口腔癌致病基因bpifb2及其應用的製作方法
2023-07-04 11:03:56
口腔癌致病基因bpifb2及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及口腔癌致病相關基因BPIFB2及其應用。本發明通過對口腔癌組織、癌旁組織及正常組織提取RNA，轉錄組深度測序分析，篩選到一個口腔癌致病相關基因BPIFB2，並採用RT-PCR方法分析篩選到的BPIFB2在口腔癌患病病人的腫瘤組織、癌旁組織表達情況，結果顯示篩選得到的BPIFB2與口腔癌具有很好的相關性，可用於製備口腔癌輔助診斷或者預後製劑。本發明還公布了一種檢測口腔癌組織中BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒及其使用方法，所述試劑盒能靈敏、快速、定量、準確、穩定的檢測口腔癌組織中BPIFB2表達水平，具有良好的應用前景。
【專利說明】口腔癌致病基因BPIFB2及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程【技術領域】，具體地，本發明涉及通過高通量轉錄組測序分析 篩選出口腔癌致病基因 BPIFB2及所述致病基因在製備口腔癌輔助診斷或者預後製劑中的 應用。
【背景技術】
[0002] 口腔癌（Oral Squarmous Cell Carcinomas,0SCC)是人體常見的腫瘤之一，尤其是 在發展中國家印度、斯裡蘭卡、巴西等其發病率可以達到全部腫瘤的25%。近年來口腔癌 的發病率在歐美等發達國家有明顯的上升趨勢，特別是發病年齡趨向年輕化。口腔鱗癌不 僅發病率高，且惡性程度較高；往往造成語音、咀嚼、吞咽、面容等功能障礙和嚴重的面容毀 損，並威脅到患者的生命；五年生存率只有60%左右。儘管近來口腔癌手術方法的不斷改 進和放療、化療的廣泛應用，但口腔癌的五年生存率並沒有明顯的提高。
[0003] 導致這一狀況的主要原因在於：口腔癌的發病機制不清，侵襲轉移機制不明，缺乏 有效的早期預防和預後判斷手段。因此研究口腔癌發生和發展的分子機制，從中找到口腔 癌早期預防、預後判斷和治療方法是口腔癌研究中急待解決的重大問題。
[0004] 轉錄組學是研究活細胞在某一功能狀態下所含信使RNA (Messenger RNA，mRNA)的 類型和拷貝數，反應了某一特定時間和空間細胞內所有基因的表達情況。轉錄組動態反應 了細胞的生長發育狀態，不同生理、病理狀態下以及不同細胞類型都具有細胞特異的轉錄 組，了解轉錄組是解讀細胞的分子功能、組成成分及其完成的生物過程所必需的，對我們理 解生命體機體發育、疾病發生與預防都具有重要作用。
[0005] 以Roche454，Illumina Solexa和ABI SOLiD為代表的第二代測序技術的出 現，使得大規模應用基因組和轉錄組學方法解決科學問題成為可能。mRNA測序（mRNA sequencing, mRNA-Seq)是把mRNA逆轉錄生成的cDNA，利用第二代高通量測序技術進行 cDNA測序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織樣本在某一狀態下幾乎所有轉錄本表 達豐度的信息。各類型的轉錄本都可以採用同樣的原理用高通量測序技術進行深度測序， 來反應它們的表達水平，統稱為RNA-Seq。伴隨著二代測序平臺的商業化，尤其是RNA-Seq 技術的應用，上千萬甚至是上億的通量測序極大的提高了轉錄組測序的深度和覆蓋度，使 得定性和定量分析轉錄組成為可能，推動了轉錄組學的快速發展。目前已廣泛應用到生物 醫學的各個領域並取得突出進展，使我們對於疾病的分子與遺傳學基礎的認識達到了一個 新的水平。這些研究成果對於闡明疾病的病因、解析疾病發生的分子機制、尋找疾病特異的 生物標誌物和藥物靶點，進而提升疾病的預防、診斷和治療水平具有重要意義。
[0006] 發明人通過Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺選取8例口腔癌癌變、 癌旁及正常組織的轉錄組深度測序分析，初步篩選出影響口腔癌發生發展的相關基因 BPIFB2,並進一步採用分子生物學方法證實了 BPIFB2基因與口腔癌的關係：BPIFB2與口腔 癌具有很好的相關性，可用於製備口腔癌輔助診斷或者預後製劑，具有重要的臨床應用價 值。
【發明內容】
[0007] 本發明目的是提供了 口腔癌致病相關基因 BPIFB2。
[0008] 本發明目的是提供了一種檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒。
[0009] 進一步，本發明還提供了一對檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR引物。
[0010] 進一步，本發明還提供了一種檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒使用方 法。
[0011] 本發明目的是提供BPIFB2基因在製備口腔癌的診斷或者預後產品中的應用。
[0012] 為實現上述目的，本發明對癌變、癌旁及正常組織的三組樣品進行高通量cDNA測 序，檢測到癌變與癌旁組織之間有252個差異表達基因，癌變與正常組織之間有234個差 異表達基因，為了更好的理解差異表達基因的功能，發明人對表達失調的基因進行Gene Ontology的功能富集分析。最終從差異表達基因中篩選出BPIFB2。
[0013] 本發明運用螢光定量PCR方法分析篩選到的口腔癌致病基因 BPIFB2在口腔癌患 病病人的腫瘤組織和癌旁組織的表達情況。
[0014] 為了實現上述目的，本發明首先分別提取了 50例口腔癌患病病人的腫瘤組織和 癌旁組織，對其總RNA的進行提取，設計了用於擴增BPIFB2基因的2條引物SEQ ID NO. 1和 SEQIDN0. 2,用於擴增內參基因β-actin的2條引物。製備了含有BPIFB2基因序列的標 準DNA模板，並進行了敏感性實驗。進而，採用qRT-PCR的方法比較BPIFB2基因在口腔癌 組織和癌旁組織中的表達水平。結果表明：qRT-PCR擴增結果穩定，其中BPIFB2在癌旁組織 中的表達水平明顯低於口腔癌瘤組織和對照質粒lOOcopies，而在口腔癌組織中的BPIFB2 高表達，即生物信息學篩選得到的BPIFB2基因與口腔癌具有很好的相關性，可用於製備口 腔癌輔助診斷或者預後製劑。
[0015] 本發明目的是提供了一種檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒及其使用 方法。該PCR試劑盒適合於目前存在市場上的所有類型螢光定量基因擴增儀，靈敏度高，定 量快速準確、穩定性好，具有良好的應用前景。
[0016] 本發明製備的一種檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒組分包括：特異性 引物、內參引物、螢光定量PCR反應液。其中所述的特異性引物包括上遊引物和下遊引物， 上遊引物序列為SEQ ID N0. 1，下遊引物序列為SEQ ID N0. 2。所述內參引物為β -actin內參 引物，上遊引物序列為SEQ ID NO. 3,下遊引物序列為SEQ ID NO. 4。所述螢光定量PCR反應液 包括 2 XUltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer (With R0X)、SuperEnzyme Mix 和 RNase-Free Water。
[0017] 本發明還公開了一種檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒的使用方法， 螢光定量PCR體系：上遊引物；下遊引物；樣品RNA10pg-100ng ;2XUltralSYBR One St印 RT-qPCR Buffer (With R0X)，SuperEnzyme Mix，加 RNase-Free Water 至 25 μ L。突光定量 PCR 程序：45°C lOmin ;95°C 5min 預變性，接 30-40 個循環：95°C 10s，60°C 45s。
[0018] 所述的試劑盒還包含RNA抽提試劑。
[0019] 所述的試劑盒應用於口腔癌BPIFB2基因的定量檢測，一步法螢光定量PCR，方便 快速，適用於臨床檢測。
[0020] 本發明還檢測了本試劑盒靈敏性，結果顯示本試劑盒檢測範圍為106-10 2c〇pieS/ μ 1，最小檢出濃度為lOOcopies/μ 1。
[0021] 本發明優點：
[0022] (a)本發明提供的BPIFB2與口腔癌具有很好的相關性，可用於製備口腔癌輔助診 斷或者預後製劑。
[0023] (b)本發明提供的檢測BPIFB2表達水平的螢光定量PCR試劑盒包含了從RNA提取 到螢光定量實驗所用的整套試劑，並且採用了一步法螢光定量PCR，既方便臨床使用，又保 證了結果的一致性。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本 發明的限制。本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可 以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由權利要求及其等同物限 定。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照廠商所建議的條 件實施檢測。
[0025] 實施例1研究樣本的收集及RNA的提取
[0026] 收集8例口腔癌及正常新鮮組織，對其進行分組及編號：3例正常組織塊（編號為 Nl、N2、N3)、3例癌旁組織（編號為PI、P2、P3)塊和2例癌組織塊（C1和C2)。
[0027] 對三組樣品進行RNA提取，RNA提取後瓊脂糖凝膠電泳。從電泳結果初步認為提 取的RNA樣品質量合格，可以用於進一步的轉錄組分析。進而通過NanoDroplOOO分光光度 計檢測RNA樣品的提取情況，結果如表1所示。每個樣品體積均為30μ1。RNA-seq測序的 樣品要求：0D260/0D280 為 1. 8-2. 2。RIN(RNA integrity number)指的是 RNA 完整性指數， 是RNA質量的重要指標。從表1可以看出，本研究的樣品均達到轉錄組測序的要求。
[0028] 表1 口腔癌RNA樣品的分光光度檢測
[0029]
【權利要求】
1. 一種BPIFB2基因在製備口腔癌的診斷或者預後產品中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的口腔癌的診斷或者預後產品包括 用RT-PCR、基因晶片或免疫方法檢測口腔癌中BPIFB2基因的產品。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，所述的用於RT-PCR檢測口腔癌中BPIFB2 基因的產品含有一對特異性擴增BPIFB2基因的引物；所述的基因晶片包括與BPIFB2基因 的核酸序列雜交的探針；所述用免疫方法檢測口腔癌的產品包括與BPIFB2蛋白特異性結 合的抗體。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述一對特異性擴增BPIFB2基因的引物 上遊引物序列為SEQ ID NO. 1，下遊引物序列為SEQ ID NO. 2。
5. -種檢測口腔癌相關基因 BPIFB2的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒 包括：特異性引物、內參引物、螢光定量PCR反應液。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特徵在於，所述特異性引物包括上遊引物和下遊 引物，上遊引物序列為SEQ ID NO. 1，下遊引物序列為SEQ ID NO. 2。
7. 根據權利要求5或6任意一項所述的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒還包含RNA 抽提試劑。
8. 根據權利要求5-7任意一項所述的試劑盒，其特徵在於，螢光定量PCR體系：上遊引 物、下遊引物、樣品 cDNA、2 XUltralSYBR One Step RT-qPCR Buffer (With R0X)，SuperEnzyme Mix，RNase-Free Water ;突光定量 PCR 程序：45°C lOmin ;95°C 5min 預變性，接 30-40 個循 環：95°C 10s，60°C 30s。
9. 一種權利要求5-8任意一項所述的試劑盒在製備口腔癌輔助診斷或者預後製劑中 的應用。
【文檔編號】C12Q1/06GK104059982SQ201410315624
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月4日 優先權日:2014年7月4日
【發明者】楊承剛, 李紅偉, 常鵬, 孫錦雲 申請人:楊承剛