真菌抗性植物和它們的用途的製作方法

2023-06-11 15:18:46

專利名稱：：真菌抗性植物和它們的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，優選馬鈴薯和番茄對卵菌(Oomycetes)門的植物病原體的抗性的新方法，所述方法包括增加本發明多肽的活性。本發明還涉及多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體。本發明還涉及相應的載體、細胞、轉基因植物和來自它們的轉基因繁殖材料，涉及產生它們的方法，還涉及它們用於生產糧食、飼料、種子、藥物或者精細化學品的用途。植物生物技術工作的目的是產生具有有益的新性質的植物，例如，用於增加農業生產力，增加糧食質量，或者產生特定化學品或者藥物(DunwellJM(2000)JExpBot51SpecNo487-96)。植物對於病原體的天然防禦機制通常是不足的。僅真菌病就導致每年幾億美元的產量損失。導入來自植物、動物或者微生物來源的外來基因可以增加防禦。實例是通過表達處於35SCaMV啟動子控制下的蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)內毒素保護菸草免於昆蟲的攝食損害(Vaeck等人(1987)Nature32833-37)或者通過表達處於CaMV啟動子控制下的豆幾丁質酶保護菸草免於真菌感染(Broglie等人(1991)Science2541194-1197)。然而，所描述的多數方法僅僅提供了對一種病原體或者窄範圍病原體的抗性。儘管19世紀中葉眾所周知的愛爾蘭馬鈴薯饑荒，晚疫仍然是農作物植物中所有疾病最具破壞性的疾病之一。晚疫由卵菌真菌致病疫黴(Phytophthorainfestans)導致，致病疫黴是一種特化病原體，其主要在許多茄科物種，尤其馬鈴薯和番茄的葉子和果實上導致疾病。首次在墨西哥觀察到該真菌，由於幾種原因，認為墨西哥是該真菌的起源中心。在例如Toluca地區提取永久存在兩種交配型A1和A2。而且，有報導在墨西哥的偏遠地區的當地茄屬物種上存在致病疫黴。此外，在墨西哥發現具有塊莖茄屬的許多種具有對晚疫的高水平抗性。預防農作物死亡或者產量減小的主流措施意味著應用殺真菌劑防止或者治療致病疫黴導致的感染。代替化學殺蟲劑的大量使用用於控制晚疫的備選方法是有益的使用栽培種，其具有對晚疫的部分或者完全抗性。為了得到晚疫抗性，培育者在過去專注於來自墨西哥本地一種野生馬鈴薯種Solanumdemissum的顯性R基因的漸滲現象。已經鑑定了11種此類基因，它們的一些已經定位到馬鈴薯的遺傳學圖的特定基因座(Gebhardt和Valkonen，2001中綜述)並且最近已經克隆了R1基因。R1和R2分別位於5號和4號染色體。R3、R6和R7位於11號染色體上。賦予對晚疫的品種特異抗性的未知R基因也已經在馬鈴薯andigena亞種(S.tuberosumssp.andigena)和S.berthaultii與S.pinnatisectum中描述。在任何情況下，這些R基因誘導的抗性(幾乎)是完全的但是似乎不能持久。因為高水平抗性和容易轉移，所以許多栽培種含有S.demissum衍生的抗性。不幸的是，S.demissum衍生的品種特異抗性儘管幾乎是完全的，但是不是持久的。一旦在商業田間中以大規模生長新近培育的馬鈴薯栽培種，就出現致病疫黴的新毒性，其使得該病原體能夠克服漸滲的抗性。在一些墨西哥和中南美洲茄屬種中可以發現對晚疫的更持久的田間抗性，其通常可以在本質上定量並且認為是品種非特異的。然而，通過雜交和表型選擇通常難以將該類型的抗性轉移到馬鈴薯栽培種中。來自墨西哥和瓜地馬拉的二倍體S.bulbocastanum是一種具有塊莖的物種，很久以來就知道它對晚疫具有高水平抗性。不幸的是，由於倍性和胚乳平衡數(EBN)中的困難，通常不能實施將抗性從茄屬物種轉移到培育的馬鈴薯的經典轉移。儘管有這些困難，但是S.bulbocastanum抗性性狀的漸滲已經取得了成功。最近，發現S.bulbocastanum和馬鈴薯的體細胞雜種和回交的種質即使在極大的疾病壓力下也對晚疫是高度抗性的(Helgeson等人，1998)。儘管有重組抑制的報導，但是回交材料中的抗性似乎在8號染色體內RFLP標記CP53和CT64之間的約6cM間隔上。來自番茄RFLP探針CT88的CAPS標記與抗性共分離。因此，近年來，對卵菌門病原體抗性植物的開發穩步前進。然而，對可用的種質的40年的深入和持續的研究和育種工作仍然沒有導致在市場上引入抗性栽培種。近年來鑑定的多數基因僅僅是品種特異抗性。此外，所實現的抗性不是持久的。此外，普遍認為植物保護劑的應用造成環境負擔。從而，在一些西方國家，法律變得更嚴格並且部分禁止應用特定殺真菌劑，使得疾病的化學控制更加困難。此外，化學控制是昂貴的。最後，另一個限制是世界上許多國家已經報導真菌產生了對特定殺真菌劑如甲霜靈的抗性。因此，本發明的根本問題是提供有效保護植物免於晚疫和相關疾病的新手段和方法。通過提供權利要求中表徵的實施方案解決了技術問題。因此，本發明涉及產生或者增加植物對卵菌門植物病原體的抗性的方法，其包括增加植物或植物或其部分中組織、器官或細胞中Rpi-blb2蛋白質的活性。Rpi-blb2是LZ-NBS-LRR型R基因並且顯示出與賦予對三種根結線蟲(Meloidogynespp.)的抗性的番茄基因Mi-1以及與馬鈴薯蚜蟲馬鈴薯長管蚜(Macrosiphumeuphorbiae)(Vos等人，1998；Rossi等人，1998；Milligan等人，1998)和與粉蝨(煙粉蝨(Bemisiatabaci))(Nombela等人，2003)的B-和Q-生物型的序列同源性。如對於Rpi-blb所發現的，Rpi-blb2也賦予對攜帶多種毒性因子的一系列致病疫黴分離物的完全抗性，並且還沒有表現出品種特異性。術語「Rpi-blb2」指編碼具有本文提到的Rpi-blb2蛋白質活性的多肽的多核苷酸或者具有所述Rpi-blb2蛋白質活性的多肽。下文中術語「Rpi-blb2」涉及多肽還是多核苷酸可以從其使用的上下文中明確。術語「產生」或「增加」或「刺激」「植物的抗性」指與參照相比，增加或產生或刺激了植物或其部分的抗性。「賦予」、「現有」、「產生」、「刺激」或「增加」病原體抗性指在相同條件(例如，氣候條件、生長條件、病原體種類等等)下，與沒有應用根據本發明方法的野生型植物相比，由於應用了根據本發明的方法，特定植物種或者變種的防禦機制對一種或多種病原體的抗性增加。增加的抗性優選表現在疾病症狀表現的減小，疾病症狀除了包括上面提到的不利效果外還包括例如病原體進入植物或者植物細胞的穿透效率或者病原體在植物或植物細胞內部或者上面的繁殖效率。在該上下文中，疾病症狀優選減小至少10％或至少20％，尤其優選至少40％或60％，非常特別優選至少70％或80％，最優選至少90％或95％。術語「增加的」在此指基因產物活性比參照中的活性高。從而，術語「增加的」包括如果在參照中沒有發現活性(例如，本文描述的Rpi-blb2活性)，那麼重新產生的該活性(例如，Rpi-blb2基因產物或者另一種基因產物的活性)。術語「增加的」還涉及基因產物活性的刺激。可以以多種方法刺激基因的增加的表達，即它的活性，所述方法為例如對生物應用化學品或者通過生物應激。例如，通過用寄生蟲，例如，用致病疫黴感染可以激活針對感染性寄生蟲介導基因的抗性並且該抗性賦予對相同和/或其他病原體的增加的抗性。從而，在下文中，術語「增加」還包括術語「刺激」和「產生」。「病原體抗性」表示病原體感染後植物的疾病症狀的減輕或者減弱。症狀可以是多樣的，但是優選包括對植物的質量、產量、用作飼料或糧食的適宜性直接或間接具有不利影響，或者使得播種、種植、收穫或加工農作物困難的那些症狀。在本發明範圍內「病原體」作為實例但不作為限制指病毒或者類病毒、細菌、真菌、動物害蟲，如昆蟲或者線蟲。術語「Rpi-blb2」蛋白質涉及蛋白質或多肽，其在植物或植物部分中的表達與非抗性株系相比賦予該植物或植物部分對本文描述的病原體的抗性。與具有相同遺傳背景但是沒有允許Rpi-blb2的表達必需的遺傳元件的植物或者其部分(本文稱作「野生型」或者「參照」)相比，包含Rpi-blb2蛋白質的增加的活性的植物或植物組織、或者細胞或者植物部分對於病原體，尤其卵菌門病原體，優選對於致病疫黴的敏感性較低。測試植物或者其部分的抗性的測定法是本領域技術人員熟知的。對致病疫黴的抗性可以定義為根據Flier，2001的孢子形成指數。Flier將孢子形成指數描述為每1cm2孢子形成水平。從而，與野生型相比每1cm2孢子形成的20％減少在本文定義為抗性。在闡明本發明的實施例中，孢子形成指數定義為每個病灶孢子形成的水平。從而，術語「抗性」可以備選地指與野生型相比每個病灶孢子形成減少20％。優選後一定義。在優選實施方案中，在測定中孢子形成減少30％，更優選減少50％，甚至更優選減少70％，更優選減少80％以上，更優選減少85％和90％。最優選減少95％或以上。因此，在本發明中，Rpi-blb2蛋白質的「活性」指蛋白質表達賦予孢子形成指數的所述減少。此外，觀察到含有Rpi-blb2的植物對致病疫黴感染的典型應答是在生長期結束時存在小病灶，沒有明顯的孢子形成。從而，在一個實施方案中，Rpi-blb2的活性定義為在所描述的實驗中存在沒有任何明顯孢子形成的小病灶。Rpi-blb2抗性表現出壞死區域，其含有低水平孢子形成。用離脫葉進行的實驗例證了Rpi-blb2的活性。該實驗在實施例17和圖18中描述。Rpi-blb2和其他致病疫黴抗性基因之間的差異是Rpi-blb2允許低水平孢子形成(圖18)。在其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在病灶的離脫葉測定顯示了低水平孢子囊，而含有S.demissum基因R2的基因型上完全沒有孢子囊。孢子形成指數為敏感表型(cv.Bintje)的僅1.1％。田間實驗也表明Rpi-blb2允許低水平感染。在生長期期間(圖3，ARF87-801)或者生長期結束時(圖2，ARF87-601；圖3，ARF87-507和ARF87-601)產生晚疫症狀。從而，在一個實施方案中，Rpi-blb2的活性還定義為在植物中表達後導致壞死區中含有如所述實驗中描述的低水平孢子形成。從而，在一個實施方案中，本發明的方法產生顯示出含有低水平孢子形成或更低水平孢子形成的壞死區的植物。術語「參照」涉及生物或者其部分，例如，細胞，所述生物或者其部分在基因組、蛋白質組和/或代謝組與相關生物或者其部分，例如細胞，例如，與本發明的植物基本相同。從而，術語「參照」涉及例如生物或者其部分，例如，細胞，所述生物或者其部分在遺傳、蛋白質組和/或代謝上與本發明的生物或者其部分基本相同，但是由於在參照的基因組、蛋白質組或者代謝組中存在相關差異，不能觀察到它的特定基因產物(例如，Rpi-blb2)的活性。從而，參照可以是不表達或者表達很少相關活性基因產物的植物或者其部分，例如，它不編碼Rpi-blb2或者不轉錄Rpi-blb2編碼基因或者不翻譯活性Rpi-blb2mRNA。從而，參照不提供產生足量活性基因產物而導致所述表型的修飾。兩種植物是否基本上在遺傳上相同可以用本領域技術人員已知的測定法測試，例如，如用Roldan-Ruiz，Theor.Appl.Genet.，2001，1138-1150描述的指紋分析測試。可以如本領域描述的測試蛋白質的表達模式，例如，用通過凝膠電泳(一維、二維、三維)、質譜分析和例如，在www.waters.com，www.proteine.org.au，www.proteomesci.com，www.sdu.dk/Nat/CPA中描述的其他方法進行。技術人員按照本領域描述的可以分析代謝組，例如，通過HPLC、GC、OPLC、LC-MS、GC-MS、LC-MS-MS和例如，在www.metabolic-explorer.com，www.ki.se/icsb2002/pdf/ICSB_209.pdf，www.genomics.rug.nl/technologies.htm，Fiehn等人，NatureBiotech，18(2000)，1157，Raamsdonk等人，NatureBiotech，19(2991)，45-50，Buchholz，Anal.Biochem，295(2001)129-137，Soga等人，AnalChem.74(2002)2233-2239中描述的其他方法實施所述分析。為了增加對病原體的抗性，參照生物或者其部分對於病原體，例如植物病原體，例如，致病疫黴的感染是敏感的。優選地，參照是生物的克隆，該克隆中例如，已經導入相關多核苷酸，例如，本發明的多核苷酸，或者激活劑，例如，介導活性的相關基因產物的激活劑，例如，增加相關多核苷酸或者所述多核苷酸衍生物的表達的激活劑，或者相關多肽，例如本發明多肽的激活劑，和/或相應的相關基因產物編碼載體。例如，本發明方法中的優選參照是生物或者其部分，其是生物的克隆或者其部分，例如，細胞，所述克隆或者其部分已經用本發明的多核苷酸或者載體轉染或者轉化。如果不能鑑定所述克隆，本領域技術水平是切除或者敲除或者關閉基本上介導相關活性的那些元件，所述相關活性為例如介導增加的Rpi-blb2活性，例如，介導生物，例如植物中增加的表達。本領域技術人員公知怎樣減小或者抑制相關基因產物的活性，例如通過減小或者抑制例如Rpi-blb2的表達。然後此類克隆可以與根據本發明的方法產生的生物，例如，與致病疫黴抗性、表達Rpi-blb2的基因型生物比較。本文所用的術語「植物」指植物界的高等和低等植物的所有屬和種。該術語包括成熟植物、種子、芽和幼苗和它們的衍生部分、繁殖材料、植物器官、組織、原生質體、愈傷組織和其他培養物，例如，細胞培養物，和給予功能或結構單位的任意其他類型的植物細胞分組。「成熟植物」指幼苗之外的任意希望的發育階段的植物。幼苗指在早期發育階段的幼小的不成熟植物。「植物」包括所有一年生和多年生單子葉植物和雙子葉植物。本發明範圍內優選為用作糧食或者飼料的那些植物，例如，單子葉或者雙子葉屬，尤其種，像上述種，例如，分別穀類種或者茄科的成員，最優選馬鈴薯和番茄。如本領域技術人員已知的，本發明的方法還包括選擇那些植物，在所述植物中與參照植物相反或相比，對至少一種所述病原體的抗性已經存在或者增加。關於其中與參照植物相反或相比，對至少一種所述病原體的抗性已經存在或者增加的植物的「選擇」指適於識別針對病原體的現有或者增加的抗性的所有那些方法。這些可以是病原體感染的症狀，但是也可以包括本文描述的症狀，其涉及植物的質量、產量、用作飼料或者糧食的適宜性等等。因此，在本發明方法的一個實施方案中，Rpi-blb2蛋白質由包含核酸分子的多核苷酸編碼，所述核酸分子選自a)編碼SEQIDNO2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含編碼所述多肽的至少成熟形式的如SEQIDNO1或3，或5或6中描繪的編碼序列；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡併產生；d)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽的胺基酸序列的一個或幾個胺基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的胺基酸序列具有70％或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARF1F和ARF1R從核酸文庫擴增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項編碼的多肽的以胺基酸1、30、50、100、200、300、500或1000開始並以胺基酸1276、1000、500、300、200、50、30、或1結束的片段；i)包含(a)或(d)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(h)任一項的核酸分子編碼的多肽產生的單克隆抗體識別；k)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(j)任一項的核酸分子或者其至少15個，優選30、60、100或更多核苷酸的片段的序列的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和l)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(k)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到(l)任一項的互補鏈；或者表達Solanumbulbocastanum的連鎖群6的區段編碼的多肽，所述區段與選自表3A的標記共分離，並且所述多肽介導對病原體，尤其選自卵菌門病原體的抗性。在一個實施方案中，本發明方法的多核苷酸不由Seq.IDNO.7和/或9中描述的序列組成和/或不由編碼Seq.IDNO.8和/或10中描述的蛋白質的核酸分子的序列組成。在一個實施方案中，本發明方法的多核苷酸不由Mil.1或者Mil.2的核酸分子的序列組成和/或不由編碼Mil.1或者Mil.2蛋白質的核酸分子的序列組成。從而，在一個實施方案中，本發明方法的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNASUSA959750-9754，Milligan等人，1998.PlantCell101307-1319；和/或WO9806750中所示的序列組成。在圖15和17中顯示了Rpi-blb2、Mil.1和Mil.2的序列比較。本文所用術語「連鎖群」涉及兩種或多種性狀和/或基因座和/或基因和/或標記，它們由於所述性狀和/或基因座和/或基因和/或標記之間的關聯而傾向於一起遺傳。性狀和/或基因座和/或基因和/或標記越密切，在DNA修復或者複製過程，如真核生物中有絲分裂或減數分裂期間它們分離的概率越低，從而它們將一起遺傳的概率越大。連鎖群與染色體的同源對一樣多。術語「連鎖群6」涉及與6號染色體關聯的馬鈴薯或番茄的連鎖群，通過基於Bernatzky和Tanksley(1986)和Tanksley等人(1992)發表的工作鑑定已知染色體位置的標記建立此類關聯。連鎖群具有與它們的各自染色體相同的編號。在番茄中，根據粗線期測量的染色體的長度對染色體編號。此類編號已經由Barton(1950)採用；1號染色體是最長的，12號染色體是最短的。除了長度，諸如著絲粒的位置和異染色質的量和分布的特徵用於鑑定每個染色體。短臂通過「S」表示，長臂用「L」表示；從而如在Barton，D.W.(1950)AmericanJournalofBotany.37，639-643，Bernatzky，R.和Tanksley，S.D.(1986)Genetics112，887-898，Tanksley，S.D.，等人，(1992)Genetics132，1141-1160中，「1S」表示1號染色體的短臂。本文所用術語「共分離」涉及兩種或多種緊密連鎖的性狀和/或基因座和/或基因和/或標記傾向於一起遺傳。例如，6號染色體的與Rpi-blb2共分離的更具體的區域是短臂，其在番茄中具有形態學標記Mi。因此，在一個實施方案中，本發明涉及本發明的方法，其中Rpi-blb2蛋白質由本發明的多核苷酸編碼，例如，由Seq.ID.1或3或5或6中所示的多核苷酸或者其片段編碼。基於BLASTX檢索，與所鑑定的Rpi-blb2序列具有最高同源性的所鑑定基因是Mil.1和Mil.2基因和蛋白質；見圖15和17。兩種基因都與Seq.ID.1或3或5或6中描述的序列具有高同一性但是不賦予對卵菌門植物病原體的抗性。因此，Mil.1和Mil.2的活性不同於本發明多肽活性。Mil.1和Mil.2ORF的序列和編碼蛋白質在本文中以Seq.IDNO.7到10顯示。此外，申請EP401764.4涉及Mi-基因。現有技術Mil.1-和Mil.2-基因的序列排除在本發明多核苷酸之外，具體排除Seq.IDNO.7和9。還包括編碼Seq.IDNO.8或10的多肽的多核苷酸序列。從而，在一個實施方案中，還排除編碼Mil.1和Mil.2蛋白質的序列。與本發明的多核苷酸編碼的多肽具有較低同源性的蛋白質是Hero抗性蛋白質1和2(Genbank檢索號gi26190252和gi26190254)、番茄斑萎病毒(Tospovirus)抗性蛋白質A、B、C、D和E[Genbank檢索號gi15418709、gi15418710、gi15418712、gi15418713、gi15418714]；R1[Genbank檢索號gi17432423]和Prf[Genbank檢索號gi8547237]，它們的序列或者編碼的序列也排除在本發明的序列之外。本文中所用術語「基因」、「多核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、或者「核酸分子」指任意長度的核苷酸的聚合形式，可以為核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸。該術語僅指分子的一級結構。從而，該術語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。它還包括已知類型的修飾，例如，甲基化、一個或多個天然發生的核苷酸用類似物的「帽」替代。優選地，本發明的DNA序列包含編碼本文定義的多肽的編碼序列。「編碼序列」是核苷酸序列，當置於適宜的調節序列的控制下時，所述核苷酸序列轉錄成mRNA和/或翻譯成多肽。由5』末端的翻譯起始密碼子和3』-末端的翻譯終止密碼子決定編碼序列的界限。編碼序列可以包括，但不限於mRNA、cDNA、重組核苷酸序列或者基因組DNA，而在某些條件下也可以存在內含子。「雜交」指此類核酸分子在常規雜交條件下，優選在如Sambrook(MolecularCloning；ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989))描述的嚴格條件下雜交。此類嚴格雜交條件的一個實例是在4×SSC65℃下雜交，然後在0.1×SSC65℃下洗滌1小時。備選地，代表性嚴格雜交條件是在50％甲醯胺，4×SSC中，42℃下。此外，洗滌步驟期間的條件可以選自低嚴格條件(約2×SSC50℃下)和高嚴格條件(約0.2×SSC50℃，優選65℃下)界定的條件範圍(20×SSC0.3M檸檬酸鈉，3MNaCl，pH7.0)。此外，洗滌步驟期間的溫度可以從室溫，約22℃的低嚴格條件升高到約65℃的高嚴格條件。兩種參數鹽濃度和溫度可以同時改變或者兩個參數之一可以保持恆定而僅另一個改變。在雜交期間可以使用變性劑，如甲醯胺或者SDS。在50％甲醯胺存在下，優選在42℃實現雜交。下面顯示了雜交和洗滌步驟條件的一些其他實例(1)例如，可以從下面的條件選擇雜交條件a)4×SSC65℃，b)6×SSC45℃，c)6×SSC，100mg/ml變性片段化魚精DNA，68℃d)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml變性鮭精DNA，68℃，e)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml變性片段化鮭精DNA，50％甲醯胺，42℃，f)50％甲醯胺，4×SSC42℃，g)50％(體積/體積)甲醯胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸鈉緩衝液pH6.5，750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉，42℃，h)2×或4×SSC，50℃(低嚴格條件)，或i)30到40％甲醯胺，2×或4×SSC，42℃(低嚴格條件)。(2)例如，可以從下面的條件選擇步驟a)0.015MNaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％SDS，50℃，b)0.1×SSC65℃，c)0.1×SSC，0.5％SDS，68℃，d)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲醯胺，42℃，e)0.2×SSC，0.1％SDS，42℃，f)0.2×SSC65℃(低嚴格條件)。在本發明的一個實施方案中，本發明的多核苷酸包含多核苷酸，其與包含或者由具有SeqIDNo.1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子組成的核酸分子雜交。所述片段包含或者優選由SeqIDNo.1或3或5或6的15、20、30、40、70、100、300、500、700、1000或更多殘基組成。在優選實施方案中，本發明的多核苷酸包含在「嚴格」雜交條件下與包含或者由具有SeqIDNo.1或3或5或6所示序列或者其片段的核酸分子組成的核酸分子雜交的多核苷酸。本文所用的術語「在嚴格雜交條件下」指任一種本文提到的嚴格雜交條件。在另一實施方案中，術語「在嚴格雜交條件下」指在實施例中提及或在Sambrook(MolecularCloning；ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)中所用的雜交條件。在一個優選實施方案中，本文所用的術語「在嚴格雜交條件下」指所有本文提到的嚴格雜交條件，表示多核苷酸在所有提到的嚴格條件下雜交。來自其他生物的Rpi-blb2可以由其他DNA序列編碼，所述序列在鬆弛雜交條件下與SeqIDNo.1或3或5或6中所示序列雜交並且表達時編碼具有Rpi-blb2的活性的肽。此外，一些應用必須在低嚴格雜交條件下進行，對雜交的特異性沒有任何影響。例如，可以用本發明的多核苷酸探測總DNA的DNA印跡分析並在低嚴格條件(55℃，2×SSPE，0.1％SDS中)下洗滌。雜交分析可以揭示僅編碼Rpi-blb2的基因的簡單模式。此類低嚴格雜交條件的另一實例是4×SSC50℃下，或者用30到40％甲醯胺在42℃雜交。此類分子包含本發明的Rpi-blb2的片段、類似物或者衍生物並且例如通過單獨或組合的胺基酸和/或核苷酸缺失、插入、替代、加入和/或重組或本領域已知的任何其他修飾而與上述胺基酸序列或者它們潛在的核苷酸序列不同。然而，優選使用高嚴格雜交條件。術語「同源」指各自核酸分子或者編碼的蛋白質在功能和/或結構上等價。與上述核酸分子同源並且是所述核酸分子衍生物的核酸分子為例如，所述核酸分子代表修飾的變異，其具有相同的生物功能，尤其編碼具有相同或基本上相同生物功能的蛋白質。它們可以是天然發生的變異，如來自其他植物變種或品種的序列，或者突變。這些突變可以天然發生或者可以通過誘變技術得到。等位基因變異可以是天然發生的等位基因變體以及合成產生或者基因工程化的變體。通過例如，測試所述多肽與抗體的結合可以鑑定結構等價物。結構等價物具有相似的免疫學特徵，例如，包含相似的表位。術語「片段」、「序列的片段」或「序列的部分」指所指的最初序列的截短的序列。截短的序列(核酸或者蛋白質序列)可以在長度上變化很大；最小尺寸是提供具有所指最初序列的相當功能和/或活性的序列的足夠大小的序列；而最大尺寸不是關鍵的。在一些應用中，最大尺寸通常不顯著大於提供最初序列的所希望的活性和/或功能所需的尺寸。通常，截短的胺基酸序列將長為約5到約1260個胺基酸。然而，更典型地，該序列將最大長約1000個胺基酸，優選最大約500或100個胺基酸。通常希望選擇具有至少約10、12或15個胺基酸，多達最大約20到約25個胺基酸的序列。術語「表位」涉及抗原內的特異免疫反應位點，也稱作抗原決定簇。這些表位可以是聚合成分中單體的線陣-如蛋白質中的胺基酸-或者組成為或者包含更複雜的二級或者三級結構。技術人員將認識到所有免疫原(即，能夠引起免疫應答的物質)都是抗原；然而，一些抗原(如半抗原)不是免疫原，但是通過偶聯載體分子可以稱為免疫原性的。術語「抗原」包括對物質的參考，可以產生針對該物質的抗體和/或該抗體對該物質是特異免疫反應的。在一個實施方案中，本發明涉及Rpi-blb2的表位。術語「一個或幾個胺基酸」涉及至少一個胺基酸但是不多於將導致低於70％同一性的同源性的胺基酸數。優選地，同一性多於75％或80％，更優選為85％、90％或95％，甚至更優選為96％、97％、98％或99％同一性。術語「多核苷酸」和「核酸分子」還涉及「分離的」多核苷酸或者核酸分子。「分離的」核酸分子是與存在於該核酸的天然來源的其他核酸分子分離的核酸分子。優選地，「分離的」核酸沒有這樣的序列，其天然地在所述核酸所來源的生物的基因組DNA中所述核酸的側翼(即，位於所述核酸的5』和3』末端的序列)。例如，在多種實施方案中，本發明的多核苷酸可以含有小於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb或更少的核苷酸序列，其天然位於所述核酸所來源的生物的基因組DNA中所述核酸分子的側翼。此外，本發明的多核苷酸，尤其「分離的」核酸分子，如cDNA分子，當通過重組技術產生時可以基本上無其他細胞材料，或者培養基，或者當化學合成時可以基本上無化學前體或者其他化學品。此外，本發明的多核苷酸包含與上述多核苷酸的核苷酸序列之一或者其部分互補的核酸分子。與SeqIDNo.1或3或5或6中所示核苷酸序列之一互補的核酸分子是與SeqIDNo.1或3或5或6中所示核苷酸序列之一足夠互補的序列，從而它可以與SeqIDNo.1或3或5或6中所示核苷酸序列雜交，從而形成穩定的雙鏈體。本發明的多核苷酸還包含與SeqIDNo.1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分至少約70％，優選至少約75％，更優選至少約80％、90％或95％，甚至更優選至少約96％、97％、98％、99％或以上同源的核苷酸序列。本發明的多核苷酸包含與SeqIDNo.1或3或5或6中所示的核苷酸序列或者其部分雜交，優選在本文定義的嚴格條件下雜交的核苷酸序列。此外，本發明的多核苷酸可以包含SEQIDNo1或3或5或6的序列之一的編碼區的僅一部分，例如，可以用作探針或者引物的片段或者編碼Rpi-blb2蛋白質編碼基因的生物活性部分的片段。從當前Rpi-blb2蛋白質編碼基因克隆確定的核苷酸序列允許產生探針和引物，它們設計用於鑑定和/或克隆它在其他細胞類型和生物中的同源物。探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸通常包含核苷酸序列區，其在嚴格條件下與例如，SEQIDNo1或3或5或6中提出的序列之一的反義鏈的至少約12、15個，優選約20或25個，更優選約40、50或75個連續核苷酸雜交，例如與SEQIDNo1或3或5或6中給出的序列之一的反義序列或者其天然發生的突變體雜交。基於本發明核苷酸的引物可以用於PCR反應中克隆Rpi-blb2同源物，例如，使用本發明的實施例中描述的引物，如表3a或3b中所示的引物，優選引物ARF1F和ARF1R。用引物univ24R和univ14L進行的PCR將導致Rpi-blb2的片段，其可以如本文描述的使用。所述引物組可以互換。本領域技術人員已知組合所述引物以得到所希望的產物，例如，得到全長克隆或者部分序列。基於Rpi-blb2核苷酸序列的探針可以用於檢測編碼相同或者同源蛋白質的轉錄物或者基因組序列。探針可以還包含連接該探針的標記物組，例如，標記物組可以是放射性同位素、螢光化合物、酶、或者酶輔因子。此類探針可以用作基因組標記測試試劑盒的部分用以鑑定表達Rpi-blb2的細胞，如通過測量細胞樣品中Rpi-blb2編碼核酸的水平，例如，通過檢測Rpi-blb2mRNA水平或者測定基因組Rpi-blb2基因是否已經突變或者缺失進行所述鑑定。本發明的多核苷酸編碼多肽或者其部分，所述多肽或者其部分包括與SEQIDNo2或4的胺基酸足夠同源的胺基酸序列從而蛋白質或者其部分保持參與對病原體抗性，尤其植物中實施例中所描述的Rpi-blb2蛋白質活性的能力。如本文所用的，術語「足夠同源的」指蛋白質或者其部分的胺基酸序列包括最小數目的與SEQIDNo2或4的胺基酸序列相同或等價(例如，胺基酸殘基與本發明的多肽序列之一中的胺基酸殘基具有相似側鏈)胺基酸殘基，從而所述蛋白質或者其部分能夠參與植物對所述病原體的抗性。在本文描述了Rpi-blb2蛋白質活性的實例。從而，Rpi-blb2蛋白質的功能直接或者間接有助於對植物病原體，優選對本文提到的病原體，更優選對致病疫黴的抗性。所述蛋白質至少約70％，優選至少約75％，更優選至少約80％、90％、95％，最優選至少約96％、97％、98％、99％或以上同源於SEQIDNo2或4的完整胺基酸序列。本發明的多核苷酸編碼的蛋白質的部分優選具有生物活性。如本文提到的，術語「生物活性部分」意在包括部分，例如，結構域/基序，所述部分賦予對卵菌植物病原體和/或煙粉蝨(Bemisiatabaci)和/或蚜蟲的抗性或者具有免疫學活性從而它結合特異結合Rpi-blb2蛋白質的抗體或者它具有實施例中給出或者本文描述的活性。通過分離SEQIDNo1或3或5或6中序列之一的一部分，表達Rpi-blb2蛋白質或者肽的編碼部分(例如，通過體外重組表達)並評估蛋白質的編碼部分的活性可以製備編碼本發明多肽的生物活性部分的額外的核酸片段。本發明還包括由於遺傳密碼簡併性而與SEQIDNo1或3或5或6(和其部分)中所示核苷酸序列之一不同從而編碼SEQIDNo2或4中所示序列編碼的Rpi-blb2多肽的多核苷酸。此外，本發明的多核苷酸具有編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有SEQIDNo2或4中所示胺基酸序列。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸編碼全長蛋白質，其與SEQIDNo2或4中所示胺基酸序列基本上同源。此外，本領域技術人員將理解在群體(例如，S.bulbocastanum群體)內可以存在DNA序列多態性，其導致胺基酸序列中的改變。由於自然變異，Rpi-blb2基因中此類遺傳多態性可以存在於群體內的個體間。如本文所用的，術語「基因」和「重組基因」指包含編碼Rpi-blb2，優選S.bulbocastanumRpi-blb2的可讀框的核酸分子。此類天然變異通常可以導致Rpi-blb2基因的核苷酸序列中1-5％變異。本發明範圍內意在包括由於天然變異導致並且不改變Rpi-blb2的功能活性的Rpi-blb2中的任意和所有此類核苷酸變異和所得胺基酸多態性。使用本發明的多核苷酸或者其部分作為雜交探針，根據標準雜交技術，在嚴格雜交條件下，可以基於與本文公開的S.bulbocastanumRpi-blb2多核苷酸的同源性分離相應於Rpi-blb2cDNA的天然變體和非S.bulbocastanum同源物的多核苷酸。因此，在另一實施方案中，本發明的多核苷酸長為至少20個核苷酸。優選地，它在嚴格條件下與包含本發明多核苷酸的核苷酸序列，例如，SEQIDNo1或3或5或6的核酸分子雜交。在其他實施方案中，所述核酸長為至少20、30、50、100、250或更多個核苷酸。術語「在嚴格條件下雜交」如上定義並且意在描述雜交和洗滌條件，在該條件下相互至少65％同一的核苷酸序列通常保持相互雜交。優選地，所述條件使得相互至少約70％，更優選至少約75％或80％，甚至更優選至少約85％、90％或95％或以上同一的序列通常保持相互雜交。優選地，在嚴格條件下與SEQIDNo1或3或5或6的序列雜交的本發明的多核苷酸相應於天然發生的核酸分子。如本文所用的，「天然發生的」核酸分子指具有天然發生的核苷酸序列的RNA或者DNA分子(例如，編碼天然蛋白質)。優選地，所述多核苷酸編碼天然的S.bulbocastanumRpi-blb2。除了可能存在於群體中的Rpi-blb2序列的天然發生的變體外，技術人員將還理解通過突變可以向編碼Rpi-blb2的多核苷酸的核苷酸序列中引入改變，從而導致所編碼的Rpi-blb2的胺基酸序列的改變，而不改變Rpi-blb2的功能能力。例如，可以在編碼Rpi-blb2的核苷酸的序列中，例如，在SEQIDNo1或3或5或6中進行導致在「非必需」胺基酸殘基處胺基酸替代的核苷酸替代。「非必需」胺基酸殘基是可以從Rpi-blb2蛋白質的野生型序列改變而不改變所述Rpi-blb2蛋白質活性的殘基，而「必需」胺基酸殘基是Rpi-blb2蛋白質活性所需的。然而，其他胺基酸殘基(例如，在具有Rpi-blb2活性的結構域中不保守或者僅半保守的那些殘基)可能對活性不是必需的，從而可能順從改變而不改變Rpi-blb2活性。因此，本領域技術人員已知生物之間的密碼子選擇可以不同。因此，他將使得本發明的多核苷酸的密碼子選擇適於所述多核苷酸或者多肽在其中表達的生物的選擇。因此，本發明涉及編碼Rpi-blb2的多核苷酸，所述Rpi-blb2含有對Rpi-blb2活性不是必需的胺基酸中的改變。此類Rpi-blb2的胺基酸序列與SEQIDNo2或4中所含序列不同，但是仍然保持本文所述的Rpi-blb2活性。所述多核苷酸可以包含編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含與SEQIDNo2或4的胺基酸具有至少約70％同一性的胺基酸序列並且能夠參與對植物病原體的抗性。優選地，所述核酸分子編碼的蛋白質與SEQIDNo2或4中的序列具有至少約70％同一性，更優選與SEQIDNo2或4中序列之一具有至少約75％同一性，甚至更優選與SEQIDNo2或4中序列具有至少約80％、90％、95％同源性，最優選與SEQIDNo2或4中序列具有至少約96％、97％、98％或99％同一性。為了確定兩條胺基酸序列(例如，SEQIDNo2或4的序列之一和其突變形式)或者兩條核酸之間的百分數同一性，為了最優比較目的將序列進行比對(例如，在一個蛋白質或者核酸的序列中引入缺口以與另一蛋白質或者核酸進行最優比對)。然後比較相應胺基酸位置或者核苷酸位置上的胺基酸殘基或核苷酸。當一條序列(例如，SEQIDNo2或4的序列之一)中的位置被與另一條序列(例如，所選序列的突變形式)中相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據時，這兩個分子在該位置同源(即，本文所用的胺基酸或者核酸「同源性」等價於胺基酸或核酸「同一性」)。兩條序列之間百分數同源性是所述序列共有的相同位置數的函數(即，％同源性＝相同位置數/位置總數×100)。藉助於程序算法GAP(WisconsinPackage版本10.0，UniversityofWisconsin，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，USA；Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.253389，參照以下)通過比較可以計算同源性，設置下面的參數缺口權重50長度權重3平均匹配10平均錯配0例如，在核酸水平與SEQIDNO1的序列具有至少80％同源性的序列理解為指一個序列，其當通過上面的程序算法使用上面的參數設置與SEQIDNO1的序列比較時，具有至少80％同源性。兩條多肽之間的同源性理解為指藉助於程序算法GAP(WisconsinPackage版本10.0，UniversityofWisconsin，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，USA)，設置下面的參數缺口權重8長度權重2平均匹配2912平均錯配-2003，通過比較計算的每條完整序列長度上胺基酸序列的同一性。例如在蛋白質水平與序列SEQIDNO2具有至少80％同源性的序列理解為指一個序列，其當通過上面的程序算法使用上面的參數設置與SEQIDNO2的序列比較時，具有至少80％同源性。在本申請中，用可以在www.ebi.ac.uk/tools找到的程序clustalW，選擇序列分析並選擇選項clustalW(多序列比對)確定同源性。所有選項在標準條件下進行，如下比對完全；輸出格式alnw/numbers；輸出順序對準的；顏色調整無；ktup(字號)def；窗口長def；得分類型百分數；topdiagdef；pairgapdef；矩陣def；缺口打開def；結束缺口def；缺口延伸def；延伸距離def；cpu模式單個；樹圖/類型進化樹；樹圖/距離隱藏；種系發生樹/樹類型無；種系發生樹/校正距離關；種系發生樹/忽略缺口關。因此，優選根據clustalW的同源性計算。通過替代、插入或者缺失，從根據本發明的SEQIDNo2或4所示的多肽之一衍生的功能等價物與根據本發明的SEQIDNo2或4所示的多肽之一具有至少70％，優選至少80％，優選至少90％，特別優選至少95％，非常特別優選至少98％同一性並且通過具有與SEQIDNo2或4中所示多肽基本上相同的性質區別開來。通過替代、插入或者缺失從根據本發明的SEQIDNo1或3或5或6所示的核苷酸序列衍生的功能等價物與根據本發明的SEQIDNo2或4所示的多肽之一具有至少70％，優選至少80％，優選至少90％，特別優選至少95％，非常特別優選至少98％同一性並且編碼具有與SEQIDNo2或4中所示多肽基本上相同的性質的多肽。功能等價物的「基本上相同的性質」尤其理解為指賦予病原體抗性表型或者賦予或者增加對至少一種病原體的抗性而增加所述功能Rpi-blb2等價物在植物或者植物組織、部分或細胞中的蛋白質的量、活性或者功能。感染後孢子形成和病灶表型聯合功能等價物的蛋白質量、活性或功能的所述增加理解為基本性質。編碼與SEQIDNo2或4的蛋白質序列同源的Rpi-blb2的核酸分子可以通過在本發明的多核苷酸的核苷酸序列，尤其SEQIDNo1或3或5或6中引入一個或多個核苷酸替代、加入或缺失來產生，從而向所編碼的蛋白質中引入一個或多個胺基酸替代、加入或缺失。通過標準技術，如定點誘變和PCR介導的誘變可以向例如SEQIDNo1或3或5或6的序列中引入突變。優選地，在一個或多個預測的非必需胺基酸殘基上進行保守胺基酸替代。「保守胺基酸替代」是其中將胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基替換的替代。本領域中已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如，天冬氨酸、穀氨酸)、具有不帶電極性側鏈的胺基酸(例如，甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的胺基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分枝側鏈的胺基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈胺基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。從而，Rpi-blb2中預測的非必需胺基酸殘基優選用來自相同家族的另一胺基酸殘基替換。備選地，在另一實施方案中，例如，通過飽和誘變可以沿著Rpi-blb2編碼序列的所有或部分隨機導入突變，並且可以對所得突變體篩選本文描述的Rpi-blb2活性以鑑定保持Rpi-blb2活性的突變體。SEQIDNo1或3或5或6的序列之一誘變後，可以重組表達所編碼的蛋白質並且可以使用例如，本文描述的測定法(見實施例)測定所述蛋白質的活性。在一個實施方案中，在本發明的方法中，Rpi-blb2蛋白質和另一抗性蛋白質的活性增加了。預計在田間條件下一種以上的抗性基因，尤其賦予對相同病原體的抗性的基因的存在是有益的。對於存在能夠克服一種R-基因的抗性的病原體分離物(例如，致病疫黴品種)的情況下，其他一種或多種R基因仍然是有功能的，使得所述病原體不能感染植物。兩種未打敗的R基因的存在大大減小了病原體，尤其致病疫黴品種能夠突變成克服兩種或多種R基因的品種的機會。在下文中「抗性多肽」或者「抗性蛋白質」涉及多肽，其(增加的)活性將賦予對敏感基因型(「野生型」或「參照」)的抗性。因此，Rpi-blb2是抗性蛋白質以及例如，Rpi-blb(或者RB或Sbu1)。「另一種抗性蛋白質」涉及不同於本發明蛋白質的另一種抗性蛋白質，而術語「抗性蛋白質」包含本發明的多肽以及一種或多種抗性蛋白質。還理解術語「和另一種抗性蛋白質」涉及一種或多種其他抗性蛋白質。從而，可以增加一種或多種抗性蛋白質的活性。在下文中描述了其他抗性蛋白質。然而，通常任意其他已知的抗性蛋白質可以與本發明的多肽共表達或者可以通過本文描述的關於Rpi-blb2的任意方法增加它的活性。在優選實施方案中，另一種抗性蛋白質包含LRR結構域和P環。超過30種以上賦予對細菌、真菌、卵菌、病毒、線蟲或者昆蟲抗性的植物疾病抗性(R)基因的克隆和分子表徵允許不管病原體特異性而對它們在結構類別中進行分類(Dangl和Jones，2001中綜述)。預測所表徵的R基因的最豐富的類別(包含擬南芥屬基因組中預測的基因的約0.5％)編碼細胞外蛋白質，其攜帶在其他受體和信號轉導蛋白質中也發現的富含亮氨酸重複單位(LRR)和核苷酸結合位點(NBS)結構域、基序。NBS-LRRR蛋白質主要在N-末端不同，所述N-末端顯示出與果蠅Toll蛋白質和哺乳動物白介素-1受體結構域(TIR-NBS-LRR)的序列相似性，或者編碼捲曲螺旋結構(CC-NBS-LRR)，有時為亮氨酸拉鏈(LZ-NBS-LRR)的形式。儘管可能是膜結合的，但是預測NBS-LRR蛋白質為細胞質的。相比，預測攜帶LRR的R蛋白質的兩個其他類別跨越細胞膜，具有胞外LRR結構域LRR-跨膜(LRR-TM)Cf蛋白質和LRR-TM-激酶Xa21蛋白質。所表徵的缺少LRR的R蛋白質是來自番茄的Pto基因、來自甜菜的Hs1pro-1基因、來自大麥的mlo基因、來自擬南芥的Rpw8基因和來自大麥的Rpg1基因。根據基因對基因(gene-for-gene)假說，疾病抗性遵循具有無毒性(Avr)功能的病原體效應分子的植物R蛋白質的觀點，其中通過某種引發子(elicitor)識別複合體引發信號轉導途徑，導致超敏反應(HR)。與其他受體一起，通常認為NBS-LRRR蛋白質具有調節結構，其具有分開的識別和發信號結構域，其中LRR是候選識別結構域並且N-末端區包括NBS——主要的發信號結構域。重組R蛋白質的功能分析表明識別特異性實際上存在於LRR中。此外，LRR是與相關NBS-LRR蛋白質緊密相關的最多變區並且處於分叉選擇下。然而，不斷積累的證據表明LRR也通過涉及推定的分子內相互作用的負向調節有助於信號轉導。當前，已經從馬鈴薯克隆了5種R基因，包括賦予對晚疫抗性的兩種R基因，並且所有基因都屬於植物R基因的CC/LZ-NBS-LRR類。儘管S.demissum來源的R1基因賦予對晚疫的品種特異抗性，但是最近克隆的S.bulbocastanum來源的基因Rpi-blb(或者RB或者Sbu1)賦予對攜帶多種毒性因子的一系列致病疫黴分離物的完全抗性，並且還沒有表現品種特異性。此外，如前描述，在墨西哥的田間實驗中，含有Rpi-blb的體細胞雜種的子代植物不受晚疫的影響，在所述田間中發現幾乎每個品種的真菌。闡明了通過培養的馬鈴薯和番茄中敏感表型的互補，通過用單一克隆的R基因可能實現廣譜晚疫抗性從兩性不相容的宿主物種向培養的茄科的種間轉移的可能性。US6,127,607描述了具有LRR結構域和P環的抗性蛋白質。本文引用US6,127,607的內容作為參考。具體地，6到8列和11列描述了LRR結構域和P環。此外，Song，2003，PNAS100(16)，9128-9133說明了圖4中Rpi-blbLRR基序的比較並且在第9132上給出關於LRR結構域的概述。在圖14以及圖15中顯示了本發明多肽的結構域。優選地，選自Rpi-blb(同義詞RB或Sbu1)、Rpi-ABPT1、Rpi-blb3、Rpi-mcd、R1、R-ber(同義詞R12)、Rpi1、R2、R3a、R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和Ph-3構成的組的一種或多種抗性蛋白質的活性增加了。優選除了Rpi-blb2之外，至少Rpi-blb的活性也增加了。在本發明的一個實施方案中，例如，轉基因的Rpi-blb2蛋白質的表達增加了，並且另一轉基因抗性基因的表達增加了。與Rpi-blb2(或者RB或者Sbu1)共表達的抗性蛋白質優選為本文提到的抗性蛋白質之一，尤其Rpi-blb、Rpi-ABPT1、Rpi-blb3、R1、Rpil、R-ber、Rpi-mcd、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph-1、Ph-2或Ph-3，但是也可以是本領域技術人員已知的賦予對植物病原體的其他抗性之一的蛋白質。如所提到的，根據本發明的術語「增加的表達」也包括多核苷酸或者多肽的重新表達。最優選的是通過本發明多肽與Rpi-blb的共表達增加抗性。如在實施例和Song2003，PNAS100(16)，9128中描述的，Rpi-blb和Rpi-blb2在離脫葉測定中提供了對致病疫黴分離物的完全抗性。所述抗性賦予基因例如描述於RB或者Sbu1(Rpi-blb的同義詞)AY336128[gi32693280]，(Song等人，2003)。包含Rpi-blb基因的BAC克隆177013和CB3A14已經保藏在GenBank，檢索號AY303171和AY303170；R1AF447489[gi9117432422]，(Ballvora等人，2002)；Rpi1Kuhl，J.C.，Hanneman，R.E，和Havey，M.J，(2201)CharacterizationandmappingofRpi1，alateblightresistancelocusfromdiploid(1EBN)MexicanSolanumpinnatisectum.Moleculargenet.Genomics265977-985；R-berEwing，E.E.，Simko，I.，Smart，C.D.，Bonierbale，M.W，Mizubuti，E.S.G，May，G.D，和Fry，W.E，(2000)GeneticmappingfromfieldtestsofqualitativeandquantitativeresistancetoPhytophthorainfestansinapopulationderivedfromSolanumtuberosumandSolanumberthaultii.Molecularbreeding625-36；R2Li，X.，vanEck，H.J.，vanderVoort，J.N.A.M，Huigen，D.J，Stam，P，和Jacobsen，E.(1998)AutotetraploidsandgeneticmappingusingcommonAFLPmarkerstheR2alleleconferringresistancetoPhytophthorainfestansmappedonpotatochromosome4.TheoreticalandAppliedGenetics96(8)1121-112；R3、R6、R7Elkharbotly，A，Palominosanchez，C，Salamini，F，Jacobsen，E，和Gebhardt，C.(1996)R6andR7allelesofpotatoconferringrace-specificresistancetoPhytophthorainfestans(Mont)deBaryidentifiedgeneticlociclusteringwiththeR3locusonchromosomeXI.TheoreticalandApplied.Genetics92(7)880-884；Ph-1Bonde和Murphy(1952)MainAgric.Exp.Stn.Bull.No497；Ph-2Moreau，P，Thoquet，P.，Olivier，J，Laterrot，H，和Grimsley，N.H.(1998)GeneticmappingofPh-2，asinglelocuscontrollingpartialresistancetoPhytophthorainfestansintomato.MolecularPlantMicrobeInteractions11(4)259-269；Ph-3Chunwongse，J，Chunwongse，C.，Black，L.，和Hanson，P.(2002)MolecularmappingofthePh-3geneforlateblightresistanceintomato.JournalofHorticulturalScienceBiotechnology77(3)281-286；Rpi-blb3、Rpi-ABPT1和Rpi-mcdPark，T.H，VanderVossen，E，Vleeshouwers，V.G.A.A，Tan，A，Visser，R.G.F.和VanEck，H.J.2004.MajorresistancegenesfortuberandleafresistancetoPhytophthorainfestansinpotatoAnoutlineofaPhDproject.CropFunctionalGenomics2004，July2004，Jeju，Korea，93頁；R3a和R3bHuang，S.，Vleeshouwers，V.G.A.A，Werij，J.S，Hutten，R.C.B，VanEck，H.J，Visser，R.G.F，和Jacobsen，E.(2004).TheR3resistancetoPhytophthorainfestansinpotatoisconferredbytwocloselylinkedRgeneswithdistinctspecificities.MPMI17(4)，428-435；在一個實施方案中，根據本發明，Rpi-blb2的活性增加了，例如，本發明多核苷酸的表達增加了並且編碼Rpi-blb、Rpi-ABPT1、Rpi-blb3、Rpi-mcdR1、R-ber、Rpi1、R2、R3a、R3b、R6、R7、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的至少一種核酸分子的表達增加了，其中所述核酸分子選自a)核酸分子，其編碼至少如下的至少成熟形式Rpi-blb(或者RB-或者Sbu1-)多肽，優選由GenBank檢索號AY336128[gi32693280]中所示的序列編碼；R1多肽，優選由GenBank檢索號AF447489[gi9117432422]中所示的序列編碼；Rpi-blb3、Rpi-ABPT1和/或Rpi-mcd多肽，優選由Park，T.H，VanderVossen，E.，Vleeshouwers，V.G.A.A，Tan，A，Visser，R.G.F.和VanEck，H.J.2004.MajorresistancegenesfortuberandleafresistancetoPhytophthorainfestansinpotatoAnoutlineofaPhDproject.CropFunctionalGenomics2004，July2004，Jeju，Korea，93頁中所示或者其中的信息可以推導的序列編碼；R3a和/或R3b多肽，優選由Huang，S.，Vleeshouwers，V.G.A.A，Werij，J.S.，Hutten，R.C.B，VanEck，H.J，Visser，R.G.F，和Jacobsen，E.(2004).TheR3resistancetoPhytophthorainfestansinpotatoisconferredbytwocloselylinkedRgeneswithdistinctspecificities.MPMI17(4)，428-435中所示或者其中的信息可以推導的序列編碼；和/或病原體，優選致病疫黴抗性賦予蛋白質，其如所描述的作圖和表徵，例如，對於Rpi1在Kuhl，J.C，Hanneman，R.E，和Havey，M.J，(2001)CharacterizationandmappingofRpi1，alateblightresistancelocusfromdiploid(1EBN)MexicanSolanumpinnatisectum.Moleculargenet.Genomics265977-985中；對於R-ber在Ewing，E.E，Simko，I.，Smart，C.D.，Bonierbale，M.W，Mizubuti，E.S.G，May，G.D，和Fry，W.E，(2000)GeneticmappingfromfieldtestsofqualitativeandquantitativeresistancetoPhytophthorainfestansinapopulationderivedfromSolanumtuberosumandSolanumberthaultii.Molecularbreeding625-36中；對於R2在Li，X.，vanEck，H.J.，vanderVoort，J.N.A.M，Huigen，D.J.，Stam，P，和Jacobsen，E.(1998)AutotetraploidsandgeneticmappingusingcommonAFLPmarkerstheR2alleleconferringresistancetoPhytophthorainfestansmappedonpotatochromosome4.TheoreticalandAppliedGenetics96(8)1121-1128中；對於R3、R6、R7在Elkharbotly，A，Palominosanchez，C，Salamini，F，Jacobsen，E.，和Gebhardt，C.(1996)R6andR7allelesofpotatoconferringrace-specificresistancetoPhytophthorainfestans(Mont)deBaryidentifiedgeneticlociclusteringwiththeR3locusonchromosomeXi.TheoreticalandApplied.Genetics92(7)880-884中；對於Ph-1在Bonde和Murphy(1952)MainAgric.Exp.Stn.Bull.No497；或對於Ph-2在Moreau，P，Thoquet，P.，Olivier，J，Laterrot，H，和Grimsley，N.H.(1998)GeneticmappingofPh-2，asinglelocuscontrollingpartialresistancetoPhytophthorainfestansintomato.MolecularPlantMicrobeInteractions11(4)259-269中；和/或對於Ph-3在Chunwongse，J，Chunwongse，C.，Black，L.，和Hanson，P.(2002)MolecularmappingofthePh-3geneforlateblightresistanceintomato.JournalofHorticulturalScienceBiotechnology77(3)281-286中；或者賦予病原體抗性的多肽，優選從所述出版物可以推導的賦予致病疫黴抗性的多肽；b)核酸分子，其核苷酸序列是(a)的核苷酸序列由於遺傳密碼簡併導致的序列；c)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽的胺基酸序列的一個或幾個胺基酸的替代、缺失和/或加入從(a)或(b)的多核苷酸編碼的多肽衍生；d)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)的核酸分子編碼的多肽的胺基酸序列具有70％或以上的同一性；e)核酸分子，其包含(a)到(d)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的部分；f)核酸分子，其編碼(a)到(e)任一項編碼的多肽的以胺基酸1、30、50、100、200、300、500或1000開始並以胺基酸1276、1000、500、300、200、50、30、或1結束的片段；g)包含(a)或(b)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；h)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(f)任一項的核酸分子編碼的多肽產生的單克隆抗體識別；i)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(h)任一項的核酸分子或者其至少20個，優選30或更多核苷酸的片段的序列的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和j)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(i)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到(j)任一項的互補鏈。因此，本發明的方法賦予本發明的所述植物之一、植物組織或者植物細胞對卵菌門植物病原體的抗性，優選對腐黴目(Pythiales)或者Peronosperales，更優選對腐黴科或者霜黴科(Peronosporaceae)，更優選對疫黴屬(Phytophthora)或者盤梗黴屬(Bremia)或者霜黴屬(Peronospera)或者單軸黴屬(Plasmopara)病原體的抗性，最優選地，其中病原體為寄生疫黴菸草致病變種(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)(導致菸草黑柄等)、大豆疫黴(Phytophthorasojae)(導致大豆中疫黴根部腐爛)、辣椒疫黴(Phytophthoracapsici)(導致胡椒、葫蘆和番茄中腐爛)、紅腐疫黴(Phytophthoraerythroseptica)(導致馬鈴薯中粉紅色腐爛)、葡萄生單軸黴(Plasmoparaviticola)(導致葡萄藤霜黴病)、萵苣盤梗黴(Bremialactuca)(導致萵苣中霜黴病)或者Peronosporatabaci(導致菸草中藍色黴)的物種。通過本領域技術人員公知和例如，在Sambrook等人，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NY，1989中描述的方法可以在根據本發明的植物、植物細胞、植物組織、植物器官或植物部分中增加、產生或者刺激Rpi-blb2的活性。從而，在優選實施方案中，本發明涉及本發明的方法，其中表達是重新表達。術語細胞、組織或者生物或者其部分中的「重新表達」在本文理解為涉及基因產物的表達，而以前所述基因產物或者所述基因產物的活性，尤其相應多肽或者多核苷酸在細胞、組織、或者生物或者其部分中是不可檢測的。優選地，編碼細胞、組織、或者生物或者其部分中的多肽或者多核苷酸並且應該重新表達的基因不存在於細胞、組織、或者生物或者其部分中的基因組中。如果在細胞、組織、或者生物或者其部分中不能檢測到基因產物的表達，那麼通常認為在細胞、組織、或者生物或者其部分中沒有發生表達。因此，如果不能檢測到活性，那麼通常認為沒有相應活性存在。然而，本領域技術人員已知檢測方法和手段發展到更高靈敏性。從而，在優選實施方案中，術語「重新表達」涉及系統中新的和額外的表達，其中例如由於低水平表達或者表達幾乎無活性的基因產物而活性水平太低以致不能賦予對植物病原體，尤其對致病疫黴的抗性。敲除株系和低和/和高表達株系表型的比較可以表明是否可以觀察到針對本文提到的病原體的抗性中的差異。因此，在本發明的另一實施方案中，Rpi-blb2和/或另一種抗性蛋白質的內源活性增加了。通過本領域技術人員已知的方法可以增加細胞中表達水平。本文描述了幾種技術，例如，本發明的多核苷酸或者多肽的轉基因表達。多核苷酸或者多肽可以是外源來源。優選地，導入與宿主細胞、植物細胞、植物組織或者植物相同遺傳起源的多核苷酸。通過一些方法可以增加活性，尤其內源活性，還增加轉基因表達的Rpi-blb2的活性。因此，在優選實施方案中，通過一個或多個下面的步驟增加本文描述的抗性蛋白質的活性a)穩定抗性蛋白質；b)穩定編碼抗性蛋白質的mRNA；c)增加抗性蛋白質的比活；d)表達用於抗性表達的同源或者人工轉錄因子或者增加用於抗性表達的同源或者人工轉錄因子的表達；e)通過外源誘導因子刺激抗性蛋白質活性；f)表達轉基因抗性基因；和/或g)增加抗性編碼基因的拷貝數。通常，通過增加生物中特定蛋白質，即抗性蛋白質的量可以增加所述生物，尤其植物細胞、植物、或者植物組織中的活性。「蛋白質的量」理解為生物、組織、細胞或者細胞隔室中多肽，優選Rpi-blb2的量。蛋白質的量的「增加」指在相同條件下(例如，培養條件、植物年齡等等)，與沒有應用該方法的相同屬和種的野生型相比，生物、組織、細胞或者細胞隔室中蛋白質的量的數量增加(例如，通過下文描述的方法之一)。所述增加達到至少10％，優選至少20％或至少50％，尤其優選至少70％或90％，非常特別優選至少100％，最優選至少200％或以上。活性的「增加」理解為指在相同條件下(例如，培養條件、植物年齡等等)，與沒有應用該方法的相同屬和種的野生型相比，生物、組織、細胞或者細胞隔室中蛋白質的總活性的增加。所述增加達到至少10％，優選至少20％或至少50％，尤其優選至少70％或90％，非常特別優選至少100％，最優選至少200％或以上。在該上下文中，與當增加SEQIDNO2或4中所示Rpi-blb2蛋白質之一所得值相比，病原體抗性的功效可以向下或者向上偏離。優選的功能等價物為其中病原體抗性功效(例如，通過病原體的穿透功效或者如本文描述的測量)與通過減去如SEQIDNO2或4中所示Rpi-blb2蛋白質所得的比較值相差不超過50％，優選不超過25％，尤其優選不超過10％的功能等價物。特別優選的是那些序列，其中基於減去如SEQIDNO2或4中所示Rpi-blb2蛋白質之一所得的比較值，所述增加將病原體抗性的功效定量增加50％以上，優選100％，尤其優選500％，非常特別優選1000％。優選在類似條件下進行比較。「類似條件」指所有條件，如培養或生長條件、測定條件(如緩衝液、溫度、底物、病原體濃度等等)在待比較的實驗間保持相同並且設置僅在待比較的Rpi-blb2多肽的序列、它們的生物來源，如果適宜，和病原體方面不同。當選擇病原體時，每個比較需要所選的病原體最相似於其他等價物，考慮物種專一性。由於增加的Rpi-blb2活性，植物或者其部分的抗性增加了。在優選實施方案中，本發明的方法導致與野生型相比，用致病疫黴感染後孢子形成指數減小至少30％，更優選減小50％，甚至更優選為70％，甚至更優選大於80％，最優選為85％和90％。最優選為95％或以上。因此，本發明還涉及如上定義的編碼Rpi-blb2蛋白質的本發明的所述多核苷酸，其包含核酸分子，所述核酸分子選自a)編碼SEQIDNO2或者4中描述的多肽的至少成熟形式的核酸分子；b)核酸分子，其包含如SEQIDNO1或3或5或6中描繪的編碼序列編碼所述多肽的至少成熟形式；c)核酸分子，其核苷酸序列由(a)或者(b)的核苷酸序列的遺傳密碼簡併產生；d)核酸分子，其編碼的多肽通過從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽的胺基酸序列的一個或幾個胺基酸的替代、缺失和/或加入從(a)到(c)的多核苷酸編碼的多肽衍生；e)核酸分子，其編碼的多肽的序列與(a)或(b)的核酸分子編碼的多肽的胺基酸序列具有70％或以上的同一性；f)核酸分子，其包含(a)到(e)任一項的核酸分子編碼的多肽的片段或者具有表位的部分；g)核酸分子，其包含的多核苷酸具有用表3b中所列引物，尤其ARF1F和ARF1R從核酸文庫擴增的核酸分子的序列；h)核酸分子，其編碼(a)到(g)任一項編碼的多肽的以胺基酸1、30、50、100、200、300、500或1000開始並以胺基酸1267、1000、500、300、200、50、30、或1結束的片段；i)包含(a)或(d)任一項的多核苷酸的至少20個核苷酸的核酸分子；j)核酸分子，其編碼的多肽被針對(a)到(h)任一項的核酸分子編碼的多肽產生的單克隆抗體識別；k)核酸分子，其可以通過用具有(a)到(j)任一項的核酸分子或者其至少15個，優選30、60、90或更多個核苷酸的片段的序列的探針在嚴格條件下篩選適宜文庫得到；和l)核酸分子，其互補鏈在嚴格條件下與(a)或(k)任一項的核酸分子雜交；或者(a)到(l)任一項的互補鏈；或者編碼Solanumbulbocastanum的6號染色體或連鎖群6的區段編碼的多肽，所述區段與選自表3a或3b的標記共分離，並且所述多肽介導對植物病原體，尤其選自卵菌門病原體的抗性。在一個實施方案中，本發明多核苷酸不由Seq.IDNO.7和/或9中描述的序列組成和/或不由編碼Seq.IDNO.8和/或10中描述的蛋白質的核酸分子的序列組成。在一個實施方案中，本發明的多核苷酸不由Mil.1或者Mil.2的核酸分子的序列組成和/或不由編碼Mil.1或者Mil.2蛋白質的核酸分子組成。從而，在一個實施方案中，本發明的多核苷酸不由Rossi等人1998，PNASUSA959750-9754，Milligan等人，1998.PlantCell101307-1319；和/或WO9806750中所示的序列組成。在另一實施方案中，本發明的多核苷酸來自或者分離自生物的基因組，所述生物選自根據SystemaNaturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科(Menyanthaceae)、茄科、厚殼樹科(Sclerophylacaceae)、核果茄科(Duckeodendraceae)Goetzeaceae、旋花科(Convolvulaceae)、菟絲子科(Cuscutaceae)、花荵科(Polemoniaceae)和田基麻科(Hydrophyllaceae)構成的組或者具有其來源，更優選選自由根據SystemaNaturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的顛茄屬(Atropa)、Browallia、番茉莉屬(Brunfelsia)、辣椒屬(Capsicum)、夜香樹屬(Cestrum)、Cyphomandra、曼陀羅屬(Datura)、Fabiana、Frariciscea、天仙子屬(Hyoscyamus)、枸杞屬(Lycium)、茄參屬(Mandragora)、假酸漿屬(Nicandra)、菸草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、酸漿屬(Physalis)、Schizanthus和茄屬(Solanum)構成的組或者具有其來源，甚至更優選地選擇茄科，優選S.bulbocastanum、馬鈴薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum)、矮牽牛、樹番茄(S.betaceum)、pearmelon(S.muricatum)和茄子(S.melongena)。甚至更優選地，將番茄或者馬鈴薯或者S.bulbocastanum作為本發明多核苷酸來源。最優選地，將S.bulbocastanum作為來源。已經從來自ABPT的馬鈴薯材料分離Rpi-blb2。從而，從分類學觀點，所描述的Rpi-blb2也是馬鈴薯來源的。然而，所述基因存在於可能來自S.bulbocastanum的漸滲片段上。許多馬鈴薯變種含有相關茄屬的漸滲片段，但是仍然是馬鈴薯。因此，根據分類學系統，馬鈴薯也可以是本發明的多核苷酸的來源，尤其ABPT來源的馬鈴薯，以及以類似方式衍生的其他茄屬變種的其他變種。因此，在另一實施方案中，本發明的多核苷酸來自馬鈴薯。使用標準分子生物學技術和本文提供的序列信息可以分離本發明的多核苷酸，例如，具有SeqIDNO1或3或5或6的核苷酸序列或者其部分的核酸分子。例如，使用本發明多核苷酸的序列之一的所有或者部分作為雜交探針和標準雜交技術(例如，Sambrook等人，MolecularCloningALaboratoryManual.第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989中描述)可以從文庫分離Rpi-blb2cDNA。此外，通過聚合酶鏈反應，使用基於該序列(例如，包含本發明的多核苷酸序列之一的所有或部分的核酸分子)設計的寡核苷酸引物可以分離包含本發明的多核苷酸序列之一的所有或部分的多核苷酸。例如，可以從例如，S.bulbocastanum或者另一種植物分離mRNA(例如，通過Chirgwin等人(1979)Biochemistry185294-5299的硫氰酸胍提取方法)，並且使用逆轉錄酶(例如，MoloneyMLV逆轉錄酶，可以從Gibco/BRL，Bethesda，MD得到，或者AMV逆轉錄酶，可以從SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，FL得到)可以製備cDNA。基於SEQIDNo1或3或5或6中所示核苷酸序列之一可以設計用於聚合酶鏈反應擴增的合成的寡核苷酸引物。使用cDNA，備選地，使用基因組DNA作為模板和適宜的寡核苷酸引物，根據標準PCR擴增技術可以擴增本發明的多核苷酸。可以將如此擴增的多核苷酸克隆到適宜的載體中並通過DNA序列分析鑑定。此外，通過標準合成技術，例如，使用自動化DNA合成儀可以製備相應於Rpi-blb2核苷酸的寡核苷酸。在本發明的一個實施方案中，由Solanumbulbocastanum或者馬鈴薯的6號染色體或者連鎖群6的區段編碼Rpi-blb2蛋白質。此外，本發明包含Solanumbulbocastanum或者馬鈴薯的6號染色體或者連鎖群6的區段。在本發明方法的一個優選實施方案中，所表達的Rpi-blb2蛋白質由多核苷酸編碼，其包含S.bulbocastanum的6號染色體或者連鎖群6的區段。優選地，所述區段還包含順式作用元件，例如，啟動子、增強子、結合位點等等，或者反式作用元件，像輔因子、激活劑或者其他抗性蛋白質，其賦予增加的抗性。在Seq.IDNO.5和6中描繪了包含Rpi-blb2基因和其他調節元件的基因組片段。本領域技術人員已知怎樣得到染色體區段，例如，通過將染色體片段克隆到BAC，如Song，2003，.PNAS100(16)，9128或者本文和所引用的參考文獻中描述。因此，在另一實施方案中，本發明的多核苷酸或者編碼Rpi-blb2蛋白質的多核苷酸與選自表3a的標記共分離或者包含所述標記的複製位點或雜交位點。如實施例中詳細描述的，用表3a或者3b中描繪的標記可以對致病疫黴抗性作圖。由於標記距離基因越近，品系，即子代克隆中所述基因與所述標記共分離的百分數越高。因此，在優選實施方案中，本發明的多核苷酸與標記E40M58、CT119和/或CT216共分離。在另一實施方案中，本發明涉及製備重組載體的方法，其包括將本發明的多核苷酸插入到載體中或者將所述多核苷酸和另一抗性蛋白質插入到載體中。因此，在另一實施方案中，本發明涉及含有本發明的多核苷酸或者所述多核苷酸和通過本發明的方法產生的另一抗性基因的載體。如本文所用的術語「載體」指能夠運輸其所連接的多核苷酸的核酸分子。一種類型的載體是「質粒」，其指環狀雙鏈DNA環，其中可以連接額外的DNA區段。另一種類型的載體是病毒載體，其中可用將額外的DNA或者RNA區段連接到病毒基因組中。某些載體(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)能夠在它們所導入的宿主細胞中自主複製。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)當引入宿主細胞中時整合到宿主細胞的基因組，從而隨著宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導它們有效連接的基因的表達。此類載體在本文中稱作「表達載體」。通常，重組DNA技術所用的表達載體通常是質粒形式的。在本說明書中，「質粒」和「載體」可以互換使用，因為質粒是載體的最常用的形式。然而，本發明意在包括其他形式的表達載體，如病毒載體(例如，複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，它們起等價功能。本發明還涉及通常用於基因工程的粘粒、病毒、噬菌粒和其他載體，它們含有根據本發明的核酸分子。本領域技術人員熟知的方法可以用於構建多種質粒和載體；見，例如，Sambrook，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y.和Ausubel，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.(1989)中描述的技術。備選地，可以將本發明的核酸分子和載體重構到脂質體中用以遞送到靶細胞。在另一實施方案中，本發明的載體或者本發明的方法的特徵在於編碼Rpi-blb2蛋白質的多核苷酸或者另一抗性蛋白質有效連接表達控制序列和/或連接編碼轉基因表達調節信號的核酸序列，所述調節信號允許在原核或者真核宿主細胞中表達。在優選實施方案中，本發明涉及本發明的載體或者本發明的方法，其中編碼Rpi-blb2蛋白質和/或另一抗性蛋白質的多核苷酸有效連接與所述編碼Rpi-blb2蛋白質和/或另一抗性蛋白質的多核苷酸具有相同物種來源的表達控制序列。對於根據本發明的核酸分子在細胞中表達的情況，原則上可能如此修飾編碼序列使得蛋白質位於植物細胞的任意希望的隔室中。這些隔室包括細胞核、內質網、液泡、線粒體、質體樣造粉體、葉綠體、色質體、質外體、細胞質、細胞外空間、油體、過氧化物酶體和植物細胞的其他隔室(綜述見，Kermode，Crit.Rev.PlantSci.15，4(1996)，285-423和其中引用的參考文獻)。然後多核苷酸可以有效融合適宜的多核苷酸(例如，載體)，其編碼用於轉運到所希望的隔室的信號。本發明的另一優選實施方案涉及載體，其中本發明的多核苷酸有效連接表達控制序列，其允許在原核或真核宿主細胞中表達。此類控制序列的性質取決於宿主生物而不同。在原核生物中，控制序列通常包括啟動子、核糖體結合位點和終止子。在真核生物中，一般的控制序列包括啟動子、終止子和在一些情況中，包括增強子、反式作用子或者轉錄因子。術語「控制序列」意在至少包括表達必需的組分，並且可以還包括額外的有益組分。術語「有效連接」指並列，其中所描述的組分處於允許它們以它們的所希望的方式發揮功能的關係中。「有效連接」編碼序列的控制序列以如此方式連接使得在與控制序列相容的條件下實現編碼序列的表達。對於控制序列是啟動子的情況，對於技術人員顯然的是使用雙鏈核酸。有效連接將理解為指例如，啟動子與待表達的核酸序列和如果適宜，其他調節元件，如終止子以如此方式順序排列使得當核酸序列重組表達時，每個調節元件都可以實現其功能，這取決於核酸序列關於有義或者反義RNA的排列。為此，不一定需要化學意義上的直接鍵合。遺傳控制序列，如增強子序列在距離他DNA分子遙遠的位置上也可以對靶序列發揮它們的功能。優選排列為其中待重組表達的核酸序列位於作為啟動子的序列之後，從而兩個序列相互共價連接。啟動子序列和待重組表達的核酸序列之間的距離優選小於200個鹼基對，特別優選小於100個鹼基對，非常特別優選小於50個鹼基對。通過例如在ManiatisT，FritschEF和SambrookJ(1989)MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY)，SilhavyTJ，BermanML和EnquistLW(1984)ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor(NY)，AusubelFM等人(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience和Gelvin等人(1990)PlantMolecularBiologyManual中描述的常規重組和克隆技術可以產生有效連接和表達盒。然而，作為具有限制酶的特異切割位點的接頭，或者作為信號肽的其他序列也可以位於兩個序列之間。序列的插入也可以導致融合蛋白質的表達。優選地，由啟動子和待表達的核酸序列連接組成的表達盒可以以載體整合的形式存在並且可以例如通過轉化插入到植物基因組中。此類調節序列描述於例如，GoeddelGeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)或參見Gruber和Crosby，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，CRCPress，BocaRaton，Florida，編者Glick和Thomson，第7章，89-108，包括其中的參考文獻。調節序列包括指導核苷酸序列在許多類型宿主細胞中表達的那些序列和指導核苷酸序列僅在某些宿主細胞或者在某些條件下表達的那些序列。本領域技術人員將理解表達載體的設計可以取決於諸如待轉化的宿主細胞的選擇、所希望的蛋白質的表達水平等因素。可以將本發明的表達載體導入宿主細胞，從而產生本文描述的多核苷酸編碼的蛋白質或肽，包括融合蛋白質或者肽。可以設計本發明的重組表達載體用於所述抗性蛋白質，優選Rpi-blb2在原核或真核細胞中的表達。例如，編碼本發明的多核苷酸的基因可以在細菌細胞(如大腸桿菌(E.coli)、百合棒桿菌(C.glutamicum)、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens))、昆蟲細胞(使用杆狀病毒表達載體)、酵母和其他真菌細胞(見Romanos，(1992)，Yeast8423-488；vandenHondel，(1991)J.W.BennetL.L.Lasure，編者，396-428頁AcademicPressSanDiego；和vandenHondel，(1991)AppliedMolecularGeneticsofFungi，Peberdy，編者，1-28頁，CambridgeUniversityPressCambridge))、藻類(Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology.1，3239-251)和多細胞植物細胞(見Schmidt，R.(1988)，PlantCellRep.583-586)；PlantMolecularBiologyandBiotechnology，CPress，BocaRaton，Florida，6/7章，S.71-119(1993)；F.F.White，B.Jenes等人，TechniquesforGeneTransfer，TransgenicPlants，卷1，EngineeringandUtilization，編者Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)，205-225(和其中引用的參考文獻)或者哺乳動物細胞中表達。適宜的宿主細胞在Goeddel，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)中進一步討論。備選地，可以在體外轉錄和翻譯重組表達載體，例如，使用T7啟動子調節序列和T7聚合酶。通常用載體實施蛋白質在原核生物中的表達，所述載體含有指導融合或者非融合蛋白質表達的組成型或者可誘導的啟動子。融合載體向其中編碼的蛋白質加入許多胺基酸，通常加在重組蛋白質的氨基末端，但是也加在C-末端或者與所述蛋白質的適宜區域融合。此類融合載體通常起三種目的1)增加重組蛋白質的表達；2)增加重組蛋白質的溶解性；和3)通過作為親和純化中的配體幫助純化重組蛋白質。此外，融合載體可以還編碼額外的蛋白質，其表達支持Rpi-blb2活性的增加或者針對植物病原體的植物抗性的增加，例如，所述額外的蛋白質為其他抗性蛋白質。通常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋白質的接點引入蛋白酶剪切位點以便使得可以在純化融合蛋白質後分離重組蛋白質與所述融合部分。此類酶和它們的同族識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith，D.B.andJohnson，K.S.(1988)Gene6731-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。適宜的可誘導的非融合大腸桿菌表達載體的實例包括pTrc(Amann(1988)Gene69301-315)和pET11d(Studier等人，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)60-89。最大化重組蛋白質表達的一種策略是在蛋白酶剪切所述重組蛋白質的能力受損的宿主細菌中表達所述蛋白質(Gottesman，S，GeneExpressionTechnologyMethodsinEnzymology185，AcademicPress，SanDiego，California(1990)119-128)。另一種策略是改變待插入到表達載體中的核酸的核酸序列從而每個胺基酸的各個密碼子是選擇用於表達的細菌(如大腸桿菌或者百合棒桿菌)中優先使用的密碼子(Wada等人(1992)NucleicAcidsRes.202111-2118)。可以通過標準DNA合成技術實施本發明的核酸序列的此類改變。此外，載體可以是酵母表達載體。用於在酵母釀酒酵母(S.cerivisae)中表達的載體的實例包括pYepSec1(Baldari，等人，(1987)EmboJ.6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30933-943)、pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene54113-123)和pYES2(InvitrogenCorporation，SanDiego，CA)。優選地，本發明或者本文描述的多核苷酸有效連接植物表達控制序列，例如表達盒。植物表達盒優選含有能夠驅動植物細胞中基因表達的調節序列，並且所述調節序列有效連接從而每個序列都可以完成其功能，如轉錄終止，如多腺苷酸化信號。優選的多腺苷酸化信號為來自根癌農桿菌t-DNA的多腺苷酸化信號，如已知為Ti質粒pTiACH5的章魚鹼合酶的基因3(Gielen等人，EMBOJ.3(1984)，835ff)或者其功能等價物，在植物中具有功能活性的所有其他終止子也是適宜的。植物基因表達通常不限於轉錄水平，因為植物表達盒優選含有其他有效連接的序列，像翻譯增強子，如含有來自菸草花葉病毒的5』-未翻譯的前導序列的超驅動序列，其增強蛋白質/RNA比率(Gallie等人，1987，Nucl.AcidsResearch158693-8711)。因此，本文描述的多核苷酸可以有效連接適宜的啟動子，其賦予適時、細胞或組織特異的方式的基因表達。優選為驅動組成型表達的啟動子(Benfey等人，EMBOJ.8(1989)2195-2202)，像來自植物病毒如35SCAMV(Franck等人，Cell21(1980)285-294)、19SCaMV(s也見US5352605和WO8402913)的啟動子，或者植物啟動子，像US4962028中描述的來自Rubisco小亞基的啟動子。術語「植物特異啟動子」理解為指原則上能夠控制基因，尤其外來基因在植物、或植物部分、植物細胞、植物組織或者植物培養物中表達的啟動子。在該上下文中，表達可以為例如，組成型的、可誘導的或者依賴發育的。優選下面的啟動子a)組成型啟動子優選的載體為使得可以在植物中組成型表達的那些載體(Benfey等人(1989)EMBOJ82195-2202)。「組成型」啟動子理解為指在植物發育的重要時期內，優選植物發育的所有階段，確保在許多，優選所有組織中表達的那些啟動子。具體地，優選使用植物啟動子或者來自植物病毒的啟動子。尤其優選CaMV花椰菜花葉病毒35S轉錄物的啟動子(Franck等人(1980)Cell21285-294；Odell等人(1985)Nature313810-812；Shewmaker等人(1985)Virology140281-288；Gardner等人(1986)PlantMolBiol6221-228)或者19SCaMV啟動子(US5,352,605；WO84/02913；Benfey等人(1989)EMBOJ82195-2202)。另一適宜的組成型啟動子是「Rubisco小亞基(SSU)」啟動子(US4,962,028)、豆球蛋白B啟動子(GenBank檢索號X03677)、農桿菌胭脂氨酸合成酶啟動子、TR二元啟動子、農桿菌OCS(章魚鹼合成酶)啟動子、泛蛋白啟動子(HoltorfS等人(1995)PlantMolBiol29637-649)、泛蛋白1啟動子(Christensen等人(1992)PlantMolBiol18675-689；Bruce等人(1989)ProcNatlAcadSciUSA869692-9696)、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(US5,683,439)、液泡ATP酶亞基的啟動子或者來自小麥的富含脯氨酸蛋白質的啟動子(WO91/13991)，和基因的其他啟動子，其中所述基因在植物中的組成型表達是技術人員已知的。b)組織特異性啟動子還優選對花葯、子房、花、葉、莖幹、根和種子具有特異性的啟動子。種子特異啟動子例如，菜豆蛋白啟動子(US5,504,200；BustosMM等人(1989)PlantCell1(9)839-53)、2S白蛋白基因啟動子(JoseffsonLG等人(1987)JBiolChem26212196-12201)、豆球蛋白啟動子(ShirsatA等人(1989)MolGenGenet215(2)326-331)、USP(未知的種子蛋白質)啟動子(BumleinH等人(1991)MolGenGenet225(3)459-67)、油菜籽蛋白基因啟動子(US5,608,152；StalbergK等人(1996)LPlanta199515-519)、蔗糖結合蛋白質啟動子(WO00/26388)或者豆球蛋白B4啟動子(LeB4；BumleinH等人(1991)MolGenGenet225121-128；Baeumlein等人(1992)PlantJournal2(2)233-9；FiedlerU等人(1995)Biotechnology(NY)13(10)1090f)、擬南芥油質蛋白啟動子(WO98/45461)、芸苔(Brassica)Bce4啟動子(WO91/13980)。其他適宜的種子特異啟動子為編碼高分子量麥谷蛋白(HMWG)、麥醇溶蛋白、分枝酶、ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)或者澱粉合酶的基因的啟動子。還優選允許在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等中種子特異表達的啟動子。可以有利地使用下面的Ipt2或者Ipt1基因的啟動子(WO95/15389、WO95/23230)或者WO99/16890中描述的啟動子(大麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麥醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、kasirin基因或者裸麥醇溶蛋白基因的啟動子)。塊莖-、貯藏根-、或者根-特異啟動子，如I類patatin啟動子(B33)、馬鈴薯組織蛋白酶D抑制劑啟動子。葉特異啟動子如馬鈴薯胞質溶膠FBPase啟動子(WO97/05900)、馬鈴薯的Rubisco(核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶)SSU(小亞基)啟動子或者ST-LSI啟動子(Stockhaus等人(1989)EMBOJ82445-2451)。非常特別優選的是表皮特異啟動子，如OXLP基因(草酸氧化酶樣蛋白質)啟動子(Wei等人(1998)PlantMol.Biol.36101-112)。花特異啟動子例如，八氫番茄紅素合酶啟動子(WO92/16635)或者P-rr基因的啟動子(WO98/22593)。花葯特異啟動子如5126啟動子(US5,689,049、US5,689,051)、glob-I啟動子和γ-玉米醇溶蛋白啟動子。c)化學可誘導的啟動子表達盒還可以包含化學可誘導的啟動子(綜述文章Gatz等人(1997)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolBiol4889-108)，通過所述啟動子可以控制植物中的外源基因在特定時間點表達。同樣可以使用諸如，PRP1啟動子(Ward等人(1993)PlantMolBiol22361-366)、水楊酸可誘導的啟動子(WO95/19443)、苯磺醯胺可誘導的啟動子(EP0388186)、四環素可誘導的啟動子(Gatz等人(1992)PlantJ2397-404)、脫落酸可誘導的啟動子(EP0335528)或者乙醇或者環己酮可誘導的啟動子(WO93/21334)的啟動子。d)脅迫-或者病原體可誘導的啟動子其他優選的啟動子為通過有生命或者無生命的脅迫可以誘導的啟動子，如PRP1基因的病原體可誘導的啟動子(Ward等人(1993)PlantMolBiol22361-366)、番茄高溫可誘導的hsp70或者hsp80啟動子(US5,187,267)、馬鈴薯低溫可誘導的α-澱粉酶啟動子(WO96/12814)、光可誘導的PPDK啟動子，或者創傷可誘導的pinII啟動子(EP375091)。病原體可誘導的啟動子包括由於病原體感染誘導的基因的啟動子，所述基因為例如，PR蛋白質、SAR蛋白質、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶等的基因(例如，Redolfi等人(1983)NethJPlantPathol89245-254；Uknes，等人(1992)ThePlantCell4645-656；VanLoon(1985)PlantMolVirol4111-116；Marineau等人(1987)PlantMolBiol9335-342；Matton等人(1987)MolecularPlant-MicrobeInteractions2325-342；Somssich等人(1986)ProcNatlAcadSciUSA832427-2430；Somssich等人(1988)MolGenGenetics293-98；Chen等人(1996)PlantJ10955-966；Zhang和Sing(1994)ProcNatlAcadSciUSA912507-2511；Warner等人(1993)PlantJ3191-201；Siebertz等人(1989)PlantCell1961-968(1989)。還包括創傷可誘導的啟動子，如pinII基因的啟動子(Ryan(1990)AnnRevPhytopath28425-449；Duan等人(1996)NatBiotech14494-498)、wun1和wun2基因的啟動子(US5,428,148)、win1和win2基因的啟動子(Stanford等人(1989)MolGenGenet215200-208)、系統素的啟動子(McGurl等人(1992)Science2251570-1573)、WIP1基因的啟動子(Rohmeier等人(1993)PlantMolBiol22783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBSLetters32373-76)、MPI基因的啟動子(Corderok等人(1994)ThePlantJ6(2)141-150)等等。e)發育依賴性啟動子其他適宜的啟動子為例如，果實成熟特異啟動子，如番茄果實成熟特異啟動子(WO94/21794、EP409625)。發育依賴性啟動子部分包括組織特異啟動子，因為個體組織本質上以發育依賴性方式發育。本發明的多肽僅在本文提到的病原體感染或者穿透的組織中具有活性或者具有增加的活性是有利的。特別優選組成型啟動子和葉和/或莖幹-特異的、病原體可誘導和表皮特異的啟動子，最優選病原體可誘導的和表皮特異的啟動子。還優選天然啟動子，其例如包含在Seq.IDNO.5和6中描繪的基因組片段中。此外，其他啟動子可以有效連接待表達的核酸序列，所述啟動子使得可能在其他植物組織或者其他生物，例如，大腸桿菌細菌中表達。適宜的植物啟動子原則上為所有上述啟動子。術語「遺傳控制序列」在廣義上理解並且指對根據本發明的表達盒的實體化或者功能具有影響的所有那些序列。例如，遺傳控制序列修飾原核或者真核生物中轉錄和翻譯。優選地，根據本發明的表達盒包含待重組表達的所述核酸序列的5』上遊的對胚表皮和/或花具有特異性的啟動子，和3』下遊終止子序列作為額外的遺傳控制序列和，如果適宜，其他常規調節元件，在每種情況中，它們都有效連接待重組表達的核酸序列。遺傳控制序列還包含其他啟動子、啟動子元件、或者最小啟動子，它們都可以修飾表達控制性質。從而，例如，由於遺傳控制序列，組織特異表達還可以額外地依賴於某些應激子。已經關於例如，水脅迫、脫落酸(LamE和ChuaNH，JBiolChem1991；266(26)17131-17135)和熱脅迫(SchofflF等人，MolecularGeneralGenetics217(2-3)246-53，1989)描述了此類元件。其他有利的控制序列為例如，革蘭氏陽性啟動子amy和SPO2，酵母或者真菌啟動子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH。原則上，它們的調節序列像上述調節序列的所有天然啟動子都可以用於根據本發明的方法。此外，也可以有利地使用合成啟動子。遺傳控制序列還包括基因的5』非翻譯區、內含子和非編碼3』區，如肌動蛋白-1內含子或者Adh1-S內含子1、2和6(一般參考TheMaizeHandbook，第116章，Freeling和Walbot，編著，Springer，NewYork(1994))。已經闡明它們在基因表達的調節中起重要作用。從而，已經闡明5』非翻譯序列可以增強異源基因的瞬時表達。可以提及的翻譯增強子的實例為菸草花葉病毒5』前導序列(Gallie等人(1987)NuclAcidsRes158693-8711)等等。此外，它們可以促進組織特異性(RousterJ等人(1998)PlantJ15435-440)。表達盒可以有利地包含一個或多個所稱作的增強子序列，其有效連接啟動子，使得核酸序列的增強的重組表達成為可能。額外有利的序列，如其他調節序列或者終止子也可以插入待重組表達的核酸序列的3』末端。基因構建體中可以存在待重組表達的核酸序列的一個或多個拷貝。在一個實施方案中，使用SeqIDNo.5和/或6中描繪的基因組片段中包含的天然終止子序列。適宜作為控制序列的多腺苷酸化信號為植物多腺苷酸化信號，優選基本上相應於來自根癌農桿菌的T-DNA多腺苷酸化信號的多腺苷酸化信號，尤其Ti質粒pTiACHS(Gielen等人(1984)EMBOJ3835etseq.)的T-DNA(章魚鹼合酶)3』的基因或者其功能等價物。特別適宜的終止子序列的實例是OCS(章魚鹼)終止子和NOS(胭脂鹼合酶)終止子。控制序列還進一步被理解為使得可以同源重組或者插入到宿主生物的基因組或者允許從基因組除去的控制序列。對於同源重組，例如，具體基因的天然啟動子可以與對胚表皮和/或花具有特異性的啟動子交換。諸如cre/lox技術的方法允許組織特異性，如果適宜可誘導地從宿主生物的基因組除去表達盒(SauerB(1998)Methods.14(4)381-92)。在該方法中，特定側翼序列(lox序列)附著到靶基因，所述側翼序列以後允許通過cre重組酶除去。表達盒和從其衍生的載體可以包含其他功能元件。術語功能元件將在廣義上理解並且指對根據本發明的表達盒、載體或者轉基因生物的產生、擴增或功能具有影響的所有那些元件。作為實例但不作為限制，可以提及下面的a)選擇標記，其賦予對代謝抑制劑，諸如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(WO98/45456)、抗生素或者殺生物劑，優選除草劑，如卡那黴素、G418、博來黴素或者潮黴素，或者膦絲菌素等等的抗性。特別優選的選擇標記是賦予除草劑抗性的那些選擇標記。可以提及的實例為編碼膦絲菌素乙醯基轉移酶(PAT)和失活穀氨醯胺合酶抑制劑(bar和pat基因)的DNA序列；5-烯醇-丙酮酸基莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSN合酶基因)，其賦予對草苷膦(N-(膦醯基甲基)甘氨酸)的抗性；gox基因，其編碼草苷膦降解酶(草苷膦氧化還原酶)；deh基因(編碼失活茅草枯的脫滷素酶)；失活磺醯脲和咪唑啉酮的乳酸乙醯合酶；和bxn基因，其編碼降解溴草腈的腈水解酶；aasa基因，其賦予對抗生素apectinomycin的抗性；鏈黴素磷酸轉移酶(SPT)基因，其允許對鏈黴素的抗性；新黴素磷酸轉移酶(NPTII)基因，其賦予對卡那黴素或者geneticidin的抗性；潮黴素磷酸轉移酶(HPT)基因，其介導對潮黴素的抗性；乙醯乳酸合酶基因(ALS)，其賦予對磺醯脲除草劑的抗性(例如，具有S4和/或Hra突變的突變ALS變體)。b)報導基因，其編碼容易定量的蛋白質和，通過它們的顏色或者酶活性，使得可能評估轉化功效、表達部位或者表達時間。在該上下文中非常特別優選的是編碼報導蛋白的基因(SchenbornE，GroskreutzD.MolBio-technol.1999；13(1)29-44)，所述報導蛋白為例如，綠色螢光蛋白(GFP)(Sheen等人(1995)PlantJournal8(5)777-784；Haseloff等人(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(6)2122-2127；Reichel等人(1996)ProcNatlAcadSciUSA93(12)5888-5893；Tian等人(1997)PlantCellRep16267-271；WO97/41228；ChuiWL等人(1996)CurrBiol6325-330；LeffelSM等人(1997)Biotechniques.23(5)912-8)、氯黴素轉移酶、螢光素酶(Ow等人(1986)Science234856-859；Millar等人(1992)PlantMolBiolRep10324-414)，和水母發光蛋白基因(Prasher等人(1985)BiochemBiophysResCommun126(3)1259-1268)、β-半乳糖苷酶R基因座基因(其編碼調節植物組織中產生花色素苷色素(紅色)的蛋白質從而使得可以直接分析啟動子活性而不加入額外的輔助物質或者顯色底物；Dellaporta等人ChromosomeStructureandFunctionImpactofNewConcepts，18thStadlerGeneticsSymposium，11263-282，1988)，特別優選β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人，EMBOJ.1987，6，3901-3907)。c)複製起點，其確保根據本發明的表達盒或者載體在例如大腸桿菌中的擴增。所提及的實例為ORI(DNA複製起點)、pBR322ori或者P15Aori(Sambrook等人MolecularCloning.ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)。d)農桿菌介導的植物轉化必需的元件，如T-DNA或者vir區的右邊界或者左邊界。為了選擇成功經歷同源重組的細胞，或者選擇經轉化的細胞，通常必須還導入選擇標記，其賦予已經成功經歷重組的細胞對殺生物劑(例如，除草劑)、代謝抑制劑(如2-脫氧葡萄糖-6-磷酸(WO98/45456))或者抗生素的抗性。選擇標記允許從未轉化的細胞選擇轉化的細胞(McCormick等人(1986)PlantCellReports581-84)。可以有利地使用包含表達盒的載體實現根據本發明的表達盒向生物或者其細胞、組織、器官、部分或者種子的導入(優選導入植物或植物細胞、組織、器官、部分或者種子中)。可以通過適宜的限制性切割位點將表達盒導入載體(例如，質粒)中。首先將所形成的質粒導入大腸桿菌中。選擇、生長正確轉化的大腸桿菌並通過技術人員熟悉的方法得到重組質粒。限制性分析和測序可以用於驗證克隆步驟。用於在特定植物部分中表達的其他啟動子為例如，來自油菜籽的油菜籽蛋白基因啟動子、來自蠶豆(Viciafaba)的USP啟動子(Baeumlein等人，MolGenGenet，1991，225(3)459-67)、來自擬南芥的油質蛋白啟動子(WO9845461)、來自菜豆(Phaseolusvulgaris)的菜豆蛋白啟動子(US5504200)，來自芸苔的Bce4-啟動子(WO9113980)或者豆球蛋白B4啟動子(LeB4；Baeumlein等人，1992，PlantJournal，2(2)233-9)以及在像玉米、大麥、小麥、黑麥、稻等的單子葉植物中賦予種子特異表達的啟動子。所提及的適宜啟動子為來自大麥的Ipt2或者Ipt1基因啟動子(WO9515389和WO9523230)或者在WO9916890中描繪的那些啟動子(來自大麥醇溶蛋白基因、稻穀蛋白基因、稻水稻素基因、稻醇溶蛋白基因、小麥醇溶蛋白基因、小麥谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥谷蛋白基因、高梁kasirin基因、黑麥黑麥醇溶蛋白基因的啟動子)。此外，可以將本發明的多核苷酸以反義方向克隆到表達載體中。即，DNA分子有效連接調節序列，所述連接的方式允許表達(通過DNA分子的轉錄)本發明的多核苷酸編碼的mRNA反義的RNA分子。可以選擇有效連接以反義方向克隆的核酸的調節序列，其指導所述反義RNA分子在多種細胞類型中連續表達，例如，可以選擇指導反義RNA的組成型、組織特異的或者細胞類型特異表達的病毒啟動子和/或增強子，或調節序列。反義表達載體可以為重組質粒、噬菌粒或者減毒病毒的形式，其中所產生的反義核酸分子處於高效率調節區的控制下，所述調節區的活性可以通過確定載體所導入的細胞類型確定。關於使用反義基因調節基因表達的討論，見Weintraub，H.等人，AntisenseRNAasamoleculartoolforgeneticanalysis，Reviews-TrendsinGenetics，Vol.1(1)1986和Mol等人，1990，FEBSLetters268427-430。在一個實施方案中，本發明涉及產生重組宿主細胞的方法，其包括向宿主細胞導入本發明的載體或者多核苷酸或者所述載體或所述多核苷酸和表達另一種抗性蛋白質的載體。可以通過常規轉化或轉染技術向原核或真核細胞導入載體DNA。本文所用的術語「轉化」和「轉染」、接合和轉導意在指多種本領域已知的將外源核酸(例如，DNA)導入宿主細胞的技術，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂轉染、天然感受態、化學介導的轉移，或者電穿孔。轉化或者轉染宿主細胞(包括植物細胞)的適宜的方法可以參見Sambrook，等人(MolecularCloningALaboratoryManual.第二版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)和其他實驗室手冊，如MethodsinMolecularBiology，1995，卷44，Agrobacteriumprotocols，編者Garland和Davey，HumanaPress，Totowa，NewJersey。為了穩定轉染真核細胞，已知取決於所用的表達載體和轉染技術，僅一小部分細胞可以將外來DNA整合到它們的基因組。為了鑑定和選擇這些整合體，通常將選擇性標記(例如，對抗生素的抗性)隨目的基因導入宿主細胞。優選的選擇性標記包括賦予對藥物(如G418、潮黴素和氨甲蝶呤)抗性的那些選擇性標記或者在植物中為賦予對除草劑如草苷膦或草銨膦的抗性的選擇性標記。可以將編碼選擇性標記的核酸導入宿主細胞中與編碼本發明多肽相同的載體上或者導入單獨的載體。用所導入的核酸穩定轉染的細胞可以通過例如，藥物選擇鑑定(例如，具有所摻入的選擇性標記基因的細胞將存活，而其他細胞死亡)。可以產生其他宿主細胞，其含有允許所導入的基因的受調節的表達的選擇系統。例如，將本發明的多核苷酸包括在載體中處於lac操縱子控制下允許僅在存在IPTC時表達該多核苷酸。此類調節系統是本領域公知的。優選地，所導入的核酸分子是宿主細胞外來的。「外來的」指核酸分子關於宿主細胞是異源的，這意味著來自具有不同基因組背景的細胞或者生物，或者所述核酸分子關於宿主細胞是同源的但是位於不同於所述核酸分子的天然發生的對應物的基因組環境中。這意味著，如果核酸分子關於所述宿主細胞是同源的，其不位於所述宿主細胞的基因組中的天然位置，尤其它被不同的基因包圍。在該情況中，核酸分子可以處於其自身啟動子控制下或者處於異源啟動子控制下。宿主細胞中存在的根據本發明的載體或者核酸可以整合到宿主細胞的基因組或者可以以某種形式保持在染色體外。在該方面，還理解本發明的核酸分子可以用於通過同源重組恢復或者產生突變基因(Paszkowski(編者)，HomologousRecombinationandGeneSilencinginPlants.KluwerAcademicPublishers(1994))。因此，在另一實施方案中，本發明涉及用本發明的多核苷酸或者本發明的載體，或者用所述載體或所述多核苷酸和用於表達另一種抗性蛋白質的載體或者多核苷酸基因工程化的宿主細胞。術語「宿主細胞」和「重組宿主細胞」在本文中互換使用。將理解此類術語不僅指具體受試者細胞，而且指此類細胞的後代或者潛在後代。因為由於某些突變或者環境影響，在連續世代中可以發生某些修飾，所以此類後代可能實際上不與親代細胞相同，但是仍然包括在本文所用的術語的範圍內。例如，可以將本發明的多核苷酸導入細菌細胞、昆蟲細胞、真菌細胞或者哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或者COS細胞)、藻類、纖毛蟲、植物細胞或者真菌中。適宜的宿主細胞是本領域技術人員已知的。優選大腸桿菌、杆狀病毒、農桿菌或者植物細胞。此外，還可以轉化宿主細胞從而(過)表達其他酶和蛋白質，所述表達支持植物對病原體抗性的增加。優選地，還表達另一抗性基因，優選還表達一種或多種抗性基因，優選本文提及的基因。最優選地是Rpi-blb2和Rpi-blb的共表達。進一步優選的是本文提及的植物之一，尤其上面提及的茄科植物之一的細胞，最優選馬鈴薯、番茄、矮牽牛、樹番茄、pearmelon或者茄子的細胞。在另一實施方案中，本發明涉及產生本發明的多肽，尤其具有Rpi-blb2活性的蛋白質的方法，其包括培養本發明的宿主細胞並從培養基或細胞回收所述多核苷酸編碼並且宿主細胞表達的所述多肽。術語「表達」指在細胞中產生蛋白質或者核苷酸序列。然而，所述術語還包括在無細胞體系中表達蛋白質。它包括從編碼產物的DNA轉錄成RNA產物，轉錄後修飾和/或翻譯成蛋白質產物或者多肽，以及可能的翻譯後修飾。取決於所用的特定構建體和條件，可用從細胞、培養基或者兩者回收蛋白質。對於本領域技術人員，公知不僅可以表達天然蛋白質，而且可以表達作為融合多肽的蛋白質或者加入指導蛋白質到達宿主細胞的特定隔室，例如，確保蛋白質分泌到培養基等等的信號肽。此外，此類蛋白質和其片段可以經化學合成和/或根據例如下文描述的標準方法修飾。本發明的宿主細胞，如培養中的原核或者真核宿主細胞可以用於產生(即表達)本發明的多核苷酸編碼的多肽，優選具有Rpi-blb2活性的多肽。此外，通過電穿孔或者農桿菌介導的基因轉移通過直接轉移DNA到正發育的花中也可以應用備選方法。因此，本發明還提供了使用本發明的宿主細胞產生Rpi-blb2的方法。在一個實施方案中，所述方法包括在適宜的培養基中培養本發明的宿主細胞從而產生本發明的多肽。此外，所述方法包括從培養基或者宿主細胞分離和/或回收所述多肽。優選通過重組DNA技術產生本發明的多肽。例如，將編碼蛋白質的核酸分子克隆到表達載體(如上述)中，將表達載體導入宿主細胞(如上述)並且在該宿主細胞中表達所述多肽。然後通過適宜的純化方案，使用標準蛋白質純化技術從細胞分離所述多肽。重組表達的備選方案是可以使用標準肽合成技術化學合成本發明的多肽或者肽。此外，例如，使用下文描述的本發明的抗體，尤其抗Rpi-blb2抗體從細胞(例如，內皮細胞)分離天然Rpi-blb2，通過標準技術，使用本發明的多肽或者其片段，即本發明的多肽可以產生所述抗體。在一個實施方案中，本發明涉及Rpi-blb2蛋白質或者具有Rpi-blb2活性的蛋白質。在一個實施方案中，本發明涉及具有本發明的多核苷酸編碼的胺基酸序列或者可以通過本發明的方法得到的多肽。在一個實施方案中，所述多肽不由Seq.IDNO.8和/或10中描繪的序列組成和/或不由Seq.IDNO.7和/或9中描繪的核酸分子編碼的序列組成。在一個實施方案中，本發明的多肽不由Mil.1或者Mil.2蛋白質的序列組成和/或不由編碼Mil.1或者Mil.2蛋白質的核酸分子編碼的蛋白質組成。從而，在一個實施方案中，本發明的多肽可以不由Rossi等人1998，PNASUSA959750-9754，Milligan等人，1998.PlantCell101307-1319；和/或WO9806750中所示的序列組成。用於本申請中的術語「蛋白質」和「多肽」是可以互換的。「多肽」指胺基酸的聚合物(胺基酸序列)並且不涉及分子的特定長度。從而多肽的定義中包括肽和寡肽。該術語還指或者包括多肽的翻譯後修飾，例如，糖基化、乙醯化、磷酸化等等。所述定義包括例如，含有胺基酸的一個或多個類似物(包括例如，非天然胺基酸等等)的多肽、具有取代的連接的多肽，以及本領域已知的天然發生和非天然發生的其他修飾。優選地，所述多肽是分離的。「分離的」或者「純化的」蛋白質或者其生物活性部分當通過重組DNA技術產生時基本上細胞材料，或者當化學合成時基本上無化學前體或者其他化學品。術語「基本上無細胞材料」包括本發明多肽的製備物，其中所述蛋白質與天然或者重組產生該蛋白質的細胞中的細胞組分分離。在一個實施方案中，術語「基本上無細胞材料」包括具有小於約30％(按照乾重)「汙染性蛋白質」，更優選小於約20％「汙染性蛋白質」，更優選小於約10％「汙染性蛋白質」，最優選小於約5％「汙染性蛋白質」的製備物。術語「汙染性蛋白質」涉及不是本發明的多肽的多肽。當重組產生本發明的多肽或者其生物活性部分時，還優選基本上無培養基，即，培養基為蛋白質製備物體積的約20％以下，更優選約10％以下，最優選約5％以下。術語「基本上無化學前體或者其他化學品」包括製備物，其中本發明的主題，例如，本發明的多肽與涉及該蛋白質合成的化學前體或者其他化學品分離。術語「基本上無化學前體或者其他化學品」包括製備物，其具有小於約30％(按乾重計)化學前體或者非Rpi-blb2化學品，更優選小於約20％化學前體或者非Rpi-blb2化學品，更優選小於約10％化學前體或者非Rpi-blb2化學品，最優選小於約5％化學前體或者非Rpi-blb2化學品。在優選實施方案中，分離的蛋白質或者其生物活性部分缺少汙染性蛋白質，其中所述汙染性蛋白質與本發明的多肽來自相同生物。通常，通過重組DNA技術產生此類蛋白質。本發明的多肽或者其部分可以優選包含與SEQIDNo2或4的胺基酸序列足夠同源的胺基酸序列，從而所述蛋白質或者其部分保持賦予本發明的抗性的能力。所述蛋白質的部分優選為本文描述的生物活性部分。優選地，本發明的多肽具有與SEQIDNo2或4中所示相同的胺基酸序列。此外，所述多肽可以具有由核苷酸序列編碼的胺基酸序列，所述核苷酸序列與本發明的多核苷酸的核苷酸序列雜交，優選在上文描述的嚴格雜交條件下雜交。因此，所述多肽具有核苷酸序列編碼的胺基酸序列，其與SEQIDNo2或4的胺基酸序列之一具有至少約70％，優選至少約75％，更優選至少約80％、90％、95％，甚至更優選至少約96％、97％、98％、99％或以上的同源性。本發明的優選的多肽優選具有本文描述的至少一種Rpi-blb2蛋白質活性，例如，其抗性或者免疫活性。本發明的優選多肽包括核苷酸序列編碼的胺基酸序列，所述核苷酸序列與SEQIDNo1或3或5或6的核苷酸序列雜交，優選在嚴格條件下與所述核苷酸序列雜交，或者與所述核苷酸序列同源(如上定義的)。因此，如本文詳述，本發明的多肽可以由於天然變異或者誘變在胺基酸序列中與SEQIDNo2或4不同。因此，所述多肽可以包含與SEQIDNo1或3或5或6的完整胺基酸至少約70％，優選至少約75％，更優選至少約80％、90％、95％，最優選至少約96％、97％、98％、99％或以上同源的胺基酸序列。本發明多肽的生物活性部分包括包含來源於Rpi-blb2蛋白質的胺基酸序列的胺基酸序列，例如，SEQIDNo2或4中所示的胺基酸序列或者與其同源的蛋白質的胺基酸序列，其包括的胺基酸少於全長Rpi-blb2蛋白質的胺基酸或者少於如下全長蛋白質的胺基酸，所述全長蛋白質與本文描繪的Rpi-blb2蛋白質同源並且顯示出Rpi-blb2蛋白質的至少一種活性。通常，生物(或者免疫學)活性部分，即肽，例如，長為5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100或更多胺基酸的肽包含具有Rpi-blb2蛋白質的至少一種活性或表位的結構域或者基序。此外，其中缺失多肽的其他區域的其他生物活性部分可以通過重組技術製備並且評估本文描述的一種或多種活性。本發明的Rpi-blb2多核苷酸的操作可以導致產生具有與野生型Rpi-blb2蛋白質功能不同的Rpi-blb2。這些蛋白質可以在效率或者活性方面得到提高，可以以比通常更大的數目存在於細胞中，或者效率或活性減小。Rpi-blb2的誘變策略導致所述化合物的所述抗性增加或者對另一種植物病原體種或者前述提到的植物病原體種的另一種株系的抗性增加，所述誘變策略不意在限制；這些策略的變通方案是本領域技術人員顯而易見的。使用此類策略，並且整合本文公開的機制，可以用本發明的多核苷酸和多肽產生植物或其部分，其表達野生型Rpi-blb2或者突變的Rpi-blb2多核苷酸和蛋白質分子從而所希望的化合物的生產的產率、產量和/或效率提高了。該所希望的化合物可以是植物的任意天然產物，其包括生物合成途徑的終產物和天然發生的代謝途徑的中間物，以及在所述細胞的代謝中不天然發生的分子，但是其通過本發明的所述細胞產生。本發明還提供了嵌合或融合蛋白質。本文所用的「嵌合蛋白質」或者「融合蛋白質」包含有效連接非Rpi-blb2多肽的多肽。「Rpi-blb2多肽」指具有相應於具有Rpi-blb2活性的多肽的胺基酸序列的多肽，而「非Rpi-blb2多肽」指具有相應於不基本上同源於Rpi-blb2的蛋白質的胺基酸序列的多肽，例如，不賦予本文描述的抗性，尤其不賦予對致病疫黴抗性和來源於相同或不同生物的蛋白質。在融合蛋白質中，術語「有效連接」意在表示Rpi-blb2多肽和非Rpi-blb2多肽相互融合，從而兩條序列都完成所用序列的計劃的功能。非Rpi-blb2多肽可以與Rpi-blb2多肽的N-末端或者C-末端融合。例如，在一個實施方案中，融合蛋白質是GST-LMRP融合蛋白質，其中Rpi-blb2序列融合GST序列的C-末端。此類融合蛋白質可以方便重組Rpi-blb2的純化。在另一實施方案中，融合蛋白質是在其N-末端含有異源信號序列的Rpi-blb2。在某些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中，通過使用異源信號序列可以增加Rpi-blb2的表達和/或分泌。優選地，通過標準重組DNA技術產生本發明的Rpi-blb2嵌合或者融合蛋白質。例如，根據常規技術將編碼不同多肽序列的DNA片段連接在框內，例如，通過平末端或者交錯末端用於連接，用限制酶消化以提供適宜的末端，如果適宜，填充粘性末端，鹼性磷酸酶處理以避免不希望的連接，和酶連接。通過常規技術(包括自動化DNA合成儀)可以合成融合基因。備選地，可以用錨定引物實施基因片段的PCR擴增，所述引物在兩個連續基因片段之間形成互補突出端，所述基因片段可以隨後退火併再擴增產生嵌合基因序列(見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，編者Ausubel等人，JohnWileySons1992)。此外，可以通過商業途徑得到已經編碼融合部分(例如，GST多肽)的許多表達載體。可以將本發明的多核苷酸克隆到此類表達載體中從而融合部分在框內連接所編碼的蛋白質。此外，使用適宜的電腦程式可以進行本發明蛋白質的結構基序的摺疊模擬和計算機再設計(Olszewski，Protein25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11(1995)，675-679)。蛋白質摺疊的計算機建模可以用於詳細的肽和蛋白質模型的構象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。具體地，可以用適宜的程序鑑定促有絲分裂的cyplin及其受體的相互作用位點，並通過互補肽序列的計算機輔助搜索鑑定它的配體或者其他相互作用蛋白質(Fassina，Immunomethods(1994)，114-120。用於設計蛋白質和肽的其他適宜的計算機系統描述於現有技術，例如，Berry，Biochem，Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann.N.Y.Acad.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry25(1986)，5987-5991。從上述計算機分析得到的結果可用於例如，製備本發明蛋白質或者其片段的肽模擬物。所述蛋白質的天然胺基酸序列的此類假肽類似物可以非常有效地模擬母蛋白質(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，容易得到的非手性Q-胺基酸殘基向本發明蛋白質或者其片段的摻入導致脂肪族鏈的聚亞乙基單位對醯胺鍵的取代，從而提供構建假肽的方便的策略(Banerjee，Biopolymers39(1996)，769-777)。在現有技術中描述了其他系統中小肽激素的強效肽模擬類似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。通過連續醯胺烷基化合成肽模擬物組合文庫，並測試所得化合物的例如，結合和免疫活性，也鑑定了本發明蛋白質的適宜的肽模擬物。產生和使用肽模擬物組合文庫的方法在現有技術，例如，在Ostresh，MethodsinEnzymology267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述。此外，可以用本發明蛋白質的三維和/或晶體結構設計本發明蛋白質的生物活性的肽模擬物抑制劑(Rose，Biochemistry35(1996)，12933-12944；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。在另一實施方案中，本發明涉及特異結合本發明的多肽或者部分，即此類蛋白質的特定片段或者表位的抗體。本發明的抗體可以用於鑑定和分離任意生物中的Rpi-blb和基因，優選以本文中描述的植物製備的植物中的Rpi-blb和基因。這些抗體可以為單克隆抗體、多克隆抗體或者合成抗體以及抗體片段，如Fab、Fv或者scFv片段等等。例如，通過最初在Khler和Milstein，Nature256(1975)，495，和Galfr6，Meth.Enzymol.73(1981)，3中描述的技術製備單克隆抗體，所述技術包括將小鼠骨髓瘤細胞與來自經免疫的哺乳動物的脾細胞融合。此外，通過使用例如，Harlow和Lane″Antibodies，ALaboratoryManual″，CSHPress，ColdSpringHarbor，1988中描述的方法可以得到針對前述肽的抗體或者其片段。這些抗體可以例如，用於根據本發明的蛋白質的免疫沉澱和免疫定位，以及用於監視例如，重組生物中此類蛋白質的合成，和用於鑑定與根據本發明的蛋白質相互作用的化合物。例如，用於BlAcore系統中的表面等離子體共振可以用於增加噬菌體抗體選擇的效率，從結合本發明蛋白質表位的噬菌體抗體的單個文庫產生親和力的高度增加(Schier，HumanAntibodiesHybridomas7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods183(1995)，7-13)。在許多情況中，抗體對抗原的結合現象等價於其他配體/抗配體結合。在一個實施方案中，本發明涉及包含本發明的多肽的互補序列的反義核酸分子。修飾表達水平和/或活性的方法是本領域技術人員已知的並且包括例如過表達、共抑制、使用核酶、有義和反義策略、基因沉默方法。「有義鏈」指雙鏈DNA分子的鏈，其與其mRNA轉錄物同源。「反義鏈」含有與「有義鏈」的序列互補的倒置序列。「反義」核酸分子包含與編碼蛋白質的「有義」核酸分子互補，例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補或者與mRNA序列互補的核苷酸序列。因此，反義核酸分子可以通過氫鍵結合有義核酸分子。反義核酸分子可以與整個Rpi-blb2編碼鏈互補，或者僅與其一部分互補。因此，反義核酸分子可以為本發明多核苷酸的核苷酸序列的編碼鏈的「編碼區」的反義序列。術語「編碼區」指包含密碼子的核苷酸序列區，所述密碼子翻譯成胺基酸殘基。此外，反義核酸分子是編碼Rpi-blb2的核苷酸序列的編碼鏈的「非編碼區」反義的。術語「非編碼區」指編碼區側翼的5』和3』序列，其不翻譯成多肽，即也稱作5』和3』非翻譯區(5』-UTR或者3』-UTR)。考慮到編碼本文公開的Rpi-blb2的編碼鏈序列，可以根據Watson和Crick鹼基配對法則設計本發明的反義核酸分子。反義核酸分子可以與Rpi-blb2mRNA的完整編碼區互補，但是也可以是與Rpi-blb2mRNA的編碼或者非編碼區的僅一部分反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸可以與Rpi-blb2mRNA的翻譯起始位點周圍的區域互補。反義寡核苷酸可以長為例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50個核苷酸。使用化學合成和酶促連接反應，用本領域公知的方法可以構建本發明的反義核酸分子。例如，使用天然發生的核苷酸或者設計用於增加分子的生物學穩定性或者增加反義和有義核酸之間形成的雙鏈體的物理穩定性的多種經修飾的核苷酸可以化學合成反義核酸分子(例如，反義寡核苷酸)，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。經修飾的核苷酸的實例可以用於產生反義核酸，包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯基胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基-氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基-肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5』-甲氧基羧基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-巰基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基-乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、和2，6-二氨基嘌呤。備選地，可以使用表達載體通過生物學方法產生反義核酸，其中已經以反義方向將多核苷酸亞克隆到所述表達載體(即，從所插入的多核苷酸轉錄的RNA將為與目的靶多核苷酸反義方向，在下面的小節中進一步描述)。通常將本發明的反義核酸分子施用於細胞或者原位產生從而它們與編碼Rpi-blb2的細胞mRNA和/或基因組DNA雜交或者結合，從而例如，通過抑制轉錄和/或翻譯抑制蛋白質的表達。雜交可以通過常規核苷酸互補形成穩定的雙鏈體，或者例如，對於結合DNA雙鏈體的反義核酸分子，通過雙螺旋的大溝中的特異相互作用。可以修飾反義分子從而其特異結合表達於所選細胞表面上的受體或者抗原，例如，通過將反義核酸分子連接到結合細胞表面受體或者抗原的肽或者抗體實現所述特異結合。使用本文描述的載體也可以遞送反義核酸分子。為了實現反義分子的足夠細胞內濃度，優選其中反義核酸分子置於強原核生物、病毒或者真核生物(包括植物)啟動子的控制下的載體構建體。在另一實施方案中，本發明的反義核酸分子可以是異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與互補RNA形成特異雙鏈雜合分子，其中與常規單位相反，所述鏈相互平行(Gaultier等人(1987)NucleicAcids.Res.156625-6641)。反義核酸分子還可以包含2』-O-甲基-核糖核苷酸(Inoue等人(1987)NucleicAcidsRes.156131-6148)或者嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等人(1987)FEBSLett.215327-330)。此外，本發明的反義核酸分子可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性DNA分子，其能夠切割與其有互補區的單鏈核酸，如mRNA。從而，核酶(例如，錘頭核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334585-591)中描述)可以用於催化性切割Rpi-blb2mRNA轉錄物從而抑制mRNA的翻譯。可以基於本文公開的Rpi-blb2cDNA的核苷酸序列或者基於將根據本發明中教導的方法分離的異源序列設計對編碼Rpi-blb2的核酸分子具有特異性的核酶。例如，可以構建四膜蟲L-19IVSRNA的衍生物，其中活性位點的核苷酸序列與編碼mRNA中待切割的核苷酸序列互補。見，例如，Cech等人美國專利號4,987,071和Cech等人美國專利號5,116,742。備選地，可以用Rpi-blb2mRNA從RNA分子庫選擇具有特異核糖核酸酶活性的催化性RNA。見，例如，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science2611411-1418。本發明的反義分子還包含多核苷酸，其包含與Rpi-blb2核苷酸序列的調節區(例如，其啟動子和/或增強子)互補的核苷酸序列，例如，以形成三螺旋結構，其防止靶細胞中基因的轉錄。一般見，Helene，C.(1991)AnticancerDrugDes.6(6)569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays14(12)807-15。此外，在一個實施方案中，本發明涉及產生轉基因植物、植物細胞或者植物組織的方法，其包括將本發明的多核苷酸或者載體導入所述植物、植物組織或者植物細胞的基因組。在優選實施方案中，所述載體或者所述多核苷酸在用於表達另一抗性基因，尤其Rpi-blb的載體或多核苷酸之前、之後或一起導入所述植物、植物組織或者植物細胞的基因組。為了在植物細胞中以有義或者反義方向表達根據本發明的核酸分子，將分子置於確保在植物細胞中表達的調節元件的控制下。這些調節元件可以關於待表達的核酸分子以及關於待轉化的植物種類是異源或同源的並且在上文中詳細描述。通常，此類調節元件包含在植物細胞中有活性的啟動子。為了得到轉基因植物的所有組織中的表達，例如，使用組成型啟動子，如CaMV的35S啟動子(Odell，Nature313(1985)，810-812)或者玉米的聚泛蛋白(polyubiquitin)基因的啟動子(Christensen，PlantMol.Biol.18(1982)，675-689)。為了實現轉基因植物中特定組織的表達，可能使用組織特異啟動子(見，例如，Stockhaus，EMBOJ.8(1989)，2245-2251)。還已知在馬鈴薯的塊莖或者不同植物種，如玉米、蠶豆、小麥、大麥等的種子中具有特異活性的啟動子。可以用誘導型啟動子以便能夠精確控制表達。誘導型啟動子也包含通過植物的感染誘導的啟動子。其他實施方案在上文描述。在一個實施方案中，本發明涉及產生抗卵菌門病原體的植物或其部分的方法，其包括步驟在植物或其部分中表達本發明的多肽和另一抗性蛋白質。因此，在另一實施方案中，本發明涉及本發明的或者根據本發明方法產生的轉基因植物或植物組織，其當存在所述多核苷酸或載體時抗所述病原體。經轉化的生物(或者轉化的細胞或組織)的產生需要向相關宿主細胞導入所述DNA、RNA或者蛋白質。許多方法可用於該步驟，其稱作轉化(或者轉導或轉染)(Keown等人(1990)MethodsinEnzymology185527-537)。例如，通過微注射或者用DNA包被的微粒轟擊可以直接導入DNA或RNA。而且，例如，使用聚乙二醇可以化學透化細胞，從而DNA可以通過擴散進入細胞。還可以通過原生質體與其他含有DNA的單位，如小細胞(minicell)、細胞、溶菌酶或者脂質體融合導入DNA。導入DNA的另一種適宜的方法是電穿孔，其中通過電脈衝可逆地透化細胞。已經描述了適宜的方法(例如，Bilang等人(1991)Gene100247-250；Scheid等人(1991)MolGenGenet228104-112；Guerche等人(1987)PlantScience52111-116；Neuhause等人(1987)TheorApplGenet7530-36；Klein等人(1987)Nature32770-73；Howell等人(1980)Science2081265；Horsch等人(1985)Science2271229-1231；DeBlock等人(1989)PlantPhysiology91694-701；MethodsforPlantMolecularBiology(Weissbach和Weissbach，編著)AcademicPressInc.(1988)；和MethodsinPlantMolecularBiology(Schuler和Zielinski，編著)AcademicPressInc.(1989))。在植物中，上述從植物組織或植物細胞轉化和再生植物的方法用於瞬時和穩定轉化。適宜的方法特別為通過聚乙二醇誘導的DNA攝入的原生質體轉化、使用基因槍的生物射彈方法(其也稱作微粒轟擊方法)、電穿孔、將乾燥胚胎在含有DNA的溶液中孵育，和微注射。除了這些「直接」轉化技術，通過根癌農桿菌或者毛根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的細菌感染也可以實現轉化。農桿菌介導的轉化最適於雙子葉植物細胞。所述方法由例如，HorschRB等人(1985)Science2251229f描述。當使用農桿菌時，表達盒必需整合到特定質粒中，可以整合到穿梭載體或者中間載體，或者整合到雙元載體中。如果用Ti或者Ri質粒進行轉化，Ti或者Ri質粒T-DNA的至少右邊界，但是在多數情況中，右邊界和左邊界以側翼區的形式連接待導入的表達盒。優選使用雙元載體。雙元載體能夠在大腸桿菌和農桿菌中複製。通常，它們包含選擇標記基因和接頭或多接頭，其側翼是右和左T-DNA邊界序列。可以將它們直接轉移到農桿菌中(Holsters等人(1978)MolGenGenet163181-187)。選擇標記基因允許選擇所轉化的農桿菌並且為，例如，nptII基因，其賦予對卡那黴素的抗性。作為宿主生物的農桿菌在該情況中應該已經含有具有vir區的質粒。vir區是將T-DNA轉移到植物細胞所需的。以這種方法轉化的農桿菌可以用於轉化植物細胞。T-DNA用於轉化植物細胞的用途已經詳細研究和描述(EP120516；Hoekema，TheBinaryPlantVectorSystem，OffsetdrukkerijKantersB.V.，Alblasserdam，V章；An等人(1985)EMBOJ4277-287)。多種雙元載體是已知的，它們的一些可以通過商業途徑得到，如pBI101.2或者pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.USA)。已經描述了適宜在植物中表達的其他啟動子(Rogers等人(1987)MethinEnzymol153253-277；Schardl等人(1987)Gene611-11；Berger等人(1989)ProcNatlAcadSciUSA868402-8406)。直接轉化技術適於任意生物和細胞類型。對於DNA或者RNA注射或者電穿孔到植物細胞的情況，所用的質粒不必滿足任何具體要求。可以使用簡單質粒，如pUC系列的質粒。如果將從所轉化的細胞再生完整植物，必需額外的選擇標記基因位於質粒上。選擇標記是所導入的DNA的部分時，可以從未轉化的細胞選擇穩定轉化的細胞，即含有整合到宿主細胞的DNA的所導入DNA的那些細胞。可以作為標記的基因的實例為能夠賦予抗生素或者除草劑(如卡那黴素、G418、博來黴素、潮黴素或者膦絲菌素)抗性的基因(見上文)。表達此類標記基因的轉化細胞能夠在相應抗生素或除草劑的一定濃度存在下存活，而所述抗生素或除草劑殺死未轉化的野生型。實例在上文描述並且優選包含bar基因，其賦予對除草劑膦絲菌素的抗性(RathoreKS等人(1993)PlantMolBiol21(5)871-884)，還包括nptII基因，其賦予卡那黴素抗性；hpt基因，其賦予潮黴素抗性，或者EPSP基因，其賦予除草劑草甘膦抗性。選擇標記允許從未轉化的細胞選擇經轉化的細胞(McCormick等人(1986)PlantCellReports581-84)。可以以常規方式培育和雜交所得植物。為了確保基因組整合是穩定和可遺傳的，應該生長兩代或更多代。上述方法描述於例如，SDKung和RWu編著的JenesB等人(1993)TechniquesforGeneTransferTransgenicPlants，卷1，EngineeringandUtilization，AcademicPress，128-143頁和Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42205-225)。優選將待表達的構建體克隆到適於農桿菌轉化的載體，例如，pBin19中(Bevan等人(1984)NuclAcidsRes128711f)。一旦已經產生了經轉化的植物細胞，就可以使用技術人員已知的方法得到完整植物。例如，愈傷組織培養物用作起始材料。可以用該還未分化的細胞生物量以已知方式誘導芽和根的發育。所得的芽可以移植到戶外並繁殖。技術人員熟悉從植物細胞和植物部分再生完整植物的方法。再生方法描述於例如，Fennell等人(1992)PlantCellRep.11567-570；Stoeger等人(1995)PlantCellRep.14273-278；Jahne等人(1994)TheorApplGenet89525-533。根據本發明的方法可以有利地與產生病原體抗性(例如，對昆蟲、真菌、細菌、線蟲等的抗性)、脅迫抗性和植物性質的另一種改善的其他方法聯合使用。實例由DunwellJM，Transgenicapproachestocropimprovement，JExpBot.2000；51SpecNo；487-96頁提及。農桿菌的適宜株系和載體以及農桿菌的轉化和適宜的生長和選擇培養基是技術人員公知的並且描述於現有技術中(GV3101(pMK90RK)，Koncz，Mol.Gen.Genet.204(1986)，383-396；C58C1(pGV3850kan)，Deblaere，Nucl.AcidRes.13(1985)，4777；Bevan，Nucleic.AcidRes.12(1984)，8711；Koncz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)，8467-8471；Koncz，PlantMol.Biol.20(1992)，963-976；Koncz，Specializedvectorsforgenetaggingandexpressionstudies.InPlantMolecularBiologyManual卷2，Gelvin和Schilperoort(Eds.)，Dordrecht，荷蘭KluwerAcademicPubl.(1994)，1-22；EP-A-120516；HoekemaTheBinaryPlantVectorSystem，OffsetdrukkerijKantersB.V.，Alblasserdam(1985)，ChapterV，Fraley，Crit.Rev.Plant.Sci.，4，1-46；An，EMBOJ.4(1985)，277-287)。儘管在本發明方法中優選使用根癌農桿菌，但是如果希望所述株系賦予的表型，也可以使用其他農桿菌株系，如毛根農桿菌。使用上述方法可能轉化多數雙子葉植物。但是對於單子葉植物的轉化，也已經開發了一些成功的轉化技術。這些技術包括使用例如，上述生物射彈方法轉化以及原生質體轉化、部分透化細胞的電穿孔、使用玻璃纖維導入DNA，等等。本文所用的術語「轉化」指將外源多核苷酸轉移到宿主細胞，而不管用於轉移的方法。可以將多核苷酸瞬時或者穩定導入宿主細胞並且可以例如作為質粒或者作為嵌合連接保持不整合，或者備選地，可以整合到宿主基因組。然後所得轉化的植物細胞可以用於以技術人員已知的方式再生經轉化的植物。因此，在一個實施方案中，本發明涉及植物細胞，其包含本發明的或者通過本發明方法可以得到的多核苷酸或載體。優選地，細胞包含賦予另一抗性的多核苷酸或者載體，更優選地，為編碼Rpi-blb的載體或者多核苷酸。從而，本發明還涉及轉基因植物細胞，其含有(優選穩定整合到基因組)根據本發明的多核苷酸，其連接到允許在植物細胞中表達所述多核苷酸的調節元件，並且其中所述多核苷酸是轉基因植物細胞外來的。對於外來的含義，見上文。從而，本發明還涉及包含根據本發明的轉基因植物細胞的轉基因植物和轉基因植物組織。由於本發明多肽的(過)表達，所述植物或植物組織抗植物病原體，尤其抗卵菌。優選地，所述植物還抗其他病原體，例如，抗吮吸性植物病原體。本文描述了其他病原體。優選所述植物或者植物組織抗疫黴種，最優選地抗致病疫黴。例如，為了得到表達Rpi-blb2基因的轉基因植物，可以將其編碼區克隆到例如，pBinAR載體(Hfgen和Willmitzer，Plant-Science，66，1990，221-230)中。例如，根據聚合酶鏈反應(PCR)技術，可以用實施例和附圖，例如，表3b中所示引物，尤其用ARF1F和ARF1R擴增Rpi-blb2的編碼區。可以純化所得PCR片段並隨後將該片段克隆到載體中。可以將所得載體轉移到根癌農桿菌中。該株系可以用於轉化並且可以選擇轉基因植物。在另一實施方案中，本發明涉及包含本發明的植物細胞的轉基因植物或者植物組織。例如，關於核酸序列、包含所述核酸序列的表達盒或者載體或者用所述核酸序列、表達盒或者載體轉化的生物，「轉基因的」指通過重組方法產生的所有那些構建體，在所述構建體中，a)Rpi-blb2核酸序列，或者b)有效連接Rpi-blb2核酸序列的遺傳控制序列，例如，啟動子，或c)(a)和(b)不位於它們的天然遺傳環境中或者已經通過重組方法修飾，修飾的一個實例是替代、加入、缺失、倒置或者插入一個或多個核苷酸殘基。天然遺傳環境指最初生物中天然染色體基因座，或者指存在於基因組文庫中。對於基因組文庫，優選保持，至少部分保持核酸序列的天然遺傳環境。所述環境在核酸序列側翼的至少一邊並且具有長為至少50bp，優選至少500bp，特別優選至少1000bp，非常特別優選至少5000bp的序列。天然發生的表達盒-例如，Rpi-blb2啟動子與相應Rpi-blb2基因的天然發生的組合-當用非天然的、合成的「人工「方法如誘變修飾時，變成轉基因表達盒。已經描述了此類方法(US5,565，350；WO00/15815；也見上文)。此外，還可以轉化植物細胞、植物組織或者植物，從而(過)表達其他酶和蛋白質，所述表達支持植物或者植物組織抗性的增加，例如，Rpi-blb(同義詞Rpi-blb1、RB或Sbu1)、R1、Rpi-mcd、R-ber(同義詞R12)、Rpi1、Rpi-blb3、Rpi-ABPT1、R2、R3a或R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3-蛋白質。優選Rpi-blb和Rpi-blb2共表達。本發明還涉及包含如上述的轉基因植物細胞的培養的植物組織，所述植物細胞顯示出根據本發明的蛋白質的表達。根據上面的定義，優選作為轉基因生物的宿主和起始生物主要是植物。本發明的範圍內包括植物界高等和低等植物的所有屬和種。還包括具有增加的Rpi-blb2活性的成熟植物、種子、芽和幼苗，和部分、繁殖材料和從中得到的培養物，例如，細胞培養物。成熟植物指幼苗之外的任意發育階段的植物。術語幼苗指早期發育階段的年幼的不成熟的植物。根據本發明得到的任意轉化的植物可以用於常規育種方案中或者用於體外植物繁殖以產生更多具有相同特徵的經轉化的植物和/或可以用於在相同或相關種的其他品種中引入相同特徵。此類植物也是本發明的部分。從經轉化植物得到的種子在遺傳上也含有相同的特徵並且是本發明的部分。如前面提到的，本發明原則上可以應用於可以用本領域技術人員已知的任意轉化方法轉化的任意植物和農作物。通常，可以根據本發明修飾並且顯示出根據本發明的蛋白質的過表達或者此類蛋白質合成減少的植物可以來自任意希望的植物種。它們可以是單子葉植物或者雙子葉植物，優選它們屬於在農業、林業或者園藝上重要的植物種，如農作物植物(例如，玉米、稻、大麥、小麥、黑麥、燕麥等等)、馬鈴薯、產油植物(例如，油菜籽、向日葵、花生、大豆等等)、棉花、甜菜、甘蔗、豆科植物(例如，豆類、豌豆等等)、產木材植物，優選樹等等。然而，優選可以受疫黴種感染的植物。因此，在一個實施方案中，本發明的或者根據本發明方法產生的植物、植物細胞或者植物組織選自根據SystemaNaturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚殼樹科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟絲子科、花荵科和田基麻科(Hydrophyllaceae)構成的組或者具有其來源。優選地，本發明的或者根據本發明方法產生的所述植物、植物細胞或者植物組織為茄科，優選選自根據SystemaNaturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的由顛茄屬、Browallia、番茉莉屬、辣椒屬(Capsicum)、夜香樹屬、Cyphomandra、曼陀羅屬(Datura)、Fabiana、Franciscea、天仙子屬(Hyoscyamus)、枸杞屬(Lycium)、茄參屬(Mandragora)、假酸漿屬(Nicandra)、菸草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、酸漿屬(Physalis)、Schizanthus和茄屬(Solanum)構成的組或者具有其來源。更優選地，本發明的或者根據本發明方法產生的植物、植物細胞或者植物組織為S.bulbocastanum、馬鈴薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum)、矮牽牛、樹番茄(S.betaceum)、pearmelon(S.muricatum)和茄子(S.melongena)。甚至更優選地，所述植物、植物組織或植物細胞是馬鈴薯或番茄。最優選地為馬鈴薯。在其他系統中，分類將是類似的。本領域技術人員已知所述差異，例如，更通常，番茄被系統命名為Lycopersiconlycopesicum(L.)KarstenexFarwell。在再一方面，本發明還涉及根據本發明的轉基因植物的可收穫部分和繁殖材料，其含有表達根據本發明的核酸分子和/或多肽的轉基因植物細胞或者含有顯示出本發明多肽的增加的水平的細胞。可收穫部分原則上可以為植物的任意有用的部分，例如，花、花粉、幼苗、塊莖、葉子、莖幹、果實、種子、根等等。繁殖材料包括例如，種子、果實、插條、幼苗、塊莖、根莖等等。優選馬鈴薯、番茄、eggfruits或者pearmelons作為可收穫的或者繁殖材料。對於本發明的植物為矮牽牛的情況，本發明在一個實施方案中涉及矮牽牛的花作為可收穫的部分。本發明還涉及根據本發明的轉基因生物和(對於轉基因植物生物)從它們來源的細胞、細胞培養物、部分，例如，根、葉等等，和轉基因繁殖材料(如種子或果實)的用途，用於生產食品或飼料、藥物或者精細化學品。具體地，馬鈴薯可以用於產生精細化學品。因此，在另一實施方案中，本發明涉及本發明的多核苷酸、植物、植物細胞或者植物組織、載體或者多肽的用途，用於製備脂肪酸、類胡蘿蔔素、類異戊二烯、維生素、脂類、蠟酯、(多)糖和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其類固醇激素、膽固醇、前列腺素、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體產生細胞、組織、和/或植物。有許多機制，通過這些機制可以實現脂肪酸、類胡蘿蔔素、類異戊二烯、維生素、蠟酯、脂類、(多)糖和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其類固醇激素、膽固醇、甘油三酯、前列腺素、膽汁酸和/或酮體或者摻入此類經改變的蛋白質的上面定義的精細化學品的產生、生產和/或生產效率。對於植物，例如，通過增加乙醯輔酶A的表達，可能增加所產生的所述化合物的量，從而允許更容易收穫和純化，或者對於植物，更有效分配，乙醯輔酶A是細胞中許多產物的基礎，所述產物為例如，脂肪酸、類胡蘿蔔素、類異戊二烯、維生素、脂類、(多)糖、蠟酯、和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其前列腺素、類固醇激素、膽固醇、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體。此外，可能需要一種或多種所述代謝產物、增量輔因子、前體分子，和適宜的生物合成途徑的中間化合物。因此，通過增加參與營養(如碳源(即糖)、氮源(即，胺基酸、銨鹽)、磷酸和硫)輸入的轉運蛋白的數目和/或活性，由於除去了對生物合成過程的營養供給限制，可以提高如上所述的乙醯輔酶A和其代謝產物的產生。具體地，可以提高植物中所述化合物的產生、生產和/或生產效率，所述化合物為例如，脂肪酸、類胡蘿蔔素、類異戊二烯、維生素、脂類、(多)糖、和/或聚羥基鏈烷酸酯，和/或其代謝產物，尤其類固醇激素、膽固醇、前列腺素、甘油三酯、膽汁酸和/或酮體分子。進一步優選的是在宿主生物中重組產生藥物或者精細化學品的方法，其中用上述表達盒之一轉化宿主生物，並且該表達盒包含一種或多種結構基因，其編碼所希望的精細化學品或者催化所希望的精細化學品的生物合成，培養所轉化的宿主生物，並從培養基分離所希望的精細化學品。該方法可以廣泛應用於精細化學品如酶、維生素、胺基酸、糖、脂肪酸，和天然和合成調味劑、香料物質和著色劑。特別優選的是產生生育酚和生育三烯酸和類胡蘿蔔素類。培養所轉化的生物並通過技術人員公知的方法從宿主生物或者培養基分離產物。藥物，如抗體或者疫苗的產生由HoodEE，JilkaJM.CurrOpinBiotechnol.1999Aug；10(4)382-6；MaJK，VineND.CurrTopMicrobiolImmunol.1999；236275-92描述。在一個實施方案中，本發明還涉及本發明的多核苷酸、載體或者多肽的用途，用於產生具有所述抗性的植物或植物或其部分的組織、器官或者細胞。此外，在一個實施方案中，本發明涉及鑑定刺激對所述植物病原體的抗性的化合物的方法，其包括a)在細胞培養條件下將表達本發明多肽或者其mRNA的細胞與候選化合物接觸；b)測定所述多肽或者所述mRNA的表達的增加；c)比較不存在所述候選化合物時，做出的對標準應答的表達水平；其中相對於標準增加的表達表明所述化合物刺激抗性。所述化合物可以化學合成或者經微生物產生和/或包含於例如來自例如，植物、動物或者微生物，例如，病原體的的樣品中，例如，細胞提取物中。此外，所述化合物可以是本領域已知的但是迄今為止還不知道能夠抑制或者激活Rpi-blb2。反應混合物可以是無細胞提取物或者可以包含細胞或者組織培養物。本發明方法的適宜的構成是本領域技術人員已知的並且例如，通常描述於Alberts等人，MolecularBiologyoftheCell，第三版(1994)，尤其第17章。化合物可以例如，加到反應混合物、培養基、注射到細胞或者噴霧到植物上。如果以本發明的方法鑑定了含有化合物的樣品，那麼可能從鑑定為含有能夠激活或者增加對所述病原體抗性的化合物的原始樣品分離所述化合物，或者可以進一步細分原始樣品(例如，如果它由許多不同化合物組成)以便減小每個樣品不同物質數並用原始樣品的細分樣品重複所述方法。取決於所述樣品的複雜性，上述步驟可以進行數次，優選直到根據本發明鑑定的樣品僅包含有限數目的或者僅一種物質。優選地，所述樣品包含具有相似化學和/或物理性質的物質，最優選地，所述物質是相同的。優選地，根據上述方法鑑定化合物或者其衍生物進一步以適於應用於植物育種或者植物細胞或組織培養的形式配製。可以根據本發明的方法測試和鑑定的化合物可以是表達文庫，例如，cDNA表達文庫、肽、蛋白質、核酸、抗體、小有機化合物、激素、肽模擬物、PNA等等(Milner，NatureMedicine1(1995)，879-880；Hupp，Cell83(1995)，237-245；Gibbs，Cell79(1994)，193-198和如上引用的參考文獻)。所述化合物還可以是已知抑制劑或者激活劑的功能衍生物或者類似物。製備化學衍生物和類似物的方法是本領域技術人員公知的並且描述於例如，Beilstein，HandbookofOrganicChemistry，SpringereditionNewYorkInc.，175FifthAvenue，NewYork，N.Y.10010U.S.A.和OrganicSynthesis，Wiley，NewYork，USA。此外，可以根據本領域已知的方法測試所述衍生物和類似物的效果。此外，例如，根據上述方法，可以使用肽模擬物和/或計算機輔助設計適宜的衍生物和類似物。可以用於本發明方法中的細胞或者組織優選為上文實施方案中描述的本發明的宿主細胞、植物細胞或者植物組織。可以如實施例中描述的，尤其通過孢子形成指數測定可以確定化合物是否能夠抑制或者激活所述物質。通過上述方法鑑定的激活劑可以證明用作殺真菌劑或者植物保護劑。從而，在另一實施方案中，本發明涉及根據本發明方法得到或鑑定的化合物，所述化合物為Rpi-blb2的激動劑。因此，在一個實施方案中，本發明還涉及通過本發明方法鑑定的化合物。所述化合物為例如，Rpi-blb2的同源物。通過誘變，例如Rpi-blb2的離散點突變或者截短可以產生本發明多肽的同源物。如本文所用的，術語「同源物」指作為Rpi-blb2的活性激動劑的蛋白質的變體形式。所述蛋白質的激動劑可以基本上保持Rpi-blb2的相同生物活性或者其一部分。在一個實施方案中，本發明涉及特異識別本發明化合物的抗體。本發明還涉及診斷組合物，其包含至少一種前述多核苷酸、核酸分子、載體、蛋白質、本發明的抗體或者化合物和任選適宜的檢測方法。本發明的診斷組合物適於從細胞分離mRNA並在雜交條件下將所得到的mRNA與包含如上述的核酸探針的探針接觸，檢測與所述探針雜交的mRNA的存在，從而檢測細胞中所述蛋白質的表達。檢測根據本發明的蛋白質的存在的其他方法包括本領域公知的免疫技術，例如，酶聯免疫吸附測定。此外，可能使用根據本發明的核酸分子，尤其實施例，例如表3a或3b中描述的標記作為植物育種中的分子標記或者引物。適宜檢測方法是本領域技術人員公知的，例如，用於雜交測定的緩衝液和溶液，例如，前述融合和緩衝液，和例如Sambrook等人中描述的DNA印跡、蛋白質印跡、RNA印跡等是已知的。在另一實施方案中，本發明涉及試劑盒，其包含本發明的多核苷酸、載體、宿主細胞、多肽、反義核酸、抗體、植物細胞、植物或植物組織、可收穫部分、繁殖材料或者化合物。本發明的試劑盒的化合物可以包裝在諸如瓶子的容器中，任選使用緩衝液和/或溶液。如果適宜，可以將一種或多種所述組分包裝在一個和相同容器中。額外或備選地，可以將一種或多種所述組分吸附到固相支持體，如硝酸纖維素濾膜、玻璃板、晶片或者尼龍膜或者微量滴定板的孔。所述試劑盒可以用於任一種本文描述的方法和實施方案中，例如，用以產生宿主細胞、轉基因植物、藥物組合物、檢測同源序列、鑑定拮抗劑或激動劑等等。此外，試劑盒可以還包含關於試劑盒用於任意所述實施方案，尤其用於增加植物細胞、植物組織或植物對一種或多種所述病原體的抗性的使用說明。在優選實施方案中，所述試劑盒還包含多核苷酸，其編碼一種或多種前述抗性蛋白質，優選Rpi-blb，和/或與所述抗性蛋白質，優選與Rpi-blb相關的抗體、載體、宿主細胞、反義核酸、植物細胞或植物組織和/或植物。在另一實施方案中，本發明涉及產生植物保護劑的方法，所述植物保護劑提供本發明的多核苷酸、載體或者多肽，所述方法包括本發明方法的步驟；和以可以用作植物農業組合物的形式配製本發明的多核苷酸、載體或者多肽或者所述方法的步驟(c)中鑑定的化合物。在另一實施方案中，本發明涉及產生植物保護劑組合物的方法，其包括本發明方法的步驟；和(a)以可以作為農業組合物接受的形式配製步驟(c)中鑑定的化合物。「可以作為農業組合物接受」理解為此類組合物符合規定殺真菌劑、植物營養、除草劑等的含量的法律。優選地，此類組合物對所保護的植物和用該植物飼養的動物(包括人)沒有任何害處。本發明還涉及與此類用途和方法有關的一些實施方案。可以以一種或多種下面的方法使用本文描述的多核苷酸、多肽、蛋白質同源物、融合蛋白質、引物、載體、宿主細胞鑑定抗所提及的植物病原體和相關生物的的植物；基因組作圖；鑑定和定位目的序列；進化研究；確定功能所需區域；活性的調節。因此，本發明的多核苷酸具有許多用途。首先，它們可以用於鑑定生物為S.bulbocastanum或者其親戚。而且它們可以用於鑑定混合植物群體中S.bulbocastanum或者其親戚的存在。通過在嚴格條件下用跨該S.bulbocastanum獨特的本發明基因的區域的探針探測從植物的單一或者混合群體培養物所提取的基因組DNA，可以確定本發明是否使用了S.bulbocastanum或者其親戚，例如近親，或者是否存在S.bulbocastanum或者其親戚，例如，近親。此外，本發明的多核苷酸可以與相關物種的序列足夠同源從而這些核酸分子可以作為構建相關生物中基因組圖譜的標記。本發明的多核苷酸還可以用於進化和蛋白質結構研究。通過比較本發明的Rpi-blb2的序列與編碼來自其他生物的相似酶的序列，可以評估生物的進化相關性。類似地，此類比較允許評估所述序列的哪些區是保守的，哪些不是保守的，這可以有助於確定蛋白質的對於所述酶功能必要的那些區。這種確定對於蛋白質工程化研究是有價值的並且可以指示在誘變而不喪失功能方面，所述蛋白質可以耐受什麼。本發明的描述和實施例公開並包括這些和其他實施方案。關於按照本發明使用的方法、用途和化合物任一種的其他文獻可以使用例如電子裝置從公共圖書館檢索。例如，可以利用公共資料庫「Medline」，其可以在網際網路上以http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html提供。其他資料庫和網址，如http//www.ncbi.nim.nih.gov/，http//www.infobiogen.fr/，http//www.fmi.ch/biology/research-tools.html，http//www.tigr.org/是本領域技術人員已知的並且可以使用例如，http//www.lycos.com得到。在Berks，TIBTECH12(1994)，352-364中給出了生物技術專利信息綜述和可用於回溯檢索和最新文獻通報的專利信息的相關來源的調查。表表1序列表2.2000年在荷蘭的Marknesse進行的田間試驗中BC4作圖群ARG95-3和ARP96-11的2851個子代克隆中抗性的分離。用括號中的百分數表示分類為具有抗性、敏感或者未知表型的克隆數。表3A.用於Rpiblb2作圖的標記概述1)Ori引物方向；F正向引物；R反向引物2)aARG95-3，bARP96-11，cB6a表3B用於Rpi-blb2作圖的引物概述1)N＝A+T+G+C，S＝G+C，W＝A+T表4.馬鈴薯中晚疫敏感性的互補1R0基因型是用含有Rpi-blb2基因候選者RGC1到RGC8和RGC24L或者空pBINPLUS載體的T-DNA構建體轉化敏感馬鈴薯栽培種Impala或者Kondor得到的原代轉化株。根癌農桿菌株系U1A143a或AGL0b用於轉化致病疫黴敏感的馬鈴薯栽培種Impala和Kondor。表5.用於TAIL-PCR的循環條件a這些是9-部分超級循環，每個由兩個高嚴格和一個低嚴格循環組成。表6通過Rpi-blb2對番茄栽培種MoneyMaker中晚疫敏感性的互補R0基因型是用含有Rpi-blb2基因RGC5的T-DNA構建體轉化敏感番茄栽培種Moneymaker得到的原代轉化株。根癌農桿菌株系UIA143a用於轉化致病疫黴敏感的番茄栽培種。附圖如下圖1.開發稱作「ABPT」(1a)的複雜種間雜種克隆和來自這些克隆的兩種ABPT克隆55和ABTP克隆60(1b到d)的馬鈴薯作圖群的圖示。ASolanumacaule；BS.bulbocastanum，PS.pureja，T馬鈴薯，2x二倍體(2n＝2x＝24)，3x三倍體，4x四倍體，6x六倍體，cv栽培種。斜體代碼表示作圖群。圖2.1991年在墨西哥的TolucaValley田間試驗克隆ARF87-601和敏感對照栽培種(cv)Bildtstar、Eersteling和部分抗性對照栽培種Pimpernel葉子對晚疫抗性的疾病發展曲線。在栽培後8個時間點，以1到9CIP等級(Estrada-Ramos，1983)對由於自然晚疫感染導致的枯萎葉百分數打分。圖3.1992年在菲律賓的Benguet省田間試驗克隆ARF87-507、ARF87-601、ARF87-801、敏感對照栽培種(cv)Granola和部分抗性育種克隆AR85-96-13葉子對晚疫抗性的疾病發展曲線。在8月25日到11月24日的6個時間點，以1到9CIP等級(Estrada-Ramos，1983)對由於自然晚疫感染導致的疫病葉百分數打分。圖4.在荷蘭Marknesse的每年田間試驗中用致病疫黴的分離物IPO82001接種約6周後對Rpi-blb2介導的晚疫抗性分離的四倍體抗性和敏感親代克隆和子代克隆的典型表型。具有顯示出抗性表型(黑色實線內)的克隆的6株植物圖不表現或幾乎不表現出任何孢子形成病灶，具有敏感表型(白色虛線內)的一個克隆表現出完全患疫病的葉子。圖5.基於馬鈴薯作圖群ARG95-15的109個子代克隆的遺傳學圖，其表明7個AFLP標記與Rpi-blb2基因座共分離。垂直線左邊的數字表示側翼標記或者Rpi-blb2基因座之間的遺傳距離(釐摩(cm))。圖6.基於馬鈴薯作圖群ARG95-3的137個子代克隆的遺傳學圖，其表明15個AFLP標記和RGA標記S1E00與Rpi-blb2基因座共分離。用離脫葉測定得到了子代克隆的表型。垂直線左邊的數字表示側翼標記或者Rpi-blb2基因座之間的遺傳距離(釐摩(cm))。圖7.基於馬鈴薯作圖群ARG95-3的178個子代克隆的遺傳學圖，其表明5個標記與馬鈴薯的連鎖群6上的Rpi-blb2基因座共分離。1998年在荷蘭的Marknesse用田間試驗確定了子代克隆的表型。標記E40M58和E46M52得分為AFLP、CAPS、SCAR或者延伸(後綴e)標記(表3A)。部分地，將標記CT119打分為CT119N(表3a)。標記CT216得分為SCAR標記。垂直線左邊的數字表示側翼標記或者Rpi-blb2基因座之間的遺傳距離(釐摩(cm))。對於每種標記，標記和表型之間重組體的數目和打分的子代克隆的總數在括號中給出。圖8.基於馬鈴薯作圖群ARG95-3的886個子代克隆和馬鈴薯作圖群ARP96-11的170個子代克隆的遺傳學圖，表明有標記與馬鈴薯的連鎖群6上Rpi-blb2基因座共分離。2000年在荷蘭的Marknesse用田間試驗確定了子代克隆的表型。垂直線左邊的數字表示側翼標記之間的遺傳距離(釐摩(cm))。限定Rpi-blb2基因的位置的標記間隔(基於子代克隆中檢測的重組事件)通過雙箭頭線指出。圖9.含有馬鈴薯(上面的水平線)和S.bulbocastanum(下面的水平線)中Rpi-blb2的基因組區的物理圖。垂直線表示與抗性連鎖的標記的相對位置。水平線上的數字為分別來自複雜種雜種「ABPT」(圖1)的馬鈴薯的1056個子代植物和1899個S.bulbocastanum子代植物中側翼標記之間鑑定的重組體數。ABTP-來源的子代包含來自作圖群ARG95-3和ARP96-11兩者的克隆。長方形代表除了具有前綴「Blb」的BAC克隆之外的來自ARD1197-16BAC文庫的酵母人工染色體(BAC)，具有前綴「Blb」的BAC克隆來自S.bulbocastanumBlb2002BAC克隆。限定Rpi-blb2基因的位置的標記間隔(基於子代克隆中檢測的重組事件)通過雙箭頭線指出。小箭頭指出抗性基因候選者(RGC)的位置。圖10.開發S.bulbocastanum的二倍體、種內作圖群B6的圖示。斜體代碼指示作圖群。圖11.基於S.bulbocastanum作圖群B6的1899個子代克隆的遺傳學圖，顯示了發現與S.bulbocastanum的6號染色體上Rpi-blb2基因座共分離的標記。通過離脫葉測定法確定子代克隆的表型。垂直線左邊的數字指出側翼標記之間的遺傳距離(釐摩(cM))。限定Rpi-blb2基因的位置的標記間隔(基於子代克隆中檢測的重組事件)通過雙箭頭線指出。圖12.晚疫敏感性的遺傳互補。用致病疫黴分離物655-2A的胞囊孢子懸浮物接種後6天馬鈴薯葉子的典型疾病表型。用pBINPLUS轉化的卡那黴素抗性cvKondor植物得到的葉子(對照；A)，從含有BACSPB39衍生的(B)或者BAC211衍生(C)的RGC5的cvKondor植物得到的葉子，從用pBINPLUS轉化的卡那黴素抗性cvImpala植物得到的葉子(對照；D)，從含有BACSPB39衍生的(E)或BAC211衍生的RGC5(F)的cvImpala植物得到的葉子。小圖A和D描繪典型的敏感性應答，具有致病疫黴的廣泛孢子形成病灶。小圖B、C、E和F描繪在含有Rpi-blb2的轉基因馬鈴薯植物上接種位點觀察到的典型的抗性反應。圖13.編碼Rpi-blb2基因的核酸序列。A.Rpi-blb2基因的編碼核酸序列。B.包括內含子序列(43-128位)的Rpi-blb2基因的編碼核酸序列。C.p211F-C12中存在的ARD1197-16BAC211的7967bpSau3AI基因組DNA片段的序列，兩種遺傳構建體之一用於晚疫抗性的遺傳互補。所述基因組片段含有Rpi-blb2基因，包括該基因的正確表達所需的天然調節元件。用下劃線標出起始密碼子(1546-1548位ATG)和終止密碼子(5433-5435位TAG)。D.pSP39-20中存在的S.bulbocastanum2002BACBlbSP39的9949bpSau3AI基因組DNA片段的序列，兩種遺傳構建體之一用於晚疫抗性的遺傳互補。所述基因組片段含有Rpi-blb2基因，包括該基因的正確表達所需的天然調節元件。用下劃線標出起始密碼子(1413-1415位ATG)和終止密碼子(5300-5303位TAG)。圖14.推定的Rpi-blb2基因結構和推導的Rpi-blb2蛋白質序列。A.Rpi-blb2基因結構的圖示。水平線指出外顯子。開放框代表編碼序列。角度向下的線指出內含子序列的位置。B.推導的Rpi-blb2蛋白質序列。從Rpi-blb2的DNA序列推導的胺基酸序列分成三個結構域(LZ、NBS和LRR)。結構域A中形成潛在亮氨酸拉鏈(LZ)結構域的七殘基重複序列的第一個殘基的疏水殘基以下劃線指出。R蛋白質中保守基序以小寫字母寫出，NBS結構域中的保守基序以斜體表示。LRR結構域中匹配細胞質LRR的共有序列的殘基以粗體表示。已經引入序列中的點以比對該序列與胞質LRR的共有LRR序列。圖15.Rpi-blb2、Mi-1.1和Mi-1.2的所推導的編碼蛋白質產物的比對。顯示了Rpi-blb2的完整胺基酸序列和Mi-1.1和Mi-1.2中與Rpi-blb2中相應殘基不同的胺基酸殘基。破折號表示為保持最佳比對而插入的缺口。當與Mi-1.1和Mi-1.2中相應位置的胺基酸殘基比較時，對Rpi-blb2特異的胺基酸殘基以粗體和紅色高亮顯示。對LRR的相應於β-鏈/β-轉角基序xxLxLxxxx的區域加下劃線。NBS結構域中的保守基序以小寫字母表示。垂直線指出CC-NBS和LRR區之間的分界。VLDL基序中在許多植物R蛋白質的第三個LRR中保守但是在Rpi-blb2中不保守的位置通過具陰影的長方形表示。圖16.Mi1.1、Mi1.2和Rpi-blb2核酸的CLUSTALW(1.82)多序列比對。圖17.Mi1.1、Mi1.2和Rpi-blb2蛋白質的CLUSTALW(1.82)多序列比對。圖18.與cv.Bintje(C)的敏感表型相比抗性基因R2(A)和Rpi-blb2(B)的典型表型。小圖A描繪了典型的超敏應答反應，其具有非常小的壞死斑點，而小圖B顯示了大壞死區，其含有低水平孢子形成。小圖C描繪了典型的敏感反應，其具有清晰的孢子形成。通過下面的實施例進一步闡明本發明，這些實施例不應被理解為限制。實施例實施例1評估ABPT來源的回交克隆和群體中抗性BC2-克隆ARF87-507和ARF87-801選自用晚疫(LB)敏感馬鈴薯栽培種OberarnbacherFrühe作為第一種親本和馬鈴薯栽培種Arkula(圖1b)和Blanka(圖1c)分別作為第二種親本對複雜種雜種ABPT-克隆號55(圖1a)進行兩輪迴交後所得BC2-後代。類似地，通過用BL敏感馬鈴薯栽培種Alcmaria和Blanka(圖1d)對ABPT-克隆60連續雜交得到BC2-克隆ARF87-601。1991年在墨西哥的Toluca地區作為田間試驗的一部分測試克隆ARF87-601以篩選LB抗性。一小塊土地上克隆ARF87-601的7株植物圖與具有9株植物的幾小塊土地比較進行評估，這幾小塊土地每塊上的9株植物分別是對照栽培種Bildtstar、Eersteling和Pimpernel。根據1988年荷蘭國家推薦馬鈴薯栽培種表中晚疫抗性的等級評定，以從3到8的遞增抗性的尺度將這些對照栽培種分別打分為3、3和8。認為栽培種Pimpernel是部分抗性來源(Colon等人，1985)。種植後約40天，建立致病疫黴的天然感染。然後在從7月16日到9月2日期間監視葉子中LB的發育8次(圖2)。ARF87-601的疾病發展曲線與對照栽培種相比存在明顯不同。種植後第74天，對照栽培種的葉子完全或者接近完全患疫病，而克隆ARF87-601沒有顯示出可觀察到的症狀(圖2)。1992年在菲律賓的Benguet省篩選LB-抗性的田間試驗中，克隆ARF87-507、ARF87-801和克隆ARF87-601顯示出相當的結果(圖3)。3種BC2克隆、對照栽培種Granola和中等LB抗性育種克隆AR85-96-13(其用作雌性親本以得到AR92-1197(圖1d)每種10株植物在8月25日種植。發生致病疫黴的天然感染後對疫病葉子百分數6次打分。當與栽培種Granola和克隆AR85-96-13相比時，ABTP來源的BC2-克隆的疾病發展曲線顯著不同(圖3)。在打分期間，BC2-克隆不顯示或者幾乎不顯示症狀並且沒有清楚的疾病發展，而栽培種Granola在第三次打分日具有幾乎完全患疫病的葉子。克隆ARF87-601、ARF87-507和ARF87-801用於與LB敏感栽培種和馬鈴薯的育種克隆進一步回交(圖1b到1d)。該育種工作產生四種不同的作圖群四倍體BC3-群體ARG95-15、四倍體BC4-群體ARG95-3和ARP96-11和二倍體BC4-群體DP1。在該育種工作的連續步驟期間，基於通常實踐的育種評價中農學性能以及通過在荷蘭Marknesse的田間試驗中對用致病疫黴的複雜分離物IPO82001接種的它們的親代和相關後代篩選以選擇抗性克隆ARF87-507、ARF87-601、ARF87-801、AR91-1263、AR91-1292和AR92-1197。在AR92-1197xPhu81-101(圖1d)雜交的子代中選擇二倍體(2n＝2x＝24)克隆ARD1197-16，已知Phu81-101親代克隆能夠在雌性親本中誘導孤雌生殖種子組(Hermsen和Verdenius，1973)。最初，使用致病疫黴分離物IPO82001、IPO655-2A和IPO428-2進行重複離脫葉測定後發現了ARD1197-16中對LB的抗性，並且在1998年在Marknesse的田間試驗中驗證。通過流式細胞術(Plantcytometryservices，Schijndel，荷蘭)證實克隆ARD1197-16的二倍體狀態。用致病疫黴分離物IPO82001接種後約6周，在Marknesse的試驗點的田間試驗的連續幾年裡，觀察到ABPT-來源的子代和作圖群中LB抗性性狀的明顯分離。通常，抗性克隆不顯示或幾乎無任何孢子形成病灶，而敏感克隆顯示出完全患疫病的葉子(圖4)。在2000年，以單個植物地塊對來自作圖群ARG95-3和ARP96-11的共2851個克隆篩選。平均24％克隆表現出不能清楚地歸類為抗性或敏感的表型。對於群體ARG95-3和ARP96-11，可以分為此類的克隆顯示出抗性對敏感表型分別為1∶1和1∶1.5的分離比(表2)。發現用ABPT-來源的子代和作圖群進行的離脫葉測定對於確定表型沒有田間條件下準確。然而，認為離脫葉測定結果適於初步確定個體克隆的表型，從而可以用於構建作圖群。實施例2ABTP來源的回交群體中Rpi-blb2抗性基因座的遺傳作圖在所有四種作圖群(圖1)中，抗性如對於單基因性狀預期的分離，表明在單個基因座上存在顯性抗性等位基因(表2)。將該基因座稱作Rpi-blb2基因座。為了鑑定與Rpi-blb2連鎖的標記，基於離脫葉測定，對10株抗性和10株敏感ARG95-15子代植物(包括親代克隆)的DNA進行初步AFLP分析，使用14個引物組合(pc)。對額外的89株植物的21種潛在連鎖標記的測試鑑定了與抗性連鎖的一些標記(圖5)。隨後用160個pc，對2個抗性和2個敏感DNA庫進行的大批分離子分析(BSA)鑑定了共58種可能與抗性連鎖的AFLP標記(圖5)，其中所述DNA庫每種含有8種抗性或敏感ARG95-15子代植物的基因組DNA。當對ARG95-3的137株子代植物測試許多這些標記時，它們也與該群體中的抗性連鎖，表明通過相同基因座確定兩個群體中的抗性(圖6)。這些共分離標記分別定位於ARG95-15和ARG95-3中基因座一邊的2到28釐摩(cM)和1到7.2cM，表明Rpi-blb2可以位於染色體的遠端位置。為了確定馬鈴薯的遺傳學圖上Rpi-blb2的位置，將兩種共分離標記AFLP標記E40M58和E46M52(圖6)克隆到pGEM-T載體(Promega，荷蘭)並測序。對所克隆的AFLP片段的序列末端設計的引物(表3)用於開發切割的經擴增的多態序列(CAPS)標記E40M58，發現其與ARG95-3的25個抗性和25個敏感克隆的抗性性狀共分離。隨後對CxE作圖群的46個子代植物測試CAPS標記E40M58(vanEck等人，1995)。將這些數據加到CxE群體的現有標記得分。Joinmap(Stam，1993)連鎖分析將E40M58定位到GP79遠端8cM(Gebhardt等人，1991)，將Rpi-blb2定位於6號染色體的短臂上。在群體ARG95-3的178個子代植物中，沒有觀察到Rpi-blb2和AFLP標記E40M58、E40M60和CAPS標記CT119之間的重組。AFLP標記E46M52和序列表徵的擴增區(SCAR)標記CT216定位於所述基因近端2.2cM(圖7)。實施例3鑑定與Rpi-blb2連鎖的RGA標記在鑑定與抗性連鎖的功能相關標記的嘗試中，基於植物R基因(Leister等人，1996)的NBS結構域的保守基序設計的引物用於改編AFLP方案(RGA-AFLP)用以鑑定抗性基因類似物(RGA)特異標記。使用Leister等人(1996)的基於P-環的引物S1聯合Eco00AFLP引物，開發了RGA特異標記S1E00，其與ARG95-3作圖群中的抗性和標記E40M58和CT119共分離(圖6和7)。實施例4開發用於重組篩選的E40M58e和E46M52eSCAR標記使用AR91-1263的基因組DNA作為模板，通過TAIL-PCR延伸AFLP標記E46M52的克隆的片段。使用引物ARO77(sp1)和ARO94(AD)進行初次TAIL-PCR。隨後，用ARO128(sp2)與引物AD聯合進行二次PCR，用ARO129(sp3)聯合引物AD進行三次PCR。這導致E46M52e片段，其在5』末端延伸約500bp。在pGEM-T中克隆E46M52e片段並測序。用該序列設計新的正向引物並且PCR聯合引物ARO77導致SCAR標記E46M52e，其與四個馬鈴薯作圖群中的抗性表型共分離，並且在群體B6中也作為CAPS標記。使用ARD1197-16的基因組DNA作為模板，還通過TAIL-PCR延伸AFLP標記E40M58的克隆片段。使用sp1引物ARO73(3′)和74(5′)聯合引物AD在5』和3』方向進行初次TAIL-PCR。隨後分別用sp2ARO82或79進行二次PCR。將從二次PCR得到的片段從3』末端750bp和從5』末端400bp克隆到pGEM-T中並測序。基於兩個序列，設計了兩種新引物，導致SCAR標記，其與作圖群ARG95-3和DP1中的抗性共分離(表3)。可以在作圖群ARG95-3和DP1的抗性親代中擴增SCAR標記E40M58e的片段，作圖群ARG95-3和DP1都來自ABPT克隆55(圖1)，但是作圖群ARP96-11和ARG95-15(都來自ABPT克隆60)的親代或子代克隆中PCR擴增不產生任何可檢測的PCR產物。假設這可能由基因組序列中的微小差異導致，因此，使用克隆AR91-1292的基因組DNA作為模板通過TAIL-PCR延伸AFLP片段。得到約300bp的E40M58e2片段，將其克隆並測序。將所述序列與AFLP標記E40M58的最初片段比較表明僅延伸片段的前37bp是相同的。用根據E40M58e2的序列設計的引物進行的PCR沒有得到多態性標記。對S.bulbocastanum的5個抗性或者敏感克隆(BGRC8005和8006)測試了延伸標記E40M48e和E40M58e2兩者。僅SCAR標記E40M58e的片段可以在S.bulbocastanum克隆中擴增，表明E40M58e2的序列部分不來自S.bulbocastanum。該觀察表明E40M58e位於克隆AR91-1292中S.bulbocastanum基因滲入片段的邊緣，並且Rpi-blb2基因座的位置接近標記E40M58e。實施例5來自ABTP材料的二倍體作圖群中Rpi-blb2的作圖用標記E40M58e和E46M52e篩選二倍體作圖群DP1的共149個子代克隆。當與四倍體作圖群ARG95-3比較時，在這些標記之間沒有發現重組，表明所研究的基因組區中受抑制的重組(圖7)。以部分重複的離脫葉測定對112個克隆的子集篩選對致病疫黴分離物IPO82001、IPO655-2A和IPO428-2的抗性。11個克隆(11％)顯示出中間反應並且歸類為具有未知表型。另外51和50個克隆分別歸類為抗性和敏感型。鑑定了三個子代克隆DP1-28、DP1-79和DP1-81，推定它們在Rpi-blb2基因座和標記E40M58e和E46M52e之間重組。在2000年，在Marknesse試驗點在田間試驗112個表型確定的克隆中50個克隆組成的子集對LB的抗性。這50個克隆的33個得到了關於LB抗性表型的結論性結果。用離脫葉測定法確定的克隆28和81的表型似乎是錯誤的。從而，斷定這些克隆不代表Rpi-blb2和所用的標記之間的重組事件。在田間條件下不能決定性驗證克隆DP1-79的表型並且該克隆可能代表DP1的101個子代克隆中Rpi-blb2基因座和標記E40M58e和E46M52e之間的唯一重組事件(1cM)。因為證明與ARG95-15、ARG95-3和ARP96-11中抗性性狀連鎖的兩種標記與DP1中LB-抗性的相同基因座共分離，斷定DP1親代克隆ARD1197-16適宜作為基於克隆方法的圖中Rpi-blb2基因分離的來源。實施例6ABPT來源的Rpi-blb2基因座的物理作圖對Rpi-blb2基因座雜合的抗性克隆ARD1197-16用作構建BAC文庫的源DNA(下文中稱作ARD1197-16BAC文庫)。如RouppevanderVoort等人(1999)中描述的實施高分子量DNA製備和BAC文庫構建。最初，將具有100kb的平均插入片段大小的共67968個克隆(其相應於約7個基因組當量)單獨在-80℃保存在177個384孔微量滴定板中。如RouppevanderVoort等人(1999)中描述的實施ARD1197-16BAC文庫的標記篩選。基本上，通過PCR，用與Rpi-blb2基因座連鎖的SCAR或者CAPS標記篩選為每個384孔板產生的DNA庫以便構建跨越Rpi-blb2基因座的BAC重疊群。用標記E40M58e、S1E00和CT119篩選ARD1197-16BAC文庫鑑定了一些陽性BAC克隆，其用作種子BAC，從其開始跨越Rpi-blb2基因座的染色體步查。標記E40M58e用於分離BAC克隆69和141，而BAC克隆14、24、123和133對於標記S1E00是陽性的。標記CT119用於分離BAC67。測序這些BAC克隆的左(L)和右(R)邊界後，開發了一組新的標記14L、24L、24R、69L、69R、141R、123L、123R、133R和67L。用這些標記篩選所分離的BAC克隆表明下面的BAC克隆對共有重疊123的右邊與133的左邊重疊、14完全與24重疊、69的左邊與141的右邊重疊。BAC67不與其他BAC克隆具有重疊。S1E00陽性BAC克隆14、24、123和133不形成單個重疊群這一發現表明S1E00是重複序列。該發現與BAC克隆24和123的右BAC末端序列顯示出與來自番茄的Mi1抗性基因的不同區域的同源性(Milligan等人，1998，Simons等人，1998)這一發現一起表明Rpi-blb2基因座含有一個以上的RGA。用標記141R、24L、24R和123L篩選最初的ARD1197-16BAC文庫不導致重疊群延伸。然而，用標記123R和133R篩選該文庫導致BAC克隆99和113的分離，從而以一個方向延伸BAC123/133。這兩個BAC克隆的BAC末端測序導致開發了兩個新標記99L和113R。用69R篩選ARD1197-16BAC文庫導致141/69重疊群的延伸。用來自BAC克隆的標記連續篩選BAC文庫進一步延伸該重疊群，導致BAC克隆36、41和112的分離，和標記36L、41L和112L開發。在完成跨越Rpi-blb2基因座的BAC重疊群的嘗試中，用～100kb的額外的38864個BAC克隆(384孔板編號178-273)擴大ARD1197-16BAC文庫。用標記24L、24R、123L和141R篩選該第二個文庫，導致鑑定對24R和123L都為陽性的BAC克隆(例如，191)和對24L陽性的BAC克隆(211、242)。這樣，克隆了BAC24和123之間的缺口並且24/14重疊群向BAC克隆141延伸。在延伸的ARD1197-16文庫中沒有對標記141R陽性的新克隆。實施例7構建BAC123/133區中額外的標記在從BAC123和133開發額外的多態標記的嘗試中，構建了BAC123和133的10kb亞克隆文庫。將BACDNA用Sau3AI部分切割，並且在載體pBINPLUS的BamHI位點中克隆約10kbp的片段。為了選擇含有最初BAC末尾序列的克隆，用BAC末尾標記123L或133R篩選BAC123的288個亞克隆和BAC133的192個亞克隆。共14個亞克隆對標記123L陽性，11個亞克隆對標記133R陽性。隨後，使用相關BAC末端標記的正向或反向引物聯合引物M13F或M13R(表3)，通過數次PCR確定BAC末端陽性克隆的定向。對於標記123L，選擇了3個亞克隆，對於標記133R，選擇了2個亞克隆，並對不含有123L或者133R標記的末端測序(約500bp)。基於該新序列，設計了兩種新引物用於亞克隆123，導致標記123L2，對於亞克隆133設計了兩種新引物，導致標記123R2。SCAR標記123L2(其位於標記123L近端10kbp處)似乎在作圖群ARG95-3、ARP96-11中是多態的，並且如B6中的CAPS。SCAR標記133R2(其位於標記133R遠端10kbp)在作圖群ARG95-3和ARP96-11中是唯一多態的。實施例8ABPT來源的作圖群中Rpi-blb2基因座的精細作圖為了對ABPT來源的作圖群中Rpi-blb2基因進行精確作圖，2000年在Marknesse的試驗點在田間試驗了作圖群ARG95-3的2283個新子代克隆和作圖群ARP96-11的598個克隆對LB的抗性(表2)。在群體ARG95-3中，846個克隆(37％)得分為敏感的，886個克隆為抗性的(39％)。剩餘的551個克隆的表型不清楚。在群體ARP96-11中，256個克隆(45％)得分為敏感的，170個克隆(30％)為抗性的。剩餘的142個(25％)的表型不清楚(表2)。來自作圖群ARG95-3和ARP96-11的846個和170個抗性克隆選擇用於分別用SCAR標記CT216和CAPS標記41L或36L進行重組篩選。在作圖群ARG95-3和ARP96-11中分別得到了共85(9.6cM)和22個(12.9cM)個重組體，將它們隨後用CAPS標記67L篩選，對於作圖群ARG95-3，將在標記間隔67L-36L重組體的數目減小到5個(0.56cM)，對於作圖群ARP96-11，在標記間隔67L-41L中減小到4個重組體(2.35cM)(圖8)。用SCAR和CAPS標記113R、99L、133R、133R2、123R、123L、24R、14L、24L、141R、69L、E40M58e和69R進一步分析這些剩餘的9個重組體。後兩個標記僅在作圖群ARG95-3中打分。在群體ARG95-3中，兩個克隆顯示出在標記E40M58e和69L之間的重組，將Rpi-blb2基因置於標記E40M58e近端0.23cM處。兩個其他克隆在標記113R和67L之間重組，一個克隆在標記133R2和133R之間重組，將Rpi-blb2基因置於標記133R遠端0.11cM處。在群體ARP96-11中，在標記41L和69L之間沒有檢測到重組，將Rpi-blb2基因置於標記36L近端0.58cM處。兩個子代克隆在標記113R和67L之間重組，一個克隆在標記99L和133R之間重組，將Rpi-blb2基因置於標記99L遠端0.58cM處(圖8；圖9)。實施例9S.bulbocastanum種內作圖群中晚疫抗性的評估和遺傳作圖為了產生S.bulbocastanum種內作圖群，從interaccessioncross(圖10)得到抗性克隆Blb2002該克隆與敏感克隆Bib48-5正反交，Blb48-5也在從interaccessioncross產生的子代中選擇(圖10)。所得群體稱作B6，其具有別名B6a、Blb99-229、Blb00-7和Blb00-8。最初，使用致病疫黴的分離物IPO655-2A的胞囊孢子溶液作為接種物，在部分重複的離脫葉測定中篩選B6群體的47個子代植物構成的小組對致病疫黴的抗性。接種後6到9天具有明顯顯示出孢子形成病灶的葉子的植物被認為是敏感表型，而不存在清楚的孢子形成下具有在接種邊沒有可見的症狀或者壞死的葉子的植物被認為是抗性的。在47個幼苗中，23個得分為抗性，24個為敏感的。這些數據表明作圖群B6的子代在離脫葉測定中得到抗性性狀的明顯分離，並且該抗性可以是由於單個顯性基因或者緊密連鎖的基因簇。為了確定該基因座的染色體位置，用標記112L和E46M52e分析46個幼苗。發現標記112L與抗性表型互斥連鎖，因為在該標記和46個幼苗的表型之間僅得到了兩個重組體(4cM)。而且，發現標記E46M52e與抗性表型互斥連鎖。這裡，在標記E46M52e和所述表型之間得到了5個重組體(11cM)。此外，用標記69R、69L和141R分別用額外的組6、15和14非重組幼苗分析標記112L和E40M58e之間的7個重組體，並且發現以偶聯(標記69R)或者互斥相(標記69L和141R)與抗性完全連鎖，表明該抗性基因位於與例如ABPT來源的作圖群中相同的基因座，即，Rpi-blb2上。為了更精確地確定Rpi-blb2相對於可利用標記的位置，培養B6作圖群的另外849個幼苗和來自正反交(圖10)的1054個幼苗並分析標記E46M52e和112L之間的重組。從而，除了最初47個幼苗，還篩選了B6群體的共1903個個體後代克隆。在共138個這些幼苗中檢測到標記E46M52e和112L之間的重組(7,25cM)。以兩步實施Rpi-blb2基因座的精確作圖。首先，用將從RD1197-16BAC文庫分離的BAC克隆的左(L)和右(R)邊界序列來源的標記14Lb、113R、123L2、24L、141R和69L(表3)通過額外篩選將138個重組體組成的組減小到19個，然後對在標記113R和69L之間重組的所有幼苗進行選擇。可能由於雙重組，四個重組體的標記圖譜得分偏離所研究的遺傳間距中單次重組事件並且假定標記的共線性時所預計的得分。將這些抽取用於進一步分析。其次，用從Blb2002文庫分離的BAC克隆的邊界序列的標記SPB39L和SPB30L，或者用MiGA標記24L9spec、24Lspec和14L24L(表3)分析剩餘的15個重組體。這剩餘的15個重組體(它們給出清楚的可解釋的標記得分和表型)的標記分析的結果將Rpi-blb2基因座置於標記69L和24L之間0.11cM(n＝1899)的遺傳間隔上(圖11)。實施例10MiGA標記用標記123R、14L或者24L作為探針對BAC克隆14、24、123和133的BAC克隆的DNA印跡分析表明這些BAC克隆含有一些抗性基因類似物(RGA)。考慮到標記14L、24L和123R與來自番茄的Mil基因的序列之間的同源性，在下文中將Rpi-blb2區內的RGA稱作Mi基因類似物(MiGA)。在開發Rpi-blb2間隔內的額外的多態性標記的嘗試中，將用引物組合14LR和24LF從BAC克隆24和123產生的PCR片段克隆到pGEM-T載體(Promega，荷蘭)並部分測序。基於這些部分序列的比對，設計了一組通用引物univ14L和univ24L(表3)，目的是在Rpi-blb2間隔內儘可能多地擴增MiGA的相應區。該通用引物組隨後用於開發與Rpi-blb2連鎖的MiGA特異SCAR/CAPS標記(例如，標記14L24L、24Lspec、24L9spec；圖9)。實施例11S.bulbocastanum來源的Rpi-blb2基因座的物理作圖對Rpi-blb2基因座雜合的抗性克隆Blb2002用作源DNA以構建S.bulbocastanumBAC文庫，其在下文中稱作Blb2002BAC文庫。如以前描述的實施高分子量DNA製備和BAC文庫構建。產生了共約100,000個克隆並保存為50個細菌庫，其含有約2000個白色菌落。通過用無菌玻璃塗布器，將來自瓊脂板的菌落刮除到含有18％甘油和12.5μg/ml氯黴素的LuriaBroth培養基產生這些細菌庫。為了篩選Blb2002BAC文庫，用標準鹼裂解方案從每個克隆庫分離質粒DNA，並實施PCR以鑑定陽性庫。將相應於陽性庫的細菌稀釋並塗布在含有氯黴素(12.5μg/ml)的LuriaBroth瓊脂板上。隨後挑選單個白色菌落到384孔微量滴定板中並如前述鑑定單個陽性BAC克隆。從Blb2002BAC文庫分離的BAC克隆的名稱帶有前綴BlbSP。為了建立跨越Rpi-blb2遺傳標記間隔(69L-24L)的Blb2002來源的BAC重疊群，用標記141R和24L篩選Blb2002BAC文庫。這導致BAC克隆BlbSP39和BlbSP30的分離，它們相互重疊並且跨141R-24L標記間隔。兩個BAC克隆的BAC末端序列用於開發標記SPB30L和SPB39L(圖9)。實施例12互補分析為了互補，靶定所有Rpi-blb2基因候選者，即存在於BAC克隆BlbSP30、BlbSP39、24、242和211上的所有MiGA用以亞克隆到雙元載體pBINPLUS(vanEngelen等人，1996)。這如下進行。將約1μgBACDNA的等分試樣用1U、0.1U或者0.01USau3AI限制酶消化30分鐘。部分消化的BACDNA進行4℃0.5×TBE中的輪廓夾緊的均勻電場(contour-clampedhomogeneouselectricfield)(CHEF)電泳，使用1-10秒的線性增加脈衝時間和6V/cm的場強持續16小時。電泳後，用溴化乙錠對瓊脂糖凝膠染色以定位含有大小約10kbp的DNA片段的凝膠區。從凝膠切除該區並用GELASE(EpicentreTechnologies，USA)根據生產商的方法處理。將大小選擇的DNA連接到BamHI消化並脫磷酸化的雙元載體pBINPLUS(vanEngelen等人，1995)中，然後轉化到ElectroMAX大腸桿菌DH10B感受態細胞(LifeTechnologies，UK)。每個BAC克隆，使用引物univ24L和univ14L(表3)對共384個克隆篩選MiGA序列的存在。選擇陽性克隆用於進一步表徵。基於用酶RsaI、TaqI、AluI、DpnII或者Msel消化的14L24L片段的限制圖，鑑定了MiGA的不同組。用通用引物univ14L和univ24L沒有檢測到含有標記24L的MiGA，標記24L完全存在於BAC克隆BIbSP39、211和242上。通過PCR，對於5』末端使用內部引物123Mi和14L2和對於3』末端使用univ14L和24L2聯合來自pBINPLUS載體序列的引物(ARO295和296；表3)確定10kbp亞克隆中MiGA序列的相對位置。對每個BAC文庫每個RGA選擇兩個亞克隆用於轉化。對於互補分析，通過農桿菌介導的轉化，使用分離物UIA143(Farrand等人，1989)或AGLO(Lazo等人，1991)將所選亞克隆轉移到敏感馬鈴薯栽培種Impala和Kondor。以離脫葉測定法，使用分離物IPO655-2A和IPO82001(表4)測試含有目的轉基因的原代轉化體對致病疫黴的抗性。僅含有RGC5的基因構建體(都來自馬鈴薯和S.bulbocastanum)能夠互補栽培種Impala和Kondor中的敏感表型；在19個含有RGC5的原代轉化體中共18個是抗性的(表4，圖12)，而所有含有RGC1、RGC2、RGC3、RGC4、RGC6、RGC7或RGC8基因的原代轉化體都對致病疫黴是敏感的。由於RGC5轉化體顯示出與作圖群B6的抗性S.bulbocastanum親代類似的抗性表型，所以將RGC5稱作Rpi-blb2基因。還可以將同源物RGC24L轉移到所描述的敏感馬鈴薯栽培種中並以離脫葉測定法測試對致病疫黴的抗性。通過DNA印跡分析法分析一組含有RGC5的原代轉化體的拷貝數。將EcoRI消化的基因組DNA與nptII探針雜交(表3)。基於nptII雜交片段數的存在，原代轉化體含有至少1到11個轉基因插入片段。共觀察到栽培種Impala中4個單一拷貝整合，在栽培種Kondor中觀察到6個單一拷貝整合，其中一個栽培種Kondor轉化體似乎具有致病疫黴敏感表型。為研究Rpi-blb2是否也可以互補番茄中的敏感表型，產生含有Rpi-blb2基因構建體的栽培種Moneymaker的原代轉化體並用番茄來源的分離物IPO82001和IPO655-2A測試。疾病抗性測定揭示RGC5也能夠互補敏感番茄表型(表6)。實施例13Rpi-blb2基因構建體和推定的胺基酸序列通過引物行走(primerwalk)策略對含有RGC5的雙元亞克隆211F/C12和SP39-20的插入片段測序，其中用一組嵌套引物實施連續輪的測序，所述嵌套引物設計為延伸相鄰序列。用M13F和M13R引物產生第一組序列。克隆211F/C12和SP39-20的插入片段的完整序列分別由7967和9949個核苷酸(nt)組成(圖13)。克隆211F/C12的序列與克隆SP39-20的相應序列相同。用GENSCAN(Burge和Karlin，1997)、GeneMark(Lukashin和Borodovsky1998)並通過與Mil.1和Mil.2的基因序列比對預測Rpi-blb2的位置和推定結構。用GeneRacerTM試劑盒(InvitrogenTM，Groningen，荷蘭)，通過cDNA末端的5』和3』快速擴增(RACE)確定編碼序列的精確長度和結構。RACE鑑定5』和3』Rpi-blb2特異cDNA片段，其分別包含767和201個核苷酸(nt)的5』和3』未翻譯區(UTR)。Rpi-blb2基因含有2個內含子。內含子1為626nt長並且位於ATG起始密碼子上遊5』URT末端32個核苷酸內。內含子2長為86nt，從基因的ATG起始密碼子上遊42個核苷酸開始。Rpi-blb2轉錄物的編碼序列為3804個核苷酸。Rpi-blb2基因的推導的可讀框編碼所預測的1267個胺基酸的多肽，估計其具有146kDa的分子量(圖14)。植物R基因的NBS-LRR類的R基因中存在的一些功能基序在所編碼的蛋白質中是明顯的。如圖14中闡明，Rpi-blb2蛋白質屬於NBS-LRR抗性蛋白質的亮氨酸拉鏈(LZ)子集。Rpi-blb2蛋白質的N-末端半部分含有胺基酸413和434之間的潛在LZ區和指示核苷酸結合位點的6個保守的基序(vanderBiezen和Jones，1998)。Rpi-blb的C-末端半部分包含一系列15個不規則的LRRs，它們可以根據在其他細胞質R蛋白質中觀察到的共有序列hxxhxxLxxLxLxxC/N/Sx(x)LxxLPxx比對，其中h可以為L、I、M、V或F，x為任意胺基酸殘基(Jones和Jones，1997)。實施例14與本領域已知狀態的R基因序列的同源性為鑑定Rpi-blb2基因的計算機晶片上(insilico)同源性，用Rpi-blb2基因的編碼序列實施BLAST檢索(Altschul等人，1990)。BLASTN檢索鑑定了具有與Rpi-blb2基因顯著同源性的許多序列。使用DNAStar軟體包中的比對程序ClustalW(標準設置)，我們確定Rpi-blb2編碼序列與Mi-1.1(89.8％)和Mi-1.2(89.7％)的最高同源性(Genbank檢索號分別為AF039681和AF039682)。後一序列相應於番茄的Mi基因，其賦予對根結線蟲(Meloidogynespp.)的三種最具破壞性的種的抗性(Milligan等人，1998)。此外，Rpi-blb2編碼序列的核苷酸2410-3461與龍葵(Solanumnigrum)的部分NBS-LRR序列(Genbank檢索號AY055116.1)共有87.8％序列同源性。在胺基酸水平，推定的Rpi-blb2蛋白質序列與Mi-1.1(82％同一性)和Mi-1.2(81％同一性)具有最高同源性(Genbank檢索號AF039681和AF039682)。通過Rpi-blb2、Mi-1.1和Mi-1.2的推導的胺基酸序列的ClustalW比對，我們鑑定了Rpi-blb2獨特的200個胺基酸(aa)殘基(圖15)。其中，發現31個在高變位置，即，該位置的殘基在所有三種序列中都不同並且11個由小插入編碼(一個3aa殘基插入和一個8aa殘基插入)。剩下的為Rpi-blb2特異的，因為在Mi-1.1和Mi-1.2的相應位置遇到的aa殘基與Rpi-blb2殘基不同但是在兩個Mi蛋白質序列中保守(圖15)。有趣地，在包括Mi(Axtell等人，2001；Banerjee等人，2001)的許多NBS-LRR蛋白質的三個LRR中保守的VLDL基序不在Rpi-blb2中保守(圖15)。實施例15野生茄樹物種中Rpi-blb2等位基因mining使用關於Rpi-blb2基因的起始和終止密碼子設計的引物ARF1F和ARF1R(表3B)，可能通過PCR從任意茄科物種擴增Rpi-blb2的等位基因。可以用雙元質粒克隆轉錄調節序列之間的擴增產物並將其通過農桿菌介導的轉化或者本領域技術人員已知的任意方法轉移到馬鈴薯。可以隨後分析所得原代轉化體對致病疫黴或者其中馬鈴薯作為其宿主植物的任意病原體的抗性。實施例16材料和方法植物材料和(1)馬鈴薯中作圖群的開發。由Hermsen和同事(Hermsen，1966；Hermsen和Ramanna，1969；Ramanna和Hermsen，1971；Hermsen和Ramanna，1973；Hermsen，1983；Hermsen，1994)製備稱作ABPT的複雜種間雜種克隆(圖1a)。Hermsen(1966)和Hermsen和DeBoer(1971)描述了用秋水仙素進行染色體加倍步驟。認為某些ABTP克隆中對致病疫黴的抗性是來自S.bulbocastanumBGRC8007(CGN21306；Pi275196)和BGRC8008(CGN17693；Pi275198)的accessions的之一或者兩者，S.bulbocastanumBGRC8007和BGRC8008用於最初的雜交中以產生S.acaule和S.bulbocastanum之間的雜種，因為用於ABPT克隆的育種方案中所有其他親本在離脫葉測定中都對致病疫黴敏感或者僅部分抗性(Hermsen和Ramanna，1973)。在1988年從前DepartmentofPlantBreedingoftheWageningenAgriculturalUniversity(Wageningen，荷蘭)接受群體[(ABPT克隆數55×栽培種(cv)OberarnbacherFrühe)xcvArkula]的19個克隆的塊莖、群體[(ABPT克隆數55cvOberarnbacherFrühe)xcvBlanka]的7個克隆的塊莖、群體[(ABPT克隆數60xcvAlcmaria)xcvBlanka]的5個克隆的塊莖。克隆ARF87-507、ARF87-801和ARF87-601分別選自這些群體。它們代表與複雜種間ABPT克隆的第二次回交(BC2)的後代並用於進一步回交，其導致一個四倍體BC3群體、兩個四倍體BC4群體和一個二倍體BC4群體，這些群體用於Rpi-bib2基因的遺傳作圖(圖1)。通過致病疫黴抗性克隆ARF87-507與敏感栽培種Alkon雜交產生四倍體馬鈴薯作圖群。通過致病疫黴抗性克隆AR91-1263與敏感栽培種Cosmos雜交產生四倍體群體ARG95-3。通過抗性克隆AR92-1292與敏感栽培種Celeste雜交產生四倍體群體ARP96-11。通過抗性克隆ARD1197-16與敏感克隆ARD93-2090雜交得到二倍體群體DP1(圖1)。植物材料和在(2)Solanumbulbocastanum中作圖群的開發通過致病疫黴抗性克隆Blb2002(別名M94-81-C)與敏感克隆Blb48-5雜交產生稱作B6(別名B6a、Blb99-229、Blb00-7和Blb00-8)的二倍體S.bulbocastanum作圖群。合併從群體B6的正反交得到的結果。從作為雌性親本的S.bulbocastanum克隆Blb93-D26-3(accessionBGRC8002；CGN17690；Pi275187)和作為雄性親本的S.bulbocastanum克隆Blb93-60-10(accessionBGRC8006；Pi275194)之間雜交得到群體B6的抗性親代克隆。從來自accessionsBGRC8005(CGN17692，PI275193)和BGRC8006的S.bulbocastanum克隆之間的雜交得到群體B6的敏感親代克隆。疾病測定(1)致病疫黴分離物從PlantResearchInternationalB.V.(Wageningen，荷蘭)得到三種不同的致病疫黴分離物。分離物具有如下不同的品種結構和交配型IPO82001品種結構1.2.3.4.5.6.7.10.11，交配型A2；IPO655-2A品種結構1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11，交配型A1；IPO428-2品種結構1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11，交配型A2(Flier等人，2003)。疾病測定(2)田間試驗從1985到2002在荷蘭的Marknesse、1991年在墨西哥的Toluca地區或者1992年在菲律賓的Benguet省在試驗點種植溫室生長的幼苗塊莖或者田間生長的種子馬鈴薯。對於單個克隆，小塊土地種植由1到10個塊莖。種植後約8周，Marknesse的田間用致病疫黴IPO82001的胞囊孢子溶液接種並在接種後3到6周收集疾病得分。沒有或者幾乎沒有晚疫的克隆分類為具有抗性表型而具有完全或幾乎完全患疫病的葉子的克隆分類為敏感型。對晚疫具有中間反應的克隆分類為具有未知表型。在墨西哥和菲律賓的田間試驗中，發生天然感染。一旦建立致病疫黴的該天然感染，分別在8和6天以1-9等級對每小塊土地上植物的患疫病葉子的百分數打分，所述1-9等級為患疫病葉子的估計百分數，它們為0、3、10、25、50、75、90、97和100(Estrada-Ramos等人，1983)。疾病測定(3)離脫葉對於離脫葉測定，將在溫室中生長6到12周的植物的葉子以小片置於水飽和的約35×4×4cm的floristsfoam中，並置於有孔底部的盤子(40cm寬，60cm長，6cm高)中。用兩滴(每滴25μl)孢囊孢子溶液在遠軸邊接種每個葉片。隨後，將盤子置於盤頂的塑料包中，其中放置水飽和的濾紙，並在人工氣象室(climateroom)中17℃中和使用螢光的16h/8h/白天/黑夜光周期下(PhilipsTLD50W/84HF和OSRAML58W/21-840)孵育。6-9天後，對葉子評估致病疫黴疾病症狀的發展。評估認為接種後6到9天具有明顯顯示孢子形成病灶的植物具有敏感表型，而認為具有在接種側不存在明顯孢子形成、不表現可見症狀或者壞死的葉子的植物是抗性的。植物DNA標記篩選根據Bendahmane等人(1997)等人的方法從幼葉提取基因組DNA。對於PCR分析，製備15μl反應混合物，其含有0.5μgDNA、15ng每種引物、0.2mM每種dNTP、0.6單位Taq聚合酶(15U/μl，SphaeroQ，Leiden，荷蘭)，10mMTris-HClpH9，1.5mMMgCl2，50mMKCl，0.1％TritonX-100和0.01％(w/v)明膠。使用下面的循環方案進行PCR94℃下25秒DNA變性、30秒退火和72℃下延伸40秒。由於PCR擴增DNA的第一步是94℃變性5分鐘，最後是72℃額外的5分鐘延長步驟。以BiometraT-Gradient或BiometraUno-II熱循環儀(Westburg，Leusden，荷蘭)進行擴增反應。取決於標記，將PCR產物用適宜的限制酶消化。在表3中給出標記概述，包括引物序列、退火溫度和限制酶(如果適宜)。隨後，用電泳在瓊脂糖或者丙烯醯胺凝膠中分析(切割的)PCR產物。對於丙烯醯胺凝膠分析，使用CleanGelDNAAnalysisKit和DNASilverStainingKit(AmershamPharmaciaBiotechBenelux，Roosendaal，荷蘭)。通過熱不對稱交錯(TAIL)-PCR延伸AFLP片段根據Liu和Whittier(1995)通過TAIL-PCR進行AFLP片段的序列延伸。簡言之，使用2或3種嵌套特異引物(sp)聯合任意簡併(AD)引物進行AFLP片段的延伸。根據表5中所描述的方案，用引物sp1和AD進行第一次PCR，用sp2和AD進行第二次PCR，用sp3和AD進行第三次PCR。用含有如前描述的標準PCR混合物的25μl反應物進行PCR，只是使用30ng引物AD。用pGEM-T(Promega，荷蘭)克隆延伸的片段並測序。BAC文庫構建和測序對Rpi-blb2基因座雜合的抗性克隆ARD1197-16用作構建馬鈴薯BAC文庫的源DNA。對Rpi-blb2基因座雜合的抗性克隆Blb2002用作構建S.bulbocastanumBAC文庫的源DNA。如RouppevanderVoort等人(1999)中所述進行高分子量DNA製備和BAC文庫構建。對於馬鈴薯BAC文庫，最終得到了平均插入大小100kb的約120,000個克隆，其對應8到10個基因組當量。將總共約70,000個克隆單獨在177個384孔微量滴定板中-80℃保存。另外50,000個克隆以含有約4000個白色菌落的14個細菌庫保存。通過用無菌玻璃塗布器將所述克隆從瓊脂板刮除到含有18％甘油和12.5μg/ml氯黴素的LuriaBroth培養基得到這些克隆。這些所稱作的超級庫(superpool)也保存在-80℃。最後，將另外37,000個克隆加入馬鈴薯BAC文庫。S.bulbocastanumBAC文庫由約2,000個菌落的48個超級庫組成。如RouppevanderVoort等人(1999)中描述的進行含有單獨保存的BAC克隆的BAC文庫的標記篩選。為了篩選以超級庫保存的BAC文庫，用標準鹼裂解方案從每個克隆庫分離質粒DNA並實施PCR以鑑定陽性庫。將相應於陽性庫的細菌稀釋並在含有氯黴素(12.5μg/ml)的LuriaBroth瓊脂板上鋪板。隨後挑選單個白色菌落置於384孔微量滴定板中並隨後如上述鑑定單個陽性BAC克隆。從超級庫分離的BAC克隆的名稱帶有前綴SP(例如，SP39)。候選基因的亞克隆如下從BAC克隆24、211、242、BLBSP39和BLBSP30亞克隆候選RGA。將約1μgBACDNA的等分試樣用1U、0.1U或者0.01USau3AI限制酶消化30分鐘。將部分切割的BACDNA進行4℃下0.5×TBE中CHEF電泳，使用1-10秒的線性增加的脈衝時間，場強為6V/cm，電泳16小時。電泳後，用溴化乙錠對瓊脂糖凝膠染色以定位含有約10kbp大小的DNA片段的凝膠區。從凝膠切割該區並用GELASE(EpicentreTechnologies，USA)根據生產商的說明處理。將大小選擇的DNA連接到BamHI切割並脫磷酸化的雙元載體pBINPLUS(vanEngelen等人，1995)，然後轉化到ElectroMAX大腸桿菌DH10B感受態細胞(LifeTechnologies，UK)。用標記24L14L(表3)的引物對總共192個克隆通過PCR篩選RGC序列的存在。選擇陽性克隆用於進一步表徵。通過對來自陽性克隆的14L24LPCR片段測序實施含有RGC1、RGC2、RGC3、RG4、RGC5、RGC6、RGC7、RGC8和RGC24L的克隆的鑑定。通過PCR分析，使用內部引物(24L2，123Mi)聯合pBINPLUS特異引物(表3)確定亞克隆內RGA的相對位置。馬鈴薯的根癌農桿菌介導的轉化將含有候選基因的雙元質粒轉化到根癌農桿菌株系AGL0(Lazo等人，1991)或UIA143(Farrand等人，1989)中，後者含有輔助質粒pCH32(Hamilton等人，1996)。所轉化的根癌農桿菌株系的過夜培養物用於根據標準方案(Hoekema等人，1989；Fillati等人，1987)轉化馬鈴薯塊莖圓片(discs)(栽培種Impala和Kondor)。簡言之，將栽培種Impala和Kondor的檢定種子馬鈴薯去皮並在含有0.1％Tween20的1％次氯酸鈉溶液中消毒30分鐘。然後以大量無菌蒸餾水充分洗滌塊莖(4次，10分鐘)。從用木塞鑽孔器製備的塊莖組織柱體切割厚約2mm和直徑為7mm的圓片。將塊莖圓片轉移到含有根癌農桿菌的液體MS30培養基中並孵育15分鐘。除去根癌農桿菌溶液後，將塊莖圓片轉移到含有MS30、0.9mg/lIAA、3.6mg/lzeatineriboside和8g/l瓊脂的再生培養基(Hoekema等人，1989)中。將平板在24℃16小時晝長下孵育(PhilipsTLD50W/84HF)。共培養48小時後，將塊莖圓片在包含抗生素200mg/l萬古黴素、250mg/l頭孢噻肟和75mg/l卡那黴素的液體MS培養基中衝洗5分鐘並轉移到補加相同抗生素的再生培養基中。將平板在24℃16小時晝長下孵育(PhilipsTLD50W/84HF)。每三周將塊莖圓片轉移到新鮮培養基中。將再生枝條轉移到含有75mg/l卡那黴素的MS30培養基中。體外繁殖生根的枝條並通過將一小片莖幹在3mLLuriaBroth培養基孵育(3周，37℃，400轉/分鐘)檢測根癌農桿菌的缺乏。將一棵每種轉化的再生植物轉移到溫室中。番茄的根癌農桿菌介導的轉化用70％乙醇衝洗敏感番茄品種Moneymaker的種子以溶解種皮並用無菌水洗滌。隨後，將種子用1.5％次氯酸鈉表面消毒15分鐘，用無菌水衝洗3分鐘並置於含有補加10g/l蔗糖(MS10)和160ml蛭石的140mlMS培養基pH6.0(Murashige和Skoog，1962)的容器中。讓種子在25℃和0.5W/M2光下發芽8天。將8天齡的子葉外植體在培養皿中預培養24小時，其中所述培養皿含有鋪在共培養培養基(補加Nitsch維生素(DuchefaBiochemieBV，Haarlem，荷蘭)，0.5g/lMES緩衝液和8g/lDaichin瓊脂的MS30，pH5.8))上的菸草懸浮細胞的2周齡滋養層。將根癌農桿菌的過夜培養物離心並將沉澱重懸浮在含有200μM乙醯丁香酮的細胞懸浮培養基(補加Nitsch維生素、0.5g/lMES緩衝液，pH5.8的MS30，pH5.8)中至最終O.D.600為0.25。然後用含有pBINRGC5的根癌農桿菌UIA143的稀釋的過夜培養物感染外植體25分鐘，在無菌濾紙上印跡乾燥並在最初滋養層平板上共培養48小時。培養條件如上述。共培養後，將子葉外植體轉移到具有選擇性芽誘導培養基(補加10g/l蔗糖的MSpH5.8，包括Nitsch維生素、0.5g/lMES緩衝液、5g/l瓊脂凝膠、2mg/lzeatineriboside、400mg/l羧苄青黴素、100mg/l卡那黴素、0.1mg/lIAA)的培養皿並在25℃，3-5W/m2光下培養。外植體每3周在新鮮培養基上傳代培養。將出現的芽從下面的愈傷組織解剖並轉移到具有選擇性根誘導培養基(MSpH5.8，補加Nitsch維生素、0.5g/lMES緩衝液、5g/l瓊脂凝膠、0.25mg/lIBA、200mg/l羧苄青黴素和100mg/l卡那黴素)的容器中。RNA提取用Trizol根據生產商(InvitrogenTM，Groningen，荷蘭)提供的方案(具有小的改動)分離總RNA。簡言之，將0.5g幼葉組織在液氮中研磨並將粉末懸浮在5mlTrizol中。室溫(RT)下孵育5分鐘後，加入0.5ml氯仿，渦旋懸浮物並孵育2分鐘。離心(15分鐘，11404×g，4℃)後，將上清液轉移到新管中並加入2.5ml異丙醇。室溫下10分鐘後，沉澱核酸(10分鐘，11404×g，4℃)。用5ml70％乙醇洗滌沉澱(5分鐘，室溫)並離心(5分鐘，6415×g，4℃)後，乾燥沉澱並重懸浮在100μl無菌蒸餾水中。用OligotexTMmRNAmidi試劑盒(Qiagen，GmbH，德國)從總RNA提取PolyA+RNA。cDNA末端的快速擴增使用GeneRacerTM試劑盒(InvitrogenTM，Groningen，荷蘭)通過cDNA末端的快速擴增(RACE)確定Rpi-blb2cDNA的5』和3』末端並證實推定的內含子位置。對用引物GSP4(ARO772)合成的cDNA實施5』RACE。隨後，引物GSP6(ARO774)與GeneRacerTM5』引物聯合使用並且將GSP6與GeneRacerTM5』嵌套引物聯合實施最後擴增。用嵌套引物GSP1(ARO769)和GSP2(ARO770)聯合GeneRacerTM3』引物實施3』RACE。用GSP3(ARO771)聯合GeneRacerTM嵌套3』引物實施最後擴增。用Accuprime(vitrogenTM，Groningen，荷蘭)代替GeneRacerTM試劑盒提供的Taq聚合酶實施3』和5』RACE擴增步驟。AFLP指紋法和AFLP片段的克隆基本上如Vos等人(1995)中描述的進行模板製備和AFLP指紋法。為了克隆特異片段，通過重疊聚丙烯醯胺凝膠，在Whatmann3MM紙上乾燥，用放射自顯影圖從丙烯醯胺凝膠切除33P-標記的AFLP片段。切除目的帶下的凝膠/紙片並轉移到200μlTE中並在室溫孵育1小時。使用PCR，用5微升上清液再擴增片段，其中EcoRI+0聯合MseI+0用作引物。將再擴散的AFLP片段隨後克隆到pGEM-T克隆載體(Promega，荷蘭)並對一些克隆的插入片段測序。切除的AFLP帶的DNA序列用於設計基因座特異引物。使用限制酶，對用此類引物得到的擴增產物篩選內部多態性。限制性酶切後，將片段在含有溴化乙錠的2-3％瓊脂糖凝膠上分離。RGA-AFLP分析基本上如Vos等人(1995)中描述進行模板製備。然而，用Leister等人(1996)的基於P-環的引物S1聯合EcoRI+0AFLP引物進行第二次擴增步驟。將10μl反應混合物加入到10μl稀釋的模板(在MQ水中稀釋20倍)並使用下面的循環方案進行PCR反應94℃下45秒DNA變性，49℃下45秒引物退火和72℃下2分鐘的延伸步驟(35個循環)。循環前，將模板DNA在94℃變性2分鐘並在72℃進行額外的5分鐘延伸步驟完成PCR。擴增反應在PerkinElmer9600熱循環儀中進行。標記的PCR產物片段在6％聚丙烯醯胺凝膠上分離並通過放射自顯影根據標準步驟對各個帶顯色。實施例17Rpi-blb2表達的表型材料和方法用3mlH2O衝洗受感染小葉(IPO82001)的四個病灶(在標準條件下接種後6天)。用血細胞計數器Fuchs-Rosenthal(W.SchreckHofheim/Ts.)確定濃度。定義孢子形成指數是在受感染的小葉的病灶上檢測的每ml孢子囊的量。表7在離脫葉測定中用致病疫黴感染後不同基因型的孢子形成指數Rpi-blb2和其他致病疫黴抗性基因之間的差別是Rpi-blb2允許低水平孢子形成(圖18)。這通過離脫葉測定闡明，其中Rpi-blb2基因型(ARD92-1197-16)上存在的病灶顯示出低水平孢子囊，相比在含有S.demissum基因R2的基因型上完全不存在孢子囊。然而，孢子形成指數為敏感表型(cv.Bintje)的僅1.1％(表7和圖18)。田間實驗也表明Rpi-blb2允許低水平感染。在生長期(圖3，ARF87-801)或者在生長期結束(圖2，ARF87-601；圖3，ARF87-507和ARF87-601)時產生低水平晚疫症狀。參考文獻Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，和Lipman，D.J.(1990)Basiclocalalignmentsearchtool.JournalofMolecularBiology215，403-410.Axtell，M.J.，McNellis，T.W.，Mudget，M.B.，Hsu，C.S.，和Staskawicz，B.J.(2001)MutationalanalysisoftheArabidopsisRPS2diseaseresistancegeneandthecorrespondingPseudomonassyringaeavrRpt2virulencegene.MolecularPlant-Microbeinteractions14，181-188.Balivora，A.，Ercolano，M.R.，Weis，J.，Meksem，K.，Bormann，C.A.，Oberhagen，P.，Salamini，F.，和Gebhardt，C.(2002)TheR1geneforpotatoresistancetolateblight(Phytophthorainfestans)belongstotheleucinezipper/NBS/LRRclassofplantresistancegenes.PlantJournal30，361-371.Banerjee，D.，Zhang，X.，和Bent，A.F.(2001)Theleucine-richrepeatdomaincandetermineeffectiveinteractionbetweenRPS2andotherhostfactorsinArabidopsisRPS2-mediateddiseaseresistance.Genetics158，439-450.Bendahmane，A.，Kanyuka，K.，和Baulcombe，D.C.(1997)TheHigh-resolutiongeneticandphysicalmappingoftheRxgeneforextremeresistancetopotatovirusXintetraploidpotato.TheoreticallyAppliedGenetics95，153-162.Burge，C.B.和Karlin，S.(1997)PredictionofcompletegenestructuresinhumangenomicDNA.JournalofMolecularBiology268，78-94.Colon，L.T.，Turkensteen，L.J.，Pummel，W.，Budding，D.J.和Hoogendoorn，J.(1985)Durableresistancetolateblight(Phytophthorainfestans)inoldpotatocultivars.EuropeanJournalofPlantPathology101，387-397.Dangl，J.L.和Jones，J.D.G.(2001)Plantpathogensandintegrateddefenceresponsestoinfection.Nature411，826-833.Estrada-Ramos，N.，Perez-Alvarez，O.，Henfling，J.和Malamud，O.(1983)InW.J.Hooker(ed)，Researchforthepotatointheyear2000.InternationalPotatoCenter，Lima，Peru，pp78-79.Farrand，S.K.，O′Morchoe，S.P.，和McCutchan，J.(1989)ConstructionofanAgrobacteriumtumefaciensC58recAmutant.JournalofBacteriology171，5314-5321.Fillati，J.J.，Kiser，J.，Rose，R.，和Comai，L.(1987)EfficienttransferofaglyphosphatetolerancegeneintotomatousingabinaryAgrobacteriumtumefaciensvector.BioTechnology5，726-730.Flier，W.G.(2001)VariationinPhytophthorainfestans，sourcesandimplications.PhDthesisWageningenUniversity，Wageningen，荷蘭，p.93.Flier，W.G.，vandenBosch，G.B.M.，andTurkensteen，L.J.(2003)StabilityandpartialresistanceinpotatocultivarsexposedtoaggressivestrainsofPhytophthorainfestans.PlantPathology52(3)，326-337.Gebhardt，C，Ritter，E.，Barone，A.，Debener，T.，Walkemeier，B.，Schachtschabel，U.，Kaufmann，H.，Thompson，R.D.，Bonierbale，M.W.，Ganal，M.W.，Tanksley，S.D.，和Salamini，F.(1991)RFLPmapsofpotatoandtheiralignmentwiththehomologoustomatogenome.TheoreticallyAppliedGenetics83，49-57.Hamilton，C.M.，Frary，A.，Lewis，C.，和Tanksley，S.D.(1996)StabletransferofintacthighmolecularweightDNAintoplantchromosomes.ProceedingsofNationalAcademyofScienceUSA93，9975-9979.Hermsen，J.G.Th.(1966)Crossability，fertilityandcytogeneticstudiesinSolanumacaulexSolanumbulbocastanum.Euphytica15，149-155.Hermsen，J.G.Th.和Ramanna，M.S.(1969)MeiosisindifferentFi-hybridsofSolanumacauleBitt.xS.bulbocastanumDun.andit′sbearingongenomerelationship，fertilityandbreedingbehaviour.Euphytica18，27-35.Hermsen，J.G.Th.，和DeBoer，A.J.E.(1971)TheeffectofcolchicinestreatmentsonSolanumacauleandS.bulbocastanum；acompleteanalysisofploidychimerasinS.bulbocastanum.Euphytica20，171-180Hermsen，J.G.Th.和Ramanna，M.S.(1973)Double-bridgehybridsofSolanumbulbocastanumandcultivarsofSolanumtuberosum.Euphytica22，457-466Hermsen，J.G.Th.和Verdenius，J.(1973)SelectionfromSolanumtuberosumgroupPhurejaofgenotypescombininghigh-frequencyhaploidinductionwithhomozygosityforembryo-spot.Euphytica22，244-259.Hermsen，J.G.Th.(1983)Utilizationofwidecrossesinpotatobreeding.InReportofaplanningconferenceonpresentandfuturestrategiesforpotatobreedingandimprovement.InternationalPotatoCenter，Lima，Peru，pp115-132.He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leIleLeuThrThrArgGluLysLysVal660665670AlaLeuHisGlyLysLeuTyrThrAspProLeuAsnLeuArgLeuLeu675680685ArgSerGluGluSerTrpGluLeuLeuGluLysArgAlaPheGlyAsn690695700GluSerCysProAspGluLeuLeuAspValGlyLysGluIleAlaGlu705710715720AsnCysLysGlyLeuProLeuValValAspLeuIleAlaGlyIleIle725730735AlaGlyArgGluLysLysLysSerValTrpLeuGluValValAsnAsn740745750LeuHisSerPheIleLeuLysAsnGluValGluValMetLysValIle755760765GluIleSerTyrAspHisLeuProAspHisLeuLysProCysLeuLeu770775780TyrPheAlaSerAlaProLysAspTrpValThrThrIleHisGluLeu785790795800LysLeuIleTrpGlyPheGluGlyPheValGluLysThrAspMetLys805810815SerLeuGluGluValValLysIleTyrLeuAspAspLeuIleSerSer820825830SerLeuValIleCysPheAsnGluIleGlyAspTyrProThrCysGln835840845LeuHisAspLeuValHisAspPheCysLeuIleLysAlaArgLysGlu850855860LysLeuCysAspArgIleSerSerSerAlaProSerAspLeuLeuPro865870875880ArgGlnIleSerIleAspTyrAspAspAspGluGluHisPheGlyLeu885890895AsnPheValLeuPheGlySerAsnLysLysArgHisSerGlyLysHis900905910LeuTyrSerLeuThrIleAsnGlyAspGluLeuAspAspHisLeuSer915920925AspThrPheHisLeuArgHisLeuArgLeuLeuArgThrLeuHisLeu930935940GluSerSerPheIleMetValLysAspSerLeuLeuAsnGluIleCys945950955960MetLeuAsnHisLeuArgTyrLeuSerIleGlyThrGluValLysSer965970975LeuProLeuSerPheSerAsnLeuTrpAsnLeuGluIleLeuPheVal980985990AspAsnLysGluSerThrLeuIleLeuLeuProArgIleTrpAspLeu99510001005ValLysLeuGlnValLeuPheThrThrAlaCysSerPhePheAsp101010151020MetAspAlaAspGluSerIleLeuIleAlaGluAspThrLysLeu102510301035GluAsnLeuThrAlaLeuGlyGluLeuValLeuSerTyrTrpLys104010451050AspThrGluAspIlePheLysArgLeuProAsnLeuGlnValLeu105510601065HisPheLysLeuLysGluSerTrpAspTyrSerThrGluGlnTyr107010751080TrpPheProLysLeuAspPheLeuThrGluLeuGluLysLeuThr108510901095ValAspPheGluArgSerAsnThrAsnAspSerGlySerSerAla110011051110AlaIleAsnArgProTrpAspPheHisPheProSerSerLeuLys111511201125ArgLeuGlnLeuHisGluPheProLeuThrSerAspSerLeuSer113011351140ThrIleAlaArgLeuLeuAsnLeuGluGluLeuTyrLeuTyrArg114511501155ThrIleIleHisGlyGluGluTrpAsnMetGlyGluGluAspThr116011651170PheGluAsnLeuLysCysLeuMetLeuSerGlnValIleLeuSer117511801185LysTrpGluValGlyGluGluSerPheProThrLeuGluLysLeu119011951200GluLeuSerAspCysHisAsnLeuGluGluIleProSerSerPhe120512101215GlyAspIleTyrSerLeuLysIleIleGluLeuValArgSerPro122012251230GlnLeuGluAsnSerAlaLeuLysIleLysGluTyrAlaGluAsp123512401245MetArgGlyGlyAspGluLeuGlnIleLeuGlyGlnLysAspIle125012551260ProLeuPheLys126521052117967212DNA213Solanumbulbocastanum220221基因組_DNA_片段222(1)..(7967)223存在於p211F-C12中的ARD1197-16BAC211的7967bpSau3AI基因組DNA片段的序列，Rpi-blb2基因包括該基因的正確表達所需的天然調節元件。起始密碼子(ATG位置1546-1548)和終止密碼子(TAG位置5433-5435)220221stop_codon222(5433)..(5435)223存在於p211F-C12中的ARD1197-16BAC211的7967bpSau3AI基因組DNA片段的序列，Rpi-blb2基因包括該基因的正確表達所需的天然調節元件。起始密碼子(ATG位置1546-1548)和終止密碼子(TAG位置5433-5435)220221start_codon222(1546)..(1548)223存在於p211F-C12中的ARD1197-16BAC211的7967bpSau3AI基因組DNA片段的序列，Rpi-blb2基因包括該基因的正確表達所需的天然調節元件。起始密碼子(ATG位置1546-1548)和終止密碼子(TAG位置5433-5435)4005gatctagaatcaccgaacctcccctcggtacagctcctccagttctaccatgaatttcat60ccactgattcctcttcaatcgccattgcagattctctcgatctatgctcaaaaaatcccg120agataaaaccctagatctgcttcaaatgctctgataccatgtaatttcagtgaattctaa180ctaaacaatggagagaattaactattttagaaagactgattgaaggagaagaagagagaa240aaattctatattgaactcatgaaccaaaatgaatgaaaaaaataatgagaagaactatac300tattacaatctatatatctctatttatattctaatctgaagcagttaatttaactgactc360taacaactagactgataggtgtacattttctgttagtgcactgcagtgcatttaactaac420tgcttaacataaagaatgttgttcgaacttcattcgaatagcttcaatgagaagcaaaca480tgtgtacctgtaaagacacacagtaaaagtgttaataatgaataaatatgaataaatcaa540ataataaattaaaaataaaaacacatccaattaacattggaggtcttgaaaatcgatggt600aattaacaaagacccttgtgaaatttaagtctgtaattgaaaatttgagtataggttagg660ggacatttgactattttctcattttctttatctttttcctaatttgtggcagacaagtga720ggaggccccactgtaattgattcatgcttttgctttcttgactttttggaacaatactat780gcatcatatttggtcttaattattcctctgtttatttccagaattttgagctctatacat840ctaataacaaagcaagcagaggatatatagtttcatcaactaaaaaggttagtcaactca900tctaatatttgctactctcatctctattgaagtacagttatggaaaagtagaagtgatgt960aagaaaaatgaaagaactttagtaggttagttggatctaacaaagagaaagggaaataaa1020ttgcaggagaaagagagaggttaaatacttactcacaccaccgatttacaacaaatcact1080taattgtggttagttaatgtatactttcacctcattaaattattacttacccatgataag1140ttgtattaatttggtattaatatccggtgcgggtgaattcttaccgggtgagagggatgg1200ggttggagagtgtggagtgaacagaagcagatgttttagattttttctaagatgacgaaa1260gattcccctcactaatgaaaatatattactatacgctattagagatagaaaggttcggta1320ccagttggtctcgtttctggatgaaccccatttttacaagtcattttcttcaattcaaat1380cgcaagtgtacctttatcatcttccactaattaagtcctcttaagttcgcgtgaaaatag1440tgaaattattgattattcttatcatttcatcttctttctcctgataaagttttatgtact1500ttttatgcatcaggtcttgagaacttggaaaggaaaagtagaatcatggaaaaacgaaaa1560gataatgaagaagcaaacaactcattggtatgttatttgatagagtgaactgtaaagtat1620tgaattgtagatatcatgtggctttaaaaatttgatatgtgttattttggcaggagtcat1680tttctgctcttcgcaaggatgctgccaatgttctggatttcctagagagattaaagaatg1740aagaagatcaaaaggctgttgatgtggatctgattgaaagcctgaaattgaagctgacat1800ttatttgtacatatgtccagctttcttattccgatttggagaagtttgaagatataatga1860ctagaaaaagacaagaggttgagaatctgcttcaaccaattttggatgatgatggcaaag1920acgtcgggtgtaaatatgtccttactagcctcgccggtaatatggatgactgtataagct1980tgtatcatcgttctaaatcagatgccaccatgatggatgagcaattgggcttcctcctct2040tgaatctctctcatctatccaagcatcgtgctgaaaagatgtttcctggagtgactcaat2100atgaggttc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物病原體的植物或其部分的方法，其包括步驟在所述植物或其部分中表達權利要求19或20的多肽和另一抗性蛋白質。27.產生具有對疫黴具有持久抗性的植物或其部分的方法，該方法包括在植物或者其部分中共表達Rpi-blb2和Rpi-blb2蛋白質或者權利要求19或20的多肽。28.權利要求25的或者根據權利要求26或27產生的轉基因植物或者植物組織，當存在所述多核苷酸或者載體時所述轉基因植物或植物組織抗卵菌門的植物病原體。29.權利要求25的轉基因植物或植物組織的可收穫部分，其包含權利要求24的植物細胞。30.權利要求25的轉基因植物或植物組織的繁殖材料，其包含權利要求24的植物細胞，所述細胞具有增加的Rpi-blb2活性。31.權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體，或者權利要求19或20的多肽的用途，用於產生抗卵菌門植物病原體的植物或植物組織、植物器官或植物細胞或植物部分。32.鑑定刺激針對卵菌門植物病原體的抗性的化合物的方法，其包括a)在細胞培養條件下將表達權利要求19或20的多肽或者其mRNA的細胞與候選化合物接觸；b)測定所述多肽或者所述mRNA的表達的增加；c)比較不存在所述候選化合物時，做出的對標準應答的表達水平；從而相對於標準增加的表達表明所述化合物刺激抗性。33.權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體、權利要求19或20的多肽或者權利要求21的抗體的用途，用於鑑定和/或產生激活或者刺激針對卵菌門植物病原體的植物抗性的化合物。34.診斷組合物，其包含權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體、權利要求21的抗體或者權利要求22的反義核酸和任選適宜的檢測方法。35.試劑盒，其包含權利要求8到12任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體、權利要求16或17的宿主細胞、權利要求19或20的多肽、權利要求22的反義核酸、權利要求21的抗體、權利要求24的植物細胞、權利要求25的植物或植物組織、權利要求29的可收穫部分、或權利要求30的繁殖材料和任選編碼Rpi-blb的多核苷酸、Rpi-blb蛋白質或者針對Rpi-blb的抗體。36.產生提供權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12到14任一項的載體或權利要求19或20的多肽的植物作物保護劑的方法，其包括權利要求32的方法的步驟；和以農業組合物可以應用的形式配製權利要求8到10任一項的多核苷酸、權利要求12或14的載體或權利要求19或20的多肽或權利要求32的步驟(c)中鑑定的化合物。37.權利要求1到36任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中所述植物病原體是腐黴目(Pythiales)或者Peronosperales。38.權利要求1到37任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中所述植物病原體是致病疫黴、紅腐疫黴、辣椒疫黴、大豆疫黴、寄生疫黴菸草致病變種、萵苣盤梗黴、Peronosporatabaci或者葡萄生單軸黴。39.權利要求1到38任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中所述抗性蛋白質的特徵是P-環和NBS結構域。40.權利要求2到39任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中另一抗性基因是編碼Rpi-blb、R1、R-ber、Rpi1、Rpi-blb3、Rpi-ABPT1、Rpi-mcd、R2、R3a和R3b、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、Ph-1、Ph-2和/或Ph-3的基因。41.權利要求2到40任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中另一抗性蛋白質是Rpi-blb蛋白質。42.權利要求1到41任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中所述植物、植物細胞或植物組織選自根據SystemaNaturae2000，Brands，S.J，Amsterdam的荇菜科、茄科、厚殼樹科、核果茄科、Goetzeaceae、旋花科、菟絲子科、花荵科和田基麻科構成的組或者具有其來源。43.權利要求1到42任一項的載體、宿主細胞、植物細胞、植物組織、植物、用途、試劑盒或方法，其中所述多核苷酸、多肽、植物細胞、宿主細胞、植物組織或植物來自茄科，優選來自S.bulbocastanum、馬鈴薯(S.tuberosum)、番茄(S.lycopersicum或Lycopersiconlycopersicum(L.)KarstenexFarwell))、矮牽牛、樹番茄(S.betaceum)、pearmelon(S.muricatum)或茄子(S.melongena)。全文摘要本發明涉及增加植物，尤其茄科(Solanaceae)植物，優選馬鈴薯和番茄對卵菌門(Oomycetes)的植物病原體的抗性的新方法，所述方法包括增加本發明多肽的活性。本發明還涉及多核苷酸和包含這些多核苷酸的載體。本發明還涉及相應的載體、細胞、轉基因植物和來自它們的轉基因繁殖材料，涉及產生它們的方法，還涉及它們用於產生糧食、飼料、種子、藥物或者精細化學品的用途。文檔編號A01H5/00GK1832961SQ200480022723公開日2006年9月13日申請日期2004年8月3日優先權日2003年8月11日發明者E·A·G·范德福森,J·J·H·M·阿萊弗斯,M·W·M·穆斯肯斯申請人:植物育種農業研究所有限公司