列中改變、添加或刪除單個胺基酸或者小百分比的胺基酸)是「經保守修飾的變體」，其中該改變導致胺基酸被化學上相似的胺基酸取代。提供了功能上相似的胺基酸的保守取代表是本領域公知的。此類經保守修飾的變體是除本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因以外進一步的，但不排除本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因。
下面的八組中的每一組包含相互作為保守取代的胺基酸 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)； 2)天冬氨酸(D)、穀氨酸(E)； 3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)； 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)； 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)； 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)；和 8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M) (參見例如，Creighton，Proteins(1984))。
「肽」是指這樣的聚合物，其中單體是胺基酸並且通過醯胺鍵連接在一起。本發明的肽的大小可以例如從兩個胺基酸到數百或數千個胺基酸變化。備選地，較大的肽被稱作「多肽」或「蛋白質」。另外，非天然胺基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸、高精氨酸和高苯丙氨酸也包括在內。不由基因編碼的胺基酸也可以用於本發明。此外，進行修飾以包括反應性基團、糖基化序列、聚合物、治療性部分、生物分子等等的胺基酸也可以用於本發明。在本發明中所使用的所有胺基酸可以是D-或L-異構體。L-異構體通常是優選的。另外，其他肽模擬物(peptidomimetics)也可用於本發明。如本文所使用的，「肽」是指糖基化的和未糖基化的肽。還包括被表達該肽的系統不完全糖基化的肽。一般性的綜述可參見，Spatola，A.F.，CHEMISTRY ANDBIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)。
在本申請中，胺基酸殘基根據它們與多肽的N-末端胺基酸(例如，N-末端甲硫氨酸)(其編號為「1」)的相對位置來進行編號(通常以上標)。N-末端胺基酸可以是甲硫氨酸(M)，其編號為「1」。如果多肽的N-末端不以甲硫氨酸開始，那麼與每個胺基酸殘基相關的編號可以容易地進行調整以反映N-末端甲硫氨酸的缺失。應當理解，示例性多肽的N-末端可以以或不以甲硫氨酸開始。
術語「野生型多肽」是指天然存在的多肽，其任選地和天然地包含本發明的O-聯糖基化序列。
術語「親本多肽」是指任何多肽，其胺基酸序列不包含本發明的「外源」O-聯糖基化序列。然而，「親本多肽」可以包含一個或多個天然存在的(內源的)O-聯糖基化序列。例如，野生型多肽可以包含O-聯糖基化序列PVS。術語「親本多肽」是指任何多肽，包括野生型多肽、融合多肽、合成多肽、重組多肽(例如，治療性多肽)以及其任何變體(例如，之前通過一次或多次胺基酸的替代、胺基酸的插入、胺基酸的刪除等等進行了修飾)，只要此類修飾不等同於形成本發明的O-聯糖基化序列。在一個實施方案中，親本多肽的胺基酸序列或者編碼親本多肽的核酸序列進行了定義並可被公眾獲得。例如，親本多肽是野生型多肽並且該野生型多肽的胺基酸序列或核苷酸序列是公眾可獲得的蛋白質資料庫(例如，EMBL核苷酸序列資料庫、NCBIEntrez、ExPasy、Protein Data Bank等等)的一部分。在另一實例中，親本多肽不是野生型多肽但是被用作治療性多肽(即，經批准的藥物)，並且公眾可在科學出版物或專利中獲得此類多肽的序列。在另外一個實例中，親本多肽的胺基酸序列或編碼親本多肽的核酸序列在本發明時可以被公眾獲得。在一個實施方案中，親本多肽是更大結構的一部分。例如，親本多肽對應於抗體的恆定區(Fc)或CH2結構域，其中這些結構域可以是完整抗體的一部分。在一個實施方案中，親本多肽不是具有未知序列的抗體。
術語「突變型多肽」或「多肽變體」是指這樣的多肽形式，其中所述多肽的胺基酸序列與它的對應的野生型形式、天然存在的形式或任何其他親本形式不同。突變型多肽可以含有一個或多個突變，例如，替代、插入、缺失，等等，這導致形成突變型多肽。
術語「非天然存在的多肽」或「序列肽段多肽(sequonpolypeptide)」是指這樣的多肽變體，其在它的胺基酸序列中包含至少一個本發明的「外源O-聯糖基化序列」(在相應的野生型形式或任何其他親本形式中不存在或者在相應的野生型形式或任何其他親本形式中的相同位置處不存在的O-聯糖基化序列)，但是也可以包含一個或多個內源(例如，天然存在的)O-聯糖基化序列。「非天然存在的多肽」可以包含一個或多個本發明的O-聯糖基化序列，並且另外還可以包含其他突變，例如替代、插入、刪除、截短等。
術語「外源O-聯糖基化序列」是指被引入親本多肽(例如，野生型多肽)的胺基酸序列中的本發明的O-聯糖基化序列，其中所述親本多肽不包含O-聯糖基化序列或者在不同的位置處包含O-聯糖基化序列。在一個實例中，將O-聯糖基化序列引入不具有O-聯糖基化序列的野生型多肽中。在另一實例中，野生型多肽天然地在第一個位置處包含第一個O-聯糖基化序列。將第二個O-聯糖基化序列在第二個位置處引入該野生型多肽中。該修飾導致在第二個位置處具有「外源O-聯糖基化序列」的多肽。可以通過突變來將外源O-聯糖基化序列引入親本多肽中。備選地，可以通過化學合成來製備具有外源O-聯糖基化序列的多肽。
術語「對應於親本多肽」(或者該術語的語法變化形式)用於描述本發明的序列肽段多肽，其中該序列肽段多肽的胺基酸序列與對應的親本多肽的胺基酸序列之間的差異僅僅在於存在有至少一個本發明的外源O-聯糖基化序列。通常，序列肽段多肽和親本多肽的胺基酸序列顯示出高的同一性百分比。在一個實例中，「對應於親本多肽」表示，序列肽段多肽的胺基酸序列與親本多肽的胺基酸序列具有至少約50％同一性、至少約60％同一性、至少約70％同一性、至少約80％同一性、至少約90％同一性、至少約95％同一性或至少約98％同一性。在另一實例中，編碼序列肽段多肽的核酸序列與編碼親本多肽的核酸序列具有至少約50％同一性、至少約60％同一性、至少約70％同一性、至少約80％同一性、至少約90％同一性、至少約95％同一性或至少約98％同一性。
術語「在親本多肽中引入(或加入等等)糖基化序列(例如，O-聯糖基化序列)」(或其語法變化形式)，或者「修飾親本序列」以包含糖基化序列(或者其語法變化形式)，並不必需表示親本多肽是這種轉化的物理起始材料，而是表示親本多肽提供了用於製備另一多肽的指導性胺基酸序列。在一個實例中，「在親本多肽中引入糖基化序列」表示，通過合適的突變來修飾親本多肽的基因以產生編碼序列肽段多肽的核苷酸序列。在另一實例中，「在親本多肽中引入糖基化序列」表示，使用親本多肽序列作為指導，在理論上設計所得的多肽。然後通過化學或其他手段來產生所設計的多肽。
術語「先導多肽」是指包含至少一個本發明的O-聯糖基化序列的非天然存在的多肽，其可以被有效地糖基化或糖PEG化。對於適合作為先導多肽的本發明的多肽，當經歷合適的反應條件時，此類多肽被糖基化或糖PEG化，其反應產率為至少約50％，優選至少約60％，更優選至少約70％，和更加優選約80％、約85％、約90％或約95％。最優選的是這樣的本發明的先導多肽，其可以以大於95％的反應產率被糖基化或糖PEG化。在一個優選的實施方案中，先導多肽以這樣的方式被糖基化或糖PEG化，即每個O-聯糖基化序列中僅一個胺基酸殘基被糖基化或糖PEG化(單糖基化)。
術語「文庫」是指不同多肽的集合，每個多肽對應於共同的親本多肽。文庫中的每個多肽種類被稱作文庫的成員。優選地，本發明的文庫代表了多肽的集合，其具有足夠的數目和多樣性以提供從中鑑定出先導多肽的群體。文庫包括至少兩種不同的多肽。在一個實施方案中，文庫包括約2至約10個成員。在另一個實施方案中，文庫包括約10至約20個成員。在另外一個實施方案中，文庫包括約20至約30個成員。在進一步的實施方案中，文庫包括約30至約50個成員。在另一個實施方案中，文庫包括約50至約100個成員。在另外一個實施方案中，文庫包括超過100個成員。文庫的成員可以是混合物的一部分或者可以相互分離。在一個實例中，文庫的成員為混合物的一部分，該混合物任選地包括其他組分。例如，至少兩種序列肽段多肽存在於一定體積的細胞培養液中。在另一實例中，文庫的成員各自分開地表達並且任選地進行分離。分離的序列肽段多肽可以任選地包含在多孔容器中，其中每個孔含有不同類型的序列肽段多肽。
術語本發明的「CH2」結構域意在描述免疫球蛋白重鏈恆定CH2結構域。在定義免疫球蛋白CH2結構域方面，參考一般的免疫球蛋白，特別是由Kabat E.A.(1978)Adv.Protein Chem.321-75描述的應用於人IgG1的免疫球蛋白結構域結構。
術語「包含CH2結構域的多肽」或「包含至少一個CH2結構域的多肽」意在包括完整的抗體分子、抗體片段(例如，Fc結構域)或融合蛋白(其包括等同於免疫球蛋白CH2區的區域)。
術語「多肽綴合物」是指這樣的本發明種類，其中多肽用本文所示的糖部分(例如，經修飾的糖)進行糖綴合。在代表性的實例中，所述多肽是具有在相應的野生型或親本多肽中不存在的O-聯糖基化序列的非天然存在的多肽。
如本文所使用的，「接近脯氨酸殘基」或「與脯氨酸殘基接近」是指與脯氨酸殘基相距小於約10個胺基酸，優選與脯氨酸殘基相距小於約9、8、7、6或5個胺基酸，更優選與脯氨酸殘基相距小於4、3、2或1個殘基的胺基酸。「接近脯氨酸殘基」的胺基酸可以在脯氨酸殘基的C-或N-末端側上。
術語「唾液酸」是指九碳羧基化糖家族中的任何成員。唾液酸家族中的最常見的成員是N-乙醯神經氨酸(2-酮-5-乙醯氨基-3，5-二脫氧-D-甘油基-D-galactononulo吡喃糖-1-酮酸(通常簡寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA)。該家族的第二個成員是N-羥乙醯-神經氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙醯基被羥基化。第三個唾液酸家族成員是2-酮-3-脫氧-nonulosonic酸(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。還包括9-取代的唾液酸，例如9-O-C1-C6醯基-Neu5Ac，如9-O-乳醯基-Neu5Ac或9-O-乙醯基-Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮基-9-脫氧-Neu5Ac。關於唾液酸家族的綜述，參見例如，Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化操作程序中唾液酸化合物的合成和使用公開在1992年10月1日公布的國際申請WO 92/16640中。
術語「葡糖胺」或「葡糖胺部分」是指這樣的任何糖基或糖基模擬部分，其中環取代基的相對立體化學與葡萄糖或N-乙醯葡糖胺中的相同。示例性的「葡糖胺部分」由式(VIIIa)來表示
其中，G、E、E1、R21、R22、R23和R24如下文對於式(VIII)所定義的。式(VIIIa)包括經修飾的和未修飾的葡糖胺類似物。在式(VIIIa)中，R21、R22、R23、R24和R27任選地包含修飾基團(例如，聚合物修飾基團)。環取代基R22、R23和R24中的一個或多個可以是滷素。優選的葡糖胺部分包括GlcNAc和GlcNH，其任選地用聚合物修飾基團進行修飾。
如本文所使用的，術語「經修飾的糖」是指天然或非天然存在的碳水化合物。在一個實施方案中，使用本發明的方法，將「經修飾的糖」酶促添加到多肽的胺基酸或者糖基殘基上。經修飾的糖選自許多酶底物，包括但不限於糖核苷酸(單、二和三磷酸)、活化的糖(例如，糖基滷化物、糖基甲磺酸酯)和既未活化也非核苷酸的糖。「經修飾的糖」用「修飾基團」來共價官能化。可用的修飾基團包括，但不限於，聚合物修飾基團(例如，水溶性聚合物)、治療性部分、診斷性部分、生物分子等等。在一個實施方案中，修飾基團不是天然存在的糖基部分(例如，天然存在的多糖)。修飾基團優選是非天然存在的。在一個實例中，「非天然存在的修飾基團」是聚合物修飾基團，其中至少一個聚合物部分是非天然存在的。在另一實例中，非天然存在的修飾基團是經修飾的碳水化合物。選擇用修飾基團進行官能化的位置，從而使得它不妨礙「經修飾的糖」被酶促添加至多肽。「經修飾的糖」也指任何糖基模擬部分，其用修飾基團官能化並且是天然的或經修飾的酶(例如糖基轉移酶)的底物。
如本文所使用的，術語「聚合物修飾基團」是包含至少一個聚合物部分(聚合物)的修飾基團。被添加至多肽的聚合物修飾基團可以改變此類多肽的性質，如例如它在身體中的生物利用率、生物活性或半壽期。示例性的聚合物包括水溶性和水不溶性聚合物。聚合物修飾基團可以是線性或支化的，並且可以包含一個或多個獨立選擇的聚合物部分，例如聚(亞烷基二醇)和其衍生物。在一個實例中，聚合物是非天然存在的。在一個示例性實施方案中，聚合物修飾基團包括水溶性聚合物，例如，聚(乙二醇)和其衍生物(PEG、m-PEG)、聚(丙二醇)和其衍生物(PPG、m-PPG)等等。在優選的實施方案中，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)具有基本上均勻分散的分子量。在一個實施方案中，聚合物修飾基團不是天然存在的多糖。
術語「水溶性(的)」是指在水中具有一定的可檢測程度的溶解度的部分。用於檢測和/或定量水溶性的方法是本領域公知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等等。肽可以具有由單一胺基酸組成的混合序列，例如聚(賴氨酸)。示例性的多糖是聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如m-PEG。聚(乙烯亞胺)是示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物主鏈可以是聚(乙二醇)(即，PEG)。然而，應該理解，其他相關的聚合物也適合用於實施本發明，並且術語PEG或聚(乙二醇)的使用在該方面意在是包括性的而不是排他性的。術語PEG包括以其任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、雙官能PEG、多臂PEG、叉狀PEG、支化PEG、懸掛型PEG(即具有一個或多個懸掛在聚合物主鏈上的官能團的PEG或相關聚合物)或者其中具有可降解的鍵的PEG。
聚合物主鏈可以是線性或支化的。支化的聚合物主鏈是本領域普遍已知的。通常，支化的聚合物具有中央分枝核心部分和多個連接至該中央分枝核心的線性聚合物鏈。PEG通常以支化形式使用，其可以通過向各種多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨糖醇中添加環氧乙烷來製備。中央分枝部分也可以衍生自幾種胺基酸，例如賴氨酸。支化的聚(乙二醇)可以表示為諸如R(-PEG-OH)m的通式，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，和m代表臂的數目。多臂PEG分子，例如美國專利號5,932,462(該專利通過提及而以其整體合併入本文)中描述的那些，也可以用作聚合物主鏈。
許多其他聚合物也適合於本發明。具有2至約300個末端的非肽且水溶性的聚合物主鏈尤其可用於本發明。合適的聚合物的實例包括，但不限於，其他聚(亞烷基二醇)例如聚(丙二醇)(「PPG」)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羥丙基甲基丙烯醯胺)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(N-丙烯醯嗎啉)，如美國專利號5,629,384(該專利通過提及而以其整體合併入本文)中所描述的，以及其共聚物、三元共聚物和混合物。儘管聚合物主鏈的每條鏈的分子量可以變化，但是它通常在約100Da至約100,000Da，常常約5,000Da至約80,000Da的範圍內。
術語「均勻分散的」是指這樣的聚合物，其中聚合物樣品中實質比例的聚合物分子具有大約相同的分子量。
如本文所使用的，術語「糖綴合」是指經修飾的糖種類與多肽(例如本發明的突變型人生長激素)的胺基酸或糖基殘基的由酶介導的綴合。在一個實例中，將經修飾的糖共價附著至一個或多個修飾基團。「糖綴合」的亞類別是「糖基-PEG化」或「糖-PEG化(glyco-PEGylation)」，其中經修飾的糖的修飾基團是聚(乙二醇)或其衍生物，例如烷基衍生物(例如，m-PEG)或具有反應性官能團的衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
術語「大規模」和「工業規模」可互換使用並且指這樣的反應周期，所述反應周期在單個反應周期完成時產生至少約250mg，優選至少約500mg，和更優選至少約1g的糖綴合物。
術語「O-聯糖基化序列」或「序列肽段」是指包含具有羥基的胺基酸殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)的任何胺基酸序列(例如，含有約3至約10個胺基酸，優選約3至約9個胺基酸)。在一個實施方案中，O-聯糖基化序列是酶例如糖基轉移酶的底物，優選地當多肽的胺基酸序列的一部分時。在典型的實施方案中，所述酶通過修飾上述羥基(其被稱作「糖基化位點」)而將糖基部分轉移到O-聯糖基化序列上。本發明區分在野生型多肽或其任何其他親本形式中天然存在的O-聯糖基化序列(內源O-聯糖基化序列)和「外源O-聯糖基化序列」。包含外源O-聯糖基化序列的多肽也可以稱作「序列肽段多肽」。可以通過重組技術、化學合成或其他方法來修飾親本多肽的胺基酸序列以包含外源O-聯糖基化序列。
如本文所使用的，術語「糖基連接基團」是指共價附著有修飾基團(例如，PEG部分、治療性部分、生物分子)的糖基殘基；所述糖基連接基團將修飾基團連接至綴合物的其餘部分。在本發明的方法中，「糖基連接基團」變成共價附著至糖基化或未糖基化的多肽，從而將修飾基團連接至多肽的胺基酸和/或糖基殘基。「糖基連接基團」通常通過「經修飾的糖」酶促附著至多肽的胺基酸和/或糖基殘基而衍生自「經修飾的糖」。糖基連接基團可以是糖衍生的結構，該結構在修飾基團-經修飾的糖盒形成(例如，氧化→席夫鹼形成→還原)期間被降解，或者糖基連接基團可以是完整的。「完整的糖基連接基團」是指衍生自這樣的糖基部分的連接基團，在所述糖基部分中將修飾基團連接至綴合物的其餘部分的糖單體不被降解，例如被氧化(例如，通過偏過碘酸鈉)。通過添加糖基單位或者從親本糖結構中除去一個或多個糖基單位，可以從天然存在的寡糖得到本發明的「完整的糖基連接基團」。「糖基連接基團」可以包括糖基-模擬部分。例如，用於將經修飾的糖添加至經糖基化或非糖基化的多肽的糖基轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)顯示出對於糖基-模擬底物(例如，經修飾的糖，其中糖部分是糖基-模擬部分，例如GlcNAc-模擬部分)的耐受性。經修飾的糖基-模擬糖的轉移導致獲得具有糖基連接基團的綴合物，所述糖基連接基團是糖基-模擬部分。
如本文所使用的，術語「靶向性部分」是指將選擇性地定位於身體的特定組織或區域中的種類。所述定位由分子決定子的特異識別、靶向性試劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水相互作用等等介導。將試劑靶向特定組織或區域的其他機制是本領域技術人員已知的。示例性的靶向性部分包括抗體、抗體片段、轉鐵蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等等。
如本文所使用的，「治療性部分」意指可用於治療的任何試劑，包括但不限於，抗生素、抗炎劑、抗腫瘤藥物、細胞毒素和放射性試劑。「治療性部分」包括生物活性試劑的前體藥物，其中超過一個的治療性部分結合至載體的構建體，例如多價試劑。治療性部分還包括蛋白質和包含蛋白質的構建體。示例性的蛋白質包括但不限於，促紅細胞生成素(EPO)、粒細胞集落刺激因子(GCSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GMCSF)、幹擾素(例如，幹擾素-α、-β、-γ)、白細胞介素(例如，白細胞介素II)、血清蛋白(例如，因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黃體生成素(LH)以及抗體融合蛋白(例如，腫瘤壞死因子受體(TNFR)/Fc結構域融合蛋白)。
如本文所使用的，「抗腫瘤藥物」意指用於抗癌的任何試劑，包括但不限於，細胞毒素和諸如下列的試劑抗代謝物、烷化劑、蒽環類、抗生素、抗有絲分裂藥、丙卡巴肼、羥基脲、天冬醯胺酶、皮質類固醇、幹擾素和放射性試劑。在術語「抗腫瘤藥物」的範圍內也包括具有抗腫瘤活性的肽(例如TNF-α)的綴合物。綴合物包括但不限於在治療性蛋白質和本發明的糖蛋白之間形成的那些綴合物。代表性的綴合物是在PSGL-1和TNF-α之間形成的綴合物。
如本文所使用的，「細胞毒素或細胞毒性試劑」意指對細胞有害的任何試劑。實例包括紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽二酮(dihydroxyanthracenedione)、米託蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤黴素以及其類似物或同源物。其他毒素包括，例如蓖麻毒蛋白、CC-1065和類似物、倍癌黴素。另外的其他毒素包括白喉毒素和蛇毒(例如，眼鏡蛇蛇毒)。
如本文所使用的，「放射性試劑」包括在診斷或破壞腫瘤方面有效的任何放射性同位素。實例包括但不限於，銦-111、鈷-60。此外，天然存在的放射性元素，例如鈾、鐳和釷(其通常表現為放射性同位素的混合物)是放射性試劑的合適的實例。金屬離子通常與有機螯合部分相螯合。
許多可用的螯合基團、冠醚、穴狀配體等是本領域已知的，並且可以摻入本發明的化合物中(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等等，以及它們的膦酸鹽類似物，如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等等)。參見例如，Pitt等人，「The Design of Chelating Agents forthe Treatment of Iron Overload」，INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGYAND MEDICINE；Martell，Ed.；American Chemical Society，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLICLIGAND COMPLEXES；Cambridge University Press，Cambridge，1989；Dugas，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，New York，1989，以及其中所含的參考文獻。
此外，允許將螯合劑、冠醚和環糊精附著至其他分子的許多途徑是本領域技術人員可以得到的。參見例如，Meares等人，「Propertiesof In Vivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides.」MODIFICATION OF PROTEINSFOOD，NUTRITIONAL，ANDPHARMACOLOGICAL ASPECTS」Feeney等人，Eds.，American ChemicalSociety，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等人，Bioconjugate Chem.，9108-117(1998)；Song等人，Bioconjugate Chem.，8249-255(1997)。
如本文所使用的，「可藥用載體」包括當與綴合物相組合時保留該綴合物的活性並且優選地不與受試者的免疫系統反應的任何物質。「可藥用載體」包括固體和液體，例如承載體、稀釋劑和溶劑。實例包括但不限於，任何標準藥物載體，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液例如油/水乳液以及各種類型的溼潤劑。其他載體可以包括無菌溶液以及片劑(包括包衣片劑)和膠囊。通常，此類載體包含賦形劑，例如澱粉、乳、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油、樹膠、二元醇或者其他已知的賦形劑。此類載體可以還包括香料和顏色添加劑或其他成分。通過公知的常規方法來配製包含此類載體的組合物。
如本文所使用的，「施用」意指對受試者口服施用，作為栓劑施用，局部接觸、靜脈內、腹膜內、肌內、損害內或皮下施用，通過吸入施用，或者植入緩釋裝置，例如微型滲透泵。施用通過任何途徑進行，包括腸胃外和透黏膜(例如，口腔的、鼻的、陰道的、直腸的或經皮的)，特別是通過吸入。腸胃外施用包括，例如靜脈內、肌內、小動脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內和顱內施用。此外，當進行注射以用於治療腫瘤，例如誘導細胞凋亡時，可以直接施用至腫瘤和/或施用到腫瘤周圍的組織中。其他遞送方式包括但不限於，使用脂質體製劑、靜脈內輸注、透皮貼劑，等等。
術語「改善」是指在治療病理學狀態或病狀中任何成功的徵候，包括任何客觀或主觀的參數，例如症狀的減輕、緩解或減少或者患者身體或精神狀態的變好。症狀的改善可以基於客觀或主觀的參數；包括身體檢查和/或精神病學評估的結果。
術語「治療」或「療法」是指對疾病或病狀的「治療」或「處理」，其包括預防疾病或病狀在傾向於患該疾病但是仍未經歷或顯示該疾病症狀的動物中發生(預防性治療)、抑制疾病(減緩或阻止其發展)、提供疾病的症狀或副作用的減輕(包括姑息療法)和解除疾病(使疾病消退)。
術語「有效量」或「對……有效的量」或「治療有效量」或任何語法上等價的術語是指當施用於動物或人以治療疾病時足夠實現對該疾病的治療的量。
術語「分離的」是指這樣的材料，其實質上或基本上不含用於製備該材料的組分。對於本發明的肽綴合物，術語「分離的」是指這樣的材料，其實質上或基本上不含在用於製備該肽綴合物的混合物中通常伴隨該材料的組分。「分離的」和「純的」可互換使用。通常，本發明的分離的肽綴合物具有優選表示為一定範圍的純度水平。所述肽綴合物的純度範圍的下端為約60％、約70％或約80％，而純度範圍的上端為約70％、約80％、約90％或大於約90％。
當肽綴合物大於約90％純時，它們的純度也優選表示為範圍。純度範圍的下端為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度範圍的上端為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％的純度。
通過任何本領域公認的分析方法(例如，經銀染的凝膠上的條帶強度、聚丙烯醯胺凝膠電泳、HPLC或類似方法)來測定純度。
如本文所使用的，「群體的基本上每個成員」描述本發明肽綴合物群體的特徵，其中所選百分比的添加至肽的經修飾的糖被添加至該肽上多個相同的接納體位點。「群體的基本上每個成員」是說在與經修飾的糖相綴合的肽上的位點的「同質性」，並且是指至少約80％、優選至少約90％和更優選至少約95％同質的本發明綴合物。
「同質性」是指在與經修飾的糖相綴合的接納體部分群體中的結構一致性。因此，在這樣的本發明肽綴合物(其中每個經修飾的糖部分綴合至這樣的接納體位點，所述接納體位點具有和與每個其他經修飾的糖相綴合的接納體位點相同的結構)中，所述肽綴合物被稱為約100％同質的。同質性通常表示為範圍。肽綴合物的同質性範圍的下端為約50％、約60％、約70％或約80％，而純度範圍的上端為約70％、約80％、約90％或大於約90％。
當肽綴合物大於或等於約90％同質時，它們的同質性也優選表示為範圍。同質性範圍的下端為約90％、約92％、約94％、約96％或約98％。純度範圍的上端為約92％、約94％、約96％、約98％或約100％的同質性。通常，通過一種或多種本領域技術人員已知的方法，例如液相色譜法-質譜法(LC-MS)、基質輔助雷射解吸飛行時間質譜法(MALDITOF)、毛細管電泳等，來測定肽綴合物的純度。
當涉及糖肽種類時，「基本上均一的糖形」或「基本上均一的糖基化模式」是指被目的糖基轉移酶(例如，巖藻糖基轉移酶)糖基化的接納體部分的百分比。例如，在α1，2巖藻糖基轉移酶的情況下，如果在本發明的肽綴合物中基本上所有的(如下文定義)Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化的類似物均被巖藻糖基化，那麼存在基本上均一的巖藻糖基化模式。本領域技術人員將會理解，起始材料可以含有糖基化的接納體部分(例如，巖藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，計算出的糖基化百分比將包括通過本發明的方法糖基化的接納體部分，以及在起始材料中已經被糖基化的那些接納體部分。
在「基本上均一的」上述定義中的術語「基本上」一般是指對於特定糖基轉移酶而言，至少約40％、至少約70％、至少約80％、或更優選至少約90％、和更加優選至少約95％的接納體部分被糖基化。
當取代基由其從左至右書寫的常規化學式來指定時，它們同等地包括由將該結構從右到左書寫而產生的化學上相同的取代基，例如，-CH2O-意在也敘述了-OCH2-。
除非另有說明，術語「烷基」自身或作為另一取代基的一部分，是指具有指定碳原子數(即，C1-C10是指1至10個碳)的直鏈或支鏈的或環狀的烴基或者其組合，其可以是完全飽和的、單或多不飽和的並且可以包括二價和多價基團。飽和烴基的實例包括但不限於諸如下列的基團甲基，乙基，正丙基，異丙基，正丁基，叔丁基，異丁基，仲丁基，環己基，(環己基)甲基，環丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和異構體，等等。不飽和烷基是具有一個或多個雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的實例包括但不限於，乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基以及高級同系物和異構體。除非另有說明，術語「烷基」還意味著包括下面更詳細定義的那些烷基衍生物，例如「雜烷基」。局限於碳氫化合物基團的烷基被稱作「同烷基(homoalkyl)」。
術語「亞烷基」自身或作為另一取代基的一部分，是指衍生自烷烴的二價基團，例如但不限於-CH2CH2CH2CH2-，並且進一步包括下面描述為「雜亞烷基」的那些基團。通常，烷基(或亞烷基)將具有1至24個碳原子，在本發明中優選的是具有10個或更少碳原子的那些基團。「低級烷基」或「低級亞烷基」是較短鏈的烷基或亞烷基，其通常具有8個或更少碳原子。
術語「烷氧基」、「烷基氨基」和「烷硫基」(或硫代烷氧基)以它們的常規含義使用，並且是指各自通過氧原子、氨基或硫原子附著至該分子的其餘部分的那些烷基。
除非另有說明，術語「雜烷基」自身或與另一術語相組合地指穩定的直鏈或支鏈的或者環狀的烴基或其組合，其由指定數目的碳原子和至少一個選自O、N、Si和S的雜原子組成，並且其中氮和硫原子可以任選地被氧化以及氮雜原子可以任選地被季銨化。可以將雜原子O、N和S及Si置於所述雜烷基的任何內部位置處或者置於該烷基附著至該分子的其餘部分的位置處。實例包括但不限於，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多兩個雜原子可以是連續的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。類似地，術語「雜亞烷基」自身或作為另一取代基的一部分，是指衍生自雜烷基的二價基團，例如但不限於-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對於雜亞烷基，雜原子也可以佔據鏈末端之一或兩端(例如，亞烷基氧基、亞烷基二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基，等等)。另外，對於亞烷基和雜亞烷基連接基團，連接基團式的書寫方向並不意味著連接基團的取向。例如，式-CO2R』-表示-C(O)OR』-和-OC(O)R』-兩者。
除非另有說明，術語「環烷基」和「雜環烷基」自身或與其他術語相組合地分別表示「烷基」和「雜烷基」的環狀形式。另外，對於雜環烷基，雜原子可以佔據該雜環附著至該分子的其餘部分的位置。環烷基的實例包括但不限於環戊基、環己基、1-環己烯基、3-環己烯基、環庚基等。雜環烷基的實例包括但不限於1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有說明，術語「滷代」或「滷素」自身或作為另一取代基的一部分，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，諸如「滷代烷基」的術語意味著包括單滷代烷基和多滷代烷基。例如，術語「滷代(C1-C4)烷基」意味著包括但不限於，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有說明，術語「芳基」是指多不飽和的芳香族取代基，其可以是單環或者稠合在一起或共價連接的多個環(優選1-3個環)。術語「雜芳基」是指包含1-4個選自N、O、S、Si和B的雜原子的芳基(或環)，其中氮和硫原子任選地被氧化以及氮原子任選地被季銨化。雜芳基可以通過雜原子附著至該分子的其餘部分。芳基和雜芳基的非限制性實例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯並噻唑基、嘌呤基、2-苯並咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述各芳基和雜芳基環體系的取代基選自下述可接受的取代基。
簡言之，術語「芳基」，當與其他術語組合使用時(例如芳氧基、芳硫氧基(arylthioxy)、芳基烷基)，包括如上定義的芳基和雜芳基環兩者。因此，術語「芳基烷基」意味著包括其中芳基附著至烷基的那些基團(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括其中碳原子(例如亞甲基)被例如氧原子代替的那些烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述術語(例如「烷基」、「雜烷基」、「芳基」和「雜芳基」)各自意味著包括所述基團的取代的和未取代的形式兩者。下面提供了每種類型的基團的優選取代基。
烷基和雜烷基(包括通常被稱為亞烷基、鏈烯基、亞雜烷基、雜鏈烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基和雜環烯基的那些基團)的取代基通稱為「烷基取代基」，而且它們可以是選自但不限於以下的多種基團中的一個或多個取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烷基、-OR』、＝O、＝NR』、＝N-OR』、-NR』R」、-SR』、-滷素、-SiR』R」R』」、-OC(O)R』、-C(O)R』、-CO2R』、-CONR』R」、-OC(O)NR』R」、-NR」C(O)R』、-NR』-C(O)NR」R』」、-NR」C(O)2R』、-NR-C(NR』R」R』」)＝NR」」、-NR-C(NR』R」)＝NR』」、-S(O)R』、-S(O)2R』、-S(O)2NR』R」、-NRSO2R』、-CN和-NO2，數目從0至(2m』+1)，其中m』為此類基團中碳原子的總數。R』、R」、R』」和R」」各自優選獨立地指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3個滷素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或者芳基烷基。例如當本發明的化合物包含超過一個R基團時，獨立地選擇各個R基團，當存在超過一個R』、R」、R』」和R」」基團時，這些基團也一樣選擇。當R』和R」附著至同一個氮原子時，它們可以與該氮原子相組合以形成5-、6-或7-元環。例如，-NR』R」意味著包括但不限於1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從取代基的上述論述中，本領域技術人員將會理解，術語「烷基」意味著包括這樣的基團，所述基團含有與除氫基團之外的其他基團例如滷代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和醯基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)結合的碳原子。
類似於對於烷基所描述的取代基，將芳基和雜芳基的取代基通稱為「芳基取代基」。所述取代基選自例如取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烷基、-OR』、＝O、＝NR』、＝N-OR』、-NR』R」、-SR』、-滷素、-SiR』R」R』」、-OC(O)R』、-C(O)R』、-CO2R』、-CONR』R」、-OC(O)NR』R」、-NR」C(O)R』、-NR』-C(O)NR」R』」、-NR」C(O)2R』、-NR-C(NR』R」R』」)＝NR」」、-NR-C(NR』R」)＝NR』」、-S(O)R』、-S(O)2R』、-S(O)2NR』R」、-NRSO2R』、-CN和-NO2、-R』、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，數目從0至該芳環體系上開放價的總數；並且其中R』、R」、R』」和R」」優選獨立地選自氫、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基。例如當本發明的化合物包含超過一個R基團時，獨立地選擇各個R基團，當存在超過一個R』、R」、R』」和R」」基團時，這些基團也一樣選擇。
在芳基或雜芳基環的相鄰原子上的取代基中的兩個可以任選地被式-T-C(O)-(CRR』)q-U-的取代基代替，其中T和U獨立地是-NR-、-O-、-CRR』-或單鍵，以及q是0-3的整數。備選地，在芳基或雜芳基環的相鄰原子上的取代基中的兩個可以任選地被式-A-(CH2)r-B-的取代基代替，其中A和B獨立地是-CRR』-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR』-或單鍵，以及r是1-4的整數。如此形成的新環的單鍵之一可以任選地被雙鍵代替。備選地，在芳基或雜芳基環的相鄰原子上的取代基中的兩個可以任選地被式-(CRR』)s-X-(CR」R』」)d-的取代基代替，其中s和d獨立地是0-3的整數，以及X是-O-、-NR』-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR』-。取代基R、R』、R」和R』」優選獨立地選自氫或者取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所使用的，術語「醯基」描述了含有羰基殘基的取代基，C(O)R。R的示例性種類包括H、滷素、烷氧基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基 如本文所使用的，術語「稠合的環體系」是指至少兩個環，其中每個環與另一個環共有至少兩個原子。稠合的環體系可以包括芳族以及非芳族環。「稠合的環體系」的實例是萘類、吲哚類、喹啉類、色烯類等等。
如本文所使用的，術語「雜原子」包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、矽(Si)、硼(B)和磷(P)。
符號「R」是一般性縮寫，其代表選自下列的取代基取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基。
術語「可藥用鹽」包括活性化合物的鹽，取決於在本文所述的化合物上發現的特定取代基，所述鹽用相對無毒性的酸或鹼來製備。當本發明的化合物含有相對酸性的官能度時，可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所希望的鹼(純粹的或在合適的惰性溶劑中)接觸來獲得鹼加成鹽。可藥用鹼加成鹽的實例包括鈉、鉀、鈣、銨、有機氨基或鎂鹽，或者類似的鹽。當本發明的化合物含有相對鹼性的官能度時，可以通過使此類化合物的中性形式與足夠量的所希望的酸(純粹的或在合適的惰性溶劑中)接觸來獲得酸加成鹽。可藥用酸加成鹽的實例包括源自無機酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、碳酸氫根、磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸或者亞磷酸等等的那些鹽，以及源自相對無毒的有機酸如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等等的鹽。還包括胺基酸例如精氨酸等的鹽，和有機酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見例如，Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science，661-19(1977))。本發明的某些具體化合物同時含有允許所述化合物轉化成鹼或酸加成鹽的鹼性和酸性官能度。
所述化合物的中性形式優選通過使該鹽與鹼或酸接觸並且以常規方式分離親本化合物來再生。所述化合物的親本形式在某些物理性質，例如在極性溶劑中的溶解度方面與所述各種鹽形式不同，但是對於本發明的目的，所述鹽等同於所述化合物的親本形式。
除了鹽形式之外，本發明還提供了前體藥物形式的化合物。本文所述的化合物的前體藥物是在生理條件下容易經歷化學改變以提供本發明化合物的那些化合物。此外，可以在離體環境中通過化學或生物化學方法將前體藥物轉化為本發明的化合物。例如，當被置於具有合適的酶或化學試劑的透皮貼劑貯庫中時，前體藥物可以緩慢地轉化為本發明的化合物。
本發明的某些化合物可以以非溶劑化形式以及溶劑化形式(包括水合形式)存在。通常，溶劑化形式等同於非溶劑化形式，並且被包括在本發明的範圍內。本發明的某些化合物可以以多晶或無定形形式存在。通常，所有物理形式對於本發明所考慮的用途而言是等同的，並且旨在在本發明的範圍內。
本發明的某些化合物具有不對稱碳原子(光學中心)或雙鍵；外消旋物、非對映異構體、幾何異構體和獨個異構體被包括在本發明的範圍內。
可以將本發明的化合物製備為單一的異構體(例如，對映異構體、順反異構體、位置異構體、非對映異構體)或製備為異構體的混合物。在優選的實施方案中，將所述化合物製備為基本上單一的異構體。用於製備基本上異構體純的化合物的方法是本領域已知的。例如，可以通過下列方式來製備對映異構體富集的混合物和純的對映異構體化合物使用對映異構體純的合成中間體，並結合使得在手性中心的立體化學保持不變或者導致其完全轉化的反應。備選地，可以將沿著合成途徑的終產物或中間體拆分為單一的立體異構體。用於轉化特定的手性中心或者使其保持不變的技術以及用於拆分立體異構體混合物的技術是本領域公知的，並且完全在本領域技術人員就具體情況而選擇合適方法的能力之內。一般地，可參見，Furniss等人(eds.)，VOGEL』SENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5TH ED.，Longman Scientific and Technical Ltd.，Essex，1991，pp.809-816；和Heller，Acc.Chem.Res.23128(1990)。
本文所使用的外消旋的、ambiscalemic和scalemic或對映異構體純的化合物的圖形顯示來自Maehr，J.Chem.Ed.，62114-120(1985)實心且間斷的楔形用於表示手性元素的絕對構型；波浪線表示否定了它所代表的鍵可以產生的任何立體化學暗示；實心且間斷的粗線是幾何描述符，其指出所顯示的相對構型但是不暗示任何絕對立體化學；以及楔形輪廓和點線或虛線表示具有不確定的絕對構型的對映異構體純的化合物。
術語「對映異構體過量」和「非對映異構體過量」在本文中可互換使用。具有單個立體中心的化合物被稱作以「對映異構體過量」存在，具有至少兩個立體中心的化合物被稱作以「非對映異構體過量」存在。
本發明的化合物還可以在構成此類化合物的一個或多個原子處含有非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以用放射性同位素例如氚(3H)、氘(2D)、碘-125(125I)或碳-14(14C)來進行放射性標記。本發明化合物的所有同位素變化形式(不論是否為放射性的)意在被包括在本發明的範圍內。
如本文所使用的，「反應性官能團」是指這樣的基團，所述基團包括但不限於，烯烴、炔、醇、酚、醚、氧化物、滷化物、醛、酮、羧酸、酯、醯胺、氰酸鹽、異氰酸鹽、硫氰酸鹽、異硫氰酸鹽、胺、肼、腙、醯肼、重氮基、重氮化物(diazonium)、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亞碸、碸、磺酸、亞磺酸、縮醛、縮酮、酐、硫酸鹽、次磺酸、異腈、脒、醯亞胺、亞胺酸鹽、硝酮、羥胺、肟、異羥肟酸、硫代異羥肟酸、丙二烯類、原酸酯、亞硫酸鹽、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳二亞胺、氨基甲酸酯、亞胺、疊氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物和亞硝基化合物。反應性官能團還包括用於製備生物綴合物的那些，例如N-羥基琥珀醯亞胺酯、馬來醯亞胺類等等。用於製備每一種這些官能團的方法是本領域公知的，並且它們對於具體目的的應用或修飾在本領域技術人員的能力範圍之內(參見例如，Sandler和Karo，eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS，Academic Press，San Diego，1989)。
「非共價蛋白質結合基團」是以聯合方式與完整的或變性的多肽相互作用的部分。該相互作用在生物環境中可以是可逆的或不可逆的。向本發明的螯合劑或絡合物中摻入「非共價蛋白質結合基團」給該試劑或絡合物提供了非共價方式與多肽相互作用的能力。示例性的非共價相互作用包括疏水-疏水和靜電相互作用。示例性的「非共價蛋白質結合基團」包括陰離子基團，例如，磷酸鹽、硫代磷酸鹽、膦酸鹽、羧酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽、碸、磺酸鹽、硫代硫酸鹽和硫代磺酸鹽。
「糖基轉移酶截短」或「截短的糖基轉移酶」或者語法變化形式是指這樣的糖基轉移酶，其具有比天然存在的糖基轉移酶更少的胺基酸殘基，但是保留了某種酶促活性。截短的糖基轉移酶包括例如，截短的GnT1酶，截短的GalT1酶，截短的ST3GalIII酶，截短的GalNAc-T2酶，截短的Core-1-GalT1酶，約32至約90個胺基酸殘基(參見例如，人的酶)；截短的ST3Gal1酶，截短的ST6GalNAc-1酶和截短的GalNAc-T2酶。可以刪除任何數目的胺基酸殘基，只要該酶保留活性。在一些實施方案中，可以刪除結構域或結構域的一部分，例如，可以刪除信號-錨結構域，而留下包含幹區(stem region)和催化結構域的截短；可以刪除信號-錨結構域和幹區的一部分，而留下包含剩餘的幹區和催化結構域的截短；或者可以刪除信號-錨結構域和幹區，而留下包含催化結構域的截短。糖基轉移酶截短也可以發生在該蛋白質的C-末端。例如，一些GalNAcT酶，如GalNAc-T2，具有C-末端凝集素結構域，其可以被刪除而不減少酶促活性。
「重摺疊表達系統」是指具有氧化性細胞內環境的細菌或其他微生物，當在該微生物中表達含有二硫鍵的蛋白質時，所述微生物能夠以它們的正確/活性形式重摺疊所述蛋白質。實例包括基於大腸桿菌(E.coli)(例如，OrigamiTM(經修飾的大腸桿菌trxB-/gor-)、Origami2TM等等)、假單胞菌(Pseudomonas)(例如，螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens))的系統。關於OrigamiTM技術的示例性參考文獻，參見例如，Lobel等人，Endocrine 2001，14(2)205-212；和Lobel等人，Protein Express.Purif.2002，25(1)124-133，這些參考文獻中的每一篇通過提及而合併入本文。
III.引言 本發明提供了包含一個或多個O-聯糖基化序列的多肽，其中每個糖基化序列是糖基轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)的底物。所述酶催化糖基部分(例如，葡糖胺部分)從糖基供體分子(例如，UDP-GlcNAc)轉移到胺基酸側鏈的氧原子(糖基化位點)上，其中所述胺基酸(例如，絲氨酸或蘇氨酸)是所述O-聯糖基化序列的一部分。在備選的實施方案中，所述胺基酸包含巰基(例如，半胱氨酸)而非羥基。
本發明還提供了多肽綴合物，其中經修飾的糖部分直接(例如，通過糖PEG化反應)或間接(例如，通過間插性糖基殘基)附著至位於所述多肽內的O-聯或S-聯糖基化序列。還提供了製備本發明的綴合物的方法。
本發明的糖基化和糖PEG化方法可以在摻入了O-聯或S-聯糖基化序列的任何多肽上實施。在一個實施方案中，將糖基化序列通過突變引入到親本多肽的胺基酸序列中，從而產生本發明的非天然存在的多肽。親本多肽可以是任何多肽。實例包括野生型多肽和已經從它們的天然存在的對應物進行了修飾(例如，通過突變)而得的那些多肽。在優選的實施方案中，親本多肽是治療性多肽，例如人生長激素(hGH)、促紅細胞生成素(EPO)或治療性抗體。因此，本發明提供了在它們的胺基酸序列內包含一個或多個糖基化序列的治療性多肽的綴合物，所述糖基化序列獨立地選自S-聯和O-聯糖基化序列。
在各種實例中，本發明的方法提供了具有延長的治療半壽期的多肽綴合物，所述延長的治療半壽期是由於例如降低的清除速率或者降低的被免疫或網狀內皮系統(RES)攝取的速率而引起的。此外，本發明的方法提供了用於掩蔽肽上的抗原決定簇從而減小或消除針對該肽的宿主免疫應答的方法。使用合適的經修飾的糖將靶向性試劑選擇性地附著至肽也可以用於將肽靶向特定組織或細胞表面受體(其對於特定的靶向性試劑是特異的)。
另外，本發明的方法可以用於調節親本多肽的「生物學活性譜」。發明人已經認識到，使用本發明的方法將修飾基團例如水溶性聚合物(例如，mPEG)共價附著至親本多肽可以不僅改變所得多肽種類的生物利用率、藥效動力學性質、免疫原性、代謝穩定性、生物分布和水溶性，而且可以導致不希望的治療活性降低或者導致所希望的治療活性增強。例如，前者以在造血劑促紅細胞生成素(EPO)上觀察到。某些化學PEG化的EPO變體顯示出降低的促紅細胞生成活性，而同時保持了野生型多肽的組織保護性活性。此類結果描述於例如美國專利6,531,121；WO2004/096148，WO2006/014466，WO2006/014349，WO2005/025606和WO2002/053580中。可用於評估所選多肽的差別生物學活性的示例性細胞系概述於下面的表1中 表1用於各種多肽的生物學評估的細胞系 在一個實施方案中，本發明的多肽綴合物顯示出降低或增強的對於生物學靶蛋白(例如，受體)、天然配體或非天然配體例如抑制劑的結合親和力。例如，消除對一類特定受體的結合親和力可以減少或消除相關的細胞信號傳導和下遊生物學事件。因此，本發明的方法可以用於產生多肽綴合物，其具有與所述綴合物所衍生自的親本多肽相同、相似或不同的治療譜。本發明的方法可以用於鑑定具有特定的(例如改進的)生物學功能的經糖PEG化的治療劑以及「細調」任何治療性多肽或其他生物學活性多肽的治療譜。
IV.組合物 多肽 本發明提供了非天然存在的多肽，其對應於親本多肽並具有包含至少一個本發明的外源O-聯糖基化序列的胺基酸序列，其中所述O-聯糖基化序列在所述非天然存在的多肽所衍生自的相應親本多肽中不存在或者在所述非天然存在的多肽所衍生自的相應親本多肽中的相同位置處不存在。
在一個實例中，由本發明提供的多肽的胺基酸序列包含O-聯糖基化序列，所述O-聯糖基化序列(當作為多肽的一部分時)是一種或多種野生型的、突變型的或截短的糖基轉移酶的底物。優選的糖基轉移酶包括GlcNAc轉移酶。示例性的GlcNAc轉移酶由SEQ ID NOs1-9和228至230來表示。
在示例性的實施方案中，通過經突變來改變親本多肽(例如，野生型多肽)的胺基酸序列而產生本發明的非天然存在的多肽。所得的多肽變體包含至少一個「O-聯糖基化序列」，所述O-聯糖基化序列在相應的親本多肽中不存在或者在相應的親本多肽中的相同位置處不存在。所述非天然存在的多肽的胺基酸序列可以包含天然存在的(內源的)和非天然存在的(外源的)O-聯糖基化序列的組合，只要存在至少一個外源O-聯糖基化序列。
親本多肽可以是任何多肽。示例性的親本多肽包括野生型多肽及其片段以及從它們的天然存在的對應物進行修飾(例如，通過事先的突變或截短)而得的肽。在一個實施方案中，所述多肽是治療性多肽，例如用作藥物試劑(即，經批准的藥物)的那些。多肽的非限制性選擇顯示在於2006年6月8日提交的美國專利申請10/552,896(其通過提及而合併入本文)的圖28中。因此，本發明提供了在它們的胺基酸序列內包含一個或多個本發明的O-聯糖基化序列的治療性多肽的糖綴合物。
示例性的親本和野生型多肽包括生長因子，例如肝細胞生長因子(HGF)、神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(例如，FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22和FGF-23)、凝血因子(例如，因子V、因子VII、因子VIII、B-結構域缺失的因子VIII、部分B-結構域缺失的因子VIII、vWF-因子VIII融合物(例如，其具有全長的、B-結構域缺失的因子VIII或部分B-結構域缺失的因子VIII)、因子IX、因子X和因子XIII)、激素(例如，人生長激素(hGH)和促卵泡激素(FSH))以及細胞因子(例如，白細胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)和幹擾素(例如，INF-α、 INF-β、INF-γ))。
其他示例性的多肽包括酶，例如葡糖腦苷脂酶、α-半乳糖苷酶(例如，FabrazymeTM)、酸性-α-葡糖苷酶(酸性麥芽糖酶)、艾杜糖苷酸酶例如α-L-艾杜糖苷酸酶(例如，AldurazymeTM)、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、β-葡糖苷酶(參見例如，在美國專利申請號10/411,044中描述的酶)、芳基硫酸酯酶、天冬醯胺酶、α-葡糖神經醯胺酶、鞘磷脂酶、丁醯膽鹼酯酶、尿激酶和α-半乳糖苷酶A(參見例如，在美國專利號7,125,843中描述的酶)。
其他示例性的親本多肽包括骨形態發生蛋白(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)、神經營養蛋白(例如，NT-3、NT-4、NT-5)、促紅細胞生成素(EPO)、生長分化因子(例如，GDF-5)、神經膠質細胞系衍生神經營養因子(GDNF)、腦衍生神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、馮維勒布蘭德因子(vWF)、vWF切割蛋白酶(vWF蛋白酶、vWF降解蛋白酶)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、α1-抗胰蛋白酶(ATT或α-1蛋白酶抑制劑)、組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)、蛭素、瘦蛋白、尿激酶、人DNA酶、胰島素、B型肝炎表面蛋白(HbsAg)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、嵌合的白喉毒素-IL-2、胰高血糖素樣肽(例如，GLP-1和GLP-2)、抗凝血酶III(AT-III)、prokinetisin、CD4、α-CD20、腫瘤壞死因子受體(TNF-R)、P-選擇蛋白糖蛋白配體-1(PSGL-1)、補體、轉鐵蛋白、依賴於糖基化的細胞粘著分子(GlyCAM)、神經細胞粘著分子(N-CAM)、TNF受體-IgG Fc區融合蛋白、伸展蛋白-4、BDNF、β-2-微球蛋白、睫狀神經營養因子(CNTF)、纖維蛋白原、GDF(例如，GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6-15)、GDNF和GLP-1。一些上面所列出的多肽的示例性胺基酸序列描述在美國專利號7,214,660中，所有這些均通過提及而合併入本文。
也在本發明範圍內的是為抗體的多肽。術語「抗體」意在包括抗體片段(例如，Fc結構域)、單鏈抗體、Lama抗體、納米抗體(nano-bodies)等等。該術語還包括抗體融合蛋白，例如Ig嵌合體。優選的抗體包括人源化的單克隆抗體或其片段。此類抗體的所有已知的同種型在本發明範圍內。示例性的抗體包括針對生長因子，例如內皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(例如，針對VEGF-A的單克隆抗體，如雷珠單抗(LucentisTM))和成纖維細胞生長因子(例如，FGF-7、FGF-21和FGF-23)的抗體，以及針對它們各自受體的抗體。其他示例性的抗體包括抗TNF-α單克隆抗體(參見例如，美國專利申請號10/411,043)，TNF受體-IgG Fc區融合蛋(例如，EnbrelTM)，抗HER2單克隆抗體(例如，HerceptinTM)，針對呼吸道合胞病毒的蛋白F的單克隆抗體(例如，SynagisTM)，針對TNF-α的單克隆抗體(例如，RemicadeTM)，針對糖蛋白例如IIb/IIIa的單克隆抗體(例如，ReoproTM)，針對CD20(例如，RituxanTM)、CD4和α-CD3的單克隆抗體，針對PSGL-1和CEA的單克隆抗體。任一上面所列多肽的任何經修飾的(例如，經突變的)形式也在本發明的範圍內。
可以使用本領域已知和下文描述的方法來產生本發明的突變型多肽。
O-聯糖基化序列 在一個實施方案中，本發明的O-聯糖基化序列天然存在於野生型多肽中。在另一個實施方案中，所述O-聯糖基化序列不存在於親本多肽中或不存在於親本多肽中的相同位置處，並且通過突變或其他方法被引入到親本多肽中。本發明的O-聯糖基化序列可以是任何短的胺基酸序列(例如，1至10個，優選地約3至9個胺基酸殘基)，其包含有至少一個在其側鏈中具有羥基的胺基酸(例如，絲氨酸、蘇氨酸)。該羥基標記出了糖基化位點。
每個本發明的O-聯糖基化序列的糖基化效率取決於酶以及該糖基化序列的背景，尤其是糖基化位點周圍的多肽的三維結構。
O-聯糖基化序列的定位 在一個實施方案中，當作為多肽(例如，本發明的序列肽段多肽)的一部分時，O-聯或S-聯糖基化序列是糖基轉移酶的底物。在一個實例中，糖基化序列是GlcNAc轉移酶的底物。在另一個實例中，糖基化序列是經修飾的酶(例如截短的GlcNAc轉移酶)的底物。在合適的糖基化反應期間每個本發明的O-聯糖基化序列被糖基化的效率可以取決於酶的類型和性質，也可以取決於糖基化序列的背景，尤其是糖基化位點周圍的多肽的三維結構。
一般地，可以在多肽的胺基酸序列內的任何位置處引入O-聯糖基化序列。在一個實例中，在親本多肽的N-末端(即，第一個胺基酸之前或者緊接第一個胺基酸之後)引入糖基化序列(氨基末端突變體)。在另一個實例中，在親本多肽的氨基末端附近(例如，在N-末端的10個胺基酸殘基內)引入糖基化序列。在另一個實例中，糖基化序列位於親本多肽的C-末端緊接親本多肽最後一個胺基酸之後(羧基末端突變體)。在另外一個實例中，在親本多肽的C-末端附近(例如，在C-末端的10個胺基酸殘基內)引入糖基化序列。在另外一個實例中，O-聯糖基化序列位於親本多肽的N-末端和C-末端之間的任何位置(內部突變體)。一般優選的是，經修飾的多肽是生物學上有活性的，即使生物活性從對應的親本多肽的生物活性發生了改變。
影響序列肽段多肽的糖基化效率的一個重要因素是糖基化位點(例如，絲氨酸或蘇氨酸側鏈)對於糖基轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)和其他反應參與物(包括溶劑分子)的可接近性。如果糖基化序列位於三維多肽結構的內部結構域內，那麼糖基化將可能是無效率的。因此，在一個實施方案中，在多肽的這樣的區域中引入糖基化序列，所述區域對應於該多肽的溶劑暴露表面。示例性的多肽構象是這樣的，即其中糖基化序列的羥基不是向內的，與多肽的其他區域形成氫鍵。另一示例性的構象是這樣的，即其中羥基不可能形成氫鍵。
在一個實例中，在親本蛋白質的預先選擇的特定區域內產生糖基化序列。實際上，多肽主鏈的糖基化常常發生在該多肽的環區域內並且通常不發生在螺旋或β-摺疊片結構內。因此，在一個實施方案中，通過在親本多肽的對應於環結構域的區域中引入O-聯糖基化序列來產生本發明的序列肽段多肽。
例如，蛋白質BMP-7的晶體結構在Ala72和Ala86之間以及在Ile96和Pro103之間含有兩個延伸的環區域。產生BMP-7突變體(其中O-聯糖基化序列被置於多肽序列的那些區域內)可以導致這樣的多肽，其中所述突變引起該多肽的最初三級結構的很小的破壞或無破壞。
然而，發明人已經發現，在位於β-摺疊片或α-螺旋構象內的胺基酸位置處引入O-聯糖基化序列還可以導致在新引入的O-聯糖基化序列處被有效糖基化的序列肽段多肽。在β-摺疊片或α-螺旋結構域中引入O-聯糖基化序列可以引起多肽的結構改變，這又使得可以有效糖基化(參見例如，於2007年7月23日提交的美國專利申請11/781,885，其通過提及而以其整體合併入本文以用於所有目的)。
蛋白質的晶體結構可以用於鑑定野生型或親本多肽的最適合於引入O-聯糖基化序列的那些結構域，並且可以允許預先選擇有希望的修飾位點。
當晶體結構不可得時，多肽的胺基酸序列可以用於預先選擇有希望的修飾位點(例如，預測環結構域對α-螺旋結構域)。然而，即使多肽的三維結構是已知的，結構動力學和酶/受體相互作用在溶液中也是可變的。因此，合適的突變位點的鑑定以及合適的糖基化序列的選擇可以涉及產生一些序列肽段多肽(例如，本發明的序列肽段多肽文庫)，以及使用合適的篩選方案(例如，本文所述的那些方案)就所希望的特徵來測試那些變體。
在一個實施方案中，親本多肽是抗體或抗體片段。在一個實例中，用本發明的O-聯糖基化序列來修飾抗體或抗體片段的恆定區(例如，CH2結構域)。在一個實例中，以這樣的方式引入O-聯糖基化序列，即使得天然存在的N-聯糖基化序列被替代或在功能上受損。在另一個實施方案中，通過CH2結構域的所選區域來進行序列肽段掃描，從而產生抗體文庫，每個抗體包含本發明的外源O-聯糖基化序列。在另外一個實施方案中，使所得的多肽變體經歷酶促糖基化反應，從而向所引入的糖基化序列添加糖基部分。可以就它們結合合適受體(例如，Fc受體，如FcγRIIIa)的能力來分析被充分糖基化的那些變體。在一個實施方案中，當與親本抗體或其經天然糖基化的形式相比較時，此類經糖基化的抗體或抗體片段顯示出增加的與Fc受體的結合親和力。本發明的該方面進一步描述在於2007年1月18日提交的美國臨時專利申請60/881,130(該專利申請的公開內容以其整體合併入本文)中。所描述的修飾可以改變抗體的效應子功能。在一個實施方案中，經糖基化的抗體變體顯示出降低的效應子功能，例如降低的與存在於天然殺傷細胞表面上或存在於殺傷T-細胞表面上的受體的結合親和力。
在另一個實施方案中，不將O-聯或S-聯糖基化序列引入親本多肽序列之內，而是通過在該親本多肽的N-或C-末端處添加肽接頭片段來延伸親本多肽的序列，其中所述肽接頭片段包含本發明的O-聯或S-聯糖基化序列，例如「PVS」。肽接頭片段可以具有任何數目的胺基酸。在一個實施方案中，肽接頭片段包含至少約5個、至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約30個、至少約50個或超過50個胺基酸殘基。肽接頭片段任選地包含內部或末端胺基酸殘基，其具有反應性官能團，例如氨基(例如，賴氨酸)或巰基(例如，半胱氨酸)。此類反應性官能團可以用於將該多肽連接至另一部分，例如另一多肽、細胞毒素、小分子藥物或另一個本發明的修飾基團。本發明的該方面進一步描述在於2007年1月18日提交的美國臨時專利申請60/881,130(該專利申請的公開內容以其整體合併入本文)中。在示例性的實施方案中，肽接頭片段包含賴氨酸殘基，其用作該接頭的分支點，例如賴氨酸的氨基用作該接頭的「臂」的附著點。在示例性的實施方案中，賴氨酸替代甲硫氨酸部分。在另一個示例性的實施方案中，通過形成二硫鍵，用具有相同或不同結構的另一個接頭片段來二聚化該接頭片段。
在一個實施方案中，用本發明的肽接頭片段修飾的親本多肽是抗體或抗體片段。在根據該實施方案的一個實例中，親本多肽是scFv。本文所述的方法可用於製備本發明的scFvs，其中scFv或接頭用糖基部分或者用通過糖基連接基團附著至該肽的修飾基團來進行修飾。糖基化和糖綴合的示例性方法在例如PCT/US02/32263和美國專利申請號10/411,012中給出，這些文獻中的每一篇通過提及而以其整體合併入本文。
發明人已經發現，當O-聯糖基化序列在糖基化位點(例如，絲氨酸或蘇氨酸殘基)附近包含脯氨酸(P)殘基時，糖基化是最有效的。在一個實施方案中，脯氨酸殘基在糖基化位點之前(被發現朝向糖基化位點的N-末端)。根據該實施方案的示例性的糖基化位點包括PVS、PB2VT和P(B2)2VT。通常，在脯氨酸殘基和糖基化位點之間存在有0至5個，優選地0至4個，和更優選地0至3個胺基酸。在另一個實施方案中，脯氨酸殘基被發現朝向糖基化位點的C-末端。根據該實施方案的示例性的本發明的O-聯糖基化位點包括SB7TP和SB7SP。
在一個實施方案中，某些胺基酸殘基被包括在O-聯糖基化序列中以調節經突變的多肽在特定生物(例如大腸桿菌)中的表達能力，該多肽的蛋白水解穩定性、結構特徵和/或其他性質。
在一個實施方案中，本發明的O-聯糖基化序列包含作為選自如下顯示的式(I)至(VI)的成員的胺基酸序列 (B1)aP(B2)bUS(B3)c(I) (B1)aP(B2)bUT(B3)c(II) (B4)dPSZ(B5)e (III) (B4)dPTZ(B5)e (IV) (B6)fS(B7)gP(B8)h (V) (B6)fT(B7)gP(B8)h (VI) 在式(I)至(VI)中，整數b和g獨立地選自0至2。整數a、c、d、e、f和h獨立地選自0至5。T是蘇氨酸，S是絲氨酸，和P是脯氨酸。U是選自V(纈氨酸)、S(絲氨酸)、T(蘇氨酸)、E(穀氨酸)、Q(穀氨醯胺)和不帶電荷的胺基酸的成員。Z是選自P、E、Q、S、T和不帶電荷的胺基酸的成員，並且B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8各自是獨立地選自胺基酸的成員。
在一個示例性的實施方案中，本發明的多糖包含作為選自下列式的成員的O-聯糖基化序列 (B1)aPVS(B3)c (SEQ ID NO16)； (B1)aPVT(B3)c (SEQ ID NO17)； (B1)aPSS(B3)c (SEQ ID NO18)； (B1)aPST(B3)c (SEQ ID NO19)； (B1)aPTS(B3)c (SEQ ID NO20)； (B1)aPB2VT(B3)c (SEQ ID NO21)； (B1)aPB2VS(B3)c (SEQ ID NO22)； (B1)aPKUT(B3)c(SEQ ID NO23)； (B1)aPKUS(B3)c(SEQ ID NO24)； (B1)aPQUT(B3)c(SEQ ID NO25)； (B1)aPQUS(B3)c(SEQ ID NO26)； (B1)aP(B2)2VS(B3)c(SEQ ID NO27)； (B1)aP(B2)2VT(B3)c(SEQ ID NO28)； (B1)aP(B2)2TS(B3)c(SEQ ID NO29)； (B1)aP(B2)2TT(B3)c(SEQ ID NO30)； (B4)dPTP(B5)e (SEQ ID NO31)； (B4)dPTE(B5)e (SEQ ID NO32)； (B4)dPSA(B5)e (SEQ ID NO33)； (B6)fSB7TP(B8)h (SEQ ID NO34)；和 (B6)fSB7SP(B8)h (SEQ ID NO35)， 其中，a、b、c、d、e、f、g、h、B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7和B8如上文所定義。
在另一個示例性的實施方案中，本發明的O-聯糖基化序列包含作為選自下列的成員的胺基酸序列 PVS(SEQ ID NO36)、PVSG(SEQ ID NO37)、PVSGS(SEQ ID NO38)、VPVS(SEQ ID NO39)、VPVSG(SEQ ID NO40)、VPVSGS(SEQ ID NO41)、PVSR(SEQ ID NO42)、PVSRE(SEQ ID NO43)、PVSA(SEQ ID NO44)、PVSAS(SEQ ID NO45)、APVS(SEQ ID NO46)、APVSA(SEQ IDNO47)、APVSAS(SEQ ID NO48)、APVSS(SEQ ID NO49)、APVSSS(SEQ ID NO50)、PVSS(SEQ ID NO51)、PVSSA(SEQ ID NO52)、PVSSAP(SEQ ID NO53)、IPVS(SEQ ID NO54)、PVSR(SEQ ID NO55)、PVSRE(SEQ ID NO56)、IPVSR(SEQ ID NO57)、VPVS(SEQ IDNO58)、VPVSS(SEQ ID NO59)、VPVSSA(SEQ ID NO60)、RPVS(SEQID NO61)、RPVSS(SEQ ID NO62)、RPVSSA(SEQ ID NO63)、PVT(SEQ ID NO64)、PSS(SEQ ID NO65)、PSST(SEQ ID NO66)、PSSTA(SEQ ID NO67)、PPSS(SEQ ID NO68)、PPSST(SEQ ID NO69)、PSSG(SEQ ID NO70)、PSSGF(SEQ ID NO71)、SPST(SEQ ID NO72)、SPSTS(SEQ ID NO73)、SPSTSP(SEQ ID NO74)、SPSS(SEQ ID NO75)、SPSSG(SEQ ID NO76)、SPSSGF(SEQ ID NO77)、PST(SEQ ID NO78)、PSTS(SEQ ID NO79)、PSTST(SEQ ID NO80)、PSTV(SEQ ID NO81)、PSTVS(SEQ ID NO82)、PSVT(SEQ ID NO83)、PSVTI(SEQ ID NO84)、PSVS(SEQ ID NO85)、PAVT(SEQ ID NO86)、PAVTA(SEQ ID NO87)、PAVTAA(SEQ ID NO88)、KPAVT(SEQ ID NO89)、KPAVTA(SEQID NO90)、PAVS(SEQ ID NO91)、PQQS(SEQ ID NO92)、PQQSA(SEQID NO93)、PQQSAS(SEQ ID NO94)、PQQT(SEQ ID NO95)、PKGS(SEQ ID NO96)、PKGSR(SEQ ID NO97)、PKGT(SEQ ID NO98)、PKSS(SEQ ID NO99)、PKSSA(SEQ ID NO100)、PKSSAP(SEQ ID NO101)、PKST(SEQ ID NO102)、PADTS(SEQ ID NO103)、PADTSD(SEQID NO104)、PADTT(SEQ ID NO105)、PIKVT(SEQ ID NO106)、PIKVTE(SEQ ID NO107)、PIKVS(SEQ ID NO108)、SPST(SEQ ID NO109)、SPSTS(SEQ ID NO110)、SPTS(SEQ ID NO111)、SPTSP(SEQ IDNO112)、PTSP(SEQ ID NO113)、SPTSP(SEQ ID NO114)、SPSA(SEQID NO115)、SPSAK(SEQ ID NO116)、TSPS(SEQ ID NO117)、TSPSA(SEQ ID NO118)、LPTP(SEQ ID NO119)、LPTPP(SEQ ID NO120)、PTPP(SEQ ID NO121)、PTPPL(SEQ ID NO122)、VPTE(SEQ ID NO123)、VPTET(SEQ ID NO124)、PTE(SEQ ID NO125)、PTET(SEQ IDNO126)、TSETP(SEQ ID NO127)、ITSETP(SEQ ID NO128)、ASVSP(SEQ ID NO129)、SASVSP(SEQ ID NO130)、VETP(SEQ ID NO131)、VETPR(SEQ ID NO132)、ETPR(SEQ ID NO133)、ACTQ(SEQ ID NO134)、ACTQG(SEQ ID NO135)和CTQG(SEQ ID NO136)， 其中每個蘇氨酸(T)獨立地可以任選地被絲氨酸(S)替代，和每個絲氨酸獨立地可以任選地被蘇氨酸替代。
其他示例性的O-聯糖基化序列公開在T.M.Leavy和C.R.Bertozzi，Bioorg.Med.Chem.Lett.2007，173851-3854中，該文獻的公開內容通過提及而以其整體合併入本文以用於所有目的。在一個實施方案中，O-聯糖基化序列包含下列胺基酸序列中的一個PIPVSRE、RIPVSRE、RIPVSRA、PIPVSRA、RIPVSRP、PIPVSRP、AIPVSRA和AIPVSRP。通常，以高效率進行糖基化的O-聯糖基化序列和使得酶向每個糖基化序列只添加一個糖基殘基的O-聯糖基化序列是優選的。
非天然存在的多肽 本發明的O-聯糖基化序列可以是任何親本或野生型多肽的一部分。在一個實施方案中，以這樣的方式來使親本序列進行突變，即使得O-聯糖基化序列插入到親本序列中，從而向親本多肽的胺基酸序列中添加全長和各自數目的胺基酸。在另一個實施方案中，O-聯糖基化序列替代了親本多肽的一個或多個胺基酸。在示例性的實施方案中，在親本肽中引入突變，使用一個或多個現有的胺基酸作為O-聯糖基化序列的一部分。例如，保持親本肽中的脯氨酸殘基並使緊接該脯氨酸之前和/或之後的那些胺基酸進行突變，以產生本發明的O-聯糖基化序列。在另一個示例性的實施方案中，通過採用胺基酸插入和現有胺基酸替代的組合，產生O-聯糖基化序列。
突變型多肽文庫 用於鑑定多肽(其當經歷糖基化或糖PEG化反應時被有效地糖基化或糖PEG化(例如，以滿意的產率))的一種策略是在親本多肽的胺基酸序列內的各個不同位置(包括例如，β-摺疊片結構域和α-螺旋結構域)處插入本發明的O-聯糖基化序列，然後就它們作為糖基轉移酶(例如，人GlcNAc轉移酶)的有效底物的能力來測試許多所得的序列肽段多肽。
因此，在另一個方面，本發明提供了序列肽段多肽文庫，其包括多個不同的成員，其中該文庫的每個成員對應於共同的親本多肽並且包含至少一個獨立選擇的本發明的外源O-聯或S-聯糖基化序列。在一個實施方案中，該文庫的每個成員包含相同的O-聯糖基化序列，它們各自在親本多肽內的不同胺基酸位置處。在另一個實施方案中，該文庫的每個成員包含不同的O-聯糖基化序列，但是在親本多肽內的相同胺基酸位置處。本文描述了可與本發明的文庫組合使用的O-聯糖基化序列。在一個實施方案中，在本發明的文庫中使用的O-聯糖基化序列具有根據式(I)的胺基酸序列。在另一個實施方案中，在本發明的文庫中使用的O-聯糖基化序列具有根據式(II)的胺基酸序列。在一個實施方案中，在本發明的文庫中使用的O-聯糖基化序列具有根據式(III)的胺基酸序列。在一個實施方案中，在本發明的文庫中使用的O-聯糖基化序列具有根據式(IV)的胺基酸序列。在一個實施方案中，在本發明的文庫中使用的O-聯糖基化序列具有根據式(V)的胺基酸序列。在一個實施方案中，在本發明的文庫中使用的O-聯糖基化序列具有根據式(VI)的胺基酸序列。
在其中文庫的每個成員具有共同的O-聯糖基化序列的一個實施方案中，親本多肽具有包括「m」個胺基酸的胺基酸序列。在一個實例中，序列肽段多肽文庫包括(a)第一種序列肽段多肽，其在親本多肽內的第一個胺基酸位置(AA)n處具有O-聯糖基化序列，其中n是選自1至m的成員；和(b)至少一種額外的序列肽段多肽，其中在每個額外的序列肽段多肽中，在額外的胺基酸位置處引入O-聯糖基化序列，每個額外的胺基酸位置選自(AA)n+x和(AA)n-x，其中x是選自1至(m-n)的成員。例如，通過在第一個胺基酸位置處引入所選的O-聯糖基化序列來產生第一種序列肽段多肽。然後，可以通過在其定位進一步朝向親本多肽的N-或C-末端的胺基酸位置處引入相同的O-聯糖基化序列來產生隨後的序列肽段多肽。
在該情況下，當n-x是0(AA0)時，那麼在緊接親本多肽的N-末端胺基酸之前引入糖基化序列。示例性的序列肽段多肽可以具有部分序列「PVSM1…」。
第一個胺基酸位置(AA)n可以在親本多肽的胺基酸序列內的任何地方。在一個實施方案中，選擇第一個胺基酸位置(例如，在環結構域的開始處)。
每個額外的胺基酸位置可以在親本多肽內的任何地方。在一個實例中，序列肽段多肽文庫包括第二種序列肽段多肽，其在選自(AA)n+p和(AA)n-p的胺基酸位置處具有O-聯糖基化序列，其中p選自1至約10，優選1至約8，更優選1至約6，更加優選1至約4，和最優選1至約2。在一個實施方案中，序列肽段多肽文庫包括在胺基酸位置(AA)n處具有O-聯糖基化序列的第一種序列肽段多肽和在胺基酸位置(AA)n+1或(AA)n-1處具有O-聯糖基化序列的第二種序列肽段多肽。
在另一個實例中，每個額外的胺基酸位置緊鄰之前所選的胺基酸位置。在另外一個實例中，每個額外的胺基酸位置與之前所選的胺基酸位置準確地相距1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸。
在親本多肽的「給定胺基酸位置」處引入O-聯或S-聯糖基化序列表示，從緊接給定胺基酸位置開始(朝向C-末端)，引入突變。引入可以通過完整插入(不替代任何現有的胺基酸)或者通過替代任何數目的現有胺基酸來進行。
在示例性的實施方案中，通過在親本多肽的連續胺基酸位置處引入O-聯糖基化序列來產生序列肽段多肽文庫，每個所述胺基酸位置與之前所選的胺基酸位置緊鄰，從而經過該胺基酸鏈而「掃描」糖基化序列，直至到達所希望的最終胺基酸位置。緊鄰是指進一步朝向親本多肽的N-或C-末端正好一個胺基酸位置。例如，通過在胺基酸位置AAn處引入糖基化序列來產生第一種突變體。通過在胺基酸位置AAn+1處引入糖基化位點來產生文庫的第二個成員，通過在胺基酸位置AAn+2處引入糖基化位點來產生第三種突變體，等等。該步驟程序被稱作「序列肽段掃描」。本領域技術人員將會意識到，序列肽段掃描可以涉及設計文庫，從而使得第一個成員在胺基酸位置(AA)n處具有糖基化序列，第二個成員在胺基酸位置(AA)n+2處具有糖基化序列、第三個成員在胺基酸位置(AA)n+4處具有糖基化序列，等等。同樣地，文庫的成員可以通過糖基化序列的其他策略性放置來表徵。例如 A)成員1(AA)n；成員2(AA)n+3；成員3(AA)n+6；成員4(AA)n+9等等； B)成員1(AA)n；成員2(AA)n+4；成員3(AA)n+8；成員4(AA)n+12等等； C)成員1(AA)n；成員2(AA)n+5；成員3(AA)n+10；成員4(AA)n+15等等。
在一個實施方案中，通過下列方式來產生第一個序列肽段多肽文庫經過親本多肽的特定區域(例如，從特定環區域的開始處到該環區域的結束處)掃描所選的本發明O-聯或S-聯糖基化序列。然後，通過下列方式來產生第二個文庫經過多肽的另一個區域掃描相同的糖基化序列，「跳過」位於所述第一個區域和所述第二個區域之間的那些胺基酸位置。該多肽鏈的不被考慮的部分可以例如對應於對於生物活性重要的結合結構域或者已知不適合於糖基化的該多肽序列的另一個區域。通過對多肽的另外的序列段進行「序列肽段掃描」，可以產生任意數目的額外文庫。在示例性的實施方案中，通過下列方式來產生文庫經過整個多肽掃描O-聯糖基化序列，其中在親本多肽內的每個胺基酸位置處引入突變。
在一個實施方案中，文庫的成員是多肽混合物的一部分。例如，用多種表達載體感染細胞培養物，其中每種載體包含本發明的不同序列肽段多肽的核酸序列。在表達後，培養液可以含有多種不同的序列肽段多肽，並從而包括序列肽段多肽文庫。該技術可以用於確定文庫的哪個序列肽段多肽在給定的表達系統中被最有效地表達。
在另一個實施方案中，文庫的成員相互分離地存在。例如，可以分離上述混合物中的至少兩種序列肽段多肽。所分離的多肽一起代表了一個文庫。備選地，文庫的每個序列肽段多肽分開地表達，並且任選地分離所述序列肽段多肽。在另一個實例中，通過化學方法來合成文庫的每個成員並任選地進行純化。
可以使用本文所描述的任何O-聯糖基化序列來產生根據本發明的突變型多肽的文庫。在優選的實施方案中，使用作為選自下列的成員的O-聯糖基化序列來產生文庫 (B1)aPVS(B3)c； (B1)aPVT(B3)c； (B1)aPSS(B3)c； (B1)aPST(B3)c； (B1)aPTS(B3)c； (B1)aPB2VT(B3)c； (B1)aPB2VS(B3)c； (B1)aPKUT(B3)c； (B1)aPKUS(B3)c； (B1)aPQUT(B3)c； (B1)aPQUS(B3)c； (B1)aP(B2)2VS(B3)c； (B1)aP(B2)2VT(B3)c； (B1)aP(B2)2TS(B3)c； (B1)aP(B2)2TT(B3)c； (B4)dPTP(B5)e； (B4)dPTE(B5)e； (B4)dPSA(B5)e； (B6)fSB7TP(B8)h；和 (B6)fSB7SP(B8)h。
示例性的非天然存在的多肽 示例性的親本多肽是重組人BMP-7。選擇BMP-7作為示例性的親本多肽是為了舉例說明目的，並且不意在限制本發明的範圍。本領域技術人員將會意識到，任何親本多肽(例如，本文所示的那些)同樣適合於下面的示例性修飾。如此獲得的任何多肽變體落入本發明的範圍內。本發明的生物學活性BMP-7變體包括任何BMP-7多肽(部分的或完整的)，其包含至少一個不導致其生物活性基本上或完全喪失的修飾，如通過本領域技術人員已知的任何合適的功能測定法所測量的。下面的序列(140個胺基酸)代表全長BMP-7序列的生物學活性部分 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO137) 基於上述親本多肽序列的示例性突變型BMP-7多肽在下面的表2至11中列出。在優選的實施方案中，通過考慮糖基轉移酶的底物要求，而產生突變型多肽。
在一個示例性的實施方案中，在野生型BMP-7胺基酸序列(SEQID NO137)中引入突變，以替代親本序列中相應數目的胺基酸，從而得到含有與親本多肽相同數目的胺基酸殘基的突變型多肽。例如，用O-聯糖基化序列「脯氨酸-纈氨酸-絲氨酸」(PVS)直接取代三個正常在BMP-7中的胺基酸，然後將PVS序列朝向該多肽的C-末端順次移動，從而提供了137個包含糖基化位點PVS的BMP-7類似物。根據該實施方案的示例性序列在下面的表2中列出。
表2包含140個胺基酸的突變型BMP-7多肽的示例性文庫，其中三個現有的胺基酸被O-聯糖基化序列「PVS」替代 在位置1處引入，替代3個現有的胺基酸 M1PVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO138) 在位置2處引入，替代3個現有的胺基酸 M1SPVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO139) 在位置3處引入，替代3個現有的胺基酸 M1STPVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO140) 通過經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。如此產生的最終突變型多肽具有下面的序列 在位置137處引入，替代3個現有的胺基酸 M1SSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACPVS(SEQ ID NO141) 在另一個示例性的實施方案中，通過向親本序列添加一個或多個胺基酸來將突變引入野生型BMP-7胺基酸序列(SEQ ID NO137)中。例如，將O-聯糖基化序列PVS添加至親本BMP-7序列，從而替代親本序列中的2、1或0個胺基酸。在一個實例中，將糖基化序列添加至親本序列的N-或C-末端。根據該實施方案的示例性序列在下面的表3中列出。
表3包含PVS的示例性BMP-7突變體(141至143個胺基酸) 在位置1處引入，不替代任何現有的胺基酸(完全插入) M1PVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO142) 在位置1處引入，替代1個現有的胺基酸(S) M1PVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO143) 在位置1處引入，替代2個現有的胺基酸(ST) M1PVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO144) 在位置138處引入，替代2個現有的胺基酸(CH)，添加1個胺基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGPVS(SEQ ID NO145) 在位置139處引入，替代1個現有的胺基酸(H)，添加2個胺基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCPVS(SEQ ID NO146) 在位置140處引入，添加3個胺基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHPVS(SEQ ID NO147) 在另一個實例中，通過向親本序列添加一個或多個胺基酸而在任何胺基酸位置處將O-聯糖基化序列引入該肽序列中。在該實例中，所添加的胺基酸殘基的最大數目相應於所插入的糖基化序列的長度。在示例性的實施方案中，親本序列延伸正好一個胺基酸。例如，將O-聯糖基化序列PVS添加至親本BMP-7肽，從而替代2個正常存在於BMP-7中的胺基酸。根據該實施方案的示例性序列在下面的表4中列出。
表4包含141個胺基酸的突變型BMP-7多肽的示例性文庫，其中兩個現有的胺基酸被O-聯糖基化序列「PVS」替代 在位置1處引入，添加1個胺基酸，替代2個胺基酸(ST) M1PVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO148) 在位置2處引入，添加1個胺基酸，替代2個胺基酸(TG) M1SPVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO149) 在位置3處引入，添加1個胺基酸，替代2個胺基酸(GS) M1STPVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO150) 在位置4處引入，添加1個胺基酸，替代2個胺基酸(SK) M1STGPVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO151) 在位置5處引入，添加1個胺基酸，替代2個胺基酸(KQ) M1STGSPVSRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO152) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
另一個實例涉及向親本BMP-7肽添加O-聯糖基化序列(例如，PVS)，從而替代1個正常存在於BMP-7中的胺基酸(雙胺基酸插入)。根據該實施方案的示例性序列在下面的表5中列出。
表5包含PVS的BMP-7突變體的示例性文庫；替代一個現有的胺基酸(142個胺基酸) 在位置1處引入，添加2個胺基酸，替代1個胺基酸(S) M1PVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO153) 在位置2處引入，添加2個胺基酸，替代1個胺基酸(T) M1SPVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO154) 在位置3處引入，添加2個胺基酸，替代1個胺基酸(G) M1STPVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO155) 在位置4處引入，添加2個胺基酸，替代1個胺基酸(S) M1STGPVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO156) 在位置5處引入，添加2個胺基酸，替代1個胺基酸(K) M1STGSPVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO157) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
另外一個實例涉及在親本BMP-7序列內產生O-聯糖基化序列，其中不替代正常存在於BMP-7中的胺基酸，並且向親本肽內的任何位置添加整個長度的糖基化序列(例如，PVS的三胺基酸插入)。根據該實施方案的示例性序列在下面的表6中列出。
表6包含PVS的BMP-7變體的示例性文庫；添加3個胺基酸(143個胺基酸) 在位置1處引入，添加3個胺基酸 M1PVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO142) 在位置2處引入，添加3個胺基酸 M1SPVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO158) 在位置3處引入，添加3個胺基酸 M1STPVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO159) 在位置4處引入，添加3個胺基酸 M1STGPVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO160) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
使用任一種本發明的O-聯糖基化序列可以產生BMP-7突變體的模擬迭代(analogues iterations)。例如，可以使用SEQ ID NOs x至x中的任一種，而不是PVS。在一個實例中，可以使用序列PAVT(SEQID NO86)或PIKVS(SEQ ID NO108)，而不是PVS。在示例性的實施方案中，將PIKVS引入親本肽中，從而替代5個正常存在於BMP-7中的胺基酸。根據該實施方案的示例性序列在下面的表7中列出。
表7包含PIKVS的BMP-7突變體的示例性文庫；替代5個胺基酸(140個胺基酸) M1PIKVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO161) M1SPIKVSRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO162) M1STPIKVSSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO163) M1STGPIKVSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO164) M1STGSPIKVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO165) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
在另一個實例中，在親本序列的N-或C-末端處或接近親本序列的N-或C-末端處向野生型BMP-7序列添加O-聯糖基化序列PIKVS，從而向野生型添加1至5個胺基酸。根據該實施方案的示例性序列在下面的表8中列出。
表8包含PIKVS的BMP-7突變體的示例性文庫(141-145個胺基酸) 氨基末端突變體 在位置1處引入，添加5個胺基酸 M1PIKVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO166) 在位置1處引入，添加4個胺基酸，替代1個胺基酸(S) M1PIKVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO167) 在位置1處引入，添加3個胺基酸，替代2個胺基酸(ST) M1PIKVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO168) 在位置1處引入，添加2個胺基酸，替代3個胺基酸(STG) M1PIKVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO169) 在位置1處引入，添加1個胺基酸，替代4個胺基酸(STGS) M1PIKVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO170) 羧基末端突變體 在位置140處引入，添加5個胺基酸 M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHPIKVS(SEQ ID NO171) 在位置139處引入，添加4個胺基酸，替代1個胺基酸(H) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCPIKVS(SEQ ID NO172) 在位置138處引入，添加3個胺基酸，替代2個胺基酸(CH) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGPIKVS(SEQ ID NO173) 在位置137處引入，添加2個胺基酸，替代3個胺基酸(GCH) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACPIKVS(SEQ ID NO174) 在位置136處引入，添加1個胺基酸，替代4個胺基酸(CGCH) M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRAPIKVS(SEQ ID NO175) 另外一個實例涉及向野生型BMP-7序列中插入O-聯糖基化序列TSETP(SEQ ID NO127)，從而向親本序列添加1至5個胺基酸。根據該實施方案的示例性序列在下面的表9中列出。
表9包含TSETP的BMP-7突變體的示例性文庫 插入一個胺基酸 M1TSETPKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO176) M1STSETPQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO177) M1STTSETPRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO178) M1STGTSETPSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO179) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
插入兩個胺基酸 M1TSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO180) M1STSETPKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO181) M1STTSETPQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO182) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
插入三個胺基酸 M1TSETPGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO183) M1STSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO184) M1STTSETPKQRS QNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO185) M1STGTSETPQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO186) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
插入四個胺基酸 M1TSETPTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO187) M1STSETPGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO188) M1STTSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO189) M1STGTSETPKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO190) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
插入五個胺基酸 M1TSETPSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO191) M1STSETPTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO192) M1STTSETPGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO193) M1STGTSETPSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO194) 通過以上述方式經過整個序列「掃描」糖基化序列可以產生另外的BMP-7突變體。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
含有O-聯糖基化序列的突變型多肽的其他實例公開在於2005年8月22日提交的美國臨時專利申請60/710,401；和於2005年9月23日提交的60/720,030；WO2004/99231和WO2004/10327中，它們為了所有目的通過提及而合併入本文。
為了鑑定親本肽內用於O-聯糖基化序列的最佳位置(例如，就糖基化、糖PEG化和生物活性而言)，產生了各種突變體和然後就所希望的性質進行篩選(「序列肽段掃描」)。在示例性的實施方案中，突變位點沿著親本肽從預先選擇的肽區域的N-末端側朝向C-末端「移動」(例如，每次一個胺基酸)。
在一個實例中，通過取代現有的胺基酸和/或通過插入來將O-聯糖基化序列(例如，PVS)置於所選肽區域內所有可能的胺基酸位置處。根據該實施方案的示例性序列在下面的表10和表11中列出。
表10在A73和A82之間包含PVS的BMP-7突變體的示例性文庫 取代現有的胺基酸A73至A82 ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO195) ---P73VSLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO196) ---A73PVSNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO197) ---A73FPVSSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO198) ---A73FPPVSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO199) ---A73FPLPVSMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO200) ---A73FPLNPVSNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO201) ---A73FPLNSPVSA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO202) ---A73FPLNSYPVS82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SEQ ID NO203) 表11在I95和P103之間包含PVS的BMP-7突變體的示例性文庫 取代現有的胺基酸I95至P103 ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFP95VSETVPKP103---(SEQ ID NO204) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95PVSTVPKP103---(SEQ ID NO205) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPVSVPKP103---(SEQ ID NO206) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPPVSPKP103---(SEQ ID NO207) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPEPVSKP103---(SEQ ID NO208) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETPVSP103---(SEQ ID NO209) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPVS103---(SEQ ID NO210) 在現有的胺基酸A73至A82之間插入(添加一個胺基酸) ---P73VSPLNSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO211) ---A73PVSLNSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO212) ---A73FPVSNSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO213) ---A73FPPVSSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO214) ---A73FPLPVSYMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO215) ---A73FPLNPVSMNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ IDNO216) ---A73FPLNSPVSNA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ ID NO217) ---A73FPLNSYPVSA83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ ID NO218) ---A73FPLNSYMPVS83TNHAIVQTLVHFI96NPETVPKP104---(SEQ ID NO219) 在現有的胺基酸I95至P103之間插入(添加一個胺基酸) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFP95VSPETVPKP104---(SEQ IDNO220) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95PVSETVPKP104---(SEQ IDNO221) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPVSTVPKP104---(SEQ IDNO222) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPPVSVPKP104---(SEQ IDNO223) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPEPVSPKP104---(SEQ IDNO224) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETPVSKP104---(SEQ IDNO225) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPVSP104---(SEQ IDNO226) ---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPPVS104---(SEQ IDNO227) 可以使用任一種其他本發明的O-聯糖基化序列(例如SEQ IDNOs36-136)來進行上面的取代和插入(例如表3-11的取代和插入)。如此獲得的所有突變型BMP-7序列都在本發明的範圍內。
在另一個示例性的實施方案中，將一個或多個O-糖基化序列，例如上文所示的那些，插入到凝血因子例如因子VII、因子VIII或因子IX多肽中。如在BMP-7的情況下所給出，可以在用BMP-7例示的各種基序的任一種之中插入O-糖基化序列。例如，可以將O-糖基化序列插入到野生型序列中，而不替代任何對於野生型序列而言天然的胺基酸。在示例性的實施方案中，將O-糖基化序列插入在多肽的N-或C-末端處或者多肽的N-或C-末端附近。在另一個示例性的實施方案中，在插入O-糖基化位點之前，除去一個或多個對於野生型多肽序列而言天然的胺基酸殘基。在另外一個示例性的實施方案中，一個或多個對於野生型序列而言天然的胺基酸殘基是O-糖基化序列的組分(例如，脯氨酸)並且O-糖基化序列包含野生型胺基酸。野生型胺基酸可以在O-糖基化序列的任一末端或者在O-糖基化序列的內部。
此外，可以用本發明的O-聯糖基化序列替代任何現有的N-聯糖基化序列。另外，可以在與一個或多個N-聯糖基化序列相鄰之處插入O-聯糖基化序列。在優選的實施方案中，O-聯糖基化序列的存在阻止了N-聯糖基化序列的糖基化。
在一個具體的實例中，所述多肽是因子VIII。因子VIII和因子VIII變體是本領域已知的。例如，美國專利號5,668,108描述了其中位置1241處的天冬氨酸被穀氨酸替代的因子VIII變體。美國專利號5,149,637描述了這樣的因子VIII變體，其包含糖基化的或非糖基化的C-末端級分；和美國專利號5,661,008描述了這樣的因子VIII變體，其包含通過至少3個胺基酸殘基而連接至胺基酸1649-2332的胺基酸1-740。因此，因子VIII的變體、衍生物、修飾物和複合物是本領域公知的，並且包括在本發明中。用於產生因子VIII的表達系統也是本領域公知的，並且包括原核和真核細胞，如在美國專利號5,633,150、5,804,420和5,422,250中所例示的。任何上面所討論的因子VIII序列都可以進行修飾以包含本發明的外源O-聯或S-聯糖基化序列。
當親本多肽是因子VIII時，根據上述任一基序，可以將O-聯糖基化序列插入到A-、B-或C-結構域中。再次，根據上面的任一基序，可以將超過一個O-聯糖基化位點插入到單個結構域或超過一個結構域中。例如，可以將O-糖基化位點插入到A、B和C結構域中的每一個，A和C結構域，A和B結構域，或者B和C結構域之中。備選地，O-聯糖基化序列可以在A和B結構域或者B和C結構域的側翼。
在另一個示例性的實施方案中，因子VIII多肽是B-結構域缺失的(BDD)因子VIII多肽。在該實施方案中，可以將O-聯糖基化序列插入到連接因子VIII異二聚體的80Kd和90Kd亞基的肽接頭中。備選地，O-聯糖基化序列可以位於A結構域和接頭或者C結構域和接頭的側翼。如在上面在BMP-7的情況下所示的，可以插入O-聯糖基化序列，其中不替代現有的胺基酸，或者可以插入O-聯糖基化序列，其中替代親本多肽的一個或多個胺基酸。
在一個實例中，因子VIII是全長或野生型因子VIII多肽。全長因子VIII多肽的示例性胺基酸序列顯示在圖10(SEQ ID NO10)和11(SEQ ID NO11)中。在另外一個實例中，所述多肽是這樣的因子VIII多肽，其中B-結構域包含比野生型或全長因子VIII的B-結構域少的胺基酸殘基。那些因子VIII多肽稱為B-結構域缺失的或部分B-結構域缺失的因子VIII。本領域技術人員將能夠鑑定出在給定的因子VIII多肽內的B-結構域。B-結構域缺失的因子VIII的示例性胺基酸序列包括在圖12-15(SEQ ID NOs12-15)中顯示的那些序列。另一個示例性的因子VIII序列公開在Sandberg等人，Seminars inHematology 38(2)4-12(2000)中，其公開內容通過提及而合併入本文。
在進一步的示例性實施方案中，親本多肽是hGH，並且根據任一上述基序來添加O-糖基化位點。
如對於本領域技術人員而言將是明顯的，包含超過一個本發明的突變型O-聯糖基化序列的多肽也在本發明的範圍內。可以引入額外的突變以允許調節多肽性質，例如生物活性、代謝穩定性(例如，降低的蛋白水解)、藥物代謝動力學等等。
一旦製備了各種突變體，就可以例如使用GlcNAc轉移酶，來評估它們作為O-聯糖基化或糖PEG化的底物的能力。可以使用本領域已知的方法來檢測和定量成功的糖基化和/或糖PEG化，例如質譜法(例如，MALDI-TOF或Q-TOF)、凝膠電泳(例如，與光密度分析法相組合)或色譜分析(例如，HPLC)。生物學測定法，例如酶抑制測定法、受體結合測定法和/或基於細胞的測定法，可以用於分析給定的多肽綴合物的生物活性。評估策略在下文中更詳細地描述(參見例如，「先導多肽的鑑定」)。選擇和/或開發可用於每種突變型多肽的化學和生物學評估的合適測定法系統在本領域技術人員的能力範圍之內。
多肽綴合物 在另一個方面，本發明提供了在本發明的多肽(例如，突變型多肽)和所選的修飾基團之間的綴合物，其中修飾基團通過糖基連接基團(例如，完整的糖基連接基團)而綴合至多肽。糖基連接基團直接結合至本發明的O-聯糖基化序列內的胺基酸殘基，或者備選地，它通過一個或多個額外的糖基殘基而結合至O-聯糖基化序列。用於製備本發明的綴合物的方法在本文中和在美國專利號5,876,980；6,030,815；5,728,554；和5,922,577，以及WO 98/31826；WO2003/031464；WO2005/070138；WO2004/99231；WO2004/10327；WO2006/074279；和美國專利申請公開2003180835中給出，這些文獻的公開內容通過提及而合併入本文以用於所有目的。
本發明的綴合物將通常對應於下列的一般性結構
其中，符號a、b、c、d和s代表正的非零整數；並且t為0或正整數。「修飾基團」是聚合物部分(例如，水溶性聚合物，例如PEG)、治療劑、生物活性試劑、可檢測的標記等等。接頭可以是一大批連接基團中的任一種(下文)。備選地，接頭可以是單鍵。肽的身份沒有限制。
示例性的肽綴合物包括O-聯葡糖胺殘基(例如，GlcNAc或GlcNH)。在一個實施方案中，葡糖胺部分自身用修飾基團衍生化並代表糖基連接基團。在另一個實施方案中，將額外的糖基殘基附著至與肽結合的葡糖胺部分。例如，向第一個葡糖胺部分添加另一個GlcNAc或GlcNH，Gal或Sia殘基，這些各自可以作為糖基連接基團。在代表性的實施方案中，O-聯糖基殘基是選自經修飾的葡糖胺模擬部分的成員GlcNAc-X＊、GlcNH-X＊、Glc-X＊、GlcNAc-GlcNAc-X＊、GlcNAc-GlcNH-X＊、GlcNH-GlcNAc-X＊、GlcNAc-Gal-X＊、GlcNH-Gal-X＊、GlcNAc-Sia-X＊、GlcNH-Sia-X＊、GlcNAc-Gal-Sia-X＊、GlcNH-Gal-Sia-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Man-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Man(Man)2(任選地包含一個或多個修飾基團)或GlcNAc-Gal-Gal-Sia-X＊，其中X＊是修飾基團。在上面的實例中，每個GlcNAc獨立地可以任選地用GlcNH替代。
在示例性的實施方案中，所述多肽是包含本發明的外源O-聯糖基化序列的非天然存在的多肽。所述多肽優選地用葡糖胺部分在糖基化序列內進行O-糖基化。使用已知向GlcNAc或GlcNH進行添加的糖基轉移酶(例如，半乳糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、葡糖基轉移酶、甘露糖基轉移酶和GlcNAc轉移酶)，可以將額外的糖殘基添加至所得的O-聯葡糖胺部分。這些方法一起可以導致獲得包含兩個或更多個糖殘基的糖基結構。
修飾基團通過糖基連接基團而共價附著至多肽，所述糖基連接基團插入在所述多肽和所述修飾基團之間。糖基連接基團共價附著至多肽的胺基酸殘基或糖肽的糖基殘基。如本文所討論的，修飾基團基本上是可以附著至糖基或糖基模擬部分的任何種類，這導致「經修飾的糖」。可以將經修飾的糖摻入到由合適的轉移酶所識別的糖基供體(例如，經修飾的糖核苷酸)中，所述轉移酶將該經修飾的糖附加到多肽或糖肽上。
示例性的修飾基團選自糖苷的(例如，葡聚糖、聚唾液酸)和非糖苷的修飾基團，並且包括聚合物(例如，PEG)和多肽(例如，酶、抗體、抗原等)。示例性的非糖苷的修飾基團選自線性和支化的，並且可以包含一個或多個獨立選擇的聚合物部分，例如聚(亞烷基二醇)和其衍生物。在示例性的實施方案中，修飾基團是水溶性聚合物基團，例如，聚(乙二醇)和其衍生物(PEG、m-PEG)或者聚(丙二醇)和其衍生物(PPG、m-PPG)等等。在優選的實施方案中，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)具有基本上均勻分散的分子量。額外的修飾基團在下文中描述。在一個實施方案中，將糖基連接基團共價連接至至少一個聚合物的、非糖苷的修飾基團。
在一個實施方案中，本發明提供了多肽綴合物，其在它們的取代模式方面是高度同質的。使用本發明的方法，可能形成這樣的肽綴合物，其中在本發明的綴合物群體中基本上所有經修飾的糖部分都附著至結構上相同的胺基酸或糖基殘基。因此，在示例性的實施方案中，本發明提供了多肽綴合物，其包含通過糖基連接基團而共價結合至該多肽的O-聯糖基化序列內的胺基酸殘基(例如，蘇氨酸)的一個或多個水溶性聚合物部分。在一個實例中，每個具有與之附著的糖基連接基團的胺基酸殘基都具有相同的結構。在另一個示例性的實施方案中，水溶性聚合物部分的群體的基本上每個成員都通過糖基連接基團而結合至多肽的糖基殘基，並且其上附著了糖基連接基團的肽的每個糖基殘基具有相同的結構。
因此，本發明提供了非天然存在的多肽和聚合物修飾基團之間的共價綴合物，其中所述多肽對應於親本多肽。所述非天然存在的多肽的胺基酸序列包含至少一個在相應的親本多肽中不存在或者在相應的親本多肽中的相同位置處不存在的外源O-聯糖基化序列。在優選的實施方案中，所述O-聯糖基化序列是GlcNAc轉移酶的底物。在一個實例中，所述O-聯糖基化序列包含具有羥基的胺基酸殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)，並且所述聚合物修飾基團通過糖基連接基團在所述O-聯糖基化序列的所述羥基處共價連接至所述多肽。
在示例性的實施方案中，本發明的綴合物具有根據式(VII)的結構，其中w是選自0和1的整數，和q是選自0和1的整數
在式(VII)中，AA-O是從具有被羥基取代的側鏈的胺基酸殘基(例如，絲氨酸或蘇氨酸)衍生而得的部分，其中所述胺基酸位於本發明的O-聯糖基化序列內。當q是1時，所述胺基酸是所述多肽的內部胺基酸，和當q為0時，所述胺基酸是N-末端或C-末端胺基酸。Z＊是選自葡糖胺部分、葡糖胺模擬部分、包含葡糖胺部分的寡糖和包含葡糖胺模擬部分的寡糖的成員。X＊是選自聚合物修飾基團和包含聚合物修飾基團的糖基連接基團的成員。在一個實例中，Z＊是葡糖胺部分，和X＊是聚合物修飾基團。
在一個示例性的實施方案中，X＊是聚合物修飾基團。在另一個示例性的實施方案中，Z＊是選自下列的成員GlcNAc，GlcNH，Glc，GlcNAc-Fuc，GlcNAc-GlcNAc，GlcNH-GlcNH，GlcNAc-GlcNH，GlcNH-GlcNAc，GlcNAc-Gal，GlcNH-Gal，GlcNAc-Sia，GlcNH-Sia，GlcNAc-Gal-Sia，GlcNH-Gal-Sia，GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia，GlcNH-GlcNH-Gal-Sia，GlcNAc-GlcNH-Gal-Sia，GlcNH-GlcNAc-Gal-Sia，GlcNAc-GlcNAc-Man，GlcNAc-GlcNAc-Man(Man)2，GlcNAc-Gal-Gal-Sia以及GlcNAc、GlcNH、Gal、Glc、Man、Fuc和Sia的其他組合。在一個實施方案中，X＊是聚合物修飾基團，和Z＊是選自GlcNAc和GlcNH的成員。
糖基連接基團 當插入在多肽和修飾基團之間時，經修飾的糖的糖組分變成「糖基連接基團」。在示例性的實施方案中，從單糖或寡糖形成糖基連接基團，所述單糖或寡糖在用修飾基團進行修飾後，是合適的糖基轉移酶的底物。在另一個示例性的實施方案中，從糖基模擬部分形成糖基連接基團。本發明的多肽綴合物可以包含單價或多價的糖基連接基團(即單和多觸角結構)。因此，本發明的綴合物包含這樣的種類，其中所選的部分通過單價糖基連接基團而附著至肽。本發明還包括這樣的綴合物，其中超過一個修飾基團通過多價連接基團而附著至多肽。
在示例性的實施方案中，本發明的共價綴合物包含根據式(VIII)的部分
在式(VIII)中，G是選自-CH2-和C＝A的成員，其中A是選自O、S和NR28的成員，其中R28是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員。E是選自O、S、NR27和CH2的成員，其中R27是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員。E1是選自O和S的成員。R21、R22、R23和R24是獨立地選自H、OR25、SR25、NR25R26、NR25S(O)2R26、S(O)2NR25R26、NR25C(O)R26、C(O)NR25R26、C(O)OR25、醯基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員，其中R25和R26是獨立地選自H、醯基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烷基和修飾基團的成員。優選地，R21、R22、R23、R24、R27和R28中的至少一個包含聚合物修飾基團。
在另一個示例性的實施方案中，本發明的共價綴合物包含根據式(IX)的部分
其中X＊是選自線性和支化的聚合物修飾基團；La是選自鍵和接頭基團的成員，和R28是選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烷基的成員。
在另外一個示例性的實施方案中，本發明的共價綴合物包含根據式(X)的部分
在一個實例中，修飾基團包含作為選自下列的成員的部分
其中p和p1是獨立地選自1至20的整數。每個n是獨立地選自1至5000的整數，和m是1-5的整數。R1是選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、-NR12R13、-OR12和-SiR12R13的成員，其中R12和R13是獨立地選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基的成員。在一個實例中，R1是選自OH和OR12的成員，其中R12是選自C1、C2、C3、C4、C5和C6烷基的成員。在另一個實例中，R1是選自OH和OMe的成員。
在一個實例中，修飾基團X＊是支化的並且包含至少兩個聚合物部分。示例性的經修飾的糖提供在下面

其中R1和R2是獨立地選自OH和OMe的成員，和p是1至20的整數。
修飾基團 本發明的修飾基團可以是任何化學部分。示例性的修飾基團在下文討論。可以就它們改變給定多肽的性質(例如，生物學或物理化學性質)的能力來選擇修飾基團。通過使用修飾基團可以改變的示例性多肽性質包括但不限於，藥物代謝動力學、藥效動力學、代謝穩定性、生物分布、水溶性、親脂性、組織靶向能力和治療活性譜。優選的修飾基團是這樣的修飾基團，其改良經修飾的多肽的藥效動力學和藥物代謝動力學(當與相應的未修飾的多肽相比較時)。其他修飾基團可以用於產生這樣的多肽，所述多肽可用於診斷應用或體外生物學測定法系統。
例如，用聚乙二醇(PEG)部分可以增強治療性糖肽的體內半壽期。用PEG對多肽進行化學修飾(PEG化)增加它們的分子大小並且通常減小表面-和官能團-可接近性，每種都取決於附著至多肽的PEG部分的數目和大小。通常，該修飾導致血漿半壽期和蛋白水解穩定性的改良，以及免疫原性和肝攝取的減小(Chaffee等人J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等人Res.Commun.Chem.PatholPharmacol.29113-127(1980))。例如，據報導，白細胞介素-2的PEG化增強了它的體內抗腫瘤效力(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA.841487-1491(1987))，並且源自單克隆抗體A7的F(ab』)2的PEG化改良了其腫瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))。
在一個實施方案中，相對於未衍生化的親本多肽的體內半壽期而言，通過本發明的方法用PEG部分進行衍生化的肽的體內半壽期得到了增加。多肽體內半壽期的增加可以表示為相對於親本多肽的增加百分比範圍。增加百分比範圍的下端為約40％、約60％、約80％、約100％、約150％或約200％。範圍的上端為約60％、約80％、約100％、約150％或大於約250％。
水溶性聚合物修飾基團 在一個實施方案中，修飾基團是選自線性和支化的聚合物修飾基團。在一個實例中，修飾基團包含一個或多個聚合物部分，其中每個聚合物部分獨立地進行選擇。
許多水溶性聚合物是本領域技術人員已知的，並且可用於實施本發明。術語「水溶性聚合物」包括下列種類例如糖類(例如，葡聚糖、直鏈澱粉、透明質酸、聚(唾液酸)、乙醯肝素類、肝素類，等等)；聚(胺基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(穀氨酸)；核酸；合成聚合物(例如，聚(丙烯酸)，聚(醚)，例如聚(乙二醇)；肽，蛋白質等等。本發明可以用任何水溶性聚合物來實施，唯一的限制是所述聚合物必須包含綴合物的其餘部分的附著點。
使用修飾基團的反應性衍生物(例如，反應性PEG類似物)將修飾基團附著至一個或多個多肽部分在本發明的範圍內。本發明不受反應性類似物的身份的限制。
在優選的實施方案中，修飾基團是PEG或PEG類似物。聚(乙二醇)的許多經活化的衍生物可以通過商業途徑獲得，並且描述在文獻中。選擇和(如果需要)合成合適的經活化的PEG衍生物(其用於製備在本發明中可使用的底物)完全在本領域技術人員的能力範圍之內。參見，Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983)，三氟乙磺酸酯(Nilsson等人，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羥基琥珀醯亞胺衍生的活性酯類(Buckmann等人，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983))；碳酸酯類(Zalipsky等人，Poly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))；咪唑基甲酸酯類(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等人，Blood，711641-1647(1988))；4-聯硫基吡啶類(Woghiren等人，Bioconjugate Chem.，4314-318(1993))；異氰酸酯類(Byun等人，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和環氧化物(美國專利號4,806,595，頒發給Noishiki等人，(1989))。其他連接基團包括氨基和活化的PEG之間的氨基甲酸乙酯連接。參見，Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985)。
用於活化聚合物的方法可以在WO 94/17039、美國專利號5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、美國專利號5,219,564、美國專利號5,122,614、WO 90/13540、美國專利號5,281,698以及WO93/15189中找到，和關於經活化的聚合物和肽之間的綴合，所述肽例如為凝固因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO 94/09027)、載氧分子(美國專利號4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11141-45(1985))。
可用於本發明的經活化的PEG分子以及製備那些試劑的方法是本領域已知的，並且描述於例如WO04/083259中。
適合於活化用於製備本文所示化合物的線性PEG的活化基團或離去基團包括但不限於下列種類
示例性的水溶性聚合物是這樣的聚合物，其中聚合物樣品中實質比例的聚合物分子具有大約相同的分子量；此類聚合物是「均勻分散的」。
通過提及聚(乙二醇)綴合物來進一步舉例說明本發明。關於PEG的官能化和綴合的一些綜述和專著是可得的。參見例如，Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods inEnzymology 13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie，575-29(2002)。使用反應性分子來製備反應性PEG分子和形成綴合物的途徑是本領域已知的。例如，美國專利號5,672,662公開了聚合物酸的活性酯的水溶性且可分離的綴合物，所述聚合物酸選自線性或支化的聚(環氧烷)、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)和聚(丙烯醯嗎啉)。
美國專利號6,376,604提出了通過將聚合物的末端羥基與二(1-苯並三唑基)碳酸酯在有機溶劑中進行反應來製備水溶性且非肽聚合物的水溶性1-苯丙三唑基碳酸酯的方法。將活性酯用於與生物學活性試劑例如多肽一起形成綴合物。
WO 99/45964描述了包含生物學活性試劑和經活化的水溶性聚合物的綴合物，所述聚合物包含聚合物主鏈，所述聚合物主鏈具有至少一個通過穩定的連接而連接至聚合物主鏈的末端，其中至少一個末端包含分支部分，所述分支部分具有連接至該分支部分的近側反應性基團，其中所述生物學活性試劑連接至所述近側反應性基團中的至少一個。其他支化的聚(乙二醇)描述於WO 96/21469中，美國專利號5,932,462描述了用支化的PEG分子形成的綴合物，所述支化的PEG分子包含含有反應性官能團的支化末端。游離的反應性基團可以用於與生物學活性種類例如多肽反應，從而在聚(乙二醇)和生物學活性種類之間形成綴合物。美國專利號5,446,090描述了雙官能PEG接頭以及它在形成在每個PEG接頭末端具有多肽的綴合物中的用途。
包含可降解的PEG連接的綴合物描述於WO 99/34833；和WO99/14259，以及美國專利號6,348,558中。此類可降解的連接可應用於本發明。
上面給出的聚合物活化的本領域公認的方法可用於本發明的情況，從而形成本文所示的支化的聚合物，並且還可用於將這些支化的聚合物綴合至其他種類，例如糖、糖核苷酸等等。
示例性的水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如甲氧基-聚(乙二醇)。用於本發明的聚(乙二醇)不限於任何具體的形式或分子量範圍。對於非支化的聚(乙二醇)分子，分子量優選為500至100,000。優選使用2000-60,000，更優選約5,000至約40,000的分子量。
用於本發明的示例性的聚(乙二醇)分子包括但不限於，具有下式的那些
其中，R8是H、OH、NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的雜烷基，例如縮醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q或-(CH2)qC(Y)Z1。指數「e」表示1至2500的整數。指數b、d和q獨立地表示0至20的整數。符號Z和Z1獨立地表示OH，NH2，離去基團，例如咪唑，對硝基苯基，HOBT，四唑，滷化物，S-R9，經活化的酯的醇部分；-(CH2)pC(Y1)V，或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符號Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符號X、Y、Y1、A1和U獨立地表示部分O、S、N-R11。符號V表示OH、NH2、滷素、S-R12、經活化的酯的醇組分、經活化的醯胺的胺組分、糖核苷酸和蛋白質。指數p、q、s和v是獨立地選自0至20的整數的成員。符號R9、R10、R11和R12獨立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜環烷基和取代或未取代的雜芳基。
可用於形成本發明綴合物的聚(乙二醇)是線性的或支化的。適合用於本發明的支化的聚(乙二醇)分子包括但不限於，下式描述的那些
其中，R8和R8』是獨立地選自上面對於R8所定義的基團的成員。A1和A2是獨立地選自上面對於A1所定義的基團的成員。指數e、f、o和q如上所述。Z和Y如上所述。X1和X1』是獨立地選自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH的成員。
在其他示例性的實施方案中，支化的PEG基於半胱氨酸、絲氨酸或二賴氨酸核心。在另一個示例性的實施方案中，聚(乙二醇)分子選自下列的結構
在進一步的實施方案中，聚(乙二醇)是附著有超過一個PEG部分的支化的PEG。支化的PEG的實例描述於下列文獻中美國專利號5,932,462；美國專利號5,342,940；美國專利號5,643,575；美國專利號5,919,455；美國專利號6,113,906；美國專利號5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5283-288(1994)；和Yamasaki等人，Agric.Biol.Chem.，522125-2127，1998。在優選的實施方案中，支化的PEG的每個聚(乙二醇)的分子量小於或等於40,000道爾頓。
代表性的聚合物修飾部分包含基於含有側鏈的胺基酸例如絲氨酸、半胱氨酸、賴氨酸以及小肽例如lys-lys的結構。示例性的結構包括
本領域技術人員將會意識到，二賴氨酸結構中的游離胺也可以通過醯胺或氨基甲酸乙酯鍵用PEG部分進行PEG化。
在另外一個實施方案中，聚合物修飾部分是基於三賴氨酸肽的支化的PEG部分。該三賴氨酸可以被單-、二-、三-或四-PEG化。根據該實施方案的示例性種類具有下式
其中，指數e、f和f』是1至2500的獨立選擇的整數；和指數q、q』和q」是1至20的獨立選擇的整數。
如對於本領域技術人員而言將是明顯的，用於本發明的支化的聚合物包括上述專題中的變化形式。例如，上面所示的二賴氨酸-PEG綴合物可以包括三個聚合物亞單位，第三個亞單位鍵合到上面結構中顯示為未修飾的α-胺。類似地，使用以所希望的方式用標記有聚合物修飾部分的3或4個聚合物亞單位進行官能化的三賴氨酸在本發明的範圍內。
可用於形成具有支化的修飾基團(其包含一個或多個聚合物部分(例如，PEG))的多肽綴合物的示例性前體具有下式
在一個實施方案中，根據該式的支化的聚合物種類是基本上純的水溶性聚合物。X3』是包含可電離的官能團(例如，OH、COOH、H2PO4、HSO3、NH2和其鹽等等)或其他反應性官能團(例如，下文)的部分。C是碳。X5是非反應性基團(例如，H、CH3、OH等等)。在一個實施方案中，X5優選地不是聚合物部分。R16和R17獨立地選自非反應性基團(例如，H、未取代的烷基、未取代的雜烷基)和聚合物臂(例如，PEG)。X2和X4是優選在生理條件下基本上不具有反應性的連接片段。X2和X4獨立地進行選擇。示例性的接頭既不包含芳香族部分也不包含酯部分。備選地，這些連接可以包含被設計成在生理學相關條件下降解的一個或多個部分，例如酯、二硫化物，等等。X2和X4將聚合物臂R16和R17連接至C。在一個實施方案中，當X3』與接頭、糖或接頭-糖盒上的具有互補反應性的反應性官能團反應時，X3』被轉化為連接片段的組分。
包括X2和X4的示例性連接片段獨立地進行選擇，並且包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、和OC(O)NH、CH2、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY』-PEG，其中Y』為S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O，和o為1至50的整數。在示例性的實施方案中，連接片段X2和X4是不同的連接片段。
在示例性的實施方案中，上述前體之一或其活化的衍生物與糖、活化的糖或糖核苷酸反應並從而結合至糖、活化的糖或糖核苷酸，所述反應是通過X3』和糖部分上的具有互補反應性的基團例如胺之間的反應來進行的。備選地，根據下面的方案2，X3』與接頭La的前體上的反應性官能團進行反應。
方案2
在示例性的實施方案中，修飾基團衍生自天然或非天然的胺基酸、胺基酸類似物或胺基酸模擬物，或者從一種或多種這些種類形成的小肽。例如，在本發明化合物中發現的某些支化的聚合物具有下列通式
在該實例中，通過支化的聚合物修飾部分的前體上的反應性官能團(例如X3』)和糖部分或接頭前體上的反應性官能團之間的反應來形成連接片段C(O)La。例如，當X3』是羧酸時，它可以被活化並直接結合至從氨基-糖(例如Sia、GalNH2、GlcNH2、ManNH2等等)上懸掛出的胺基團，從而形成醯胺。另外的示例性的反應性官能團和活化的前體在下文描述。所述符號具有與上面所討論的相同的身份。
在另一個示例性的實施方案中，La是具有下列結構的連接部分
其中，Xa和Xb是獨立選擇的連接片段，並且L1選自鍵、取代或未取代的烷基或者取代或未取代的雜烷基。
Xa和Xb的示例性種類包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O、和OC(O)NH。
在另一個示例性的實施方案中，X4是結合至R17的肽鍵，R17是胺基酸、二肽(例如，Lys-Lys)或三肽(例如，Lys-Lys-Lys)，其中α-胺部分和/或側鏈雜原子用聚合物修飾部分進行修飾。
上面給出的本發明的實施方案通過參考如下種類來進一步舉例說明，在所述種類中，聚合物是水溶性聚合物，特別是聚(乙二醇)(「PEG」)，例如甲氧基-聚(乙二醇)。本領域技術人員將會意識到，下面部分中的焦點是為了清楚地舉例說明，並且使用PEG作為示例性聚合物而給出的各種基序同樣可應用於其中利用除PEG之外的其他聚合物的種類。
在本發明中使用任何分子量例如1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa和80kDa的PEG。
在其他示例性的實施方案中，多肽綴合物包含選自下列的部分
在上面的式中的每一個中，指數e和f獨立地選自1至2500的整數。在進一步的示例性實施方案中，選擇e和f以提供為約1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa和80kDa的PEG部分。符號Q表示取代或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基，例如甲基)、取代或未取代的雜烷基或H。
其他支化的聚合物具有基於二賴氨酸(Lys-Lys)肽的結構，例如
和基於三賴氨酸肽(Lys-Lys-Lys)的結構，例如
在上面的圖式中的每一個中，指數e、f、f』和f」表示獨立地選自1至2500的整數。指數q、q』和q」表示獨立地選自1至20的整數。
在另一個示例性的實施方案中，本發明的綴合物包含為選自下列的成員的式
其中，Q是選自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成員。指數e和f是獨立地選自1至2500的整數，和指數q是選自0至20的整數。
在另一個示例性的實施方案中，本發明的綴合物包含為選自下列的成員的式
其中，Q是選自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成員，優選Me。指數e、f和f』是獨立地選自1至2500的整數，以及q和q』是獨立地選自1至20的整數。
在另一個示例性的實施方案中，本發明的綴合物包含根據下式的結構
其中，指數m和n是獨立地選自0至5000的整數。指數j和k是獨立地選自0至20的整數。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是獨立地選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的雜芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13的成員。A12和A13是獨立地選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的環烷基、取代或未取代的雜環烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的雜芳基的成員。
在根據上式的一個實施方案中，支化的聚合物具有根據下式的結構
在示例性的實施方案中，A1和A2是獨立地選自-OCH3和OH的成員。
在另一個示例性的實施方案中，接頭La是選自氨基甘氨酸衍生物的成員。根據該實施方案的示例性的聚合物修飾基團具有根據下式的結構
在一個實例中，A1和A2是獨立地選自OCH3和OH的成員。根據該實例的示例性的聚合物修飾基團包括
在每個上面的實施方案(其中修飾基團包含立體中心，例如，包含胺基酸接頭或基於甘油的接頭的那些)中，立體中心可以是外消旋的或者確定的。在一個實施方案(其中此類立體中心是確定的)中，它具有(S)構型。在另一個實施方案中，立體中心具有(R)構型。
本領域技術人員將會意識到，支化的聚合物的一個或多個m-PEG臂可以用具有不同末端(例如，OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等等)的PEG部分來代替。此外，上面的結構容易地通過在α-碳原子和側鏈的官能團之間插入烷基接頭(或者除去碳原子)來進行修飾。因此，「同型(homo)」衍生物和高級同系物，以及低級同系物在用於本發明的支化PEG的核心的範圍內。
通過諸如在下面方案3中給出的方法可以容易地製備本文所示的支化的PEG種類 方案3支化的PEG種類的製備
其中，Xa是O或S，並且r是1至5的整數。指數e和f是1至2500的獨立選擇的整數。
因而，根據方案3，將天然或非天然的胺基酸與活化的m-PEG衍生物接觸，在甲苯磺酸酯的情況中，通過使側鏈雜原子Xa烷基化而形成1。使單官能化的m-PEG胺基酸與反應性m-PEG衍生物一起經歷N-醯化條件，從而裝配出支化的m-PEG 2。如本領域技術人員將會意識到的，甲苯磺酸酯離去基團可以用任何合適的離去基團例如滷素、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等來代替。類似地，用於使胺醯化的反應性碳酸酯可以用活性酯例如N-羥基琥珀醯亞胺等來代替，或者該酸可以用脫水劑例如二環己基碳二亞胺、羰基二咪唑等在原位活化。
在示例性的實施方案中，修飾基團是PEG部分，然而，任何修飾基團，例如水溶性聚合物、水不溶性聚合物、治療性部分等可以通過合適的連接而摻入糖基部分中。通過酶學方法、化學方法或其組合來形成經修飾的糖，從而產生經修飾的糖。在示例性的實施方案中，所述糖在任何位置被活性胺取代，所述位置允許修飾部分的附著，然而仍然允許該糖用作能夠將經修飾的糖偶聯至G-CSF多肽的酶的底物。在示例性的實施方案中，當半乳糖胺為所述經修飾的糖時，胺部分附著至6-位的碳原子。
水不溶性聚合物 在另一個實施方案中，類似於上面討論的那些，經修飾的糖包含水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本發明的綴合物也可以包含一種或多種水不溶性聚合物。本發明的該實施方案通過使用綴合物作為載體來舉例說明，使用該載體以受控的方式遞送治療性多肽。聚合物藥物遞送系統是本領域已知的。參見例如，Dunn等人，Eds.Polymeric Drugs And Drug Delivery Systems，ACS Symposium SeriesVol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本領域技術人員將會意識到，實質上任何已知的藥物遞送系統均可應用於本發明的綴合物。
代表性的水不溶性聚合物包括但不限於，聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚醯胺、聚碳酸酯、聚亞烷基(polyalkylenes)、聚丙烯醯胺、聚亞烷基二醇、聚環氧烷、聚亞烷基對苯二甲酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚滷乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚矽氧烷、聚氨酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸異丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸異癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸異丙酯)、聚(丙烯酸異丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(環氧乙烷)、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普流羅尼克類(pluronics)和聚乙烯基苯酚以及其共聚物。
用於本發明綴合物的經合成修飾的天然聚合物包括但不限於，烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。廣泛類別的經合成修飾的天然聚合物中特別優選的成員包括但不限於，甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三乙酸纖維素、硫酸纖維素鈉鹽以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯與藻酸的聚合物。
本文討論的這些和其他聚合物可以容易地從商業來源例如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)獲得，或者使用標準技術從獲自這些供應商的單體來合成。
用於本發明綴合物的代表性的生物可降解聚合物包括但不限於，聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己內酯)、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、其共混物和共聚物。特別有用的是形成凝膠的組合物，例如包含膠原、普流羅尼克類等的那些。
用於本發明的聚合物包括「雜合」聚合物，其包含在它們的結構的至少一部分內具有生物可吸收分子的水不溶性物質。此類聚合物的實例是包含水不溶性共聚物的聚合物，所述共聚物的每條聚合物鏈具有生物可吸收區域、親水性區域和多個可交聯官能團。
對於本發明的目的，「水不溶性物質」包括基本上不溶於水或含水環境的物質。因此，儘管共聚物的某些區域或鏈段可以是親水性的或者甚至水溶性的，但是聚合物分子(作為整體)在水中沒有任何顯著程度的溶解。
對於本發明的目的，術語「生物可吸收分子」包含能夠由身體進行代謝或分解和吸收和/或通過正常排洩途徑消除的區域。此類代謝物或分解產物優選地對身體是基本上無毒的。
生物可吸收區域可以是疏水性的或親水性的，只要該共聚物組合物作為整體不變得水溶性。因此，基於聚合物作為整體保持水不溶性的優先情況來選擇生物可吸收區域。因此，選擇生物可吸收區域和親水性區域的相對性質，即生物可吸收區域和親水性區域所包含的官能團的種類，以及生物可吸收區域和親水性區域的相對比例，以確保可用的生物可吸收組合物保持水不溶性。
示例性的可吸收的聚合物包括，例如合成產生的聚(α-羥基-羧酸)/聚氧化烯的可吸收的嵌段共聚物(參見，Cohn等人，美國專利號4,826,945)。這些共聚物不是交聯的並且是水溶性的，從而使得身體可以排洩出經降解的嵌段共聚物組合物。參見Younes等人，J Biomed.Mater.Res.211301-1316(1987)；和Cohn等人，J Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前優選的生物可吸收聚合物包括選自下列的一種或多種組分聚酯、聚羥基酸、聚內酯、聚醯胺、聚(酯-醯胺)、聚胺基酸、聚酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酸酯、聚硫酯、多糖及其混合物。更優選地，生物可吸收聚合物包括聚羥基酸組分。在聚羥基酸中，優選聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸以及其共聚物和混合物。
除了形成在體內被吸收(「生物吸收」)的片段外，用於本發明方法的優選的聚合物包衣也可以形成可排洩和/或可代謝的片段。
本發明中還可以使用高級共聚物。例如，Casey等人，美國專利號4,438,253(於1984年3月20日頒發)公開了從聚(乙醇酸)和具有羥基末端的聚(亞烷基二醇)的酯交換產生的三嵌段共聚物。此類組合物被公開用作可吸收的單絲縫合線。通過向共聚物結構中摻入芳香族原碳酸酯，例如原碳酸四對甲苯酯來控制此類組合物的柔韌性。
也可以利用其他基於乳酸和/或乙醇酸的聚合物。例如，Spinu，美國專利號5,202,413(於1993年4月13日頒發)公開了生物可降解多嵌段共聚物，其具有順序排列的聚丙交酯和/或聚乙交酯嵌段，通過丙交酯和/或乙交酯開環聚合至低聚二醇或二胺殘基上，接著用雙官能化合物例如二異氰酸酯、二醯氯或二氯矽烷進行鏈延伸來產生。
可用於本發明的包衣的生物可吸收區域可以被設計成可水解和/或可酶促切割的。對於本發明的目的，「可水解切割的」是指共聚物，尤其是生物可吸收區域在水或含水環境中對於水解的易感性。類似地，如本文所使用的，「可酶促切割的」是指共聚物，尤其是生物可吸收區域對於內源或外源酶切割的易感性。
當置於身體中時，親水性區域可以被加工成可排洩和/或可代謝的片段。因此，親水性區域可以包括，例如聚醚、聚環氧烷、多元醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烷基噁唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白質以及其共聚物和混合物。此外，親水性區域還可以是例如聚環氧烷。此類聚環氧烷可以包括，例如聚環氧乙烷、聚環氧丙烷以及其混合物和共聚物。
作為水凝膠的組分的聚合物也可以用於本發明。水凝膠是能夠吸收相對大量的水的聚合物材料。形成水凝膠的化合物的實例包括但不限於，聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明膠、角叉菜聚糖和其他多糖、羥基亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)以及其衍生物，等等。可以產生穩定的、生物可降解的和生物可吸收的水凝膠。此外，水凝膠組合物可以包括顯示出一種或多種這些性質的亞單位。
其完整性可以通過交聯來進行控制的生物相容的水凝膠組合物是已知的，並且目前優選用於本發明的方法中。例如，Hubbell等人，美國專利號5,410,016(於1995年4月25日頒發)和5,529,914(於1996年6月25日頒發)公開了水溶性系統，其是交聯的嵌段共聚物，該共聚物具有夾在兩個水解不穩定的延長部分之間的水溶性中心嵌段鏈段。此類共聚物進一步用可光聚合的丙烯酸酯官能度進行封端。當交聯時，這些系統變成水凝膠。此類共聚物的水溶性中心嵌段包含聚(乙二醇)；而水解不穩定的延長部分可以是聚(α-羥基酸)，例如聚乙醇酸或聚乳酸。參見Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一個實施方案中，所述凝膠是熱致可逆的凝膠。包含諸如下列組分的熱致可逆的凝膠目前是優選的普流羅尼克類、膠原、明膠、透明質酸、多糖、聚氨酯水凝膠、聚氨酯-脲水凝膠及其組合。
在另外一個示例性的實施方案中，本發明的綴合物包含脂質體的組分。可以根據本領域技術人員已知的方法(例如，在Eppstein等人，美國專利號4,522,811(於1985年6月11日頒發)所描述的)來製備脂質體。例如，可以通過下列方式來製備脂質體製劑將合適的脂質(例如，硬脂醯磷脂醯乙醇胺、硬脂醯磷脂醯膽鹼、花生醯(arachadoyl)磷脂醯膽鹼和膽固醇)溶解在無機溶劑中，然後蒸發所述無機溶劑，從而在容器表面上留下乾燥脂質的薄膜。然後向容器中引入活性化合物或其可藥用鹽的水溶液。然後用手旋動容器以從容器側面釋放脂質物質並分散脂質聚集體，從而形成脂質體懸浮液。
為了舉例而提供上述微粒和製備微粒的方法，並且它們並不意在限定用於本發明的微粒的範圍。對於本領域技術人員而言明顯的是，通過不同方法製造的一大批微粒可用於本發明。
上面在直連和支化的水溶性聚合物情況下所討論的結構形式一般也可應用於水不溶性聚合物。因此，例如，半胱氨酸、絲氨酸、二賴氨酸和三賴氨酸分枝核心可以用兩個水不溶性聚合物部分來官能化。用於產生這些種類的方法一般與用於產生水溶性聚合物的那些方法非常相似。
其他修飾基團 本發明還提供了類似於上面所描述的那些的綴合物，其中多肽通過糖基連接基團而綴合至治療性部分、診斷性部分、靶向性部分、毒素部分等等。上述部分中的每一種可以是小分子、天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。
在進一步的實施方案中，本發明提供了這樣的綴合物，其由於存在作為該綴合物的組分的靶向性試劑而選擇性地定位於特定組織中。在示例性的實施方案中，所述靶向性試劑是蛋白質。示例性的蛋白質包括轉鐵蛋白(腦、血池)，HS-糖蛋白(骨、腦、血池)，抗體(腦、具有抗體特異性抗原的組織、血池)，凝血因子V-XII(受損的組織、血塊、癌症、血池)，血清蛋白，例如α-酸性糖蛋白，胎球蛋白，α-胎兒蛋白(腦、血池)，β2-糖蛋白(肝臟、動脈粥樣硬化斑、腦、血池)，G-CSF，GM-CSF，M-CSF和EPO(免疫刺激、癌症、血池、紅細胞過量產生、神經保護)，白蛋白(半壽期增加)，IL-2和IFN-α。
在示例性的靶向綴合物中，將幹擾素-α2β(IFN-α2β)通過雙官能接頭綴合至轉鐵蛋白，所述雙官能接頭在PEG部分的每個末端包含糖基連接基團(方案1)。例如，PEG接頭的一個末端用附著至轉鐵蛋白的完整唾液酸接頭進行官能化，和另一末端用附著至IFN-α2β的完整C-聯Man接頭進行官能化。
生物分子 在另一個實施方案中，經修飾的糖攜帶有生物分子。在進一步的實施方案中，生物分子是功能性蛋白質、酶、抗原、抗體、肽、核酸(例如，單核苷酸或核苷、寡核苷酸、多核苷酸以及單鏈或更高鏈的核酸)、凝集素、受體或其組合。
優選的生物分子是基本上不發螢光的，或者發出如此少量的螢光從而使得它們不適合在測定法中用作螢光標記物。此外，通常優選使用不是糖類的生物分子。該優選情況的一個例外是使用通過共價附著另一實體(例如，PEG、生物分子、治療性部分、診斷性部分等)而進行修飾的天然存在的糖。在示例性的實施方案中，通過本發明的方法將糖部分(其是生物分子)綴合至接頭臂並隨後將該糖-接頭臂盒綴合至多肽。
可用於實施本發明的生物分子可以來自任何來源。生物分子可以分離自天然來源或者它們可以通過合成方法來產生。多肽可以是天然多肽或突變的多肽。可以通過化學誘變、位點定向誘變或者其他本領域技術人員已知的誘導突變的方法來實現突變。可用於實施本發明的多肽包括，例如酶、抗原、抗體和受體。抗體可以是多克隆的或單克隆的；完整的或者片段。多肽可以任選是定向進化程序的產物。
天然來源的和合成的多肽和核酸可用於本發明；這些分子可以通過任何可利用的反應性基團而附著至糖殘基組分或者交聯劑。例如，多肽可以通過反應性胺、羧基、巰基或羥基來進行附著。反應性基團可以位於多肽末端或者多肽鏈的內部位點。核酸可以通過鹼基上的反應性基團(例如，環外胺)或者糖部分上的可利用的羥基(例如，3』-或5』-羥基)來進行附著。肽和核酸鏈可以在一個或多個位點處進一步衍生化以允許合適的反應性基團附著至鏈上。參見Chrisey等人Nucleic Acids Res.243031-3039(1996)。
在進一步的實施方案中，選擇生物分子以將通過本發明方法進行修飾的多肽導向特定組織，從而相對於遞送到該組織的未衍生化的多肽的量而言增強該多肽向該組織的遞送。在更進一步的實施方案中，在所選時間段內遞送到特定組織的經衍生化的多肽的量通過衍生化而增加至少約20％，更優選至少約40％，和更加優選至少約100％。目前，用於靶向應用的優選生物分子包括抗體、激素和細胞表面受體的配體。
在更加進一步的示例性實施方案中，提供了具有生物素的綴合物。因此，例如，通過附著攜帶有一個或多個修飾基團的抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白部分來製作選擇性生物素化的多肽。
治療性部分 在另一個實施方案中，經修飾的糖包含治療性部分。本領域技術人員將會意識到，在治療性部分和生物分子類別之間存在重疊；許多生物分子具有治療性質或潛力。
治療性部分可以是已經被接受用於臨床使用的試劑，或者它們可以是這樣的藥物，所述藥物的使用是試驗性的或者所述藥物的活性或作用機制還在研究中。治療性部分可以在給定疾病狀態中具有經證明的作用，或者可以僅僅假設在給定疾病狀態中顯示出所希望的作用。在另一個實施方案中，治療性部分是化合物，所述化合物正在就其與所選組織相互作用的能力而進行篩選。可用於實施本發明的治療性部分包括來自具有各種藥理學活性的寬範圍藥物類別的藥物。優選的治療性部分是基本上不發螢光的，或者發出如此少量的螢光從而使得它們不適合在測定法中用作螢光標記物。此外，一般優選使用不是糖的治療性部分。該優選情況的一個例外是使用通過共價附著另一實體(例如PEG、生物分子、治療性部分、診斷性部分等)而進行修飾的糖。在另一個示例性的實施方案中，通過本發明的方法將治療性糖部分綴合至接頭臂並隨後將該糖-接頭臂盒綴合至多肽。
用於將治療劑和診斷劑綴合至各種其他種類的方法是本領域技術人員公知的。參見例如，Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，Eds.POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
在示例性的實施方案中，治療性部分通過在所選條件下被切割的連接而附著至經修飾的糖。示例性的條件包括但不限於，所選的pH(例如，胃、腸、胞吞液泡)、活性酶的存在(例如，酯酶、還原酶、氧化酶)、光、熱等等。許多可切割的基團是本領域已知的。參見例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.，26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.，261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，1431859-1867(1989)。
可用的治療性部分的類別包括，例如非類固醇抗炎藥物(NSAIDS)。NSAIDS可以例如選自下面的類別(例如，丙酸衍生物、乙酸衍生物、滅酸衍生物、聯苯羧酸衍生物和昔康類)；類固醇抗炎藥物，包括氫化可的松等等；抗組胺藥(例如，氯苯那敏、曲普利啶)；止咳藥(例如，右美沙芬、可待因、卡拉美芬和噴託維林)；止癢藥(例如，甲地嗪和阿利馬嗪)；抗膽鹼能藥(例如，東莨菪鹼、阿託品、後馬託品、左旋多巴)；止吐藥和止噁心藥(例如，賽克力嗪、美克洛嗪、氯丙嗪、布克力嗪)；減食慾藥(例如，苄非他明、芬特明、對氯苯丁胺、芬氟拉明)；中樞興奮藥(例如，苯丙胺、去氧麻黃鹼、右苯丙胺和哌甲酯)；抗心律不齊藥(例如，普萘洛爾、普魯卡因胺、丙吡胺、奎尼丁、恩卡尼)；β-腎上腺素能阻斷藥(例如，美託洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾、拉貝洛爾和噻嗎洛爾)；強心藥(例如，米力農、氨力農和多巴酚丁胺)；抗高血壓藥(例如，依那普利、可樂定、肼屈嗪、米諾地爾、胍那決爾、胍乙啶)；利尿藥(例如，阿米洛利和氫氯噻嗪)；血管舒張藥(例如，地爾硫

胺碘酮、異克舒令、布酚寧、妥拉唑林和維拉帕米)；血管收縮藥(例如，雙氫麥角胺、麥角胺和二甲麥角新鹼)；抗潰瘍藥(例如，雷尼替丁和西咪替丁)；麻醉藥(例如，利多卡因、布比卡因、氯普魯卡因、地布卡因)；抗抑鬱藥(例如，丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、去甲替林)；安定藥和鎮靜藥(例如，氯氮

貝那替秦、苯喹胺、氟西泮、羥嗪、洛沙平和丙嗪)；抗精神病藥(例如，氯普噻噸、氟奮乃靜、氟哌啶醇、嗎茚酮、硫利達嗪和三氟拉嗪)；抗微生物藥(抗細菌、抗真菌、抗原生動物和抗病毒藥物)。
優選摻入本組合物的抗微生物藥物包括，例如下列藥物的可藥用鹽β-內醯胺類藥物、喹諾酮類藥物、環丙沙星、諾氟沙星、四環素、紅黴素、阿米卡星、三氯生、多西環素、捲曲黴素、氯己定、金黴素、土黴素、克林黴素、乙胺丁醇、異硫羰酸己脒定、甲硝唑、噴他脒、慶大黴素、卡那黴素、林可黴素(lineomycin)、甲烯土黴素、烏洛託品、米諾環素、新黴素、乙基西梭黴素、巴龍黴素、鏈黴素、妥布黴素、咪康唑和金剛烷胺。
用於實施本發明的其他藥物部分包括抗腫瘤藥(例如，抗雄激素藥(例如，亮丙立德或氟他胺)、殺細胞劑(例如，阿黴素、多柔比星、紫杉醇、環磷醯胺、白消安、順鉑、β-2-幹擾素)、抗雌激素藥(例如，他莫昔芬)、抗代謝物(例如，氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巰基嘌呤、硫代烏嘌呤)。該類別中還包括用於診斷和治療的基於放射性同位素的試劑，和綴合的毒素，例如蓖麻毒蛋白、格爾德黴素、美登素、CC-1065、倍癌黴素、刺孢黴素及其相關的結構和類似物。
治療性部分也可以是激素(例如，甲羥孕酮、雌二醇、亮丙立德、甲地孕酮、奧曲肽或促生長素抑制素)；肌肉鬆弛藥(例如，桂美君、環苯扎林、黃酮哌酯、奧芬那君、罌粟鹼、美貝維林、異達維林、利託君、地芬諾酯、丹曲林和阿珠莫林)；解痙藥；骨活性藥物(例如，二膦酸鹽和膦醯基烷基次膦酸鹽藥物化合物)；內分泌調節藥物(例如，避孕藥(例如，炔諾醇、炔雌醇、炔諾酮、美雌醇、去氧孕烯、甲羥孕酮)、糖尿病調節劑(例如，格列本脲或氯磺丙脲)、同化激素類藥(例如，睪內酯或司坦唑醇)、雄激素類(例如，甲睪酮、睪酮或氟甲睪酮)、抗利尿藥(例如，去氨加壓素)和降鈣素)。
也可以用於本發明的是雌激素類(例如，己烯雌酚)、糖皮質激素類(例如，曲安西龍、倍他米松，等等)和孕激素類(例如，炔諾酮、炔諾醇、炔諾酮、左炔諾孕酮)；甲狀腺劑(例如，碘塞羅寧或左甲狀腺素)或抗甲狀腺劑(例如，甲巰咪唑)；抗高催乳素血症藥物(例如，卡麥角林)；激素抑制劑(例如，達那唑或戈舍瑞林)，催產藥(例如，甲麥角新鹼或催產素)和前列腺素類(例如，米索前列醇、前列地爾或地諾前列酮)。
其他有用的修飾基團包括免疫調節藥物(例如，抗組織胺藥，肥大細胞穩定劑，例如洛度沙胺和/或色甘酸鈉(cromolyn)，類固醇(例如，曲安西龍、beclomethazone、可的松、地塞米松、潑尼松龍、甲潑尼龍、丙酸倍氯米松(beclomethasone)或氯倍他索)，組胺H2拮抗劑(例如，法莫替丁、西咪替丁、雷尼替丁)，免疫抑制劑(例如，硫唑嘌呤、環孢菌素)，等等。還可以使用具有抗炎活性的基團，如舒林酸、依託度酸、酮洛芬和酮咯酸。用於本發明的其他藥物對於本領域技術人員而言將是明顯的。
經修飾的糖核苷酸 在本發明的某些實施方案中，經修飾的糖核苷酸用於向肽添加經修飾的糖。以它們的修飾形式在本發明中使用的示例性的糖核苷酸包括核苷酸一磷酸、二磷酸或三磷酸或其類似物。在優選的實施方案中，經修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷和GDP糖苷。更加優選地，經修飾的糖核苷酸選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸和CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙醯基胺衍生物也可用於本發明的方法中。
在特別優選的實施方案中，在本發明的方法中可使用的經修飾的糖核苷酸是UDP-糖，其中糖部分是選自葡糖胺部分和葡糖胺模擬部分的成員。因此，在第三個方面，本發明提供了具有根據式(XI)的結構的化合物
其中每個Q是獨立地選自H、負電荷和鹽抗衡離子(例如，Na、K、Li、Mg、Mn、Fe)的成員。E是選自O、S和CH2的成員。G是選自-CH2-和C＝A的成員，其中A是選自O、S和NR27的成員，其中R27是選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員。E1是選自O和S的成員。R21、R22、R23和R24是獨立地選自H、OR25、SR25、NR25R26、NR25S(O)2R26、S(O)2NR25R26、NR25C(O)R26、C(O)NR25R26、C(O)OR25、醯基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基和取代或未取代的雜環烷基的成員，其中R25和R26是獨立地選自H、醯基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環烷基的成員。在示例性的實施方案中，經修飾的糖核苷酸具有根據式(XIa)或(XIb)的結構
在根據上述實施方案中任一個實施方案的一個實例中，R21、R22、R23和R24中的至少一個包含聚合物修飾基團。在根據上述實施方案(例如式(XI)、(XIa)和(XIb))中任一個實施方案的另一個實例中，E和E1都是氧(O)。在另外一個實例中，經修飾的糖核苷酸是經修飾的UDP-GlcNAc或經修飾的GlcNH。在進一步的實例中，經修飾的UDP-GlcNAc或經修飾的GlcNH在2-或6-位處用聚合物修飾基團進行修飾。
在一個實例中，經修飾的糖核苷酸的糖部分用包含水溶性聚合物例如聚(環氧烷)部分(例如，PEG或PPG)或其衍生物的聚合物修飾基團進行修飾。示例性的經修飾的糖核苷酸攜帶通過糖上的胺部分進行修飾的糖基部分或糖基模擬部分。例如，糖基胺(沒有修飾基團)可以酶促綴合至肽(或者其他種類)，並且游離的胺部分隨後綴合至所希望的修飾基團。備選地，經修飾的糖核苷酸可以用作酶的底物，所述酶將經修飾的糖轉移至多肽上的糖基接納體。
在下面的討論中，給出了許多可用於實施本發明的經修飾的糖核苷酸的具體實例。在示例性的實施方案中，將葡萄糖、葡萄糖模擬部分、葡糖胺部分、葡糖胺模擬部分或任何其衍生物用作在其上附著修飾基團的糖部分。關於葡糖胺衍生物的討論的焦點僅僅是為了清楚地舉例說明，而不應當被解釋為限制本發明的範圍。本領域技術人員將會意識到，可以以與本文給出的實例類似的方式來活化和衍生化各種其他糖部分。例如，許多方法可以用於修飾半乳糖、唾液酸、葡萄糖、N-乙醯半乳糖胺和巖藻糖等糖底物，其可以通過公認的方法容易地進行修飾。參見例如，Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000)。
在示例性的實施方案中，經修飾的糖核苷酸基於葡糖胺部分。如方案3和方案4中所顯示的，可以使用標準方法在2-或6-位處修飾葡糖胺或N-乙醯葡糖胺。
方案3示例性的經修飾的糖核苷酸的製備
在上面的方案3中，指數n表示0至5000，優選10至2500，和更優選10至1200的整數。La是鍵或接頭基團，和X＊是選自線性和支化的聚合物修飾基團。符號「A」表示活化基團，例如滷代、活化的酯(例如，N-羥基琥珀醯亞胺酯)的組分、碳酸酯(例如，碳酸對硝基苯酯)的組分等等。Q是H、負電荷或鹽抗衡離子(例如，Na+)。在方案3中，首先將GlcNAc部分的伯羥基氧化成醛基(例如，使用氧化酶，例如葡糖氧化酶)，其通過還原性胺化而進一步被轉化為胺。本領域技術人員將會意識到，通過該方法和類似方法可以容易地製備其他PEG-醯胺核苷酸糖。
在其他示例性的實施方案中，用諸如氨基甲酸乙酯或脲的基團替代所述醯胺部分。
方案4示例性的經修飾的糖核苷酸的製備
在方案4中，用受保護的胺基酸(例如，甘氨酸)衍生物的經活化的酯來處理葡糖胺1，從而形成受保護的胺基酸醯胺加合物2。將化合物2轉化為相應的UDP衍生物，例如通過酶(例如UDP-Glc-合成酶)的作用，接著進行UDP衍生物的催化氫化，從而產生化合物3。將甘氨酸側鏈的氨基用於進行聚合物修飾基團(例如，PEG或PPG)的附著，所述附著通過使化合物3與經活化的(m-)PEG衍生物(例如，PEG-C(O)NHS)反應來進行，從而產生化合物4。備選地，化合物3可以與(m-)PPG衍生物(例如，PPG-C(O)NHS)進行反應，從而提供相應的PPG類似物。胺反應性PEG和PPG類似物可通過商業途徑獲得，或者它們可以通過本領域技術人員容易得到的方法來製備。
用於實施本發明的經修飾的糖核苷酸的糖部分可以在下面的式(XIIa)和(XIIb)中所圖示的任何位置處用聚合物修飾基團進行修飾

其中A和Q如上文定義。
在式(XIIa)和(XIIb)中，X1、X2、X3和X4是獨立選擇的連接基團，優選地選自單鍵、-O-、-NRe-、-S-和-CH2-，其中每個Re是獨立地選自Ra、Rb、Rc和Rd的成員。符號Ra、Rb、Rc和Rd獨立地選自H、醯基(例如，乙醯基)、修飾基團(例如，聚合物修飾基團、治療性部分、生物分子，等等)和結合至修飾基團的接頭。
在上述結構中，Ra、Rb、Rc和Rd中的至少一個包含修飾基團，例如聚合物修飾基團。位置2和6對於用聚合物修飾基團來修飾糖部分來說是特別優選的。在式(XIIb)中，A是O、S、NRf，其中Rf是選自H，Ra，Rb，Rc和Rd，取代或未取代的烷基，取代或未取代的雜烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的雜芳基，取代或未取代的環烷基和取代或未取代的雜環烷基的成員。
在一個實例中，Ra、Rb、Rc和Rd中的至少一個包含摻入了至少一個聚(環氧烷)部分(例如，PEG或PPG部分)的聚合物修飾基團。在另一個實例中，Ra、Rb、Rc和Rd中的至少一個包含選自下列的部分PEG、PPG、醯基-PEG、醯基-PPG、烷基-PEG、醯基-烷基-PEG、氨基甲醯基-PEG、氨基甲醯基-PPG、芳基-PEG、醯基-芳基-PEG、芳基-PPG、醯基-芳基-PPG、甘露糖-6-磷酸、肝素、乙醯肝素、SLex、甘露糖、軟骨素、角質素、皮膚素、白蛋白、多肽(例如，本文公開的那些中的任一種)、肽等等(例如，FGF、VFGF、整聯蛋白)。
下面的表12給出了用修飾基團例如聚合物修飾基團(例如，水溶性修飾基團，例如PEG或PPG部分)進行衍生化的經修飾的糖核苷酸的代表性實例。表12的某些化合物通過方案3的方法來製備。其他衍生物通過本領域公認的方法來製備。參見例如，Keppler等人，Glycobiology 1111R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000)。
表12用聚合物修飾基團進行衍生化的糖核苷酸的實例
在更進一步的實施方案中，聚合物修飾基團是支化的PEG，例如，本文所給出的那些種類中的一種。根據該實施方案的舉例說明性的經修飾的糖核苷酸或多肽綴合物包含選自下列的部分
其中X4是鍵或O，和J是S或O。
示例性的經修飾的糖核苷酸具有選自下列的結構

其中X4是鍵或O，J是S或O，和y是0或1。
其他示例性的經修飾的糖核苷酸具有選自下列的結構

其中Q如上文定義，和p是選自0至50的整數。
其他示例性的經修飾的糖核苷酸具有選自下列的結構

活化的糖 在其他實施方案中，經修飾的糖是活化的糖。可用於本發明的經活化的、經修飾的糖通常是被合成改變以包含離去基團的糖苷。在一個實例中，在酶促反應中使用活化的糖以將活化的糖轉移到肽或糖肽上的接納體上。在另一個實例中，通過化學方法將活化的糖添加至肽或糖肽。「離去基團」(或活化基團)指那些部分，其在酶調節的親核取代反應中容易被置換，或者備選地，在利用親核反應參與物(例如，攜帶巰基的糖基部分)的化學反應中被替代。為每種類型的反應選擇合適的離去基團在技術人員的能力範圍之內。許多活化的糖是本領域已知的。參見例如，Vocadlo等人，CARBOHYDRATE CHEMISTRY ANDBIOLOGY，Vol.2，Ernst等人Ed.，Wiley-VCH VerlagWeinheim，Germany，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.27437717(1999)。
離去基團的實例包括滷素(例如，氟、氯、溴)、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯，等等。用於在酶介導的反應中使用的優選的離去基團是在立體上不顯著阻礙糖苷向接納體的酶促轉移的那些離去基團。因此，活化的糖苷衍生物的優選實施方案包括糖基氟和糖基甲磺酸酯，糖基氟是特別優選的。在糖基氟中，最優選的是α-半乳糖基氟、α-甘露糖基氟、α-葡糖基氟、α-巖藻糖基氟、α-木糖基氟、α-唾液酸基氟、α-N-乙醯葡糖胺基氟、α-N-乙醯半乳糖胺基氟、β-半乳糖基氟、β-甘露糖基氟、β-葡糖基氟、β-巖藻糖基氟、β-木糖基氟、β-唾液酸基氟、β-N-乙醯葡糖胺基氟和β-N-乙醯半乳糖胺基氟。對於非酶促的親核取代，可以使用這些和其他離去基團。例如，活化的供體糖苷可以是二硝基苯基(DNP)或溴代-糖苷。
作為舉例說明，可以通過下列方式來從游離糖製備糖基氟首先乙醯化，然後用HF/吡啶處理所述糖部分。這產生受保護的(乙醯化的)糖基氟的熱力學上最穩定的端基異構體(即，α-糖基氟)。如果希望較不穩定的端基異構體(即，β-糖基氟)，那麼可以通過下列方式來製備用HBr/HOAc或用HCl來轉化過乙醯化的糖從而產生端基異構的溴化物或氯化物。該中間體與氟化物鹽例如氟化銀反應，從而產生糖基氟。乙醯化的糖基氟可以通過與在甲醇中的溫和的(催化性的)鹼(例如，NaOMe/MeOH)反應來去保護。此外，許多糖基氟可以通過商業途徑獲得。
使用本領域技術人員已知的常規方法可以製備其他活化的糖基衍生物。例如，可以通過下列方式來製備糖基甲磺酸酯用甲磺醯氯處理糖的完全苄基化的半縮醛形式，隨後催化氫化以除去苄基。
在進一步的示例性實施方案中，經修飾的糖是具有觸角結構的寡糖。在另一個實施方案中，所述觸角的一個或多個末端攜帶有修飾部分。當超過一個的修飾部分附著至具有觸角結構的寡糖時，該寡糖可用於「擴增」修飾部分；每個綴合至肽的寡糖單位將多個拷貝的修飾基團附著至肽。在上面的圖式中所示的本發明典型綴合物的一般結構包括多價種類，其是由於利用觸角結構來製備本發明的綴合物而產生的。許多觸角糖結構是本領域已知的，並且可以用它們來實施本方法，而沒有限制。
經修飾的糖的製備 一般地，通過使用反應性官能團在糖部分和修飾基團之間形成共價鍵，所述反應性官能團通常通過連接過程而被轉化成新的有機官能團或者非反應性種類。為了形成該鍵，修飾基團和糖部分攜帶互補的反應性官能團。反應性官能團可以位於糖部分上的任何位置。
可用於實施本發明的反應性基團和反應類別一般地是生物綴合物化學領域中公知的那些。用反應性糖部分可得的目前有利的反應類別是在相對溫和的條件下進行的那些。這些反應包括但不限於親核取代(例如，胺和醇與醯滷、活性酯的反應)、親電取代(例如，烯胺反應)和與碳-碳和碳-雜原子多重鍵加成(例如，麥可反應、第爾斯-阿爾德加成)。這些和其他有用的反應在下列文獻中討論例如March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley & Sons，NewYork，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
反應性官能團 從糖核心或修飾基團上懸掛出的可用的反應性官能團包括，但不限於 (a)羧基和其各種衍生物，包括但不限於，N-羥基琥珀醯亞胺酯、N-羥基苯並三唑酯、醯基滷、醯基咪唑類、硫酯、對硝基苯酯、烷基、鏈烯基、炔基和芳香族酯； (b)羥基，其可以被轉化成例如酯、醚、醛等等； (c)滷代烷基，其中該滷化物可以以後用親核基團例如胺、羧酸根陰離子、硫羥基陰離子、碳負離子或醇鹽離子置換，從而導致在該滷素原子的官能團處共價附著新的基團； (d)親二烯基團，其能夠參與第爾斯-阿爾德反應，例如馬來醯亞氨基； (e)醛和酮基團，從而可能通過形成羰基衍生物例如亞胺、腙、縮氨基脲或肟，或者通過諸如格利雅加成或烷基鋰加成的機制來進行隨後的衍生化； (f)磺醯滷基團，其用於隨後與例如胺反應從而形成磺醯胺； (g)硫羥基，其可以例如轉化為二硫化物或者與醯滷反應； (h)胺或巰基，其可以例如被醯化、烷基化或氧化； (i)鏈烯烴，其可以經歷例如環加成、醯化、麥可加成，等等；和 (j)環氧化物，其可以例如與胺和羥基化合物反應。
可以如此選擇反應性官能團，從而它們不參與或者幹擾對於裝配反應性糖核心或者修飾基團而言所必需的反應。備選地，可以在保護基存在下保護反應性官能團免於參與所述反應。本領域技術人員了解如何保護具體的官能團，從而使得它不幹擾所選的一組反應條件。可用的保護基的實例參見例如，Greene等人，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
交聯基團 用於本發明方法的經修飾的糖的製備包括將修飾基團附著至糖殘基並形成穩定的加合物，其是糖基轉移酶的底物。糖和修飾基團可以通過零級或高級交聯劑進行偶聯。可以用於將修飾基團附著至碳水化合物部分的示例性雙官能化合物包括，但不限於，雙官能聚(乙二醇)、聚醯胺、聚醚、聚酯等等。用於將碳水化合物連接至其他分子的一般方法是本領域已知的。參見例如，Lee等人，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)；和Bednarski等人，WO 92/18135。在下面的討論中，將反應性基團對待為在新生經修飾的糖的糖部分上是良性的。討論的焦點是為了清楚地舉例說明。本領域技術人員將會意識到，該討論也與修飾基團上的反應性基團相關。
使用各種試劑，以分子內化學交聯來修飾經修飾的糖的組分(交聯試劑和交聯程序的綜述見Wold，F.，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，Enzymes as Drugs.(Holcenberg和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，它們都通過提及而合併入本文)。優選的交聯試劑源自各種零長度的、同雙官能的和異雙官能的交聯試劑。零長度的交聯試劑包括直接綴合兩個固有的化學基團而不引入外來物質。催化二硫鍵形成的試劑屬於該類別。另一個實例是誘導羧基和伯氨基的縮合從而形成醯胺鍵的試劑，例如碳二亞胺、氯甲酸乙酯、伍德瓦德試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑鎓-3′-磺酸鹽)和羰基二咪唑。除了這些化學試劑外，轉穀氨醯胺酶(穀氨醯基-肽γ-穀氨醯轉移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長度的交聯試劑。該酶在蛋白質結合的穀氨醯胺醯基殘基的羧醯胺基團處催化醯基轉移反應，通常使用伯氨基作為底物。優選的同和異雙官能試劑分別含有兩個相同或兩個不同的位點，其可以對於氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異性基團是反應性的。
除了使用位點特異性反應性部分外，本發明還考慮使用非特異性反應性基團來將糖連接至修飾基團。
示例性的非特異性交聯劑包括在黑暗中完全惰性的光可活化的基團，其在吸收合適能量的光子後轉化為反應性種類。在一個實施方案中，光可活化的基團選自在加熱或光解疊氮化物後產生的氮賓的前體。缺電子的氮賓是極具反應性的並且可以與各種化學鍵反應，所述化學鍵包括N-H、O-H、C-H和C＝C。儘管可以使用三種類型的疊氮化物(芳基、烷基和醯基衍生物)，但是目前為芳基疊氮化物。在光解後芳基疊氮化物與N-H和O-H鍵的反應性比與C-H鍵更好。缺電子的芳基氮賓快速環擴張從而形成脫氫氮雜

，其傾向於與親核體反應，而不是形成C-H插入產物。通過在環中吸電子取代基例如硝基或羥基的存在可以增加芳基疊氮化物的反應性。此類取代基將芳基疊氮化物的最大吸收推向更長的波長。未取代的芳基疊氮化物具有在260-280nm範圍內的最大吸收，而羥基和硝基芳基疊氮化物吸收305nm外的大量光。因此，羥基和硝基芳基疊氮化物是最優選的，因為與未取代的芳基疊氮化物相比，它們允許使用對於親和組分的有害性更低的光解條件。
在更進一步的實施方案中，為接頭基團提供可以被切割從而從糖殘基釋放出修飾基團的基團。許多可切割的基團是本領域已知的。參見例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.1431859-1867(1989)。此外，寬範圍的可切割的雙官能(同和異雙官能)接頭基團可以通過商業途徑從供應商例如Pierce獲得。
用光、熱或者試劑例如硫醇、羥胺、鹼、高碘酸鹽等等可以切割示例性的可切割部分。此外，作為對於被胞吞而作出的應答，某些優選的基團在體內被切割(例如，順烏頭醯基；參見，Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優選的可切割基團包括可切割的部分，其是選自二硫化物、酯、醯亞胺、碳酸酯、硝基苄基、苯甲醯甲基和苯偶姻基團的成員。
附著至本文公開的綴合物的示例性部分包括，但不限於，PEG衍生物(例如，烷基-PEG、醯基-PEG、醯基-烷基-PEG、烷基-醯基-PEG、氨基甲醯基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(例如，烷基-PPG、醯基-PPG、醯基-烷基-PPG、烷基-醯基-PPG、氨基甲醯基-PPG、芳基-PPG)、治療性部分、診斷性部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、乙醯肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、唾液酸基Lewis X、FGF、VFGF、蛋白質、軟骨素、角質素、皮膚素、白蛋白、整聯蛋白、觸角寡糖、肽等等。將各種修飾基團綴合至糖部分的方法是本領域技術人員容易得到的(POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRYBIOTECHNICAL ANDBIOMEDICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICALAPPLICATIONS，J.Milton Harris，Ed.，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS SymposiumSeries Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
示例性的策略涉及通過使用異雙官能交聯劑SPDP(n-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基聯硫基)丙酸酯)來將受保護的巰基摻入到糖上，然後使巰基去保護，以與修飾基團上的另一巰基形成二硫鍵。
如果SPDP有害地影響經修飾的糖作為糖基轉移酶底物的能力，那麼使用一大批其他交聯劑之一，例如2-亞氨基硫雜環戊烷(2-iminothiolane)或者S-乙醯基硫代乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SATA)以形成二硫鍵。2-亞氨基硫雜環戊烷與伯胺反應，立即將未受保護的巰基摻入到含胺的分子上。SATA也與伯胺反應，但是摻入受保護的巰基，其在後來用羥胺進行脫乙醯化從而產生游離的巰基。在每種情況中，所摻入的巰基與其他巰基或者受保護的巰基(像SPDP)自由反應，形成所需的二硫鍵。
上述策略是用於本發明的示例性的而非限制性的接頭。可利用其他交聯劑，其可在將修飾基團與肽交聯的不同策略中使用。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸醯肼)和TPMPH(S-(2-硫代吡啶基)巰基-丙醯肼)與之前通過溫和的高碘酸鹽處理而氧化的碳水化合物部分反應，從而在交聯劑的醯肼部分和由高碘酸鹽產生的醛之間形成腙鍵。TPCH和TPMPH在糖上引入由2-吡啶基硫酮保護的巰基，其可以用DTT去保護，然後用於綴合，例如在組分之間形成二硫鍵。
如果發現二硫鍵對於產生穩定的經修飾的糖是不合適的，那麼可以使用在組分之間摻入更穩定的鍵的其他交聯劑。異雙官能交聯劑GMBS(N-γ-馬來醯亞氨基丁醯氧基)琥珀醯亞胺)和SMCC(琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞氨基-甲基)環己烷)與伯胺反應，從而在該組分上引入馬來醯亞胺基團。該馬來醯亞胺基團隨後可以與另一組分上的巰基(其可以通過先前所提及的交聯劑而引入)反應，從而在組分之間形成穩定的硫醚鍵。如果組分之間的位阻幹擾組分的活性或者幹擾經修飾的糖作為糖基轉移酶的能力，那麼可以使用這樣的交聯劑，其在組分之間引入長的間隔臂，並且包括一些先前提及的交聯劑(例如SPDP)的衍生物。因此，存在大量可用的合適交聯劑；每一種根據其對於最佳的肽綴合物和經修飾的糖產生所具有的影響來進行選擇。
使用各種試劑，以分子內化學交聯來修飾經修飾的糖的組分(交聯試劑和交聯程序的綜述見Wold，F.，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，Enzymes as Drugs.(Holcenberg和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，它們都通過提及而合併入本文)。優選的交聯試劑源自各種零長度的、同雙官能的和異雙官能的交聯試劑。零長度的交聯試劑包括直接綴合兩個固有的化學基團而不引入外來物質。催化二硫鍵形成的試劑屬於該類別。另一個實例是誘導羧基和伯氨基的縮合從而形成醯胺鍵的試劑，例如碳二亞胺、氯甲酸乙酯、伍德瓦德試劑K(2-乙基-5-苯基異噁唑鎓-3′-磺酸鹽)和羰基二咪唑。除了這些化學試劑外，轉穀氨醯胺酶(穀氨醯基-肽γ-穀氨醯轉移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零長度的交聯試劑。該酶在蛋白質結合的穀氨醯胺醯基殘基的羧醯胺基團處催化醯基轉移反應，通常使用伯氨基作為底物。優選的同和異雙官能試劑分別含有兩個相同或兩個不同的位點，其可以對於氨基、巰基、胍基、吲哚或非特異性基團是反應性的。
交聯試劑中優選的特異性位點 1.氨基-反應性基團 在一個實施方案中，交聯劑上的位點是氨基-反應性基團。氨基-反應性基團的可用的非限制性實例包括N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯、亞氨酸酯、異氰酸酯、醯滷、芳基疊氮化物、對硝基苯酯、醛和磺醯氯。
NHS酯優先與經修飾的糖組分的伯(包括芳香族)氨基反應。已知組氨酸的咪唑基團與伯胺競爭反應，但是反應產物是不穩定和容易水解的。該反應涉及在NHS酯的酸性羧基上胺的親核攻擊，從而形成醯胺，釋放出N-羥基琥珀醯亞胺。因而，失去原始氨基的正電荷。
亞氨酸酯是與經修飾的糖組分的胺基團反應的最特異的醯化試劑。在7至10的pH下，亞氨酸酯僅與伯胺反應。伯胺親核攻擊亞氨酸酯從而產生中間體，該中間體在高pH下分解成脒或者在低pH下分解成新的亞氨酸酯。該新的亞氨酸酯可以與另一伯胺反應，從而交聯兩個氨基，這是被認為是單官能的亞氨酸酯進行雙官能反應的情形。與伯胺反應的主要產物是脒，其是比原始的胺更強的鹼。因此，保留原始氨基的正電荷。
異氰酸酯(和異硫氰酸酯)與經修飾的糖組分的伯胺反應，從而形成穩定的鍵。它們與巰基、咪唑和酪氨醯基團反應，從而得到相對不穩定的產物。
醯疊氮也用作氨基-特異性試劑，其中親和組分的親核胺在弱鹼性條件例如pH 8.5下攻擊酸性羧基。
芳基滷例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯優先與經修飾的糖組分的氨基和酪氨酸酚基反應，但是也與巰基和咪唑基團反應。
單和二羧酸的對硝基苯酯也是可用的氨基-反應性基團。儘管試劑特異性不是非常高，但是α-和ε-氨基看起來最快地進行反應。
醛例如戊二醛與經修飾的糖的伯胺反應。儘管在氨基與醛反應後形成不穩定的席夫鹼，但是戊二醛能夠以穩定的交聯來修飾經修飾的糖。在pH 6-8(典型交聯條件的pH)下，環狀聚合物經歷脫水，從而形成α-β不飽和醛聚合物。然而，當與另一雙鍵共軛時，席夫鹼是穩定的。這兩個雙鍵的共振相互作用阻止了席夫鍵的水解。此外，高局部濃度下的胺可以攻擊該烯屬雙鍵，從而形成穩定的麥可加成產物。
芳香族磺醯氯與經修飾的糖組分的各個位點反應，但是與氨基的反應是最主要的，其導致穩定的磺醯胺鍵。
2.巰基-反應性基團 在另一實施方案中，所述位點是巰基-反應性基團。巰基-反應性基團的可用的非限制性實例包括馬來醯亞胺類、烷基滷、吡啶基二硫化物類和硫代鄰苯二甲醯亞胺類。
馬來醯亞胺類優先與經修飾的糖組分的巰基反應，從而形成穩定的硫醚鍵。它們也可以以低得多的速率與伯胺基和組氨酸的咪唑基團反應。然而，在pH7下，可以將馬來醯亞胺基團認為是巰基-特異性基團，因為在該pH下，簡單硫醇的反應速率是相應胺的1000倍。
烷基滷與巰基、硫化物、咪唑類和氨基反應。然而，在中性到弱鹼性pH下，烷基滷主要與巰基反應從而形成穩定的硫醚鍵。在較高pH下，有利於與氨基的反應。
吡啶基二硫化物類通過二硫鍵交換而與游離的巰基反應，從而得到混合的二硫化物。因而，吡啶基二硫化物類是最特異的巰基-反應性基團。
硫代鄰苯二甲醯亞胺類與游離巰基反應，從而形成二硫化物。
3.羧基-反應性殘基 在另一個實施方案中，將溶於水和有機溶劑中的碳二亞胺用作羧基-反應試劑。這些化合物與游離羧基反應，從而形成假脲，其然後偶聯至可用的胺，產生醯胺鍵。教導了如何用碳二亞胺來修飾羧基(Yamada等人，Biochemistry 204836-4842，1981)。
交聯試劑中優選的非特異性位點 除了使用位點特異性反應性部分外，本發明還考慮使用非特異性反應性基團來將糖連接至修飾基團。
示例性的非特異性交聯劑包括在黑暗中完全惰性的光可活化的基團，其在吸收合適能量的光子後轉化為反應性種類。在一個實施方案中，光可活化的基團選自在加熱或光解疊氮化物後產生的氮賓的前體。缺電子的氮賓是極具反應性的並且可以與各種化學鍵反應，所述化學鍵包括N-H、O-H、C-H和C＝C。儘管可以使用三種類型的疊氮化物(芳基、烷基和醯基衍生物)，但是目前為芳基疊氮化物。在光解後芳基疊氮化物與N-H和O-H鍵的反應性比與C-H鍵更好。缺電子的芳基氮賓快速環擴張從而形成脫氫氮雜

其傾向於與親核體反應，而不是形成C-H插入產物。通過在環中吸電子取代基例如硝基或羥基的存在可以增加芳基疊氮化物的反應性。此類取代基將芳基疊氮化物的最大吸收推向更長的波長。未取代的芳基疊氮化物具有在260-280nm範圍內的最大吸收，而羥基和硝基芳基疊氮化物吸收305nm外的大量光。因此，羥基和硝基芳基疊氮化物是最優選的，因為與未取代的芳基疊氮化物相比，它們允許使用對於親和組分的有害性更低的光解條件。
在另一個優選的實施方案中，光可活化的基團選自氟化的芳基疊氮化物。氟化的芳基疊氮化物的光解產物是芳基氮賓，它們都以高效率經歷該基團的特徵性反應，包括C-H鍵插入(Keana等人，J.Org.Chem.553640-3647，1990)。
在另一個實施方案中，光可活化的基團選自二苯酮殘基。二苯酮試劑通常給出比芳基疊氮化物試劑更高的交聯產率。
在另一個實施方案中，光可活化的基團選自重氮化合物，其在光解後形成缺電子的卡賓。這些卡賓經歷各種反應，包括插入C-H鍵中、與雙鍵(包括芳香族系統)加成、氫吸引和配位到親核中心從而得到碳離子。
在另外一個實施方案中，光可活化的基團選自重氮基丙酮酸酯。例如，重氮基丙酮酸對硝基苯酯的對硝基苯酯與脂肪族胺反應，從而得到重氮基丙酮酸醯胺，其經歷紫外線光解而形成醛。經光解的經重氮基丙酮酸酯修飾的親和組分將像甲醛或戊二醛一樣進行反應，從而形成交聯。
同雙官能試劑 1.與伯胺具有反應性的同雙官能交聯劑 胺-反應性交聯劑的合成、性質和應用在文獻中作了商業上的描述(交聯程序和試劑的綜述見上文)。許多試劑是可得的(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同雙官能NHS酯的優選的非限制性實例包括戊二酸二琥珀醯亞胺基酯(DSG)、辛二酸二琥珀醯亞胺基酯(DSS)、辛二酸二(磺基琥珀醯亞胺基)酯(BS)、酒石酸二琥珀醯亞胺基酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺基酯(sulfo-DST)、二-2-(琥珀醯亞氨基氧基羰基氧基)乙基碸(BSOCOES)、二-2-(磺基琥珀醯亞氨基氧基羰基氧基)乙基碸(sulfo-BSOCOES)、二(琥珀醯亞胺基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、二(磺基琥珀醯亞胺基琥珀酸)乙二醇酯(sulfo-EGS)、聯硫基雙(琥珀醯亞胺基丙酸酯(DSP)和聯硫基雙(磺基琥珀醯亞胺基丙酸酯(sulfo-DSP)。同雙官能亞氨酸酯的優選的非限制性實例包括丙二醯亞氨酸二甲酯(DMM)、琥珀醯亞氨酸二甲酯(DMSC)、己二醯亞氨酸二甲酯(DMA)、庚二醯亞氨酸二甲酯(DMP)、辛二醯亞氨酸二甲酯(DMS)、3，3′-氧聯二丙醯亞氨酸二甲酯(DODP)、3，3′-(亞甲基二氧基)二丙醯亞氨酸二甲酯(DMDP)、3，3′-(二亞甲基二氧基)二丙醯亞氨酸二甲酯(DDDP)、3，3′-(四亞甲基二氧基)二丙醯亞氨酸二甲酯(DTDP)和3，3′-聯硫基二丙醯亞氨酸二甲酯(DTBP)。
同雙官能異硫氰酸酯的優選的非限制性實例包括對苯撐二異硫氰酸酯(DITC)，和4，4′-二異硫氰基-2，2′-二磺酸茋(DIDS)。
同雙官能異氰酸酯的優選的非限制性實例包括二甲苯-二異氰酸酯、甲苯-2，4-二異氰酸酯、甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二異氰酸酯、2，2′-二羧基-4，4′-偶氮苯基二異氰酸酯和六亞甲基二異氰酸酯。
同雙官能芳基滷的優選的非限制性實例包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-碸。
同雙官能脂肪族醛試劑的優選的非限制性實例包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。
同雙官能醯化試劑的優選的非限制性實例包括二羧酸的硝基苯酯。
同雙官能芳香族磺醯氯的優選的非限制性實例包括苯酚-2，4-二磺醯氯和α-萘酚-2，4-二磺醯氯。
另外的氨基-反應性同雙官能試劑的優選的非限制性實例包括赤蘚醇二碳酸酯，其與胺反應而生成雙氨基甲酸酯。
2.與游離的巰基具有反應性的同雙官能交聯劑 此類試劑的合成、性質和應用描述於文獻中(交聯程序和試劑的綜述見上文)。這些試劑中的許多是通過商業途徑可獲得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙官能馬來醯亞胺類的優選的非限制性實例包括雙馬來醯亞氨基己烷(BMH)、N，N′-(1，3-亞苯基)雙馬來醯亞胺、N，N′-(1，2-亞苯基)雙馬來醯亞胺、偶氮苯基二馬來醯亞胺和二(N-馬來醯亞氨基甲基)醚。
同雙官能吡啶基二硫化物類的優選的非限制性實例包括1，4-二-3′-(2′-吡啶基聯硫基)丙醯氨基丁烷(DPDPB)。
同雙官能烷基滷的優選的非限制性實例包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘代乙醯氨基偶氮苯、α，α′-二碘代-對二甲苯磺酸、α，α′-二溴代-對二甲苯磺酸、N，N′-二(b-溴乙基)苄胺、N，N′-二(溴代乙醯基)苯肼和1，2-二(溴代乙醯基)氨基-3-苯基丙烷。
3.同雙官能光可活化的交聯劑 此類試劑的合成、性質和應用描述於文獻中(交聯程序和試劑的綜述見上文)。這些試劑中的一些是通過商業途徑可獲得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙官能光可活化的交聯劑的優選的非限制性實例包括二-β-(4-疊氮基水楊醯氨基)乙基二硫化物(BASED)、二-N-(2-硝基-4-疊氮基苯基)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)和4，4′-聯硫基二苯基疊氮化物。
異雙官能試劑 1.具有吡啶基二硫化物部分的氨基-反應性異雙官能試劑 此類試劑的合成、性質和應用描述於文獻中(交聯程序和試劑的綜述見上文)。這些試劑中的許多是通過商業途徑可獲得的(例如，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
具有吡啶基二硫化物部分和氨基-反應性NHS酯的異雙官能試劑的優選的非限制性實例包括N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基聯硫基)丙酸酯(SPDP)、6-3-(2-吡啶基聯硫基)丙醯氨基己酸琥珀醯亞胺基酯(LC-SPDP)、6-3-(2-吡啶基聯硫基)丙醯氨基己酸磺基琥珀醯亞胺基酯(sulfo-LCSPDP)、4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基聯硫基)甲苯(SMPT)和6-α-甲基-α-(2-吡啶基聯硫基)甲苯甲醯氨基己酸磺基琥珀醯亞胺基酯(sulfo-LC-SMPT)。
2.具有馬來醯亞胺部分的氨基-反應性異雙官能試劑 此類試劑的合成、性質和應用描述於文獻中。具有馬來醯亞胺部分和氨基-反應性NHS酯的異雙官能試劑的優選的非限制性實例包括馬來醯亞胺基乙酸琥珀醯亞胺基酯(AMAS)、3-馬來醯亞胺基丙酸琥珀醯亞胺基酯(BMPS)、N-γ-馬來醯亞氨基丁醯氧基琥珀醯亞胺酯(GMBS)、N-γ-馬來醯亞氨基丁醯氧基磺基琥珀醯亞胺酯(sulfo-GMBS)、6-馬來醯亞胺基己酸琥珀醯亞胺基酯(EMCS)、3-馬來醯亞胺基苯甲酸琥珀醯亞胺基酯(SMB)、間-馬來醯亞氨基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)、間-馬來醯亞氨基苯甲醯基-N-羥基磺基琥珀醯亞胺酯(sulfo-MBS)、4-(N-馬來醯亞氨基甲基)-環己烷-1-羧酸琥珀醯亞胺基酯(SMCC)、4-(N-馬來醯亞氨基甲基)環己烷-1-羧酸磺基琥珀醯亞胺基酯(sulfo-SMCC)、4-(對-馬來醯亞氨基苯基)丁酸琥珀醯亞胺基酯(SMPB)和4-(對-馬來醯亞氨基苯基)丁酸磺基琥珀醯亞胺基酯(sulfo-SMPB)。
3.具有烷基滷部分的氨基-反應性異雙官能試劑 此類試劑的合成、性質和應用描述於文獻中。具有烷基滷部分和氨基-反應性NHS酯的異雙官能試劑的優選的非限制性實例包括N-琥珀醯亞胺基-(4-碘代乙醯基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀醯亞胺基-(4-碘代乙醯基)氨基苯甲酸酯(sulfo-SIAB)、琥珀醯亞胺基-6-(碘代乙醯基)氨基己酸酯(SIAX)、琥珀醯亞胺基-6-(6-((碘代乙醯基)-氨基)己醯基氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀醯亞胺基-6-(((4-(碘代乙醯基)-氨基)-甲基)-環己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)和琥珀醯亞胺基-4((碘代乙醯基)-氨基)甲基環己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基-反應性NHS酯和烷基二滷部分的異雙官能試劑的一個實例是2，3-二溴代丙酸N-羥基琥珀醯亞胺基酯(SDBP)。SDBP通過綴合其氨基而向親和組分中引入分子內交聯。而二溴代丙醯基部分對伯胺基的反應性通過反應溫度來控制(McKenzie等人，Protein Chem.7581-592(1988))。
具有烷基滷部分和氨基-反應性對硝基苯酯部分的優選的非限制性實例包括碘代乙酸對硝基苯酯(NPIA)。
其他交聯劑是本領域技術人員已知的。參見例如，Pomato等人，美國專利號5,965,106。為具體反應選擇合適的交聯劑在本領域技術人員的能力範圍之內。
可切割的接頭基團 在更進一步的實施方案中，為接頭基團提供可以被切割從而從糖殘基釋放出修飾基團的基團。許多可切割的基團是本領域已知的。參見例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.1431859-1867(1989)。此外，寬範圍的可切割的雙官能(同和異雙官能)接頭基團可以通過商業途徑從供應商例如Pierce獲得。
用光、熱或者試劑例如硫醇、羥胺、鹼、高碘酸鹽等等可以切割示例性的可切割部分。此外，作為對於被胞吞而作出的應答，某些優選的基團在體內被切割(例如，順烏頭醯基；參見，Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優選的可切割基團包括可切割的部分，其是選自二硫化物、酯、醯亞胺、碳酸酯、硝基苄基、苯甲醯甲基和苯偶姻基團的成員。
根據本發明的具體實施方案包括
和這些種類的碳酸酯和活性酯，例如
本發明的示例性綴合物 在示例性的實施方案中，所述多肽是幹擾素。幹擾素是抗病毒糖蛋白，其在人類中在用病毒或雙鏈RNA誘導後由人初級成纖維細胞分泌。有益的是，幹擾素作為治療劑，例如抗病毒劑(例如，乙型和C型肝炎)、抗腫瘤劑(例如，肝細胞癌)，和用於治療多發性硬化。關於與幹擾素-α相關的參考文獻，參見Asano等人，Eur.J.Cancer，27(Suppl 4)S21-S25(1991)；Nagy等人，Anticancer Research，8(3)467-470(1988)；Dron等人，J.Biol.Regul.Homeost.Agents，3(1)13-19(1989)；Habib等人，Am.Surg.，67(3)257-260(3/2001)；和Sugyiama等人，Eur.J.Biochem.，217921-927(1993)。討論幹擾素-β的參考文獻，參見例如，Yu等人，J.Neuroimmunol.，64(1)91-100(1996)；Schmidt，J.，J.Neurosci.Res.，65(1)59-67(2001)；Wender等人，Folia Neuropathol.，39(2)91-93(2001)；Martin等人，SpringerSemin.Immunopathol.，18(1)1-24(1996)；Takane等人，J.Pharmacol.Exp.Ther，294(2)746-752(2000)；Sburlati等人，Biotechnol.Prog.，14189-192(1998)；Dodd等人，Biochimica et Biophysica Acta，787183-187(1984)；Edelbaum等人，J.Interferon Res.，12449-453(1992)；Conradt等人，J.Biol.Chem.，262(30)14600-14605(1987)；Civas等人，Eur.J.Biochem.，173311-316(1988)；Demolder等人，J.Biotechnol.，32179-189(1994)；Sedmak等人，J.Interferon Res.，9(Suppl 1)S61-S65(1989)；Kagawa等人，J.Biol.Chem.，263(33)17508-17515(1988)；Hershenson等人，美國專利號4,894,330；Jayaram等人，J.Interferon Res.，3(2)177-180(1983)；Menge等人，Develop.Biol.Standard.，66391-401(1987)；Vonk等人，J.InterferonRes.，3(2)169-175(1983)；和Adolf等人，J.Interferon Res.，10255-267(1990)。
在示例性的幹擾素綴合物中，將幹擾素α，例如幹擾素α2b和2a，通過完整的糖基接頭綴合至水溶性聚合物。
在進一步的示例性實施方案中，本發明提供了人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的綴合物。G-CSF是刺激中性白細胞生成性祖細胞增殖、分化和激活成功能上成熟的嗜中性粒細胞的糖蛋白。注射的G-CSF從身體中快速清除。參見例如，Nohynek等人，CancerChemother.Pharmacol.，39259-266(1997)；Lord等人，Clinical CancerResearch，7(7)2085-2090(07/2001)；Rotondaro等人，MolecularBiotechnology，11(2)117-128(1999)；和

等人，Bone MarrowTransplantation，28259-264(2001)。
本發明包括用於修飾GM-CSF的方法。GM-CSF在本領域公知為由激活的T-細胞、巨噬細胞、內皮細胞和基質成纖維細胞產生的細胞因子。GM-CSF主要作用於骨髓從而增加炎性白細胞的產生，並進一步作為內分泌激素以起始在炎症功能期間消耗的嗜中性粒細胞的補充。此外，GM-CSF是巨噬細胞激活因子並且促進朗格漢斯細胞分化成樹突細胞。像G-CSF一樣，GM-CSF也在化療後的骨髓更換中具有臨床應用。
核酸 在另一個方面，本發明提供了編碼本發明的非天然存在的多肽的分離的核酸。在一個實施方案中，本發明的核酸是表達載體的一部分。在另一個相關的實施方案中，本發明提供了包含本發明的核酸的細胞。示例性的細胞包括宿主細胞，例如大腸桿菌的各種菌株、昆蟲細胞和哺乳動物細胞，如CHO細胞。
藥物組合物 在另一個方面，本發明提供了藥物組合物，其包含至少一種本發明的多肽或多肽綴合物和可藥用載體。在示例性的實施方案中，該藥物組合物包含水溶性聚合物(例如，非天然存在的水溶性聚合物)和本發明的糖基化或非糖基化的多肽之間的共價綴合物，以及可藥用載體。示例性的水溶性聚合物包括聚(乙二醇)和甲氧基-聚(乙二醇)。備選地，將多肽綴合至除聚(乙二醇)衍生物之外的其他修飾基團，例如治療性部分或生物分子。
本發明的多肽綴合物具有寬範圍的藥物學應用。例如，糖綴合的促紅細胞生成素(EPO)可用於治療全身性貧血、再生障礙性貧血、化學誘導的損傷(例如骨髓損傷)、慢性腎衰竭、腎炎和地中海貧血。經修飾的EPO可以進一步用於治療神經病學病症，例如腦/脊柱損傷、多發性硬化和阿爾茨海默病。
第二個實例是幹擾素-α(IFN-α)，其可以用於治療AIDS和乙型或C型肝炎，由各種病毒例如人乳頭瘤病毒(HBV)、冠狀病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)引起的病毒感染，癌症例如多毛細胞白血病、AIDS相關的卡波西肉瘤、惡性黑素瘤、濾泡型非霍奇金淋巴瘤、費城染色體(Ph)-陽性、慢性期髓性白血病(CML)、腎癌、骨髓瘤、慢性髓性白血病、頭和頸癌、骨癌，以及宮頸上皮結構不良和中樞神經系統(CNS)的病症例如多發性硬化。此外，根據本發明方法進行修飾的IFN-α可用於治療各種各樣的其他疾病和病狀，例如舍格倫症候群(自身免疫疾病)、貝赫切特病(自身免疫炎性疾病)、纖維肌痛(骨骼肌疼痛/疲勞病症)、口瘡性潰瘍(復發性口潰瘍)、慢性疲勞症候群和肺纖維化。
另一個實例是幹擾素-β，其可用於治療CNS病症，例如多發性硬化(復發性/弛張性的或者慢性進行性的)，AIDS和乙型或C型肝炎，由各種病毒例如人乳頭瘤病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)和水痘帶狀皰疹病毒(VZV)引起的病毒感染，耳科感染，骨骼肌感染，以及癌症，包括乳腺癌、腦癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、頭和頸癌、基底細胞癌、宮頸上皮結構不良、黑素瘤、皮膚癌和肝癌。根據本發明方法進行修飾的IFN-β還可用於治療其他疾病和病狀，例如移植排斥(例如骨髓移植)、亨廷頓舞蹈病、結腸炎、腦炎症、肺纖維化、黃斑變性、肝硬化和角膜結膜炎。
粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是另一個實例。根據本發明方法進行修飾的G-CSF可以在用於治療癌症的化療中用作輔助劑，和用於預防或減輕與某些醫學操作程序相關的病狀或併發症，例如化學誘導的骨髓損傷；白細胞減少(全身性)；化學誘導的熱性中性白細胞減少；與骨髓移植相關的中性白細胞減少；和嚴重的慢性中性白細胞減少。經修飾的G-CSF還可以用於移植；外周血細胞活動化；使外周血祖細胞活動化以收集在將接受重度骨髓抑制性或骨髓抑制性化療的患者中；以及減少中性白細胞減少、發熱、抗生素使用、在急性粒細胞白血病(AML)的誘導/鞏固治療後住院的持續時間。可以用經修飾的G-CSF治療的其他病狀或病症包括哮喘和過敏性鼻炎。
作為一個另外的實例，根據本發明方法進行修飾的人生長激素(hGH)可用於治療生長相關的病狀，例如侏儒症、兒童和成人中的身材矮小症、惡病質/肌肉萎縮(muscle wasting)、全身性肌萎縮和性染色體異常(例如，特納症候群)。可以使用經修飾的hGH來治療的其他病狀包括短腸症候群、脂肪營養不良、骨質疏鬆症、尿毒症、燒傷、女性不孕症、骨再生、全身性糖尿病、II型糖尿病、骨關節炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和失眠症。此外，經修飾的hGH還可以用於促進各種過程，例如一般性組織再生、骨再生和傷口癒合，或者用作疫苗輔助劑。
本發明的藥物組合物適合於在各種藥物遞送系統中使用。用於本發明的合適的製劑可在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)中找到。藥物遞送方法的簡要綜述可參見Langer，Science 2491527-1533(1990)。
可以配製藥物組合物以用於任何合適方式的施用，包括例如，局部、口服、鼻、靜脈內、顱內、腹膜內、皮下或肌內施用。對於腸胃外施用，例如皮下注射，載體優選包括水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩衝劑。對於口服施用，可以使用任一種上述載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解的基質，例如微球(例如聚乳酸酯、聚乙醇酸酯)，可以用作本發明藥物組合物的載體。合適的生物可降解的微球例如公開於美國專利號4,897,268和5,075,109中。
通常，皮下或腸胃外例如靜脈內施用藥物組合物。因而，本發明提供了用於腸胃外施用的組合物，其包含溶解或懸浮在可接受的載體，優選水性載體(例如，水、經緩衝的水、鹽水、PBS等等)中的化合物。所述組合物還可以含有去汙劑，例如Tween 20和Tween 80；穩定劑，例如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖；和防腐劑，例如EDTA和間甲酚。所述組合物可以含有為了接近生理條件而所需的可藥用輔助物質，例如pH調節劑和緩衝劑、張度調節劑、潤溼劑、去汙劑，等等。
這些組合物可以通過常規滅菌技術來進行滅菌，或者可以過濾除菌。所得的水溶液可以進行包裝以就這樣使用，或者進行凍幹，並在施用前將凍幹製劑與無菌水性載體相組合。製劑的pH通常為3至11，更優選5至9，和最優選7至8。
在一些實施方案中，可以將本發明的糖肽摻入到從標準的形成小泡的脂質形成的脂質體中。各種方法可用於製備脂質體，如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利號4,235,871、4,501,728和4,837,028中所描述的。使用各種靶向性試劑(例如，本發明的唾液酸基半乳糖苷)來對脂質體實施靶向是本領域公知的(參見例如，美國專利號4,957,773和4,603,044)。
可以使用用於將靶向性試劑偶聯至脂質體的標準方法。這些方法通常涉及向脂質體中摻入脂質組分，例如磷脂醯乙醇胺，其可以被活化以用於附著靶向性試劑，或者摻入衍生化的親脂性化合物，例如本發明的用脂質衍生化的糖肽。
靶向機制通常要求，靶向性試劑以這樣的方式位於脂質體的表面上，從而使得靶向部分可用於與靶標例如細胞表面受體相互作用。可以使用本領域技術人員已知的方法，在形成脂質體之前將本發明的碳水化合物附著至脂質分子(例如，分別用長鏈烷基滷或脂肪酸對存在於碳水化合物上的羥基進行烷基化或醯化)。備選地，脂質體可以這樣進行製備形成膜時首先將銜接體部分摻入膜中。所述銜接體部分必須具有親脂性部分，其牢固地包埋並錨定在膜中。它必須還具有反應性部分，其在脂質體的水性表面上是化學上可用的。如此選擇反應性部分，從而使得它在化學上適合於與後來添加的靶向性試劑或碳水化合物形成穩定的化學鍵。在一些情況下，可能將靶向性試劑直接附著至銜接體分子，但是在大多數情況下，更合適的是使用第三種分子作為化學橋，從而將在膜中的銜接體分子與從小泡表面上三維地伸出的靶向性試劑或碳水化合物相連接。
通過本發明方法製備的化合物還可以用作診斷試劑。例如，經標記的化合物可以用於在被懷疑患有炎症的患者中定位炎症或腫瘤轉移區域。對應該用途，化合物可以用125I、14C或氚進行標記。
V.方法 鑑定作為糖基轉移酶的底物的突變型多肽 用於鑑定當進行糖基化反應時以令人滿意的產率被糖基化的突變型多肽的一種策略是製備非天然存在的(即突變型)多肽的文庫，其中每個突變型多肽包含至少一個本發明的O-聯糖基化序列，並就其用作糖基轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)的有效底物的能力來測試每個突變型多肽。通過經突變在親本多肽的胺基酸序列內的不同位置處產生所選的本發明O-聯糖基化序列，可以產生突變型多肽文庫。
突變型多肽文庫 在一個方面，本發明提供了用於產生突變型多肽文庫的方法，其中突變型多肽衍生自野生型或親本多肽。在一個實施方案中，親本多肽具有包含m個胺基酸的胺基酸序列。胺基酸序列內的每個胺基酸位置由(AA)n表示，其中n是選自1至m的成員。產生突變型多肽文庫的示例性方法包括下列步驟(i)通過在親本多肽內的第一個胺基酸位置(AA)n處引入本發明的突變型O-聯糖基化序列而產生突變型多肽；(ii)通過以所希望的次數重複步驟(i)而產生至少一種額外的突變型多肽，其中在第二個胺基酸位置處引入相同的突變型O-聯糖基化序列，該第二個胺基酸位置選自(AA)n+x和(AA)n-x的成員，其中x是選自1至(m-n)的成員。該方法的實施方案在上文中作了描述。在示例性的實施方案中，通過「序列肽段掃描」來產生突變型多肽文庫。
先導多肽的鑑定 在產生了突變型多肽文庫後，可能希望在文庫成員中選擇出這樣的突變體，所述多肽當進行酶促糖基化和/或糖PEG化反應時被有效地糖基化和/或糖PEG化。將被發現被有效地糖基化和/或糖PEG化的突變型多肽稱作「先導多肽」。在示例性的實施方案中，酶促糖基化或糖PEG化反應的產率用於選擇一種或多種先導多肽。在另一個示例性的實施方案中，先導多肽的酶促糖基化或糖PEG化產率為約10％至約100％，優選約30％至約100％，更優選約50％至約100％，和最優選約70％至約100％。任選地，通過使經糖基化的先導多肽進行另一酶促糖基化或糖PEG化反應來進一步評估可被有效地糖基化的先導多肽。
因此，本發明提供了用於鑑定先導多肽的方法。示例性的方法包括下列步驟(i)產生本發明的突變型多肽文庫(例如，根據本發明的方法)；(ii)使所述文庫的至少一個成員進行酶促糖基化反應(或任選地，酶促糖PEG化反應)，從而將糖基部分從糖基供體分子轉移到所述突變型O-聯糖基化序列中的至少一個上，其中所述糖基部分任選地用修飾基團進行衍生化；和(iii)對於文庫的至少一個成員，測量酶促糖基化或糖PEG化反應的產率。
被轉移的糖基部分可以是任何糖基部分，包括單糖和寡糖以及糖基模擬基團。在示例性的實施方案中，在最初的糖基化反應中被添加至突變型多肽的糖基部分是GalNAc部分。可以使用後繼的糖基化反應以向所得的GalNAc-多肽添加額外的糖基殘基(例如，Gal)。修飾基團可以是本發明的任何修飾基團，包括水溶性聚合物，例如mPEG。
用於產生突變型多肽(包括任何先導多肽)的方法是本領域已知的。示例性的方法描述在本文中。該方法可以包括一個或多個下列步驟(iv)產生包含對應於突變型多肽的核酸序列的表達載體；(v)用該表達載體轉染宿主細胞；(vi)在宿主細胞中表達所述突變型多肽；和(vii)分離所述突變型多肽。目的突變型多肽(例如，所選的先導多肽)可以以工業規模進行表達(例如，導致分離出超過250mg，優選超過500mg的蛋白質)。
在示例性的實施方案中，使突變型多肽文庫的每個成員進行酶促糖基化反應。例如，每種突變型多肽分開地進行糖基化反應，並且對於一種或多種所選的反應條件，測定糖基化反應的產率。
在示例性的實施方案中，在進一步的加工例如糖基化和/或糖PEG化之前，純化文庫的一種或多種突變型多肽。
在另一個實例中，可以合併幾組突變型多肽，並使所得的突變型多肽混合物進行糖基化或糖PEG化反應。在一個示例性的實施方案中，使含有文庫的所有成員的混合物進行糖基化反應。在一個實例中，根據該實施方案，可以以少於化學計算量的量(相對於存在的糖基化位點)將糖基供體試劑添加入糖基化反應混合物中，從而產生其中突變型多肽競爭作為酶的底物的環境。然後，可以例如通過質譜分析來鑑定作為酶的底物的那些突變型多肽，事先進行或不進行經糖基化的混合物的分離或純化。該相同方法可以用於這樣的一組突變型多肽，其中每個突變型多肽含有不同的本發明的O-聯糖基化序列。
可用於就其用作GlcNAc轉移酶的底物的能力來篩選多肽的示例性測定法描述於T.M.Leavy和C.R.Bertozzi，Bioorg.Med.Chem.Lett.2007，173851-3854中，該文獻通過提及而以其整體合併入本文以用於所有目的。可以使用本領域已知的任何合適的方法來測定酶促糖基化反應產率。在一個實施方案中，使用質譜法(例如，MALDI-TOF)或凝膠電泳來區分經糖基化的多肽和未反應的(例如，非糖基化的)多肽。在另一個優選的實施方案中，使用HPLC來測定糖基化的程度。為此目的，也可以使用核磁共振技術。在一個實施方案中，使用多孔平板(例如，96-孔平板)來平行地進行許多糖基化反應。該平板可以任選地在每個孔的底部裝備分離或過濾介質(例如，凝膠過濾膜)。在通過質譜法或其他方法進行分析之前，可以使用旋轉來預處理每個樣品。
宿主細胞內的糖基化 作為本發明突變型多肽的一部分的突變型O-聯糖基化序列的最初的糖基化也可以在其中表達所述多肽的宿主細胞內發生。該技術例如描述在於2006年9月6日提交的美國臨時專利申請號60/842,926中，其通過提及而以其整體合併入本文。宿主細胞可以是原核微生物，例如大腸桿菌或假單胞菌菌株。在示例性的實施方案中，宿主細胞是trxB gor supp突變型大腸桿菌細胞。
在另一個示例性的實施方案中，通過下列方式來完成細胞內糖基化在宿主細胞中共表達所述多肽和「活性核苷酸糖多肽糖基轉移酶蛋白」(例如，可溶的活性真核生物N-乙醯半乳糖胺轉移酶)，並且在允許糖部分在細胞內轉移至糖基化序列的條件下使所述宿主細胞進行生長。在另一個示例性的實施方案中，其中表達突變型多肽的微生物具有細胞內氧化環境。所述微生物可以被遺傳修飾，從而具有細胞內氧化環境。細胞內糖基化不限於轉移單個糖基殘基。可以通過共表達所需的酶和存在各自的糖基供體，而順次添加幾個糖基殘基。該方法也可以用於以商業規模產生突變型多肽。
用於確定突變型多肽是否在宿主細胞中在突變型O-聯糖基化序列內被有效地糖基化的方法是可得的。例如，通過質譜法來分析細胞裂解物(在一個或多個純化步驟後)，以測量糖基化的和非糖基化的突變型多肽之間的比例。在另一個實例中，通過凝膠電泳來分析細胞裂解物，從而將糖基化的肽與非糖基化的肽分開。
先導多肽的進一步評估 在其中最初的篩選程序涉及使用未修飾的糖基部分來進行酶促糖基化(例如，通過GalNAc-T2來轉移GalNAc部分)的一個實施方案中，可以就其作為有效底物的能力來進一步評估所選的先導多肽，以用於例如通過另一酶促反應或化學修飾來進行進一步的修飾。在示例性的實施方案中，隨後的「篩選」涉及使經糖基化的先導多肽進行另一糖基化(例如，添加Gal)和/或PEG化反應。
PEG化反應可以例如是化學PEG化反應或酶促糖PEG化反應。為了鑑定被有效地糖PEG化的先導多肽，使至少一種先導多肽(任選地事先經糖基化)進行PEG化反應並測定該反應的產率。在一個實例中，測定每種先導多肽的PEG化產率。在示例性的實施方案中，PEG化反應的產率為約10％至約100％，優選約30％至約100％，更優選約50％至約100％，和最優選約70％至約100％。可以使用適合於多肽分析的本領域已知的任何分析方法來測定PEG化產率，所述分析方法例如為質譜法(例如，MALDI-TOF、Q-TOF)、凝膠電泳(例如，與用於定量的方法例如光密度測定法相組合)、NMR技術以及色譜方法，例如HPLC(使用可用於分開所分析的多肽的PEG化和非PEG化的種類的合適柱材料)。如上面關於糖基化所描述的，可以使用多孔平板(例如，96-孔平板)來平行地進行許多PEG化反應。該平板可以任選地在每個孔的底部裝備分離或過濾介質(例如，凝膠過濾膜)。在通過質譜法或其他方法進行分析之前，可以使用旋轉和重構來預處理每個樣品。
在另一個示例性的實施方案中，在下述的「單罐反應」中發生突變型多肽的糖基化和糖PEG化。在一個實例中，將突變型多肽與第一種酶(例如，GalNAc-T2)和合適的供體分子(例如，UDP-GalNAc)接觸。將該混合物溫育合適的時間，隨後加入第二種酶(例如，Core-1-GalT1)和第二種糖基供體(例如，UDP-Gal)。可以以該方式進行任何次數的額外的糖基化/糖PEG化反應。備選地，可以將超過一種的酶和超過一種的糖基供體與突變型多肽接觸，以在一個反應步驟中添加超過一個的糖基殘基。例如，將突變型多肽與3種不同的酶(例如，GalNAc-T2、Core-1-GalT1和ST3Gal1)和三種不同的糖基供體部分(例如，UDP-GalNAc、UDP-Gal和CMP-SA-PEG)在合適的緩衝液系統中接觸，以產生經糖PEG化的突變型多肽，例如多肽-GalNAc-Gal-SA-PEG(參見實施例4.6)。可以使用上述方法來測定總產率。
多肽綴合物的形成 在另一個方面，本發明提供了在修飾基團和多肽之間形成共價綴合物的方法。在糖基化的或非糖基化的多肽和各種不同種類例如水溶性聚合物、治療性部分、生物分子、診斷性部分、靶向性部分等等之間形成本發明的多肽綴合物。將所述聚合物、治療性部分或生物分子通過糖基連接基團而綴合至所述肽，所述糖基連接基團插入在所述多肽和所述修飾基團(例如，水溶性聚合物)之間並且共價連接至所述多肽和所述修飾基團。經修飾的糖的糖部分優選選自核苷酸糖、活化的糖和既不是核苷酸也沒有活化的糖。
在示例性的實施方案中，通過將經修飾的糖酶促附著至多肽而形成多肽綴合物。與已知的化學和酶促的肽精細製作策略不同，本發明的方法使得可能裝配具有基本上均一的衍生化模式的肽和糖肽。用於本發明的酶一般對於肽的特定胺基酸殘基或者胺基酸殘基的組合而言是選擇性的。本發明的方法還為大規模生產經修飾的肽和糖肽提供了實際手段。
例用酶例如糖基轉移酶的極佳的選擇性，本方法提供了在一個或多個特定位置處攜帶有修飾基團的多肽。因此，根據本發明，將經修飾的糖直接附著至在多肽鏈內的O-聯糖基化序列，或者備選地，將經修飾的糖附加在糖肽的碳水化合物部分上。這樣的肽也在本發明的範圍內，在所述多肽中，經修飾的糖結合至經糖基化的位點和直接結合至多肽主鏈的胺基酸殘基。在優選的實施方案中，將經修飾的葡糖胺部分直接添加至本發明的O-聯糖基化序列的胺基酸側鏈，優選地通過GlcNAc轉移酶的作用。
因此，在一個方面，本發明提供了形成多肽和修飾基團(例如，聚合物修飾基團，其任選地是水溶性的)之間的共價綴合物的方法，其中所述多肽包含O-聯糖基化序列，所述O-聯糖基化序列包含具有羥基的胺基酸殘基。作為該多肽的一部分的所述O-聯糖基化序列是葡糖胺轉移酶(例如，GlcNAc轉移酶)的底物。所述聚合物修飾基團通過葡糖胺連接基團共價連接至所述多肽，所述葡糖胺連接基團插入在所述多肽和所述修飾基團之間並且共價連接至所述多肽和所述修飾基團。示例性的方法包括(i)在葡糖胺供體為其底物的糖基轉移酶(例如，人GlcNAc轉移酶)存在下，使多肽與葡糖胺供體相接觸，所述葡糖胺供體包含共價連接至聚合物修飾基團的葡糖胺部分或葡糖胺模擬部分。所述反應在對於所述糖基轉移酶將所述葡糖胺部分或葡糖胺模擬部分從所述葡糖胺供體轉移到所述O-聯糖基化序列的所述羥基上來說足夠的條件下進行。
形成本發明的多肽綴合物的另一個示例性方法包括下列步驟(i)重組產生包含本發明的O-聯糖基化序列的多肽，和(ii)將葡糖胺部分或葡糖胺模擬部分從葡糖胺供體(例如，摻入了GlcNAc或GlcNAc-模擬部分的經修飾的糖核苷酸)酶促轉移到胺基酸側鏈的羥基上，其中所述胺基酸是所述O-聯糖基化序列的一部分。
在上面的方法中，所述葡糖胺部分也可以是葡糖胺模擬部分。在優選的實施方案中，所述葡糖胺轉移酶是GlcNAc轉移酶。優選地，所述葡糖胺轉移酶是重組的酶。在特別優選的實施方案中，在本發明的方法中所使用的GlcNAc轉移酶在細菌宿主細胞，例如大腸桿菌中進行表達。
在一個實施方案中，在本發明的方法中所使用的多肽是天然地包含O-聯糖基化序列的野生型多肽。在另一個實施方案中，所述多肽是本發明的非天然存在的多肽，其衍生自親本多肽，在所述親本多肽中通過突變而引入了至少一個O-聯糖基化序列。
在一個實施方案中，在本發明的方法中所使用的葡糖胺供體具有根據式(XI)的結構(其如本文上面所描述)，不同之處在於，所述供體不需要摻入修飾基團。在一個實施方案中，在式(XI)中，E和E1都是氧。在特別優選的實施方案中，所述葡糖胺供體選自經修飾或未修飾的UDP-GlcNAc和經修飾或未修飾的UDP-GlcNH。
糖基化或糖修飾步驟可以分開地進行，或者在「單罐」反應中使用多種酶和糖基供體組合進行。例如，可以在單個容器中合併用於從所表達的多肽上修剪掉不想要的糖基殘基的糖苷酶和一種或多種糖基轉移酶以及各自的糖基供體分子。另一個實例涉及順次添加每種酶和合適的糖基供體，並以「單罐」模式進行該反應。在一個實施方案中，添加的時間點被對於每種酶進行所希望的酶促反應而言必需的反應時間所隔斷。上述方法的組合也可以用於製備本發明的化合物。
本發明還提供了手段以向肽添加(或除去)一個或多個所選的糖基殘基，之後將經修飾的糖綴合至肽的至少一個所選的糖基殘基上。例如，當希望將經修飾的糖綴合至不存在於肽上或不以所希望的量存在的所選糖基殘基時，本實施方案是有用的。因此，在將經修飾的糖偶聯至肽之前，通過酶促或化學偶聯將所選的糖基殘基綴合至所述肽。在另一個實施方案中，在綴合經修飾的糖之前，通過從糖肽上除去碳水化合物殘基來改變該糖肽的糖基化模式。參見例如，WO 98/31826。
通過化學或酶促方法來完成存在於糖肽上的任何碳水化合物部分的添加或除去。優選地，通過將多肽暴露於三氟甲磺酸或等同的化合物來進行化學去糖基化。該處理導致除了連接性糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的大多數或所有糖的切割，而使該肽保持完整。化學去糖基化由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.25952(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118131(1981)進行了描述。通過使用由Thotakura等人，Meth.Enzymol.138350(1987)所描述的各種內切和外切糖苷酶可以實現多肽變體上碳水化合物部分的酶促切割。
通過任何本領域公認的方法來進行糖基部分的化學添加。優選地，使用本文所述方法的修正形式(其中用天然糖基單位代替在本發明中使用的經修飾的糖)來實現糖部分的酶促添加。用於添加糖部分的其他方法公開在美國專利號5,876,980；6,030,815；5,728,554和5,922,577中。用於本發明的示例性方法描述在於1987年9月11日公布的WO87/05330中以及在Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，pp.259-306(1981)中。
包含兩個或更多多肽的多肽綴合物 還提供了包含通過接頭臂連接在一起的兩個或更多多肽的綴合物，即多功能綴合物；至少一個肽被O-糖基化或者包含突變型O-聯糖基化序列。本發明的多功能綴合物可以包含兩個或更多拷貝的相同肽或者具有不同結構和/或性質的各種不同肽的集合。在根據該實施方案的示例性綴合物中，兩個肽之間的接頭通過O-聯糖基殘基，例如O-聯糖基完整糖基連接基團，而附著至所述肽中的至少一個。
在一個實施方案中，本發明提供了用於通過連接基團來連接兩個或更多肽的方法。連接基團可以具有任何有用的結構並且可以選自直鏈和支鏈結構。優選地，附著至肽的接頭的每個末端包含經修飾的糖(即，新生的完整糖基連接基團)。
在本發明的示例性方法中，兩個肽通過包含PEG接頭的接頭部分而連接在一起。該構建體符合上面圖式中給出的一般結構。如本文所述，本發明的構建體包含兩個完整的糖基連接基團(即，s+t＝1)。聚焦於包含兩個糖基基團的PEG接頭是為了清楚的目的，並不應當被解釋為限制了用於在本發明的該實施方案中使用的接頭臂的身份。
因此，PEG部分在第一個末端處用第一糖基單位進行官能化，並在第二個末端處用第二糖基單位進行官能化。所述第一和第二糖基單位優選是不同的轉移酶的底物，從而允許第一個和第二個肽分別正交附著至所述第一和第二糖基單位。在實踐中，將(糖基)1-PEG-(糖基)2接頭與第一種肽和第一種轉移酶(所述第一糖基單位是其底物)接觸，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然後，任選地從反應混合物中除去轉移酶和/或未反應的肽。向該(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2綴合物添加第二種肽和第二種轉移酶(所述第二糖基單位是其底物)，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2；所述糖基殘基中的至少一個是直接或間接地O-聯的。本領域技術人員將會意識到，上面所概述的方法也可應用於在超過兩個的肽之間形成綴合物，例如通過使用支化的PEG、樹枝狀聚合物、聚(胺基酸)、多糖等等。
上述過程可以如所希望的進行許多循環，並且不限於用單個接頭在兩個肽之間形成綴合物。此外，本領域技術人員將會意識到，用肽使在PEG(或其他)接頭的末端處的完整糖基連接基團官能化的反應可以在同一個反應容器中同時進行，或者它們可以以逐步的方式進行。當反應以逐步的方式進行時，將在每步產生的綴合物任選地從一種或多種反應組分(例如，酶、肽)中純化出來。
將經修飾的糖酶促綴合至肽 將經修飾的糖綴合至糖基化或非糖基化的肽，其中使用合適的酶來介導該綴合。優選地，選擇修飾的供體糖、酶和接納體肽的濃度，從而使得糖基化反應持續進行，直到接納體被耗盡。
使用糖基轉移酶來合成所希望的寡糖結構的許多方法是已知的並且通常可應用於本發明。示例性的方法例如描述於下列文獻中WO96/32491和Ito等人，Pure Appl.Chem.65753(1993)，以及美國專利號5,352,670、5,374,541和5,545,553。
使用單種酶(例如，糖基轉移酶)或者糖基轉移酶與任選地一種或多種糖苷酶的組合來實施本發明。例如，可以使用葡糖胺轉移酶和半乳糖基轉移酶的組合。在使用超過一種酶的那些實施方案中，優選地將酶和底物合併在最初的反應混合物中，或者一旦第一個酶促反應完成或者接近完成，就將用於第二個酶促反應的酶和試劑加入反應介質中。通過在單個容器中依次進行兩個酶促反應，總產率相對於其中分離出中間體種類的程序而言得到了提高。此外，減少了多餘的溶劑和副產物的清除和處置。
本發明綴合物的O-聯糖基部分通常以附著至肽的葡糖胺部分為起始。葡糖胺轉移酶家族中的任何成員(例如，在本文中所描述的GlcNAc轉移酶，例如SEQ ID NOs1-9和228至230)可以用於將葡糖胺部分結合至肽(參見例如，Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA和Clausen H(2000)；Control of Mucin-TypeO-GlycosylationO-Glycan Occupancy is Directed by SubstrateSpecificities of Polypeptide GalNAc-Transferases；Eds.Ernst，Hart和Sinay；Wiley-VCH chapter″Carbohydrates in Chemistry and Biology-a Comprehension Handbook″，273-292)。GlcNAc部分自身可以是糖基連接基團，並用修飾基團來進行衍生化。備選地，使用一種或多種酶和一種或多種合適的糖基供體底物來擴建糖基殘基。那麼，可以將經修飾的糖添加至延伸的糖基部分。
所述酶通常通過與內切聚糖酶水解步驟的逆反應類似的合成步驟來催化該反應。在這些實施方案中，糖基供體分子(例如，所希望的寡糖或單糖結構)含有離去基團，並且通過將供體分子添加至在蛋白質上的GlcNAc殘基而持續進行該反應。例如，離去基團可以是滷素，例如氟化物。在其他實施方案中，離去基團是Asn，或Asn-肽部分。在進一步的實施方案中，修飾在糖基供體分子上的GlcNAc殘基。例如，GlcNAc殘基可以包含1，2噁唑啉部分。
在另一個實施方案中，用於產生本發明綴合物的每種酶以催化量存在。特定酶的催化量依據該酶的底物的濃度以及反應條件例如溫度、時間和pH值而變。在預選的底物濃度和反應條件下測定給定酶的催化量的方法是本領域技術人員公知的。
施行上述方法所處的溫度可以為從剛剛高於冰點到大多數敏感的酶變性的溫度。優選的溫度範圍是約0℃至約55℃，和更優選約20℃至約32℃。在另一個示例性的實施方案中，在升高的溫度下使用嗜熱的酶來進行本發明方法的一個或多個組成部分。
讓反應混合物保持足夠使接納體被糖基化的一段時間，從而形成所希望的綴合物。數小時後通常可以檢測到一些綴合物，通常在24小時或更短時間內獲得可回收的量。本領域技術人員理解，反應速率取決於許多可變因素(例如，酶濃度、供體濃度、接納體濃度、溫度、溶劑體積)，它們對於所選的系統進行優化。
本發明還提供了經修飾的肽的工業規模的生產。如本文所使用的，工業規模通常產生至少約250mg，優選至少約500mg，和更優選至少約1g完成的純化的綴合物，優選在單次反應循環後，即所述綴合物不是來自相同的連續重複的合成循環的反應產物的組合。
在下面的討論中，通過將經修飾的唾液酸部分綴合至經糖基化的肽來舉例說明本發明。該示例性的經修飾的唾液酸用(m-)PEG進行標記。下面關於經PEG修飾的唾液酸和經糖基化的肽的使用的討論焦點是為了清楚地舉例說明，而並不意在暗示本發明局限於這兩種配偶體的綴合。技術人員理解，該討論通常可應用於添加除唾液酸之外的其他經修飾的糖基部分。此外，該討論同樣可應用於用除PEG之外的其他試劑(包括其他水溶性聚合物、治療性部分和生物分子)來修飾糖基單位。
酶促方法可用於在肽或糖肽上選擇性地引入修飾基團(例如，mPEG或mPPG)。在一個實施方案中，該方法利用包含修飾基團的經修飾的糖與合適的糖基轉移酶或糖合酶(glycosynthase)的組合。通過選擇將會產生所希望的碳水化合物連接的糖基轉移酶和利用經修飾的糖作為供體底物，可以將修飾基團直接引入到肽主鏈上，引入到糖肽的現有糖殘基上，或者引入到被添加至肽的糖殘基上。在另一個實施方案中，該方法利用經修飾的糖，其攜帶被掩蔽的反應性官能團，該官能團在經修飾的糖轉移到肽或糖肽上後可以用於附著修飾基團。
在示例性的實施方案中，通過GalNAc轉移酶的作用將GalNAc殘基添加至O-聯糖基化序列。Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA和Clausen H(2000)，Control of Mucin-TypeO-glycosylationO-Glycan Occupancy is Directed by SubstrateSpecificities of Polypeptide GalNAc-Transferases(Eds.Ernst，Hart和Sinay)，Wiley-VCH chapter″Carbohydrates in Chemistry andBiology-a Comprehension Handbook″，第273-292頁。該方法包括將待修飾的肽與含有合適量的半乳糖基轉移酶和合適的半乳糖基供體的反應混合物一起進行溫育。允許該反應基本上進行到完成，或者備選地，當加入預選量的半乳糖殘基時該反應被終止。用於裝配所選的糖接納體的其他方法對於本領域技術人員而言將是明顯的。
在下面的討論中，通過使用附著有水溶性聚合物的經修飾的糖來舉例說明本發明的方法。討論的焦點是為了清楚地舉例說明。技術人員將會意識到，該討論同樣與其中經修飾的糖攜帶有治療性部分、生物分子等的那些實施方案相關。
在另一個示例性的實施方案中，經由經修飾的GlcNAc或GlcNH殘基、半乳糖基(Gal)殘基、巖藻糖基殘基(Fuc)、唾液酸基殘基(Sia)或甘露糖基(Man)殘基將水溶性聚合物添加至GlcNAc殘基。備選地，可以將未修飾的糖基殘基添加至末端GlcNAc殘基。
在更進一步的實例中，使用經修飾的GlcNAc、Gal、Sia、Fuc或Man部分和合適的轉移酶將水溶性聚合物(例如，PEG)添加到末端GlcNAc殘基上。
在更進一步的方法中，掩蔽的反應官能團存在於被轉移的糖基殘基上。掩蔽的反應性基團優選地不受用於將經修飾的糖附著至肽的條件的影響。在將經修飾的糖共價附著至肽後，除去掩蔽物，並通過在經修飾的糖殘基上的未掩蔽的反應性基團與反應性修飾基團的反應，將肽綴合至修飾基團，例如水溶性聚合物(例如，PEG或PPG)。
在一個備選的實施方案中，通過使用已知將糖殘基轉移至肽主鏈上的O-聯糖基化序列的糖基轉移酶，來將經修飾的糖直接添加至肽主鏈。可用於實施本發明的示例性糖基轉移酶包括，但不限於，GlcNAc轉移酶等。該方法的使用允許將經修飾的糖直接添加到缺少任何碳水化合物的肽上。在優選的實施方案中，經修飾的糖核苷酸是經修飾的UDP-葡糖胺，和糖基轉移酶是GlcNAc轉移酶。該示例性的實施方案在下面的方案5中給出。
方案5將示例性的經修飾的糖轉移到多肽的胺基酸殘基上
在另一個示例性的實施方案中，將糖肽綴合至靶向性試劑，例如，轉鐵蛋白(以將肽遞送穿過血腦屏障，並至內體)，肉鹼(以將肽遞送到肌細胞；參見例如，LeBorgne等人，Biochem.Pharmacol.591357-63(2000))，和膦酸例如二膦酸(以將肽靶向骨和其他含鈣組織；參見例如，Modern Drug Discovery，2002年8月，第10頁)。可用於靶向的其他試劑對於本領域技術人員而言是明顯的。例如，葡萄糖、穀氨醯胺和IGF也可用於靶向肌肉。
通過本文討論的或本領域已知的任何方法來綴合靶向性部分和治療性肽。技術人員將會意識到，除了上面所示的那些之外的其他肽也可以如本文所述的進行衍生化。示例性的肽在共同待決的共有的美國臨時專利申請號60/328,523(2001年10月10日提交)的附錄中給出。
在示例性的實施方案中，靶向性試劑和治療性肽通過接頭部分而偶聯。在該實施方案中，根據本發明的方法，將治療性肽或靶向性試劑中的至少一個經由完整的糖基連接基團而偶聯至接頭部分。在示例性的實施方案中，接頭部分包括聚(醚)，例如聚(乙二醇)。在另一個示例性的實施方案中，接頭部分包括至少一個在體內降解的鍵，從而在將綴合物遞送到身體的所靶向的組織或區域後，從靶向性試劑上釋放出治療性肽。
在另外一個示例性的實施方案中，通過改變治療性部分上的糖形而不將治療性肽綴合至靶向性部分，來改變治療性部分的體內分布。例如，通過用唾液酸(或其衍生物)來帽化糖基基團的末端半乳糖部分，可以避免治療性肽被網狀內皮系統攝取。
酶 糖基轉移酶 待用於本發明的糖基轉移酶可以是任一種，只要它可以利用經修飾的糖作為糖供體。此類酶的實例包括Leloir途徑糖基轉移酶，例如半乳糖基轉移酶、N-乙醯葡糖胺轉移酶、N-乙醯半乳糖胺轉移酶、巖藻糖基轉移酶、唾液酸轉移酶、甘露糖基轉移酶、木糖基轉移酶、葡糖苷酸基轉移酶等等。
對於涉及糖基轉移酶反應的酶促糖合成，可以從任何來源克隆或分離糖基轉移酶。許多經克隆的糖基轉移酶以及它們的多核苷酸序列是已知的。糖基轉移酶的胺基酸序列和編碼糖基轉移酶的核苷酸序列(從其可以推導出胺基酸序列)可在各種公眾可得的資料庫中找到，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等。
可用於本發明方法的糖基轉移酶包括但不限於，半乳糖基轉移酶、巖藻糖基轉移酶、葡糖基轉移酶、N-乙醯半乳糖胺轉移酶、N-乙醯葡糖胺轉移酶、葡糖苷酸基轉移酶、唾液酸轉移酶、甘露糖基轉移酶、葡糖醛酸轉移酶、半乳糖醛酸轉移酶和寡糖基轉移酶。合適的糖基轉移酶包括從真核生物中以及從原核生物中獲得的那些。
編碼糖基轉移酶的DNA可以通過化學合成而獲得，通過篩選來自合適細胞或細胞系培養物的mRNA的反轉錄物而獲得，通過篩選來自合適細胞的基因組文庫而獲得，或者通過這些程序的組合而獲得。mRNA或基因組DNA的篩選可以用從糖基轉移酶基因序列產生的寡核苷酸探針來進行。探針可以根據已知的程序用可檢測基團例如螢光基團、放射性原子或化學發光基團進行標記，並用於常規的雜交測定法中。備選地，可以使用從糖基轉移酶基因序列產生的PCR寡核苷酸引物，通過採用聚合酶鏈式反應(PCR)程序來獲得糖基轉移酶基因序列(參見例如，Mullis等人的美國專利號4,683,195和Mullis的美國專利號4,683,202)。
可以在用含有編碼糖基轉移酶的DNA的載體轉化的宿主細胞中合成糖基轉移酶。載體用於擴增編碼糖基轉移酶的DNA和/或表達編碼糖基轉移酶的DNA。表達載體是可複製的DNA構建體，其中編碼糖基轉移酶的DNA序列有效地連接至合適的控制序列，所述控制序列能夠實現糖基轉移酶在合適宿主中的表達。對於此類控制序列的需要將依據所選的宿主和所選的轉化方法而變。一般地，控制序列包括轉錄啟動子，用於控制轉錄的任選的操縱基因序列，編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列，以及控制轉錄和翻譯終止的序列。擴增載體不需要表達控制結構域。所有所需要的是在宿主中複製的能力，這通常由複製起點來賦予，和有助於識別轉化體的選擇基因。
在示例性的實施方案中，本發明利用原核生物的酶。此類糖基轉移酶包括參與脂寡糖(LOS)合成的酶，所述脂寡糖由許多革蘭氏陰性細菌產生(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology 23(3)139-180(1996))。此類酶包括但不限於，諸如大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的物種的rfa操縱子的蛋白質，包括β1，6半乳糖基轉移酶和β1，3半乳糖基轉移酶(參見，例如EMBL登錄號M80599和M86935(大腸桿菌)；EMBL登錄號S56361(鼠傷寒沙門氏菌))，葡糖基轉移酶(Swiss-Prot登錄號P25740(大腸桿菌))，β1，2-葡糖基轉移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登錄號P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot登錄號P19817(鼠傷寒沙門氏菌))，和β1，2-N-乙醯葡糖胺轉移酶(rfaK)(EMBL登錄號U00039(大腸桿菌))。胺基酸序列已知的其他糖基轉移酶包括由諸如rfaB(其已經在諸如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸沙門氏菌(Salmonella enterica)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprosum)的生物中得到表徵)的操縱子所編碼的那些，以及由銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操縱子所編碼的那些。
也適合用於本發明的是參與產生這樣的結構的糖基轉移酶，所述結構包含乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)，D-半乳糖基-β-1，4-N-乙醯基-D-葡糖胺基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，和Pk血型三糖序列，D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，它們已經在黏膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中得到了鑑定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))。來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的基因(其編碼參與這些結構的生物合成的糖基轉移酶)已經從腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))中鑑定出來。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由三個基因即lgtA、lgtB和lgE組成的基因座編碼糖基轉移酶，該酶是添加乳-N-新四糖鏈中的最後三個糖所必需的(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。最近，證明了lgtB和lgtA基因產物的酶活性，這提供了所提出的它們的糖基轉移酶功能的第一個直接證據(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，存在兩個額外的基因，即lgtD和lgtC，lgtD向乳-N-新四糖結構的末端半乳糖的3位添加β-D-GalNAc，lgtC向截短的LOS的乳糖元件添加末端α-D-Gal，從而產生Pk血型抗原結構(Gotshlich(1994)，同上)。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，分開的免疫型L1也表達Pk血型抗原並且已經顯示出攜帶lgtC基因(Jennings等人，(1995)，同上)。奈瑟氏球菌糖基轉移酶和相關的基因還描述於USPN 5,545,553(Gotschlich)中。還已經表徵了來自幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的α1，2-巖藻糖基轉移酶和α1，3-巖藻糖基轉移酶的基因(Martin等人，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)的糖基轉移酶也可用於本發明(參見例如，http://afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
(a)N-乙醯葡糖胺轉移酶 在一些實施方案中，糖基轉移酶是N-乙醯葡糖胺轉移酶，例如尿苷二磷酸-N-乙醯葡糖胺多肽β-N-乙醯葡糖胺轉移酶，其例如描述在Kreppel等人，J.Biol.Chem.1997，2729308-9315和Lubas等人，J.Biol.Chem.1997，2729316-9324中。其他示例性的GlcNAc轉移酶公開在Kreppel，L.和G.Hart，J.Biol.Chem.1999，27432015-32022；Lubas，W.和J.Hanover，J.Biol.Chem.2000，27510983-10988；Hanover，J.等人，Arch.Biochem.Biophys.2003，409287-297；Gross，B.，Kraybill，B.和S.Walker，J.Am.Chem.Soc.2005，12714588-14589；和Gross，B.，Swoboda，J.和S.Walker，J.Am.Chem.Soc.2008，130440-441中，這些文獻的公開內容通過提及而以其整體合併入本文。示例性的葡糖胺轉移酶包括GnT-I至GnT-VI。在本發明的方法中有用的GlcNAc轉移酶的示例性的胺基酸序列例如顯示在圖1至9(SEQ ID NOs1至9)中和下文(SEQ ID NOs228至230)中。
人GlcNAc轉移酶同種型1(NP858058)的序列 (SEQ ID NO228) MASSVGNVADSTEPTKRMLSFQGLAELAHREYQAGDFEAAERHCMQLWRQEPDNTGVLLLLSSIHFQCRRLDRSAHFSTLAIKQNPLLAEAYSNLGNVYKERGQLQEAIEHYRHALRLKPDFIDGYINLAAALVAAGDMEGAVQAYVSALQYNPDLYCVRSDLGNLLKALGRLEEAKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCVFNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLRALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLANALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLYRKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSNMGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIASYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKNRLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLKLSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTNFRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNELFALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMPHTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPDVKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITINGFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQLYKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRIIFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGETLASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQRISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA 人GlcNAc轉移酶同種型2(NP858059)的序列 (SEQ ID NO229) MASSVGNVADSTGLAELAHREYQAGDFEAAERHCMQLWRQEPDNTGVLLLLSSIHFQCRRLDRSAHFSTLAIKQNPLLAEAYSNLGNVYKERGQLQEAIEHYRHALRLKPDFIDGYINLAAALVAAGDMEGAVQAYVSALQYNPDLYCVRSDLGNLLKALGRLEEAKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCVFNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLRALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLANALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLYRKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSNMGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIASYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKNRLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLKLSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTNFRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNELFALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMPHTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPDVKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITINGFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQLYKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRIIFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGETLASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQRISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA 人GlcNAc轉移酶同種型CRA_a(EAX05285 CH47l132.2)的序列 (SEQ ID NO230) MLQGHFWLVREGIMISPSSPPPPNLFFFPLQIFPFPFTSFPSHLLSLTPPKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCVFNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLRALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLANALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLYRKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSNMGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIASYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKNRLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLKLSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTNFRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNELFALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMPHTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPDVKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITINGFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQLYKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRIIFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGETLASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQRISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA 其他葡糖胺轉移酶，例如來源於其他生物諸如其他哺乳動物(例如，鼠類、牛、豬、大鼠)、昆蟲(果蠅屬物種(Drosophila sp.))、酵母(例如，假絲酵母屬物種(Candida sp.))、細菌(例如，大腸桿菌)和秀麗隱杆線蟲(C.elegans)的那些葡糖胺轉移酶在本發明的方法內也是有用的。此外，上述葡糖胺轉移酶(SEQ ID NOs228至230)或任何其他葡糖胺轉移酶的任何突變的或截短的形式在本發明的方法內也是有用的。在一個實施方案中，GlcNAc轉移酶缺少一個或多個三十四肽重複(TPR，tetratricopeptide repeat)結構域。特別優選的是能夠每O-聯糖基化序列只添加一個葡糖胺部分的那些酶，和對於本發明的特定的O-聯糖基化序列來說基本上特異性的那些酶。
(b)GalNAc轉移酶 O-聯糖基化中的第一步可以通過UDP-GalNAc多肽N-乙醯半乳糖胺轉移酶(GalNAc-轉移酶)大家族中的一個或多個成員來催化，它們通常將GalNAc轉移至絲氨酸和蘇氨酸接納體位點(Hassan等人，J.Biol.Chem.27538197-38205(2000))。迄今已經鑑定和表徵了哺乳動物GalNAc-轉移酶家族的12個成員(Schwientek等人，J.Biol.Chem.27722623-22638(2002))，並且已經從基因組資料庫的分析中預測出了該基因家族的幾個另外的推定的成員。GalNAc-轉移酶同種型具有不同的動力學性質並且顯示出在時間和空間上有差別的表達模式，這暗示它們具有不同的生物學功能(Hassan等人，J.Biol.Chem.27538197-38205(2000))。GalNAc-轉移酶的序列分析已經導致這樣的假設，即這些酶含有兩個不同的亞基中心催化單位和C-末端單位，該C-末端單位與植物凝集素蓖麻毒蛋白具有序列相似性，被稱作「凝集素結構域」(Hagen等人，J.Biol.Chem.2746797-6803(1999)；Hazes，Protein Eng.101353-1356(1997)；Breton等人，Curr.Opin.Struct.Biol.9563-571(1999))。涉及所選保守殘基的位點特異性誘變的先前實驗證實，催化結構域中的突變消除了催化活性。相反地，「凝集素結構域」中的突變對於GalNAc-轉移酶同種型GalNAc-T1的催化活性沒有顯著影響(Tenno等人，J.Biol.Chem.277(49)47088-96(2002))。因此，認為C-末端「凝集素結構域」沒有功能，並且在GalNAc-轉移酶的酶促功能中不起作用(Hagen等人，J.Biol.Chem.2746797-6803(1999))。
沒有展示出表觀GalNAc-糖肽特異性的多肽GalNAc-轉移酶也似乎受它們的推定的凝集素結構域的調節(PCT WO 01/85215 A2)。近來，發現GalNAc-T1推定的凝集素結構域中的突變，類似於以前在GalNAc-T4中分析的那些突變(Hassan等人，J.Biol.Chem.27538197-38205(2000))，以類似於GalNAc-T4的方式調節該酶的活性。因此，儘管野生型GalNAc-T1向具有多個接納體位點的肽底物添加多個連續的GalNAc殘基，但是突變的GalNAc-T1不能向相同底物添加超過一個的GalNAc殘基(Tenno等人，J.Biol.Chem.277(49)47088-96(2002))。更近來，測定了鼠GalNAc-T1(Fritz等人，PNAS2004，101(43)15307-15312)以及人類GalNAc-T2(Fritz等人，J.Biol.Chem.2006，281(13)8613-8619)的x射線晶體結構。人GalNAc-T2結構揭示了在催化性結構域和凝集素結構域之間的出乎意料的柔韌性，並且暗示了被GalNAc-T2用於捕獲糖基化的底物的新機制。對於缺少凝集素結構域的GalNAc-T2的動力學分析證實了該結構域在作用於糖肽底物中的重要性。然而，除去凝集素結構域沒有顯著地影響對於非糖基化的底物的酶活性。因此，缺少凝集素結構域的截短的人GalNAc-T2酶可用於肽底物的糖基化，其中所得的單糖基化的多肽的進一步糖基化不是所希望的。
最近的證據證明，一些GalNAc-轉移酶對於部分地GalNAc-糖基化的糖肽顯示出獨特的活性。至少三種GalNAc-轉移酶同種型(GalNAc-T4、-T7和-T10)的催化作用選擇性地作用於對應於粘蛋白串聯重複結構域的糖肽，其中僅僅一些簇集的潛在糖基化序列已被其他GalNAc-轉移酶GalNAc糖基化(Bennett等人，FEBS Letters 460226-230(1999)；Ten Hagen等人，J.Biol.Chem.27617395-17404(2001)；Bennett等人，J.Biol.Chem.27330472-30481(1998)；TenHagen等人，J.Biol.Chem.27427867-27874(1999))。除了以前利用的那些以外，GalNAc-T4和-T7識別不同的GalNAc-糖基化的肽並且催化將GalNAc轉移至接納體底物位點。預測此類GalNAc-轉移酶活性的一個功能是代表了在具有高密度O-聯糖基化的糖蛋白中O-聚糖佔有密度的控制步驟。
其一個實例是癌症相關的粘蛋白MUC1的糖基化。MUC1含有20個殘基(HGV

APD

RPAPG

APPA)的串聯重複O-聯糖基化的區域，其具有5個潛在的O-聯糖基化序列。GalNAc-T1、-T2和-T3可以起始MUC1串聯重複的糖基化，並且可以僅在三個位點處摻入(HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO231)，GalNAc附著位點加有下劃線)。GalNAc-T4是獨特的，因為它是迄今鑑定的可以完成下列功能的唯一的GalNAc-轉移酶同種型將O-聯聚糖附著至乳腺癌相關的粘蛋白MUC1的20個胺基酸的串聯重複序列中所有5個接納位點。GalNAc-T4將GalNAc轉移至GalNAc4TAP24糖肽(TAPPAHGVT

APD

RPAPGSTAPP(SEQ ID NO232)，獨特的GalNAc-T4附著位點以粗體表示)上不被其他GalNAc-轉移酶同種型使用的至少兩個位點(Bennett等人，J.Biol.Chem.27330472-30481(1998))。活性，例如由GalNAc-T4所展示出的活性，似乎是產生由癌細胞表達的MUC1的糖形所必需的，其中所有潛在位點都被糖基化(Muller等人，J.Biol.Chem.27418165-18172(1999))。來自哺乳期乳腺的正常MUC1具有約2.6個O-聯聚糖/重複(Muller等人，J.Biol.Chem.27224780-24793(1997))，和源自癌細胞系T47D的MUC1具有4.8個O-聯聚糖/重複(Muller等人，J.Biol.Chem.27418165-18172(1999))。因此，MUC1的癌症相關的形式與更高密度的O-聯聚糖佔有相關，並且這通過與GalNAc-T4相同或相似的GalNAc-轉移酶活性來完成。另一種酶，GalNAc-T11，例如描述在T.Schwientek等人，J.Biol.Chem.2002，277(25)22623-22638中。
通過遺傳工程從經克隆的基因產生蛋白質如酶GalNAc TI-XX是公知的。參見例如，美國專利號4,761,371。一種方法涉及收集足夠的樣品，然後通過N-末端測序來測定該酶的胺基酸序列。然後將該信息用於分離編碼全長(膜結合的)轉移酶的cDNA克隆，其在昆蟲細胞系Sf9中表達後導致合成具有完全活性的酶。然後，通過使用下列方式來測定該酶的接納體特異性半定量分析16種不同蛋白質中在已知的糖基化序列周圍的胺基酸，接著進行合成的肽的體外糖基化研究。該工作已經證明，某些胺基酸殘基在糖基化的肽區段中過度呈現，並且在糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基周圍特定位置中的殘基可以具有相比於其他胺基酸部分而言更顯著的對於接納體效率的影響。
因為已經證明GalNAc轉移酶的突變可以用於產生與由野生型酶所產生的那些不同的糖基化模式，所以在製備本發明的O-聯糖基化的多肽中利用一種或多種突變型或截短的GalNAc轉移酶在本發明的範圍內。GalNAc-T2蛋白質的催化結構域和截短突變體描述於例如於2004年6月3日提交的美國臨時專利申請60/576,530；和於2004年8月3日提交的美國臨時專利申請60/598584中，這兩篇文獻通過提及而合併入本文以用於所有目的。還可以通過與已知的糖基轉移酶進行比對來鑑定催化結構域。截短的GalNAc-T2酶，例如人GalNAc-T2(Δ51)、人GalNAc-T2(Δ51Δ445)，以及獲得這些酶的方法也描述於WO 06/102652(PCT/US06/011065，於2006年3月24日提交)和PCT/US05/00302(於2005年1月6日提交)中，它們通過提及而合併入本文以用於所有目的。
(c)巖藻糖基轉移酶 在一些實施方案中，用於本發明方法中的糖基轉移酶是巖藻糖基轉移酶。巖藻糖基轉移酶是本領域技術人員已知的。示例性的巖藻糖基轉移酶包括將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖轉移至接納體糖的羥基位置的酶。將非核苷酸糖轉移至接納體的巖藻糖基轉移酶也可用於本發明。
在一些實施方案中，接納體糖是例如在寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基團中的GlcNAc。對於該反應而言合適的巖藻糖基轉移酶包括最初從人乳中得到表徵的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)(參見Palcic等人，Carbohydrate Res.1901-11(1989)；Prieels等人，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；和Nunez等人，Can.J.Chem.592086-2095(1981))，和在人血清中發現的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉移酶(FTIV、FTV、FTVI)。還已經表徵了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)——一種唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ巖藻糖基轉移酶。還已經表徵了重組形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)巖藻糖基轉移酶(參見，Dumas等人，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)；和Kukowska-Latallo等人，Genes and Development 41288-1303(1990))。其他示例性的巖藻糖基轉移酶包括例如α1，2巖藻糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.69)。可以通過在Mollicone等人，Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或者美國專利號5,374,655中所描述的方法來進行酶促巖藻糖基化。用於產生巖藻糖基轉移酶的細胞也將包括用於合成GDP-巖藻糖的酶系統。
(d)半乳糖基轉移酶 在另一組實施方案中，糖基轉移酶是半乳糖基轉移酶。示例性的半乳糖基轉移酶包括α(1，3)半乳糖基轉移酶(E.C.No.2.4.1.151，參見例如，Dabkowski等人，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等人Nature 345229-233(1990)，牛的(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠的(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat』l.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))，豬的(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一種合適的α1，3半乳糖基轉移酶是參與血型B抗原合成的半乳糖基轉移酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人的))。也適於實施本發明的是可溶形式的α1，3-半乳糖基轉移酶，例如由Cho，S.K.和Cummings，R.D.(1997)J.Biol.Chem.，272，13622-13628所報導的那種。
在另一個實施方案中，半乳糖基轉移酶是β(1，3)-半乳糖基轉移酶，例如Core-1-GalT1。已經描述了人Core-1-β1，3-半乳糖基轉移酶(參見例如，Ju等人，J.Biol.Chem.2002，277(1)178-186)。黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)酶描述於Correia等人，PNAS 2003，100(11)6404-6409；和Muller等人，FEBS J.2005，272(17)4295-4305中。另外的Core-1-β3半乳糖基轉移酶，包括其截短形式，公開在WO/0144478和於2006年9月6日提交的美國臨時專利申請號60/842,926中。在示例性的實施方案中，β(1，3)-半乳糖基轉移酶是選自由PubMed登錄號AAF52724(CG9520-PC的轉錄物)所描述的酶和其經修飾的形式，例如為在細菌中表達而進行密碼子優化的那些變化形式。示例性的可溶性Core-1-GalT1(Core-1-GalT1Δ31)酶的序列顯示在下面 Core-1-GαlT1Δ31的序列 (SEQ ID NO233) GFCLAELFVYSTPERSEFMPYDGHRHGDVNDAHHSHDMMEMSGPEQDVGGHEHVHENSTIAERLYSEVRVLCWIMTNPSNHQKKARHVKRTWGKRCNKLIFMSSAKDDELDAVALPVGEGRNNLWGKTKEAYKYIYEHHTNDADWFLKADDDTYTIVENMRYMLYPYSPETPVYFGCKFKPYVKQGYMSGGAGYVLSREAVRRFVVEALPNPKLCKSDNSGAEDVEIGKCLQNVNVLAGDSRDSNGRGRFFPFVPEHHLIPSHTDKKFWYWQYIFYKTDEGLDCCSDNAISFHYVSPNQMYVLDYLIYHLRPYGIINTPDALPNKLAVGELMPEIKEQATESTSDGVSKRSAETKTQ 也適合用於本發明方法的是β(1，4)半乳糖基轉移酶，其包括例如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛的(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人的(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠的(Nakazawa等人，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經醯胺半乳糖基轉移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38234-242(1994))。其他合適的半乳糖基轉移酶包括例如，α1，2半乳糖基轉移酶(來自例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等人，Mol.Biol.Cell 5519-528(1994))。
(e)唾液酸轉移酶 唾液酸轉移酶是可用於本發明的重組細胞和反應混合物的另一類型的糖基轉移酶。產生重組唾液酸轉移酶的細胞將也產生CMP-唾液酸，其是用於唾液酸轉移酶的唾液酸供體。適合用於本發明的唾液酸轉移酶的實例包括ST3Gal III(例如，大鼠或人ST3Gal III)、ST3GalIV、ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II和ST6GalNAc III(本文所使用的唾液酸轉移酶命名如Tsuji等人，Glycobiology 6v-xiv(1996)中所描述)。被稱作α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸轉移酶將唾液酸轉移至Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原性末端Gal。參見，Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1981)；Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982)；和Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一個示例性的α2，3-唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.4)將唾液酸轉移至該二糖或糖苷的非還原性末端Gal。參見，Rearick等人，J.Biol.Chem.2544444(1979)；和Gillespie等人，J.Biol.Chem.26721004(1992)。其他示例性的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾液酸轉移酶(參見，Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優選地，為了糖基化糖肽的碳水化合物，唾液酸轉移酶將能夠將唾液酸轉移至序列Galβ1，4GlcNAc-，其是在完全唾液酸化的碳水化合物結構上最常見的處於末端唾液酸之下的倒數第二的序列(參見，下表13)。
表13使用Galβ1，4GlcNAc序列作為接納體底物的唾液酸轉移酶 1)Goochee等人，Bio/Technology91347-1355(1991) 2)Yamamoto等人，J.Biochem.120104-110(1996) 3)Gilbert等人，J.Biol.Chem.27128271-28276(1996) 可用於所要求保護的方法中的唾液酸轉移酶的一個實例是ST3Gal III，其也被稱作α(2，3)唾液酸轉移酶(EC 2.4.99.6)。該酶催化將唾液酸轉移至Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal(參見，例如，Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1991))，並且負責糖肽中天冬醯胺-聯寡糖的唾液酸化。將唾液酸連接至Gal，在兩個糖之間形成α-連接。所述糖之間的鍵合(連接)在NeuAc的2-位和Gal的3-位之間。該特定的酶可以分離自大鼠肝臟(Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982))；人cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.26822782-22787；Kitagawa & Paulson(1994)J.Biol.Chem.2691394-1401)和基因組(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271931-938)DNA序列是已知的，這有助於通過重組表達來產生該酶。在另一個實施方案中，所要求保護的唾液酸化方法使用大鼠ST3GalIII。
用於本發明的其他示例性唾液酸轉移酶包括從空腸彎曲桿菌中分離的那些，包括α(2，3)。參見例如，WO99/49051。
表13中列出的那些其他唾液酸轉移酶也可在用於唾液酸化商業上重要的糖肽的經濟且有效的大規模方法中使用。作為用於發現這些其他酶的效用的簡單測試，將各種不同量的每種酶(1-100mU/mg蛋白質)與脫唾液酸-α1AGP(1-10mg/ml)反應，以比較相對於牛ST6GalI、ST3Gal III或這兩種唾液酸轉移酶而言目的唾液酸轉移酶唾液酸化糖肽的能力。備選地，其他糖肽或者從肽主鏈上酶促釋放出的N-聯寡糖可以代替脫唾液酸-α1AGP而用於該評估。能夠比ST6Gal I更有效地唾液酸化糖肽的N-聯寡糖的唾液酸轉移酶可以在用於肽唾液酸化的實際的大規模方法中使用(如本公開中對於ST3Gal III所舉例說明的)。其他示例性的唾液酸轉移酶顯示在圖10中。
融合蛋白 在其他示例性的實施方案中，本發明的方法利用融合蛋白，其具有超過一種的參與所希望的糖肽綴合物合成的酶促活性。所述融合多肽可以例如由與附屬酶的催化活性結構域相連接的糖基轉移酶的催化活性結構域組成。附屬酶催化結構域可以例如催化在形成作為用於該糖基轉移酶的供體的核苷酸糖中的步驟，或者催化參與糖基轉移酶循環的反應。例如，編碼糖基轉移酶的多核苷酸可以按閱讀框連接至編碼參與核苷酸糖合成的酶的多核苷酸。那麼，所得的融合蛋白不僅催化核苷酸糖的合成，而且將糖部分轉移至接納體分子。融合蛋白可以是連接入一個可表達的核苷酸序列中的兩個或更多個循環酶(cycleenzymes)。在其他實施方案中，融合蛋白包含兩種或更多種糖基轉移酶的催化活性結構域。參見例如，5,641,668。利用各種合適的融合蛋白，可以容易地設計和製備本發明的經修飾的糖肽(參見例如，於1999年6月24日作為WO 99/31224公布的PCT專利申請PCT/CA98/01180)。
固定化的酶 除了細胞結合的酶外，本發明還提供使用固定在固體和/或可溶性支持物上的酶。在示例性的實施方案中，提供了根據本發明方法通過完整的糖基接頭而綴合至PEG的糖基轉移酶。該PEG-接頭-酶綴合物任選地附著至固體支持物。在本發明的方法中使用由固體支持的酶簡化了反應混合物的製備和反應產物的純化，並且還使得能夠容易地回收酶。所述糖基轉移酶綴合物用於本發明的方法中。酶和支持物的其他組合對於本領域技術人員而言將是明顯的。
肽綴合物的純化 通過本文上面所描述的方法產生的多肽綴合物可以不純化而進行使用。然而，通常優選回收此類產物。用於純化經糖基化的糖的標準公知技術為例如薄層或厚層色譜法、柱色譜法、離子交換色譜法或者膜過濾。優選使用膜過濾，更優選利用反滲透膜的膜過濾，或者一種或多種柱色譜技術，如在下文中和在本文引用的文獻中所討論的。例如，其中膜具有約3000至約10,000的分子量截止值的膜過濾可用於除去蛋白質例如糖基轉移酶。然後可以使用納米過濾或者反滲透來除去鹽和/或純化產物糖(參見，例如，WO 98/15581)。納米濾膜是一類反滲透膜，取決於所使用的膜，納米濾膜讓單價鹽通過但是截留多價鹽和大於約100至約2,000道爾頓的不帶電荷的溶質。因此，在典型的應用中，通過本發明的方法製備的糖將被保留在膜中，和汙染性鹽將穿過膜。
如果在細胞內產生經修飾的糖蛋白，那麼作為第一步，例如通過離心或超濾除去顆粒狀碎屑，包括細胞和細胞碎片。任選地，可以用商購可得的蛋白質濃縮濾器來濃縮蛋白質，接著通過一個或多個色譜法步驟來分開多肽變體與其他雜質，所述色譜法步驟例如為免疫親和色譜法、離子交換色譜法(例如，在二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基的基質上)、羥基磷灰石色譜法和疏水相互作用色譜法(HIC)。示例性的固定相包括Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、兵豆凝集素-Sepharose、WGA-Sepharose、ConA-Sepharose、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl、SP-Sepharose或A蛋白Sepharose。
其他色譜技術包括SDS-PAGE色譜法、二氧化矽色譜法、色譜聚焦、反相HPLC(例如，具有附加的脂肪族基團的矽膠)、凝膠過濾(使用例如Sephadex分子篩或大小排阻色譜法)、在選擇性地結合所述多肽的柱上的色譜法、和乙醇或硫酸銨沉澱。
培養產生的經修飾的糖肽通常通過下列方式來進行分離最初從細胞、酶等中進行提取，隨後進行一個或多個濃縮、鹽析、水性離子交換或者大小排阻色譜法步驟，例如SP Sepharose。另外，可以通過親和色譜法來純化經修飾的糖蛋白。HPLC也可以用於一個或多個純化步驟。
蛋白酶抑制劑，例如甲基磺醯氟(PMSF)可以被包括在任一前述步驟中以抑制蛋白水解，並且可以包括抗生素以防止外來汙染物的生長。
在另一個實施方案中，首先使用商購可得的蛋白質濃縮濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元來濃縮來自產生本發明的經修飾的糖肽的系統的上清液。在該濃縮步驟後，可以將濃縮物施加至合適的純化基質。例如，合適的親和基質可以包含所述肽的配體、結合至合適支持物的凝集素或抗體分子。備選地，可以使用陰離子交換樹脂，例如具有側DEAE基團的基質或基材。合適的基質包括丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或者其他類型的常用於蛋白質純化的基質。備選地，可以使用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基的各種不溶性基質。特別優選的是磺丙基。
最後，一個或多個使用疏水性RP-HPLC介質(例如具有側甲基或其他脂肪族基團的矽膠)的RP-HPLC步驟，可以用於進一步純化多肽變體組合物。前述純化步驟中的一些或所有步驟(以各種組合)也可以用於提供同質的經修飾的糖蛋白。
由大規模發酵產生的本發明的經修飾的糖肽可以通過類似於Urdal等人，J.Chromatog.296171(1984)所公開的方法來純化。該參考文獻描述了用於在製備型HPLC柱上純化重組人IL-2的兩個相繼的RP-HPLC步驟。備選地，可以使用諸如親和色譜法的技術來純化經修飾的糖蛋白。
肽編碼序列的獲得 一般的重組技術 通過突變或多肽的完全化學合成來改變對應的親本多肽的胺基酸序列，可以產生出摻入了本發明的O-聯糖基化序列的突變型多肽。優選通過DNA水平上的變化來改變肽胺基酸序列，特別是通過在預先選擇的鹼基處突變編碼所述肽的DNA序列以產生將會翻譯成所希望的胺基酸的密碼子。優選使用本領域已知的方法來進行DNA突變。
本發明依賴於重組遺傳學領域中的常規技術。公開了用於本發明的一般方法的基礎教科書包括Sambrook和Russell，MolecularCloning，A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler，Gene Transferand ExpressionA Laboratory Manual(1990)；和Ausubel等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
核酸大小以千鹼基(kb)或鹼基對(bp)給出。這些是來自瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠電泳、來自經測序的核酸或來自公開的DNA序列的估計值。對於蛋白質，大小以千道爾頓(kDa)或胺基酸殘基數給出。從凝膠電泳、從經測序的蛋白質、從衍生的胺基酸序列、或從公開的蛋白質序列估計蛋白質大小。
不能商購得到的寡核苷酸可以化學合成，例如，根據首次由Beaucage & Caruthers，Tetrahedron Lett.221859-1862(1981)描述的固相亞磷醯胺三酯方法，使用自動合成儀，如Van Devanter等人，Nucleic Acids Res.126159-6168(1984)中所描述的。也可以化學合成完整基因。使用任何本領域公認的策略來進行寡核苷酸的純化，例如非變性丙烯醯胺凝膠電泳或陰離子交換HPLC，如Pearson & Reanier，J.Chrom.255137-149(1983)中所描述的。
經克隆的野生型肽基因、編碼突變型肽的多核苷酸和合成的寡核苷酸的序列可以在克隆後進行驗證，例如使用Wallace等人，Gene 1621-26(1981)的用於對雙鏈模板進行測序的鏈終止方法。
在示例性的實施方案中，通過改組多核苷酸來添加糖基化序列。可以用DNA改組方案來調節編碼候選肽的多核苷酸。DNA改組是一種遞歸重組和突變的方法，其通過相關基因的庫的隨機片段化，接著經聚合酶鏈式反應樣的過程對所述片段進行重裝配來進行。參見，例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370389-391(1994)；和美國專利號5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
野生型肽編碼序列的克隆和亞克隆 許多編碼野生型肽的多核苷酸序列已被測定並且可以從供應商處得到，例如，人生長激素，例如GenBank登錄號NM 000515、NM002059、NM 022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM022560、NM 022561和NM 022562。
人類基因組研究的快速進步已經使得這一的克隆方法成為可能，其中可以在人類DNA序列資料庫中搜索與已知的核苷酸序列(例如，編碼以前鑑定的肽的核苷酸序列)具有某一序列同源性百分比的任何基因區段。隨後，可以通過化學合成和/或聚合酶鏈式反應(PCR)技術例如重疊延伸方法來獲得任何如此鑑定出的DNA序列。對於短序列，完全的從頭合成可能是足夠的；而為了獲得更大的基因，則可能必需使用合成探針從人cDNA或基因組文庫中進一步分離全長編碼序列。
備選地，可以使用標準克隆技術例如聚合酶鏈式反應(PCR)從人cDNA或基因組DNA文庫中分離出編碼肽的核酸序列，其中基於同源性的引物可以通常源自已知的編碼肽的核酸序列。對於該目的最常使用的技術描述於標準教科書中，例如Sambrook和Russell，同上。
可以商購獲得或者可以構建適合於獲得野生型肽的編碼序列的cDNA文庫。分離mRNA、通過逆轉錄製備cDNA、將cDNA連接入重組載體中、轉染入重組宿主中以用於增殖、篩選和克隆的一般方法是公知的(參見，例如，Gubler和Hoffman，Gene，25263-269(1983)；Ausubel等人，同上)。在通過PCR獲得經擴增的核苷酸序列區段後，該區段可進一步用作探針以從cDNA文庫中分離出編碼野生型肽的全長多核苷酸序列。合適程序的一般性描述可以在Sambrook和Russell(同上)中找到。
可以按照類似的程序從人基因組文庫中獲得編碼野生型肽的全長序列，例如上述GenBank登錄號中的任一個。人類基因組文庫是商購可得的，或者可以根據各種本領域公認的方法來構建。一般地，為了構建基因組文庫，首先從可能發現肽的組織中提取DNA。然後，將DNA進行機械剪切或酶促消化以產生長度為約12-20kb的片段。然後，通過梯度離心將所述片段與具有不希望的大小的多核苷酸片段分開，並插入噬菌體λ載體中。這些載體和噬菌體在體外進行包裝。通過在Benton和Davis，Science，196180-182(1977)中所描述的噬菌斑雜交來分析重組噬菌體。如Grunstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965(1975)所描述的，進行菌落雜交。
基於序列同源性，可以設計簡併寡核苷酸作為引物組，並在合適的條件下進行PCR(參見，例如，White等人，PCR ProtocolsCurrentMethods and Applications，1993；Griffin和Griffin，PCR Technology，CRC Press Inc.1994)，以從cDNA或基因組文庫中擴增核苷酸序列區段。通過使用擴增的區段作為探針，獲得編碼野生型肽的全長核酸。
在獲得編碼野生型肽的核酸序列後，可以將編碼序列亞克隆入載體，例如表達載體中，從而可以從所得的構建體產生重組的野生型肽。隨後，可以對野生型肽編碼序列進行進一步修飾，例如核苷酸取代，以改變分子的特徵。
向肽序列中引入突變 從編碼性多核苷酸序列中，可以確定出野生型肽的胺基酸序列。隨後，可以通過在胺基酸序列中的各個位置處引入額外的糖基化序列來修飾該胺基酸序列以改變該蛋白質的糖基化模式。
一些類型的蛋白質糖基化序列是本領域公知的。例如，在真核生物中，N-聯糖基化發生在共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬醯胺上，其中Xaa是除了脯氨酸之外的任意胺基酸(Kornfeld等人，Ann RevBiochem 54631-664(1985)；Kukuruzinska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 842145-2149(1987)；Herscovics等人，FASEB J 7540-550(1993)；和Orlean，Saccharomyces Vol.3(1996))。O-聯糖基化發生在絲氨酸或蘇氨酸殘基處(Tanner等人，Biochim.Biophys.Acta.90681-91(1987)；和Hounsell等人，Glycoconj.J.1319-26(1996))。通過將糖基磷脂醯肌醇連接至蛋白質的羧基末端的羧基而形成其他糖基化模式(Takeda等人，Trends Biochem.Sci.20367-371(1995)；和Udenfriend等人，Ann.Rev.Biochem.64593-591(1995))。基於該知識，因而可以向野生型肽序列中引入合適的突變以形成新的糖基化序列。
儘管直接修飾肽序列內的胺基酸殘基可能適合於引入新的N-聯或O-聯糖基化序列，但是更經常通過突變編碼肽的多核苷酸序列來完成新的糖基化序列的引入。這可以通過使用任何已知的誘變方法來完成，所述誘變方法中的一些在下文討論。
在本領域中建立和描述了各種產生突變的方法。參見，例如，Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，944504-4509(1997)；和Stemmer，Nature，370389-391(1994)。這些程序可以分開地或相組合地使用以產生一組核酸的變體，並因而產生所編碼的多肽的變體。用於誘變、文庫構建和其他產生多樣性的方法的試劑盒是可通過商業途徑獲得的。
產生多樣性的突變方法包括例如，位點定向誘變(Botstein和Shortle，Science，2291193-1201(1985))，使用含有尿嘧啶的模板的誘變(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985))，寡核苷酸指導的誘變(Zoller和Smith，Nucl.Acids Res.，106487-6500(1982))，硫代磷酸酯修飾的DNA誘變(Taylor等人，Nucl.Acids Res.，138749-8764和8765-8787(1985))，和使用缺口雙鏈體DNA的誘變(Kramer等人，Nucl.Acids Res.，129441-9456(1984))。
用於產生突變的其他方法包括，點錯配修復(Kramer等人，Cell，38879-887(1984))，使用修復缺陷的宿主株系的誘變(Carter等人，Nucl.Acids Res.，134431-4443(1985))，缺失誘變(Eghtedarzadeh和Henikoff，Nucl.Acids Res.，145115(1986))，限制-選擇和限制-純化(Wells等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317415-423(1986))，通過全基因合成的誘變(Nambiar等人，Science，2231299-1301(1984))，雙鏈斷裂修復(Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，837177-7181(1986))，通過多核苷酸鏈終止方法的誘變(美國專利號5,965,408)，和易錯PCR(Leung等人，Biotechniques，111-15(1989))。
為了宿主生物中的偏愛密碼子使用而修飾核酸 可以進一步改變編碼突變型肽的多核苷酸序列以與特定宿主的偏愛密碼子使用相符。例如，一種菌株的細菌細胞的偏愛密碼子使用可以用於得到這樣的多核苷酸，其編碼本發明的突變型肽並且包括該菌株喜歡的密碼子。通過將由宿主細胞所表達的大量基因中偏愛密碼子使用頻率進行平均，可以計算出該宿主細胞所展示出的偏愛密碼子使用頻率(例如，計算服務可以從Kazusa DNA Research Institute，Japan的網站得到)。該分析優選地限於被宿主細胞高水平表達的基因。例如，美國專利號5,824,864提供了雙子葉植物和單子葉植物所展示出的高水平表達的基因的密碼子使用頻率。
在修飾完成時，通過測序來驗證突變型肽的編碼序列，然後亞克隆到合適的表達載體中以便用於以與野生型肽相同的方式重組產生。
突變型多肽的表達 在示例性的實施方案中，通過本發明的方法進行修飾的多肽在原核細胞(例如，大腸桿菌)、真核細胞(包括酵母和哺乳動物細胞(例如，CHO細胞))或轉基因動物中產生。
在序列驗證後，取決於編碼本文所公開的多肽的多核苷酸序列，可以使用重組遺傳學領域中的常規技術來產生本發明的突變型肽。
表達系統 為了獲得編碼本發明的突變型肽的核酸的高水平表達，通常將編碼突變型肽的多核苷酸亞克隆到表達載體中，該表達載體包含用於指導轉錄的強啟動子、轉錄/翻譯終止子和用於翻譯起始的核糖體結合位點。合適的細菌啟動子是本領域公知的，並且描述於例如Sambrook和Russell(同上)以及Ausubel等人(同上)中。用於表達野生型或突變型肽的細菌表達系統例如可以在大腸桿菌、芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)、沙門氏菌屬(Salmonella)、柄桿菌屬(Caulobacter)等中得到。用於此類表達系統的試劑盒是商購可得的。哺乳動物細胞、酵母和昆蟲細胞的真核生物表達系統是本領域公知的，並且也是商購可得的。在一個實施方案中，真核生物表達載體是腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或者逆轉錄病毒載體。
用於指導異源核酸表達的啟動子取決於具體應用。任選地，啟動子與異源轉錄起始位點的距離和它在天然背景中與轉錄起始位點的距離大致相同。然而，如本領域已知的，可以允許該距離有一定的改變而不喪失啟動子功能。
除了啟動子外，表達載體通常包含轉錄單位或表達盒，其含有對於突變型肽在宿主細胞中表達而言所需的所有另外的元件。因此，典型的表達盒包含與編碼突變型肽和對於轉錄物有效聚腺苷酸化而言所需的信號的核酸序列有效連接的啟動子、核糖體結合位點和翻譯終止。編碼肽的核酸序列通常連接至可切割的信號肽序列以促進經轉化的細胞對於該肽的分泌。此類信號肽尤其包括來自組織纖溶酶原激活物、胰島素和神經元生長因子以及煙芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信號肽。該盒的另外的元件可以包括增強子，和如果將基因組DNA用作結構基因，還包括具有功能性剪接供體和接納體位點的內含子。
除了啟動子序列外，表達盒還應當包含結構基因下遊的轉錄終止區以提供有效終止。終止區可以從與啟動子序列相同的基因獲得，或者可以從不同的基因獲得。
用於將遺傳信息轉運到細胞中的具體表達載體不是特別關鍵的。可以使用用於在真核或原核細胞中進行表達的任何常規載體。標準的細菌表達載體包括質粒例如基於pBR322的質粒，pSKF，pET23D，和融合表達系統例如GST和LacZ。也可以將附加表位(epitope tag)添加至重組蛋白質以提供方便的分離方法，例如c-myc。
包含來自真核生物病毒的調節元件的表達載體通常用於真核表達載體中，例如SV40載體、乳頭瘤病毒載體和源自EB病毒的載體。其他示例性的真核生物載體包括pMSG，pAV009/A+，pMTO10/A+，pMAMneo-5，杆狀病毒pDSVE，和任何其他這樣的載體，所述載體允許蛋白質在SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子、多角體蛋白啟動子或顯示出對於在真核細胞中表達而言有效的其他啟動子的指導下進行表達。
在一些示例性的實施方案中，表達載體選自pCWin1、pCWin2、pCWin2/MBP、pCWin2-MBP-SBD(pMS39)和pCWin2-MBP-MCS-SBD(pMXS39)，在2004年4月9日提交的共有的美國專利申請中公開的，該專利申請通過提及而合併入本文。
一些表達系統具有提供基因擴增的標記物，例如胸苷激酶、潮黴素B磷酸轉移酶和二氫葉酸還原酶。備選地，不涉及基因擴增的高產率表達系統也是合適的，如昆蟲細胞中的杆狀病毒載體，其中編碼突變型肽的多核苷酸序列處於多角體蛋白啟動子或其他強的杆狀病毒啟動子的指導下。
通常包含在表達載體中的元件還包括在大腸桿菌中發揮功能的複製子，編碼抗生素抗性以允許選擇含有重組質粒的細菌的基因，和允許插入真核生物序列的在質粒的非必需區域中的獨特限制酶切位點。所選擇的具體抗生素抗性基因不是關鍵的，本領域已知的許多抗性基因中的任何一種均是合適的。如果需要，任選地如此選擇原核生物序列，即使得它們不幹擾真核細胞中DNA的複製。
當希望獲得重組蛋白質(例如，本發明的hgh突變體)的周質表達時，表達載體進一步包含編碼分泌信號(例如大腸桿菌OppA(周質寡肽結合蛋白)分泌信號或其修飾形式)的序列，該序列直接連接至待表達的蛋白質的編碼序列的5』。該信號序列指導在細胞質中產生的重組蛋白質通過細胞膜進入周質空間。表達載體可以進一步包含信號肽酶1的編碼序列，當重組蛋白質進入周質空間時，所述信號肽酶1能夠酶促切割信號序列。關於重組蛋白質的周質產生的更詳細的描述可以在例如Gray等人，Gene 39247-254(1985)，美國專利號6,160,089和6,436,674中找到。
如上文所討論的，本領域技術人員將會認識到，可以對任何野生型或突變型肽或者其編碼序列進行各種保守取代而仍然保留該肽的生物活性。此外，還可以修飾多核苷酸編碼序列以適應特定表達宿主中的偏愛密碼子使用而不改變所得的胺基酸序列。
轉染方法 將標準的轉染方法用於產生表達大量突變型肽的細菌、哺乳動物、酵母或昆蟲細胞系，然後使用標準技術來純化所述突變型肽(參見例如，Colley等人，J.Biol.Chem.26417619-17622(1989)；Guide toProtein Purification，in Methods in Enzymology，vol.182(Deutscher，ed.，1990))。根據標準技術來進行真核和原核細胞的轉化(參見例如，Morrison，J.Bact.132349-351(1977)；Clark-Curtiss & Curtiss，Methods in Enzymology 101347-362(Wu等人，eds，1983))。
可以使用任何公知的用於將外源核苷酸序列引入宿主細胞中的程序。這些程序包括使用磷酸鈣轉染、Polybrene、原生質體融合、電穿孔、脂質體、顯微注射、原生質載體(plasma vector)、病毒載體和任何其他公知的用於將經克隆的基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其他外源遺傳物質引入宿主細胞中的方法(參見，例如，Sambrook和Russell，同上)。唯一必需的是，所使用的具體遺傳工程程序能夠成功地將至少一個基因引入能夠表達突變型肽的宿主細胞中。
檢測突變型肽在宿主細胞中的表達 在將表達載體引入合適的宿主細胞後，在有利於突變型肽表達的條件下培養經轉染的細胞。然後，就該重組多肽的表達來篩選細胞，所述重組多肽隨後用標準技術從培養物中回收(參見，例如，Scopes，Protein PurificationPrinciples and Practice(1982)；美國專利號4,673,641；Ausubel等人，同上；和Sambrook和Russell，同上)。
幾種用於篩選基因表達的一般方法是本領域技術人員公知的。首先，可以在核酸水平上檢測基因表達。通常使用各種利用核酸雜交技術來進行特異DNA和RNA測量的方法(例如，Sambrook和Russell，同上)。一些方法涉及電泳分離(例如，用於檢測DNA的Southern印跡和用於檢測RNA的Northern印跡)，但是也可以不用電泳來進行DNA或RNA的檢測(例如，通過斑點印跡)。使用序列特異性引物，通過PCR或RT-PCR也可以檢測在經轉染的細胞中編碼突變型肽的核酸的存在。
其次，可以在多肽水平上檢測基因表達。本領域技術人員常規地使用各種免疫學測定法來測量基因產物的水平，特別是使用與本發明的突變型肽特異性地反應的多克隆或單克隆抗體(例如，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Chapter 14，Cold SpringHarbor，1988；Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975))。此類技術需要通過選擇對突變型肽和其抗原性部分具有高特異性的抗體來進行抗體製備。產生多克隆和單克隆抗體的方法是成熟的，並且它們的描述可以在文獻中找到，參見例如，Harlow和Lane，同上；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976)。關於製備針對本發明突變型肽的抗體和施行用於檢測突變型肽的免疫學測定法的更詳細描述在後面的部分中提供。
純化重組產生的突變型多肽 一旦證實了重組突變型肽在經轉染的宿主細胞中的表達，那麼就以合適的規模培養所述宿主細胞以便純化所述重組多肽。
1.從細菌中純化 當通過經轉化的細菌大量重組產生本發明的突變型肽(通常在啟動子誘導後，儘管表達可以是誘導型的)時，蛋白質可以形成不溶性聚集體。存在有幾種適於純化蛋白質內含體的方案。例如，聚集體蛋白質(下文中稱作內含體)的純化通常包括通過破壞細菌細胞，例如通過在約100-150μg/ml溶菌酶和0.1％Nonidet P40(一種非離子型去汙劑)的緩衝液中進行溫育，來提取、分離和/或純化內含體。可以使用Polytron研磨器(Brinkman Instruments，Westbury，NY)來研磨細菌懸浮液。備選地，可以在冰上對細胞進行超聲處理。裂解細菌的備選方法描述在Ausubel等人以及Sambrook和Russell(都同上)中，並且對於本領域技術人員而言將是明顯的。
一般地，離心細胞懸浮液，並將含有內含體的粒狀沉澱重懸浮在緩衝液中，該緩衝液不溶解但是洗滌內含體，例如，20mM Tris-HCl(pH 7.2)，1mM EDTA，150mM NaCl和2％Triton-X 100(一種非離子型去汙劑)。必需重複洗滌步驟以除去儘可能多的細胞碎片。可以將剩餘的內含體的粒狀沉澱重懸浮在合適的緩衝液(例如，20mM磷酸鈉，pH 6.8，150mM NaCl)中。其他合適的緩衝液對於本領域技術人員而言將是明顯的。
在洗滌步驟後，通過添加既是強的氫接納體又是強的氫供體的溶劑(或者幾種溶劑的組合，每種溶劑具有這些性質之一)來溶解內含體。然後，可以通過用相容的緩衝液稀釋或透析來使形成內含體的蛋白質復性。合適的溶劑包括但不限於，尿素(約4M至約8M)、甲醯胺(至少約80％，基於體積/體積)和鹽酸胍(約4M至約8M)。一些能夠溶解形成聚集體的蛋白質的溶劑，例如SDS(十二烷基硫酸鈉)和70％甲酸對於在該程序中的使用可能是不合適的，因為蛋白質可能被不可逆地變性，伴隨著免疫原性和/或活性的缺乏。儘管鹽酸胍和類似的試劑是變性劑，但是該變性不是不可逆的，並且當除去(例如通過透析)或稀釋所述變性劑時可以發生復性，從而允許再次形成免疫學和/或生物學上有活性的目的蛋白質。在溶解後，可以通過標準分離技術來分開所述蛋白質與其他細菌蛋白質。關於從細菌內含體中純化重組肽的進一步描述，參見例如，Patra等人，Protein Expressionand Purification 18182-190(2000)。
備選地，可能從細菌周質中純化重組多肽，例如突變型肽。當重組蛋白質被輸出到細菌的周質中時，除了本領域技術人員已知的其他方法之外，可以通過冷滲壓震擾來分離細菌的周質級分(參見例如，Ausubel等人，同上)。為了從周質中分離重組蛋白質，離心細菌細胞從而形成粒狀沉澱。將粒狀沉澱重懸浮在含有20％蔗糖的緩衝液中。為了裂解細胞，將細菌離心，並將粒狀沉澱重懸浮在冰冷的5mMMgSO4中並在冰浴中保持約10分鐘。離心細胞懸浮液，並且倒出並保存上清液。可以通過本領域技術人員公知的標準分離技術來分開存在於上清液中的重組蛋白質與宿主蛋白質。
2.用於純化的標準蛋白質分離技術 當重組多肽例如本發明的突變型肽在宿主細胞中以可溶形式表達時，其純化可以按照標準蛋白質純化程序，例如下文所描述的那些來進行，或者純化可以使用別處公開的方法，例如PCT
發明者S·德弗利斯 申請人:諾和諾德公司